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ELETROFORESE DE DNA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINADEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA
LABORATÓRIO DE IMUNOLOGIA APLICADA À AQUICULTURA
Nicolas Argenta da ConceiçãoEmail: falenicolas@outlook.com
Eletroforese de DNA
Fiz a PCR
Mas... O que eu faço com essetubo? Minha PCR deu certo?
É uma técnica de separação de moléculas com carga em umamatriz devido a uma diferença de potencial elétrico
Moléculas com carga
Diferença de potencial elétrico
Matriz
Eletroforese de DNA
Eletroforese de DNA
É uma técnica de separação de moléculas com carga em umamatriz devido a uma diferença de potencial elétrico
Moléculas com carga
Diferença de potencial elétrico
Matriz
É uma técnica de separação de moléculas com carga em umamatriz devido a uma diferença de potencial elétrico
Moléculas com carga
Diferença de potencial elétrico
Matriz
Diferença de potencial
Polo Polo
Eletroforese de DNA
Diferença de potencial
Eletroforese de DNA
É uma técnica de separação de moléculas com carga em umamatriz devido a uma diferença de potencial elétrico
Moléculas com carga
Diferença de potencial elétrico
Matriz
Gel de agarose
Eletroforese de DNA
É uma técnica de separação de moléculas com carga em umamatriz devido a uma diferença de potencial elétrico
Moléculas com carga
Diferença de potencial elétrico
Matriz
Eletroforese de DNA
Etapas da eletroforese
1) Preparo do Gel
2) Migração
3) Visualização dos fragmentos
Eletroforese de DNA
Agarose: Separa fragmentos de tamanhos muito distantes (100 –
3.000 pb)
Poliacrilamida: Maior resolução. Separa fragmentos com até 1 pb
de diferença.
A escolha da matriz de separação usada depende
principalmente do tamanho dos fragmentos analisados.
Eletroforese de DNA
Agarose: polímero linear composto por resíduos de galactose
unidos por ligações glicosídicas.
Eletroforese de DNA
Algas rodophytas utilizadas na extração do ágar
A porcentagem utilizada é medida em peso/volume
Eletroforese de DNA
A agarose não é solúvel em temperatura ambiente e precisa ser aquecida e
resfriada para formação do gel (Gelificação)
32 - 45°C80 - 95°C
Eletroforese de DNA
Eletroforese de DNA
Eletroforese de DNA
O gel de agarose é feito com agarose e água?
Eletroforese de DNA
O gel de agarose é feito com agarose e água?
Água conduz eletricidade?
Eletroforese de DNA
O gel de agarose é feito com agarose e água?
Água conduz eletricidade?
NÃO
Eletroforese de DNA
Solução Tampão:
Manter pH estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida da
molécula)
Maior força iônica (carrega mais corrente que a água)
Eletroforese de DNA
Solução Tampão:
Manter pH estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida da
molécula)
Maior força iônica (carrega mais corrente que a água)
E na cuba?
Eletroforese de DNA
Diferença entre gel feito com Tampão e Água
Eletroforese de DNA
Qual escolher??
Tris-Acetato e EDTA – TAE
Tris-Borato e EDTA - TBE
Eletroforese de DNA
Tris-Acetato e EDTA – TAE
Utilizado em corridas com carga menor e por menos tempo
Tris-Borato e EDTA - TBE
Utilizados em corridas com carga maior e por mais tempo.
Têm um efeito tamponante mais duradouro
Eletroforese de DNA
Gel-Loading Buffer: aumenta a densidade da amostra e dar cor a
amostra;
Azul de Bromofenol
Xileno Cianol
Orange G
Sacarose / Glicerol / Ficoll
Eletroforese de DNA
Xileno cianol
Azul de Bromofenol
Orange G
Eletroforese de DNA
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
Tamanho da molécula;
Eletroforese de DNA
Qual é maior?
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
Tamanho da molécula;
Eletroforese de DNA
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
Tamanho da molécula;
Eletroforese de DNA
Qual é maior?
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
Tamanho da molécula;
Eletroforese de DNA
Eles são do tamanho
esperado?Maior
Intermediário
Menor
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
Tamanho da molécula;
Eletroforese de DNA
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
Tamanho da molécula;
~1000 pb
~800 pb
~600 pb
Marcador molecular
Eletroforese de DNA
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
Concentração de agarose;
Eletroforese de DNA
2%
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
Concentração de agarose;
Eletroforese de DNA
0,8%
Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:
Concentração de agarose;
Quanto mais fechada a “malha”, mais resistência os fragmentos de diferentes tamanhos sofrem e mais separados eles ficam
Eletroforese de DNA
Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de
acrilamida e bis-acrilamida.
Maior poder de resolução (até 1 pb)
Eletroforese de DNA
Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de
acrilamida e bis-acrilamida. Dependente de radicais livres (PAS e
TEMED)
Eletroforese de DNA
Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de
acrilamida e bis-acrilamida.
Eletroforese de DNA
PCR
Eletroforese
Visualização
Eletroforese de DNA
PCR
Eletroforese
Visualização
Eletroforese de DNA
Colorimétrico
Fluorescência
É necessário marcar o DNA com marcadores para visualizar os fragmentos
Eletroforese de DNA
Colorimétrico
Fluorescência
É necessário marcar o DNA com marcadores para visualizar os fragmentos
Eletroforese de DNA
Fluorescência
Eletroforese de DNA
Intercalantes de DNA
Eletroforese de DNA
Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Intercalantes de DNA
Eletroforese de DNA
Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Intercalantes de DNA
A T
C G
A T
Eletroforese de DNA
A T
C G
A T
Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Intercalantes de DNA
Eletroforese de DNA
A T
C G
A T
Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Intercalantes de DNA
Eletroforese de DNA
Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA
Intercalantes de DNA
Eletroforese de DNA
Água age como uma molécula “quencher” absorvendo a
fluorescência.Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA
Intercalantes de DNA
Eletroforese de DNA
Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA
Como emitem fluorescência?
Intercalantes de DNA
Eletroforese de DNA
A T
C G
A T
Intercalantes de DNA
Absorvem luz em um comprimento deonda e emitem em um comprimentomaior (menos energia)
Eletroforese de DNA
Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese
Eletroforese de DNA
A T
C G
A T
A T
C G
A T
A T
C G
A T
A T
C G
A T
A T
C G
A T
A T
C G
A T
Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese
Será que isso influencia na migração dos fragmentos?
Eletroforese de DNA
Brometo de Etídio
Intercalante muito utilizado para visualização do DNA
Eletroforese de DNA
Intercalante muito utilizado para visualização do DNA
Excitação em luz UV
Emissão em luz laranja/vermelho
Brometo de Etídio
Eletroforese de DNA
Eletroforese de DNA
Intercalante muito utilizado para visualização do DNA
Excitação em luz UV
Emissão em luz laranja/vermelho
É considerado tóxico
Brometo de Etídio
Eletroforese de DNA
SYBR Green
GelRed
GelGreen
Blue Green
Intercalantes alternativos
Eletroforese de DNA
ESCOLHA DE INICIADORES
PCR
Escolha de iniciadores
A PCR é uma replicação in vitro de um segmento de DNA específico
A PCR é uma replicação in vitro de um segmento de DNA específico
Iniciadores específicos para amplificação de segmentos específicos
PCRIniciador A
Iniciador B
Daonde surgem esses iniciadores?
Escolha de iniciadores
Os iniciadores são comprados em empresas
Escolha de iniciadores
Os iniciadores usados na PCR são feito de DNA e não RNA!
ssDNAPossuem entre 18 e 22 nucleotídeos
A T C G
P P P P P P P P
P OH
5’ 3’
A C G T T
Escolha de iniciadores
Actina
Agora é só mandar a sequência da actina e pedir iniciadores pra essa sequência?
Escolha de iniciadores
Actina
Escolha de iniciadores
Actina
Escolha de iniciadores
Eles flanqueiam a sequência de interesse
Actina
Os iniciadores não estão flanqueando a sequência
Escolha de iniciadores
Actina
Os iniciadores definem qual a região do DNA que será amplificada
A sequência dos iniciadores é escolhida por nós de acordo com o segmento de DNA de interesse
Escolha de iniciadores
Como escolhê-los?
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCA3’ 5’
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGT3’5’
ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’
TAGATCTCGATCGTTCGA 3’5’
Escolha de iniciadores
Como escolhê-los?
TAGATCTCGATCGTTCGA
ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’
3’5’
Forward ou Primer “Senso”
TATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCA
3’ 5’
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGT3’5’
Escolha de iniciadores
Como escolhê-los?
ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’
CGGATATGCTAGCTAGAT5’ 3’
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCA3’ 5’
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGT3’5’
Escolha de iniciadores
Como escolhê-los?
ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’
CGGATATGCTAGCTAGAT5’ 3’
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCA3’ 5’
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGT3’5’
TAGATCGATCGTATAGGC5’ 3’
COMPLEMENTAR REBATIDO (“Reverse Complement”)
Reverse ou Primer “Antissenso”
Escolha de iniciadores
Como escolhê-los?
ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGT3’5’
Escolha de iniciadores
• Como escolhê-los?
Escolha de iniciadores
O que levar em consideração?
Tamanho dos iniciadores (18 a 22 nt) – garante especificidade
Temperatura de melting (Tm):∼ 60°CTemperatura de hibridização
Conteúdo CG
Escolha de iniciadores
Forward
Reverse
ATCGCTATCGGATCGATAGC5’ 3’
CTATCGGCTTAGCATGCTAATC5’3’
Escolha de iniciadoresO que levar em consideração?
Tamanho dos iniciadores (18 a 22 nt) – garante especificidade
Temperatura de melting (Tm):∼ 60°CTemperatura de hibridização
Conteúdo CG
Formação de dímeros
ATCGCTATCGGATCGATAGC5’ 3’
CTATCGGCTTAGCATGCTAATC5’3’
......
Escolha de iniciadoresO que levar em consideração?
Tamanho dos iniciadores (18 a 22 nt) – garante especificidade
Temperatura de melting (Tm):∼ 60°CTemperatura de hibridização
Conteúdo CG
Formação de dímeros
Dúvidas?
Escolha de iniciadores
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