-­‐ PCR  (Reação  em  cadeia  da  Polimerase)    -­‐SEQUENCIAMENTO  

 GRADUAÇÃO  EM  BIOTECNOLOGIA    

Profa. Fabiana K. Seixas

SEQUENCIAMENTO  DE  DNA  

"   Clivagem química ou Método de Maxam-Gilbert (não é mais utilizado)

"   Método de Sanger: de terminação de cadeia com didesoxirribonucleosídeo trifosfato.

"   Manual

"   Automatizado

SEQUENCIAMENTO DE DNA

Método  de  Maxam-­‐Gilbert  

 Clivagem  de  uma  molécula  de  DNA  com   reagentes   químicos   que   atuam  especiOicamente   em   um   determinado  nucleotídeo  

Grupo  fosfato  radioativo  

•  Um   dos   mais   utilizado   é   o   chamado  “método   didesoxi”   conhecido   também  como   de   “terminadores   de   cadeia”   ou   de  “Sanger”  

SEQUENCIAMENTO DE DNA

Método  de  Sanger  

Polimerização

SEQUENCIAMENTO DE DNA

SEQUENCIAMENTO DE DNA

Método  de  Sanger  

2´,  3´didesoxirribonucleotídeo  trifosfato  (ddNTP)  interrompe  a  reação  de  polimerização  da  cadeia  de  DNA  

Seqüenciamento  de  nucleotídeos  

pelo  método  do  término  do  

crescimento  da  cadeia.  

SEQUENCIAMENTO MANUAL

SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO

Anelamento do primer

Extensão do primer

Terminação da síntese: adição dos ddNTPs

Método de Sanger - Manual

Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante

Autorradiografia

32P

E l e t r o f o r e s e   em   g e l   d e  po l iacr i lamida   separando  fragmentos  de  DNA  com  1  base  de  diferença  

Auto-radiogramas de um gel de seqüenciamento de DNA

Método de Sanger automatizado

Seqüenciamento    Manual  X  Automá3co  

Seqüenciando um Genoma

Há duas estratégias empregadas no seqüenciamento de genomas:

1. Mapeamento prévio do genoma. Utiliza-se uma coleção de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados, subclonados e seqüenciados);

Há duas estratégias empregadas no seqüenciamento de genomas:

2. DNA genômico é fragmentado em segmentos menores que são clonados e seqüenciados.

Vídeo Seqüenciamento

www.scq.ubc.ca/.../

Genômica  -­‐  Histórico  

•  1977   –   Técnica   de   seqüenciamento   de   DNA   –  Método   de  Sanger  

•  1991  –  Projeto  Genoma  Humano  •  1995   –   Primeiro   genoma   seqüenciado   (Haemophylus  in/luenzae)  

•  2001  –  Primeiro  rascunho  do  Genoma  Humano  •  2003  –  Conclusão  do  seqüenciamento  do  Genoma  Humano  •  2007  –  Mais  de  500  genomas  seqüenciados    

Haemophilus  influeanzae  

Fleischmann et al., Science 269:496-512, 1995

Science,  July  28,  1995  v269  n5223  p496(17)      

 Whole-­‐genome  random  sequencing  and  assembly  of  Haemophilus  in8luenzae  Rd.  (8irst  genome  of  free-­‐living  

organism  ever  completely  sequenced).     Robert   D.   Fleischmann;   Mark   D.   Adams;   Owen   White;   Rebecca   A.   Clayton;   Ewen   F.   Kirkness;  Anthony   R.   Kerlavage;   Carol   J.   Bult;   Jean-­‐Fracois   Tomb;   Brian   A.   Dougherty;   Joseph  M.  Merrick;  Keith   McKenney;   Granger   Sutton;   Will   FitzHugh;   Chris   Fields;   Jeannine   D.   Gocayne;   John   Scott;  Robert   Shirley;   Li-­‐Ing   Liu;   Anna   Glodek;   Jenny  M.   Kelley;   Janice   F.  Weidman;   Cheryl   A.   Phillips;  Tracy  Spriggs;  Eva  Hedblom;  Matthew  D.  Cotton;  Teresa  R.  Utterback;  Michael  C.  Hanna;  David  T.  Nguyen;   Deborah   M.   Saudek;   Rhonda   C.   Brandon;   Leah   D.   Fine;   Janice   L.   Fritchman;   Joyce   L.  Fuhrmann;  N.S.M.  Geoghagen;  Cheryl  L.  Gnehm;  Lisa  A.  McDonald;  Keith  V.  Small;  Claire  M.  Fraser;  Hamilton  O.  Smith;  J.  Craig  Venter.    

 ABSTRACT  

 An  approach  for  genome  analysis  based  on  sequencing  and  assembly  of  unselected  pieces  of  DNA  from   the   whole   chromosome   has   been   applied   to   obtain   the   complete   nucleotide   sequence  (1,830,137   base   pairs)   of   the   genome   from   the   bacterium   Haemophilus   inOluenzae   Rd.   This  approach   eliminates   the   need   for   initial   mapping   efforts   and   is   therefore   applicable   to   the   vast  array  of  microbial  species   for  which  genome  maps  are  unavailable.  The  H.   inOluenzae  Rd  genome  sequence   (Genome  Sequence  DataBase   accession  number  L42023)   represents   the   only   complete  genome  sequence  from  a  freeliving  organism.    

 

Organism   Complete   Draft  assembly   In  progress   total  Prokaryotes   598   396   506   1500  Archaea   48   4   29   81  Bacteria   550   392   477   1419  Eukaryotes   24   125   176   325  Animals   5   53   83   141  Mammals   2   20   23   45  Birds       1   2   3  Fishes       3   6   9  Insects   2   20   17   39  

Flatworms       1   3   4  Roundworms   1   3   13   17  Amphibians           2   2  Reptiles           1   1  

Other  animals       6   19   25  Plants   3   3   34   40  

Land  plants   2   2   27   31  Green  Algae   1   1   7   9  

Fungi   10   49   28   87  Ascomycetes   8   41   20   69  Basidiomycetes   1   6   4   11  Other  fungi   1   2   4   7  Protists   6   18   27   51  

Apicomplexans   1   9   6   16  Kinetoplasts   1   2   5   8  Other  protists   4   7   15   26  

total:   622   521   682   1825  

Projetos  

Genomas  

Revised: Nov 17, 2007 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/gpstat.html

Projetos  

Genomas  

Revised: Mar 29, 2011

OBRIGADA PELA ATENÇÃO