Aula 9 Eletroforese PCR Sequenciamento

A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Histórico• 1952, Markham and Smith

– Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico

• 1955, Smithies– Géis de amido funcionam bem para separar

proteínas do soro humano

• 1967, Loening – Géis de acrilamida com maior resolução e permitem

separar ainda moléculas grandes de DNA

• 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos

enormes• É hoje impossível imaginar um laboratório de

biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...

Vou ali correr um gelzinho e

já volto

Tenho que ir senão vou perder meu gel

Eletroforese• Movimento de partículas dispersas

num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme

• DNA, carga negativa– Tem tendência a se dirigir ao polo

positivo quando sujeito a um campo elétrico

• Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com

detergente (SDS)

• Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular

Eletroforese, etapas

1.Preparação do gel

2.Aplicação das amostras

3.Eletroforese

4.Coloração

5. Análise dos resultados

Preparação do gel

Horizontal X Vertical

Agarose X Poliacrilamida

Aplicação das amostras

Definição do mapa das amostras por canaleta

Corrida do gel• Aplicação do campo elétrico

• Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão

• Terminais positivo e negativo

• Tempo adequado, senão o DNA sai do gel

Coloração das moléculas

• Brometo de etídio– Agente intercalante do DNA

• Cancerígeno!

– Composto fluorescente à luz UV– Gel de agarose

• Prata– Gel SDS-PAGE

• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis

– Melhor resolução

• Coomassie blue, etc

Eletroforese em campo pulsado

Grandes fragmentos de DNA

PCR a reação em cadeia da polimerase


http://dotsub.com/view/538a719f-927b-4192-8e95-18a92a9e95a5



Reação em cadeia

Amplificação do DNA

Síntese de DNA in vitro

• Polimerase Chain Reaction– Reação em cadeia da Polimerase

• Amplificação in vitro demoléculas de DNA– In vivo X In vitro X In silico

• Procedimento análogo à replicação do DNA– Amostra de DNA; 2 primers; DNA polimerase; Tampão; dNTP

Etapas da PCR

• Ciclos da PCR– Separação das fitas → 96°C– Anelamento dos primers → 60°C– Síntese do DNA → 37°C

• Problema inicial da técnica– Durante a etapa de quebra das

pontes de H e separação das fitas (DNA melting) a 96°C, a enzima polimerase era desnaturada e precisava ser acrescentada ciclo a ciclo...

– Não permitia automação

História da PCR• Químico, 1966

– Doutor em bioquímica, 1972– 2 anos de pós-doutorado numa industria farmacêutica

• Deixou a academia para escrever ficção científica, foi dono de padaria por dois anos; voltou à indústria

• 1983 → Teve a idéia de utilizar um par de primers para amplificação enquanto voltava para a casa à noite ao lado da namorada

• Avisou na empresa e deixou-se que ele ficasse trabalhando na PCR, demorou um ano para padronizar a técnica

• Perdeu a namorada logo depois, mas ganhou o Nobel de química (1993)

• 1986 → utilização da enzima polimerase de Thermus aquaticus– Permitiu finalmente a automação da técnica

• Controvérsias: Surfista, já foi divorciado 3 vezes, é um dos queacredita que o HIV não causa a AIDS, e diz ter tomado bastante LSD na década de 60/70 e que isso o ajudou a descobrir a afamada técnica!

Kary Mullis, 1944

Taq polimerase

PCR

Sistema de reação:DNA molde (100 ng)Iniciadores (5 M)dNTPsTampão com MgCL2

Taq polimerase

Protocolo de amplificação:Desnaturação: 95º CAnelamento: 45-60º CExtensão: 72º C

Filmes como técnica didática

• http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/• http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm• http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm

http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ

Interlúdio explicativo


Bioquímica + Biomol

• Enzimas são proteínas, portanto:

1. São formadas por sequências de aminoácidos

2. Derivam de informações dispostas por genes no DNA, que deve ser transcrito e, posteriormente, traduzido

3. Podemos saber a sequência delas, tanto de aminoácidos quanto de nucleotídeos

>gi|188497753|ref|NM_000188.2| Homo sapiens hexokinase 1 (HK1), nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1, mRNA GAGGAGGAGCCGCCGAGCAGCCGCCGGAGGACCACGGCTCGCCAGGGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCA CGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCAGCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAG CTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTCTATGCCATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCA TAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCTCCCGGGATTTTAATCCAACAGCCAC AGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTCTGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTG GATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAATCATGAGAAAAACCAGAATGTTCACA TGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCAGTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGT TGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGACAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACG TTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTGATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAG CGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAGCCATCAAAAAGCGAGGGGACTATGA TGCCAACATCGTAGCTGTGGTGAATGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGGCTATGACGACCAGCAC TGTGAAGTCGGCCTGATCATCGGCACTGGCACCAATGCTTGCTACATGGAGGAACTGAGGCACATTGATC TGGTGGAAGGAGACGAGGGGAGGATGTGTATCAATACAGAATGGGGAGCCTTTGGAGACGATGGATCATT AGAAGACATCCGGACAGAGTTTGACAGGGAGATAGACCGGGGATCCCTCAACCCTGGAAAACAGCTGTTT GAGAAGATGGTCAGTGGCATGTACTTGGGAGAGCTGGTTCGACTGATCCTAGTCAAGATGGCCAAGGAGG GCCTCTTATTTGAAGGGCGGATCACCCCGGAGCTGCTCACCCGAGGGAAGTTTAACACCAGTGATGTGTC AGCCATCGAAAAGAATAAGGAAGGCCTCCACAATGCCAAAGAAATCCTGACCCGCCTGGGAGTGGAGCCG TCCGATGATGACTGTGTCTCAGTCCAGCACGTTTGCACCATTGTCTCATTTCGCTCAGCCAACTTGGTGG CTGCCACACTGGGCGCCATCTTGAACCGCCTGCGTGATAACAAGGGCACACCCAGGCTGCGGACCACGGT TGGTGTCGACGGATCTCTTTACAAGACGCACCCACAGTATTCCCGGCGTTTCCACAAGACTCTAAGGCGC TTGGTGCCAGACTCCGATGTGCGCTTCCTCCTCTCGGAGAGTGGCAGCGGCAAGGGGGCTGCCATGGTGA CGGCGGTGGCCTACCGCTTGGCCGAGCAGCACCGGCAGATAGAGGAGACCCTGGCTCATTTCCACCTCAC CAAGGACATGCTGCTGGAGGTGAAGAAGAGGATGCGGGCCGAGATGGAGCTGGGGCTGAGGAAGCAGACG CACAACAATGCCGTGGTTAAGATGCTGCCCTCCTTCGTCCGGAGAACTCCCGACGGGACCGAGAATGGTG ACTTCTTGGCCCTGGATCTTGGAGGAACCAATTTCCGTGTGCTGCTGGTGAAAATCCGTAGTGGGAAAAA GAGAACGGTGGAAATGCACAACAAGATCTACGCCATTCCTATTGAAATCATGCAGGGCACTGGGGAAGAG CTGTTTGATCACATTGTCTCCTGCATCTCTGACTTCTTGGACTACATGGGGATCAAAGGCCCCAGGATGC CTCTGGGCTTCACGTTCTCATTTCCCTGCCAGCAGACGAGTCTGGACGCGGGAATCTTGATCACGTGGAC AAAGGGTTTTAAGGCAACAGACTGCGTGGGCCACGATGTAGTCACCTTACTAAGGGATGCGATAAAAAGG AGAGAGGAATTTGACCTGGACGTGGTGGCTGTGGTCAACGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGCTT ATGAGGAGCCCACCTGTGAGGTTGGACTCATTGTTGGGACCGGCAGCAATGCCTGCTACATGGAGGAGAT GAAGAACGTGGAGATGGTGGAGGGGGACCAGGGGCAGATGTGCATCAACATGGAGTGGGGGGCCTTTGGG GACAACGGGTGTCTGGATGATATCAGGACACACTACGACAGACTGGTGGACGAATATTCCCTAAATGCTG GGAAACAAAGGTATGAGAAGATGATCAGTGGTATGTACCTGGGTGAAATCGTCCGCAACATCTTAATCGA CTTCACCAAGAAGGGATTCCTCTTCCGAGGGCAGATCTCTGAGACGCTGAAGACCCGGGGCATCTTTGAG ACCAAGTTTCTCTCTCAGATCGAGAGTGACCGATTAGCACTGCTCCAGGTCCGGGCTATCCTCCAGCAGC TAGGTCTGAATAGCACCTGCGATGACAGTATCCTCGTCAAGACAGTGTGCGGGGTGGTGTCCAGGAGGGC CGCACAGCTGTGTGGCGCAGGCATGGCTGCGGTTGTGGATAAGATCCGCGAGAACAGAGGACTGGACCGT CTGAATGTGACTGTGGGAGTGGACGGGACACTCTACAAGCTTCATCCACACTTCTCCAGAATCATGCACC AGACGGTGAAGGAACTGTCACCAAAATGTAACGTGTCCTTCCTCCTGTCTGAGGATGGCAGCGGCAAGGG GGCCGCCCTCATCACGGCCGTGGGCGTGCGGTTACGCACAGAGGCAAGCAGCTAAGAGTCCGGGATCCCC AGCCTACTGCCTCTCCAGCACTTCTCTCTTCAAGCGGCGACCCCCTACCCTCCCAGCGAGTTGCGCTGGG AGACGCTGGCGCCAGGGCCTGCCGGCGCGGGGAGGAAAGCAAAATCCAACTAATGGTATATATTGTAGGG TACAGAATAGAGCGTGTGCTGTTGATAATATCTCTCACCCGGATCCCTCCTCACTTGCCCTGCCACTTTG CATGGTTTGATTTTGACCTGGTCCCCCACGTGTGAAGTGTAGTGGCATCCATTTCTAATGTATGCATTCA TCCAACAGAGTTATTTATTGGCTGGAGATGGAAAATCACACCACCTGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAG CCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACCAGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCC CGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCTTCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTG GCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGTCCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTG TGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGTCCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCA TTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAATTTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTC GTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

>gi|188497754|ref|NP_000179.2| hexokinase 1 isoform HKI [Homo sapiens] MIAAQLLAYYFTELKDDQVKKIDKYLYAMRLSDETLIDIMTRFRKEMKNGLSRDFNPTATVKMLPTFVRS IPDGSEKGDFIALDLGGSSFRILRVQVNHEKNQNVHMESEVYDTPENIVHGSGSQLFDHVAECLGDFMEK RKIKDKKLPVGFTFSFPCQQSKIDEAILITWTKRFKASGVEGADVVKLLNKAIKKRGDYDANIVAVVNDT VGTMMTCGYDDQHCEVGLIIGTGTNACYMEELRHIDLVEGDEGRMCINTEWGAFGDDGSLEDIRTEFDRE IDRGSLNPGKQLFEKMVSGMYLGELVRLILVKMAKEGLLFEGRITPELLTRGKFNTSDVSAIEKNKEGLH NAKEILTRLGVEPSDDDCVSVQHVCTIVSFRSANLVAATLGAILNRLRDNKGTPRLRTTVGVDGSLYKTH PQYSRRFHKTLRRLVPDSDVRFLLSESGSGKGAAMVTAVAYRLAEQHRQIEETLAHFHLTKDMLLEVKKR MRAEMELGLRKQTHNNAVVKMLPSFVRRTPDGTENGDFLALDLGGTNFRVLLVKIRSGKKRTVEMHNKIY AIPIEIMQGTGEELFDHIVSCISDFLDYMGIKGPRMPLGFTFSFPCQQTSLDAGILITWTKGFKATDCVG HDVVTLLRDAIKRREEFDLDVVAVVNDTVGTMMTCAYEEPTCEVGLIVGTGSNACYMEEMKNVEMVEGDQ GQMCINMEWGAFGDNGCLDDIRTHYDRLVDEYSLNAGKQRYEKMISGMYLGEIVRNILIDFTKKGFLFRG QISETLKTRGIFETKFLSQIESDRLALLQVRAILQQLGLNSTCDDSILVKTVCGVVSRRAAQLCGAGMAA VVDKIRENRGLDRLNVTVGVDGTLYKLHPHFSRIMHQTVKELSPKCNVSFLLSEDGSGKGAALITAVGVR LRTEASS

917 aminoácidos

3617 bp3,6 kb

917 x 3 = 2751

3617-2751 = 866

Sequenciamento de proteínas• Degradação de Edman

– Quebra-se o aminoácido N-terminal– Identifica-se o aminoácido quebrado– Sequenciamento de 50 a 70 aa’s

• Espectometria de massa– Quebra-se a proteína em diversos

pontos e verifica-se a massa dos fragmentos

– Comparações com massas conhecidas dos aa’s identifica a sequência dos mesmos

• Técnicas com limite de automação– Não permitem produzir dados em larga-

escala– Para saber-se a sequência de um

proteína, muitas vezes sequencia-se o DNA do organismo de interesse

O Sequenciamento de moléculas de DNAProf. Dr. Francisco Prosdocimi

>gi|33869444|gb|BC008730.2| Homo sapiens hexokinase 1, mRNA (cDNA clone MGC:1724 IMAGE:3163058), complete cds GGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCACGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCA GCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAGCTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTGTATGCC ATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCATAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCT CCCGGGATTTTAATCCAACAGCCACAGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTC TGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTGGATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAAT CATGAGAAAAACCAGAATGTTCACATGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCA GTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGTTGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGA CAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACGTTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTG ATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAGCGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAG(...)TGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAGCCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACCAGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCCCGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCT TCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTGGCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGT CCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTGTGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGT CCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCATTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAAT TTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTCGTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Frederick Sanger• Único vivo dentre os 4 indivíduos que já

venceram dois prêmios Nobel

• ~1955: publicou a primeira sequência de aminoácidos da insulina– Ganhou o Nobel de química em 1958

• 1964: descobriu que as proteínas de bactéria iniciavam-se com o aminoácido formil-metionina

• 1967: desvendou a sequência do RNA ribossomal 5S• 1975: inventou o método dideóxi para o sequenciamento do DNA• 1977: sequencia, pela primeira vez, o genoma inteiro

de um organismo, o bacteriófago phi X 174– 11 genes in 5386 bases sequenciadas “à mão“– Ganha o segundo Nobel de química em 1980

O método de Sanger, 1975

Polimerização do DNA a ser sequenciado (molde)na presença de:

DNA polimeraseprimer

tampãodNTPs (desóxinucleotídeo)ddNTPs (didesóxinucleotídeo)

O que faria um nucleotídeo que, ao invés da extremidade 3’OH, tem uma extremidade 3’H?

Como acontece a síntese de moléculas de DNA?

http://www.youtube.com/watch?v=Mz-4LSfecM4&feature=related (dideóxi)

http://www.youtube.com/watch?v=Mz-4LSfecM4&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=Mz-4LSfecM4&feature=related

Amplificação interrompida com didesoxinucleotídeos

O didesóxinucleotídeo não tem a extremidade 3’OH livre

(...)

e, portanto, não permite a incorporação de novas bases a 3’ quando é adicionado,

(...)

interrompendo a formação da nova cadeia definitivamente

Desoxinucleotídeos

dNTP

ddNTP

Didesoxinucleotídeos

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA|||||||

5’3’

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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

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5’3’

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

População de moléculas

Incorporação aleatória do didesóxi

Quantidade precisa entre didesóxi e desóxi


ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT






ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT




G A T C

• moldemolde• polimerasepolimerase• ddNNTPsTPs

•ddddGGTPsTPs •ddddAATPsTPs •ddddTTTPsTPs •ddddCCTPsTPs










ATGCTTCATGCTTCTT




ATGCTTCATGCTTCTTGGATGCTTCATGCTTCTGTGGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCATGGCAGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTTGGCAGATCTGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACATGGCAGATCTGAACAGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTTGGCAGATCTGAACAGTGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGG

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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAATGGCAGATCTGAACC

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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGTGGCAGAA

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGTGGCAGATCTGAAATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGATGGCAGATCTGAAA

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACTGGCAGATCTGAACAA

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G A T C










ATGCTTCATGCTTCTT




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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGG

ATGCTTCATGCTTCTGGTGGCC

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ATGCTTCATGCTTCTGGCTGGCAA

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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAA

Modelo originalMarcação do primer

4 reações necessárias, uma para cada base

Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos

Leitura manual da sequência de baixo pra cima

Etapa 1

AmplificaçãoTipo-PCr

Etapa 2

Eletroforese

Sanger e o fago Phi 174

De fato, esse tipo de sequenciamento manual continuou acontecendo por décadas...

Modelo modernoApplied Byosystems, 1986

Marcação fluorescente do ddNTP

1 reação necessária, todas as bases lidas ao mesmo tempo

Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos

Leitura da automática sequência, de baixo pra cima, por um laser

http://www.youtube.com/watch?v=ezAefHhvecM

Leroy Hood, 1938-

Cromatograma

As máquinas necessárias para o sequenciamento

• Primeira etapa: junta-se os reagentes em poços de placas e coloca-se na máquina de PCR para a reaçãode amplificação interrompida

• Diferenças com relação ao PCR– Utilização de um só primer– Utilização dos ddNTPs

• Uma vez prontas, as sequências de diferentes tamanhos contendo os didesóxi amplificados devem ser enviadas ao sequenciador de DNA mais próximo

O que faz um sequenciador de DNA?

• Segunda etapa: realiza a eletroforese capilar– O sequenciador executa a eletroforese em géis capilares ultra-finos– Um sensor é responsável por emitir um laser e verificar qual o comprimento

de onda emitido pelo didesóxi

Exercício

Dê a sequência de DNA da canaleta apontada

azul = Guaninaamarelo = Timinavermelha = Adenina verde = Citosina

http://www.youtube.com/watch?v=dUjMf2ZezIw&feature=related

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Aula 9 Eletroforese PCR Sequenciamento