Comparação da eficácia da PCR convencional e em tempo real na identificação de espécies de Leishmania sp do Novo

Mundo, usando diferentes alvos moleculares

Aluna: Carina de Mattos SoaresOrientadora: Dra Cídia Vasconcellos

Supervisora: Dra Vânia Lucia Ribeiro da Matta

Faculdade de Medicina da Universidade de São PauloLaboratório de Patologia e Moléstias Infecciosas (LIM50)

As leishmanioses são doenças causadas pelo protozoário do gênero Leishmania que é transmitido ao homem através da

picada de insetos flebotomíneos.

Leishmaniose cutâneaLeishmaniose mucosa Leishmaniose visceral

Espécie do parasito

• A reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo empregada cada vez mais no diagnóstico das leishmanioses, devido a sua alta sensibilidade e especificidade (Reithinger; Dujardin, 2007).

• Além do diagnóstico, outra possível aplicação da PCR refere-se à identificação da espécie do parasito diretamente na amostra clínica.

Importância identificação das espécies: nos estudos epidemiológicos, no direcionamento do tratamento e no prognóstico do paciente

• A eficiência da PCR, convencional ou em tempo real, na discriminação das espécies do parasito depende do alvo (sequencia de nucleotídeos

do DNA do parasito) a ser amplificado in vitro.• A escolha dos primers (oligonucleotídeos iniciadores)

é de fundamental importância, pois são eles que vão flanquear e determinar a sequencia do

DNA do parasito que será amplificada.

PRI

MERS

Amplificação exponencial

Comparar a eficácia das reações de PCR convencional e em tempo real naidentificação de espécies de Leishmania sp do Novo Mundo,

empregando diferentes pares de primers

OBJETIVO

Primers

RV1/RV2 (alvo: kDNA)

MATERIAIS E MÉTODOS

LU5A/LC3L; LU5A/LM3A; LU5A/LB3C(alvo:gene que codifica o RNA spliced leader -SL).HSP70c (alvo: gene da proteína de choque térmico de 70 kDa)

Lima Junior et al. Rev Soc Bras Med Trop. 2009; 42(3):303-8.

Graça et al. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2012;107(5):664-74.

Harris et al. J Clin Microbiol.1998;36(7):1989-95.

MATERIAIS E MÉTODOS

• Leishmania (Leishmania) infantum chagasi(MHOM/ BR/72/LD46); (MHOM/BR/1974/PP75); (MHOM/BR/2002/LPC-RPV)

• Leishmania (Leishmania) amazonensis(MHOM/BR/1973/M2269); (IFLA/BR/1967/PH8)

• Leishmania (Viannia) braziliensis(MHOM/BR/1975/M2903/566) ; (MHOM/BR/1995/M15280); (M15323)

Leishmania (Viannia) lainsoni(MHOM/BR/1981/M6426); (M1023)

Leishmania (Viannia) shawi(MCEB/BR/1984/M8408);(M19703)

Leishmania (Viannia) naiffi

(MDAS/BR/1979/M5533); (MDAS/BR/1979/M5633)

Leishmania (Viannia) lindenberg(M15733)

• Leishmania (Viannia) guyanensis(MHOM/BR/1975/M4147) ; (MHOM/BR/1975/M2903/565)

Trypanosoma cruzi e Plasmodium malariae

Concentração DNA utilizada na PCR para

todas as espécies:100 ng/µL

Para realizar a PCR convencional utilizamos um termociclador,

e para visualização da amplificação é necessária

a confecção de um gel de agarose e a realização de

uma eletroforese para separação dos fragmentos de DNA amplificados.

100 V

Fonte

Gel PoçoPente

Tampão

CUBA

do DNA

MATERIAIS E MÉTODOS

A visualização destes fragmentosé feita através da

exposição do gel à luz ultravioleta.

A digestão com enzimas de restrição do produto amplificado gera fragmentos de diferentes tamanhos (padrões de restrição) que podem

diferenciar as espécies de Leishmania sp

MATERIAIS E MÉTODOS

Hae III

A PCR em tempo real (qPCR) dispensa o uso do gel de agarose e da eletroforese para visualizar o resultado da amplificação.

Revela o produto amplificado por fluorescência

MATERIAIS E MÉTODOS

- Fluoresce quando ligadaao DNA dupla-fita

- Cada ciclo, mais sinalfluorescente é detectado

Sybr®Green

RESULTADOS

RV1/RV2(L. (L.) i. chagasi)

Cycle

35343332313029282726252423222120191817161514131211109876543210F

luor

esce

nce

(nor

m)

74000

72000

70000

68000

66000

64000

62000

60000

58000

56000

54000

52000

50000

48000

46000

44000

42000

40000

38000

36000

34000

32000

30000

28000

26000

24000

22000

20000

18000

16000

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

0

-2000

-4000

-6000

-8000

Threshold: 3042 (Noiseband)

Baseline settings: automatic, Drift correction OFF

Lc

Lb/Tc

La

Pm

BPM La Lb Lb Ln Ln Ls Lg Lla Lli Tc Lc Lc CN

A

PCR convencionalPCR em tempo real

PCR convencional: possível diferenciar L. (L.) i. chagasi das outras 7 espécies de Leishmania sp.

qPCR : amplificação de todas as espécies analisadas. Foi possível diferenciar L. (L.) i. chagasi através da temperatura de melting(Tm).

LU5A/LC-3L(L. (L.) i. chagasi)

A

PM Lc Lc Lb Lb La La Ln Ln Ls Ls Lg Lg Lla Lla Lli Tc CN

Cycle

35343332313029282726252423222120191817161514131211109876543210

Flu

ores

cenc

e (n

orm

)

74000

72000

70000

68000

66000

64000

62000

60000

58000

56000

54000

52000

50000

48000

46000

44000

42000

40000

38000

36000

34000

32000

30000

28000

26000

24000

22000

20000

18000

16000

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

0

-2000

-4000

-6000

-8000

Threshold: 3042 (Noiseband)

Baseline settings: automatic, Drift correction OFF

B

Lb

La

Lc

PCR convencional: não houve amplificação de L. (L.) i. chagasi, e de nenhuma outra espécie de Leishmania sp analisada e de T. cruzi.

qPCR : houve amplificação das três espécies analisadas. Foi possível a diferenciação de L. (L.) i. chagasi através da Tm.

PCR convencionalPCR em tempo real

LU5A/LM-3A (L. (L.) amazonensis)

A

Cycle

35343332313029282726252423222120191817161514131211109876543210

Flu

ores

cenc

e (n

orm

)

68000

66000

64000

62000

60000

58000

56000

54000

52000

50000

48000

46000

44000

42000

40000

38000

36000

34000

32000

30000

28000

26000

24000

22000

20000

18000

16000

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

0

-2000

-4000

Threshold: 833 (Noiseband)

Baseline settings: automatic, Drift correction OFF

B

Lb/Lc

La

PM Lc Lc Lb Lb La La Ln Ln Ls Ls Lg Lg Lla Lla Lli Tc CN

PCR convencional: não houve amplificação de L. (L.) amazonensis.

qPCR : houve amplificação das três espécies analisadas e além disso, foi possível a diferenciação das três espécies testadas através da Tm.

PCR convencional PCR em tempo real

LU5A/LB-3C(L. (V) braziliensis)

A

Cycle

35343332313029282726252423222120191817161514131211109876543210

Fluo

resc

ence

(nor

m)

74000

72000

70000

68000

66000

64000

62000

60000

58000

56000

54000

52000

50000

48000

46000

44000

42000

40000

38000

36000

34000

32000

30000

28000

26000

24000

22000

20000

18000

16000

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

0

-2000

-4000

-6000

-8000

Threshold: 3042 (Noiseband)

Baseline settings: automatic, Drift correction OFF

B

Lb

La

Lc

A

A

PM Lc Lc La La Lb Lb Ln Ln Ls Lg Lg Lla Lla Lli Tc CN

PCR convencional: amplificação somente das espécies de Leishmania sp pertencentes ao subgênero Viannia.

qPCR : houve amplificação das três espécies analisadas. Diferenciação de L. (L.) amazonensis e L.(V.) braziliensis x L.(L.)i. chagasi pela Tm.

PCR convencional PCR em tempo real

HSP70c(todas as espécies de Leishmania sp)

Cycle

35343332313029282726252423222120191817161514131211109876543210

Flu

ore

scence (

norm

)

72000

70000

68000

66000

64000

62000

60000

58000

56000

54000

52000

50000

48000

46000

44000

42000

40000

38000

36000

34000

32000

30000

28000

26000

24000

22000

20000

18000

16000

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

0

-2000

-4000

-6000

-8000

Threshold: 1668 (Noiseband)

Baseline settings: automatic, Drift correction OFF

B

Lc/Lb

La

A A

PM Lc Lc Lc Lb Lb Lb La La Ln Ln Ls Ls Lg Lg Lla Lla Lli Tc Pm CN

PCR convencional: amplificação de todas as espécies de Leishmania sp e não houve amplificação de T. cruzi e P. malariae.

qPCR: houve amplificação das três espécies analisadas, porém não foi possível discriminar nenhuma das espécies pela pelaTm.

PCR convencional

PCR em tempo real

HSP70cPerfis de bandas após digestão

com Hae III

Digestão com Hae III• possível diferenciar as 3 espécies mais prevalentes no Brasil.• subgênero Viannia: foram observados três padrões de restriçãoperfil 1: L. (V.) braziliensis e L. (V.) naiffi; perfil 2: L. (V.) shawi, L. (V.) lainsoni e L. (V.) lindenberg; perfil 3: L. (V.) guyanensis.

PM Lc Lc Lc Lb Lb Lb La La

Perfil 1

Perfil 2

Perfil 3

Perfil 2

A B

PM Ln Ln Ls Ls Lg Lg Lla Lla Lli

Subgênero Viannia

CONCLUSÕES

RV1/RV2

PCR convencional

Especifico para L. (L.) i. chagasi.

PCR tempo real

•Amplifica L. (L.) i. chagasi , L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis. • Discrimina apenas L. (L.) i. chagasi.

LU5A/LC-3L

PCR convencional

Não amplificou Leishmania sp.

PCR tempo real

•Amplifica L. (L.) i. chagasi , L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis. • Discrimina apenas L. (L.) i. chagasi.

LU5A/LB-3C

PCR convencional

Específico para o subgêneroViannia de

Leishmania sp.

PCR tempo real

•Amplifica L. (L.) i. chagasi , L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis. • Discrimina apenas L. (L.) i. chagasi.

HSP70c

PCR convencional

• Amplifica todas as 8 espécies (gênero –específica)• Hae III: diferenciação entre (L.) i. chagasi, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis e várias do subgênero Viannia

PCR tempo real

• Amplifica L. (L.) i. chagasi , L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis• Não há como diferenciar essas espécies

LU5A/LM-3A

PCR convencional

Não amplificou Leishmania sp.

PCR tempo real

•Amplifica L. (L.) i. chagasi , L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis. • Discrimina todas elas.

Dada a importância da identificação das espécies nos estudos

epidemiológicos, no direcionamento do tratamento e no prognóstico

do paciente, acreditamos que o presente estudo traga elementos

contribuidores para tal identificação

CONCLUSÃO

Muito obrigada