ELETROFORESE DE DNA - LIAA · eletroforese de dna universidade federal de santa catarina departamento de biologia celular, embriologia e genÉtica laboratÓrio de imunologia aplicada

ELETROFORESE DE DNA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINADEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA

LABORATÓRIO DE IMUNOLOGIA APLICADA À AQUICULTURA

Nicolas Argenta da ConceiçãoEmail: [email protected]

Eletroforese de DNA

Fiz a PCR

Mas... O que eu faço com essetubo? Minha PCR deu certo?

É uma técnica de separação de moléculas com carga em umamatriz devido a uma diferença de potencial elétrico

Moléculas com carga

Diferença de potencial elétrico

Matriz

Eletroforese de DNA

Eletroforese de DNA




Matriz




Matriz

Diferença de potencial

Polo Polo

Eletroforese de DNA

Diferença de potencial

Eletroforese de DNA




Matriz

Gel de agarose

Eletroforese de DNA




Matriz

Eletroforese de DNA

Etapas da eletroforese

1) Preparo do Gel

2) Migração

3) Visualização dos fragmentos

Eletroforese de DNA

Agarose: Separa fragmentos de tamanhos muito distantes (100 –

3.000 pb)

Poliacrilamida: Maior resolução. Separa fragmentos com até 1 pb

de diferença.

A escolha da matriz de separação usada depende

principalmente do tamanho dos fragmentos analisados.

Eletroforese de DNA

Agarose: polímero linear composto por resíduos de galactose

unidos por ligações glicosídicas.

Eletroforese de DNA

Algas rodophytas utilizadas na extração do ágar

A porcentagem utilizada é medida em peso/volume

Eletroforese de DNA

A agarose não é solúvel em temperatura ambiente e precisa ser aquecida e

resfriada para formação do gel (Gelificação)

32 - 45°C80 - 95°C

Eletroforese de DNA

Eletroforese de DNA

Eletroforese de DNA

O gel de agarose é feito com agarose e água?

Eletroforese de DNA


Água conduz eletricidade?

Eletroforese de DNA


Água conduz eletricidade?

NÃO

Eletroforese de DNA

Solução Tampão:

Manter pH estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida da

molécula)

Maior força iônica (carrega mais corrente que a água)

Eletroforese de DNA

Solução Tampão:

Manter pH estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida da

molécula)

Maior força iônica (carrega mais corrente que a água)

E na cuba?

Eletroforese de DNA

Diferença entre gel feito com Tampão e Água

Eletroforese de DNA

Qual escolher??

Tris-Acetato e EDTA – TAE

Tris-Borato e EDTA - TBE

Eletroforese de DNA

Tris-Acetato e EDTA – TAE

Utilizado em corridas com carga menor e por menos tempo

Tris-Borato e EDTA - TBE

Utilizados em corridas com carga maior e por mais tempo.

Têm um efeito tamponante mais duradouro

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Gel-Loading Buffer: aumenta a densidade da amostra e dar cor a

amostra;

Azul de Bromofenol

Xileno Cianol

Orange G

Sacarose / Glicerol / Ficoll

Eletroforese de DNA

Xileno cianol

Azul de Bromofenol

Orange G

Eletroforese de DNA

Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:

Tamanho da molécula;

Eletroforese de DNA

Qual é maior?



Eletroforese de DNA



Eletroforese de DNA

Qual é maior?



Eletroforese de DNA

Eles são do tamanho

esperado?Maior

Intermediário

Menor



Eletroforese de DNA



~1000 pb

~800 pb

~600 pb

Marcador molecular

Eletroforese de DNA


Concentração de agarose;

Eletroforese de DNA

2%



Eletroforese de DNA

0,8%



Quanto mais fechada a “malha”, mais resistência os fragmentos de diferentes tamanhos sofrem e mais separados eles ficam

Eletroforese de DNA

Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de

acrilamida e bis-acrilamida.

Maior poder de resolução (até 1 pb)

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acrilamida e bis-acrilamida. Dependente de radicais livres (PAS e

TEMED)

Eletroforese de DNA


acrilamida e bis-acrilamida.

Eletroforese de DNA

PCR

Eletroforese

Visualização

Eletroforese de DNA

PCR

Eletroforese

Visualização

Eletroforese de DNA

Colorimétrico

Fluorescência

É necessário marcar o DNA com marcadores para visualizar os fragmentos

Eletroforese de DNA

Colorimétrico

Fluorescência

É necessário marcar o DNA com marcadores para visualizar os fragmentos

Eletroforese de DNA

Fluorescência

Eletroforese de DNA

Intercalantes de DNA

Eletroforese de DNA

Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA


Eletroforese de DNA



A T

C G

A T

Eletroforese de DNA

A T

C G

A T



Eletroforese de DNA

A T

C G

A T



Eletroforese de DNA


Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA


Eletroforese de DNA

Água age como uma molécula “quencher” absorvendo a

fluorescência.Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA



Eletroforese de DNA



Como emitem fluorescência?


Eletroforese de DNA

A T

C G

A T


Absorvem luz em um comprimento deonda e emitem em um comprimentomaior (menos energia)

Eletroforese de DNA

Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese

Eletroforese de DNA

A T

C G

A T

A T

C G

A T

A T

C G

A T

A T

C G

A T

A T

C G

A T

A T

C G

A T

Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese

Será que isso influencia na migração dos fragmentos?

Eletroforese de DNA

Brometo de Etídio

Intercalante muito utilizado para visualização do DNA

Eletroforese de DNA


Excitação em luz UV

Emissão em luz laranja/vermelho

Brometo de Etídio

Eletroforese de DNA

Eletroforese de DNA


Excitação em luz UV

Emissão em luz laranja/vermelho

É considerado tóxico

Brometo de Etídio

Eletroforese de DNA

SYBR Green

GelRed

GelGreen

Blue Green

Intercalantes alternativos

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ESCOLHA DE INICIADORES

PCR

Escolha de iniciadores

A PCR é uma replicação in vitro de um segmento de DNA específico

A PCR é uma replicação in vitro de um segmento de DNA específico

Iniciadores específicos para amplificação de segmentos específicos

PCRIniciador A

Iniciador B

Daonde surgem esses iniciadores?


Os iniciadores são comprados em empresas


Os iniciadores usados na PCR são feito de DNA e não RNA!

ssDNAPossuem entre 18 e 22 nucleotídeos

A T C G

P P P P P P P P

P OH

5’ 3’

A C G T T


Actina

Agora é só mandar a sequência da actina e pedir iniciadores pra essa sequência?


Actina


Actina


Eles flanqueiam a sequência de interesse

Actina

Os iniciadores não estão flanqueando a sequência


Actina

Os iniciadores definem qual a região do DNA que será amplificada

A sequência dos iniciadores é escolhida por nós de acordo com o segmento de DNA de interesse


Como escolhê-los?

ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCA3’ 5’

TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGT3’5’

ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’

TAGATCTCGATCGTTCGA 3’5’


Como escolhê-los?

TAGATCTCGATCGTTCGA


3’5’

Forward ou Primer “Senso”

TATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCA

3’ 5’



Como escolhê-los?


CGGATATGCTAGCTAGAT5’ 3’




Como escolhê-los?


CGGATATGCTAGCTAGAT5’ 3’



TAGATCGATCGTATAGGC5’ 3’

COMPLEMENTAR REBATIDO (“Reverse Complement”)

Reverse ou Primer “Antissenso”


Como escolhê-los?




• Como escolhê-los?


O que levar em consideração?

Tamanho dos iniciadores (18 a 22 nt) – garante especificidade

Temperatura de melting (Tm):∼ 60°CTemperatura de hibridização

Conteúdo CG


Forward

Reverse

ATCGCTATCGGATCGATAGC5’ 3’

CTATCGGCTTAGCATGCTAATC5’3’

Escolha de iniciadoresO que levar em consideração?



Conteúdo CG

Formação de dímeros

ATCGCTATCGGATCGATAGC5’ 3’

CTATCGGCTTAGCATGCTAATC5’3’

......

Escolha de iniciadoresO que levar em consideração?



Conteúdo CG

Formação de dímeros

Dúvidas?


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