Enzimologia Prof. Dr. Francisco Prosdocimi. A vida e a energia para a vida Duas condições...

Enzimologia

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

A vida e a energia para a vida• Duas condições fundamentais:

1. Autorreplicação2. Metabolismo

• Catálise enzimática

• A queima de açúcares é a principal forma segundo a qual retiramos energia do meio ambiente para vivermos

• Um saco de açúcar pode permane-cer anos na prateleira do supermercado– A prateleira não tem enzimas!

• Nos animais, a glicose libera sua energia química em segundos– Reações catalíticas promovem a oxidação

da glicose ao quebrar ligações químicas que armazenam energia

Participam das vias bioquímicas

• Enzimas realizam o controle preciso do metabolismo celular

• O metabolismo energético é um dos principais temas de estudo da bioquímica

• Permitem resposta e adaptação a ummeio em mudança

O que são as enzimas?• Proteínas notáveis, altamente especializadas

– Alto grau de especificidade com substratos• Poder catalítico extraordinário

– Muito maior do que catalisadores sintéticos• Aceleram reações químicas

– Em condições suaves de temperatura e pH• São o centro e o objeto de estudo principal da

bioquímica– Atuando de forma organizada catalisam

centenas de reações que degradam as moléculas dos nutrientes e conservam suas energias

• Doenças ocorrem quando elas não funcionam bem

• Como os cientistas descobriram as enzimas?

LOUIS PASTEUR

1835: Berzelius, conceito de catálise 1885: fermentação do acúcar por lêvedos,

gerando álcool

Vitalismo: o mágico élan vital 1896: Edward Buchner consegue fermentar o açúcar num

extrato de lêvedo sem vida!

Fermentos, portanto, catalisavam reações químicas (açúcar a álcool) – biocatalisadores

Enzima vem do grego εν ζυμη, cuja tradução é “no lêvedo”

Louis Pasteur1822-1895

Um pouco de história...

EMIL FISCHER

Sacarase Quebra da sacarose em glicose e frutose

Produziu diversos análogos de sacarose para testar se a enzima funcionava

Determinadas mutações tornavam os análogos resistentes à sacarase

Modelo de ação enzimática chave-e-fechadura

Hermann Emil Fischer1852 - 1919

Enzimas são proteínas?

Qual a natureza das enzimas? O químico orgânico alemão Richard

Willstätter (1872–1942) – ganhador do Nobel pela estrutura da clorofila – conseguiu separar o componente enzimático de um preparado biológico e não encontrou nenhuma proteína!

1926 (EUA) – J Summer cristaliza a urease e conclui: enzimas são proteínas! Willstater criticou os resultados…

James Batcheller Sumner1887-1955

SIM! Mas como funcionam?

Kunitz e Northrop Eletroforese e centrifugação: enzimas

estão na fração protéica! Mesmo em quantidades proteícas

indetectáveis pelos métodos, as enzimas continuavam tendo atividades

Como as milhares de reações catalíticas eram possíveis a uma proteína?

John Howard Northrop1891-1987

Finalmente, Sanger

1952 Publica a primeira estrutura primária

de uma proteína: a Insulina, com 51aminoácidos

O trabalho mostrava também que a estrutura das proteínas poderia serdescrita pela sua sequência de aminoácidos, do N ao C terminal

A sequência, entretanto, não ajudava a prever a função da proteína (antes da bioinformática)

Frederick Sanger13 August 1918

CONCLUSÃO: HISTÓRIA DA BIOQUÍMICA

As enzimas realizam reações catalíticas e transformam moléculas umas nas outras

Os organismos biológicos são ricos em enzimas e as enzimas funcionam também fora dos organismos biológicos → biotecnologia!

As enzimas são proteínas formadas por polímeros de aminoácidos

A multiplicidade de função se dá pela interação tridimensional formada (modelo chave-fechadura) por interações não-covalentes a partir de uma série de aminoácidos ligados covalentemente (ligação peptídica)

>gi|386828|gb|AAA59172.1| insulin [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

Toda enzima é proteína?!• Não!, há alguns RNAs que

funcionam enquanto enzimas também

• Componente químico adicional necessário para a função– Cofator: íons inorgânicos– Coenzima: moléculas orgânicas

complexas– Se liga muito firmemente: grupo

prostético

• Enzima completa: holoenzima– Parte protéica: apoenzima ou

apoproteína

Nomenclaturase das enzimases• Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do

substrato ou à atividade realizada– Urease – hidrolisa a uréia– DNA-polimerase – polimeriza DNA– Pepsina – pepsis vem do grego (digestão)

• Sistema de classificaçãoenzimático – EC number– Quatro números: 2.7.1.1

• 2: transferase• 7: fosfotransferase• 1: transfere P para grupo OH-

• 1: tem D-glicose com aceptor

Reação enzimática

• Reação se dá em fases: • Enzima aumenta a velocidade das reações• Os catalisadores aumentam a velocidade das

reações por que diminuem a energia de ativação

Equilíbrio químico• As enzimas realizam, muitas

vezes, as reações nos dois sentidos

• A concentração de substratos e produtos é o que define a velocidade das reações

• Poder catalítico das enzimas vem da energia livre liberada na formação de ligações fracas quando da interação enzima-substrato– Interações fracas entre ES são

otimizadas no estado de transição

Bastonase• Pauling (1946): Enzima deve ser complementar ao Estado de transição (ET), não ao substrato

• ET não é forma estável

• Interações fracas entre a enzima e o substrato propulsionam a catálise enzimática

• Necessidade de múltiplas interações fracas explica pq alguns prots são tão grandes

Estabiliza o substrato

Especificidade enzimática

• Deriva da formação de múltiplas interações fracas entre a enzima e a molécula do substrato específico

• Redução da entropia pela ligação– Dessolvatação do substrato– Ajuste induzido, proteína

tbm muda de conformação

Grupos catalíticos

• Catálise geral ácido-base– Transferência de prótons

• Catálise covalente– Formação de lig. covalente

transitória entre E e S• Ativação do substrato

• Catálise por íons metálicos– Estabilizam estados de transição– 1/3 das enzimas conhecidas usam íons

metálicos nas reações catalíticas

• Enzimas muitas vezes usam as três estratégias de catálise em conjunto -- quimiotripsina

Cinética enzimática• Experimentos de mutagênese sítio-

dirigida permite que os pesquisadores investiguem o papel de cada aminoácido na função protéica

• A concentração do substrato [S] influi na velocidade das reações catalisadas por enzimas

• Velocidade máxima é abstraída para concentrações excessivas de Substrato

• Constante de Michaelis– kM = [S] correspondente a ½ Vmax;

Reações com 2 ou mais substratos

• Enzimas podem formar os chamados complexos ternários ou realizar as reações uma-depois-da-outra

• Velocidade das reações químicas depende também da faixa de pH– Maior velocidade está

normalmente associada ao pH do ambiente onde a enzima atua

Inibição reversível

• Inibição competitiva– Inibidor compete pela ligação ao sítio

ativo

• A ligação do inibidor altera os parâmetros cinéticos, tornando a reação mais lenta

• Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente ou destroem grupos funcionais da enzima– Podem ser usados como drogas

Exemplos de reações enzimáticas

• Quimiotripsina• Lisozima

• Hexocinase• Enolase

• Beta-lactamases• Proteases do HIV

A quimiotripsina

• Catalisa a hidrólise de ligações peptídicas adjacentes a aminoácidos aromáticos (Trp, Phe, Tyr)

• Forma intermediário acil-enzima covalente

A hexocinase

• Sofre um ajuste induzido quando ligada ao substrato• Fosforila um resíduo de glicose

• Primeiro passo da via glicolítica• Adição de Xilose “engana” a enzima e faz com que

ela fosforile a água

A enolase• Realiza desidratação reversível

de 2-fosfoglicertato a fosfoenolpiruvato– Dímero com 436aa

• Catálise geral ácido base + estabilização do estado de transição– Interações estabilizam

intermediário (enolato)– Ligações de H com outros aa’s do

sítio ativo contribuem para o mecanismo geral

A lisozima• Agente antibacteriano

natural encontrado nas lágrimas e clara de ovo– Peptideoglicano da

parede de bactérias é seu substrato• Constituinte da parede

microbiana que protege da lise osmótica

– Enzima rompe ligação glicosídica

• Monômero com 129 aa’s• Mecanismo específico

de ação enzimática ainda é controverso

“mesmo uma infinidade de experimentos não pode provar que algo esteja certo, mas um único experimento pode provar que está errado”. Albert Einstein

Medicamentos• Muitos são inibidores de enzimas são

usados para tratar doenças; desde as dores de cabeça até a AIDS

• Penicilina (Alexander Fleming, 1928)– Peptideoglicano: polímero de açúcares

e D-aa’s da parede bacteriana– Penicilina interfere na síntese do

peptideo glicano ao mimetizar um segmento D-Ala-D-Ala

– Inibem reação de transpeptidase

Os Beta-lactâmicos• Penicilina: degradada no

ambiente do estômago• Penicilina V: estável em meio

ácido pode ser administrada em via oral

• Amoxilina: ampla faixa de ação; antibiótico β-lactâmico + prescrito

• O ataque da Ser à porção amida do anel leva a um produto acil-enzima que é praticamente irreversível– Transpeptidase inativa!– Bloqueia síntese da parede bacteriana

• Rompe-se devido à pressão osmótica

As Beta-lactamases

• Enzimas que quebram o anel beta-lactâmico das penicilinas

• Disseminaram-se em bactérias submetidas à pressão seletiva– O mau uso dos antibióticos

Guerra contra as bactérias

• Acido clavulânico: inativa irreversivelmente as Beta-lactamases

• Clavulin: amoxilina + ácido clavulânico

• Foram encontradas bactérias resistentes ao ácido clavulânico...

• Desenvolvimento e descoberta de novos antibióticos é uma indústria em crescimento

Os antivirais: (1) o que é um vírus?

• Anatomia molecular viral– Ácido nucléico envolto por uma capa protetora feita de

proteínas (capsídeo)– Uma única molécula de ácido nucléico de fita simples ou

dupla (fita positiva ou negativa)

• Genomas compactos– Contêm apenas as proteínas

necessárias à replicação viral– Genomas da ordem de Kb

Parasitismo intra-celular

• O vírus não tem metabolismo próprio– Não é um organismo de vida-livre– Parasita intra-celular obrigatório

• Forma de cristal• Sequestra a maquinaria molecular da célula– Mecanismo moleculares de

produção preferencial dos genes virais (fator sigma próprio e específico)

Variedades virais

• Vírus de DNA– Precisam chegar ao núcleo para serem primeiramente

transcritos em RNA

• Vírus de RNA– Podem atuar no citoplasma

• Vírus de RNA com transcrição reversa– Acontece a transcrição reversa do RNA

em DNA e o DNA é normalmente integrado ao genoma do hospedeiro

HIV

• SIDA: Síndrome da imunodeficiência humana– Pandemia– Matou 25 milhões de pessoas nos últimos 25 anos

• Retrovírus (lentivirus)– 2 cópias de um RNA fita simples (fita +)– Nove genes– Capsídeo é formado por cerca de 2000 proteínas p24

• 0,6% da população humana está infectada

AZT (azidotimidina)

• Mimetiza um nucleotídeo de timina– Azida no lugar de hidroxila

• Prejudica a ação da transcriptase reversa• Atrasa o desenvolvimento dos vírus, ainda que,

aos poucos o vírus se torne resistente

Transcriptase reversa mutante passa a não reconhecer mais o AZT

Outros tratamentos• Inibidores de protease

– Impedem a protease do HIV de clivar as proteínas produzindo componentes maduros

• Inibidores de integrase– Impedem o vírus de integrar seu DNA no genoma do hospedeiro

• Inibidores de fusão– Interferem nas proteínas gp120 e gp41 ou bloqueiam

receptores celulares de ligação ao HIV

• Coquetel anti-AIDS– dificulta a adaptação do vírus a várias frentes moleculares de

ataque, diminui comprovadamente o número de vírus no sangue

Proteases do HIV• O RNA do vírus é traduzido em grandes

proteínas– Essas proteínas precisam ser hidrolisadas em

proteínas individuais do capsídeo

• A protease do HIV é uma aspartil-protease– 2 resíduos de Asp facilitam ataque da água à

ligação peptídica

Inibidores de proteases• Drogas que formam complexos não-covalentes

com a protease do HIV– Ligam-se fortemente: praticamente irreversíveis

• Cadeia principal com grupo hidroxil próximo a grupo benzil– Grupo hidroxil mimetiza a água– Resto da estrutura encaixa nas fendas da

enzima

• Estrutura planejada para ser análoga ao estado de transição– Sucesso terapêutico– Aumentou longevidade e qualidade de vida dos

doentes

Enzimas regulatórias• Possui atividade catalítica aumentada

ou diminuída em resposta a certos sinais– Ajustes na velocidade da via

metabólica permite que as células se adaptem a condições em variação

• Tipos mais comuns– Enzimas alostéricas (ligações

reversíveis a compostos)– Modificações covalentes– Ativadas por remoção de segmentos

peptídicos (irreversível)

• Subunidade regulatória é normalmente diferente da subunidade catalítica

Enzimas alostéricas• Homotrópicas: o ativador é o próprio substrato

(hemoglobina)• Heterotrópicas: outro ativador

• Enzimas alostéricas– Mais de um sítio regulatório

• Cada um específico para um regulador• Aspartato-transcarbamoilase– 12 cadeias polipeptídicas– Azul: catalíticas– Vermelho/Amarelo: regulatórias

Enzimas alostéricas são reguladoras

• ... de vias bioquímicas• Normalmente são o primeiro passo da

via– “economiza” a execução das outras

reações– Único passo de regulação da via

• Inibição por retroalimentação: São inibidas pelo produto do último passo

• Inibição alostérica heterotrópica

Regulação por modificações covalentes

• 500 tipos diferentes Modificações pós-traducionais covalentes já foram descritos

• Proteínas inteiras podem ser adicionados como a ubiquitina e a sumo– Ubiquitinilação marca proteína para degradação– Sumoilação é encontrada em proteínas nucleares

• Mudanças substanciais afetam de forma significativa a função da enzima

• Fosforilação é a mudança mais comum– Podem haver vários sítios fosforiláveis

Proteínas cinases e fosfatases• Cinases: adicionam grupo fosforil

a resíduos de Ser, Thr ou Tyr– Básicas: fosforilam resíduos

de vizinhança básica– Preferências por resíduos

próximos a Pro

• Atómos de O2 do grupo fosforil podem fazer pontes de H com outras regiões da proteína– Reestabiliza a proteína

estruturalmente

• Atuam em cascatas de sinalização celular

Cinases sítio-específicas

• Fosforilações são sítio-específicas

• Cada enzima reconhece uma ordem de aminoácidos e fosforila resíduos de S, T ou Y

• Sítio de reconhecimento

• Sítio de fosforilação

Fosforilações múltiplas• São possíveis e

permitem controle requintado da regulação

• Glicogênio sintase– Catalisa a união de

glicoses para formar glicogênio

– Fosforila em vários sítios (ver figura)

Proteólise de precursores• Proteases não podem ser

produzidas em estado ativo– Do contrário destruiriam as

proteínas celulares...• Zimogênios são precursores

das proteínases– Só funcionam depois da

ativação por proteínas – Ativação irreversível

• Mecanismo de produção de pró-proteínas ou pró-enzimas

Conclusões

• A atividade das vias metabólicas é regulada pelo controle da atividade de certas enzimas

• O conhecimento do mecanismo de ação das enzimas permite desenvolver medicamentos que inibam essa ação

• A inibição de uma enzima pode ser reversível, competitiva

• Os principais mecanismos de catálise são: ácido-básica, covalente e por íons metálicos

• As enzimas são catalisadores eficazes, aumentando a velocidade de ocorrência de uma reação

• Aula baseadano livro do Lehninger(Nelson e Cox)

• Capítulo 6Enzimas