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Aminoácidos, peptídeos e proteínas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Características químicas dos aminoácidos
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Os aminoácidos
• Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L– A biologia é canhota
• Glicina nãotem isomeriaóptica
Carbono alfa
Grupo R apolar e alifáticos
• Aminoácidos apolares e hidrofóbicos• Ligações de Van der Waals• Ala, Val, Leu, Iso– Interações hidrofóbicas
• Gly; menor aminoácido• Met– Possui átomo de enxofre
• Pro– Iminoácido, menor flexibilidade estrutural
Grupo R aromáticos
• Aminoácidos hidrofóbicos• Tirosina pode formar pontes de hidrogênio
com a água• Modificações pós-
traducionais– Fosforilação do OH
da tirosina• Fenilalanina– Mais apolar
Grupos R polares, não carregados
• Solubilidade intermediária em água• Serina e treonina– Grupos hidroxil
• Asparagina e glutamina– Grupo amida
• Cisteína– Grupo sulfidril– Ligações dissulfeto
Grupos R carregados
• Aminoácidos básicos– Carga positiva– Lisina, segundo grupo amino– Arginina, grupo guanidina– Histidina, grupo aromático
imidazol
• Aminoácidos ácidos– Carga negativa– Possuem segundo grupo
ácido carboxílico
Aminoácidos incomuns
• Modificações pós-traducionais– 4-hidroxiprolina– 5-hidroxilisina– 6-N-metil-lisina– Gama-carboxiglutamato– Fosforilação de resíduos
• Selenocisteína– Selênio ao invés de enxofre na Cys– É adicionado durante a tradução por
mecanismo específico e regulado
pH e pKa
• Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas
• Ionização
• < pH; > [H]+
estado não-ionizado
Aminoácidos são ionizáveis
• Substâncias anfóteras: possuem natureza dual
• Podem funcionar assim como ácidos ou bases– Doam ou recebem
prótons
Titulação de um aminoácidos• pKa: tendência de um
grupo fornecer um próton ao meio
• Aminoácidos podem perder até 2 prótons para o meio
• Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas
Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos
• Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral
Peptídeos e proteínas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Polipeptídeo
>Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Peptídeos tbm são ionizáveis
• Ou seja, possuem curva de titulação característica
• Funcionam em faixas de pH ótimas
Número de resíduos por proteína
Uso de aminoácidos
• Varia bastante entre as proteínas
• Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula
Proteínas com outros grupos químicos
• Adicionados pós-traducionalmente
Trabalhando com proteínas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Proteínas podem ser separadas e purificadas
• Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas?– Basta selecionar por propriedade
• Tamanho, carga e propriedades de ligação
• Obter o extrato bruto– “correr” em cromatografia de coluna
• Fase estável (matriz)• Fase móvel (solução com tampão)
– Coluna maior permite maior resolução na separação
Cromatografia por troca iônica
• Polímero carregado negativamente– Proteínas positivas ligam ao
polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna
• Afinidade da proteína é definido também pelo pH
Cromatografia por exclusão de tamanho
• Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores
• Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro
Cromatografia de afinidade• Adiciona-se à matriz da
coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse
• Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz
• Elui-se com solução de ATP
Eletroforese -- Histórico• 1952, Markham and Smith
– Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico
• 1955, Smithies– Géis de amido funcionam bem para separar
proteínas do soro humano
• 1967, Loening – Géis de acrilamida com maior resolução e permitem
separar ainda moléculas grandes de DNA
• 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos
enormes• É hoje impossível imaginar um laboratório de
biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...
Vou ali correr um gelzinho e
já volto
Tenho que ir senão vou perder meu gel
Eletroforese• Movimento de partículas dispersas
num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme
• DNA, carga negativa– Tem tendência a se dirigir ao polo
positivo quando sujeito a um campo elétrico
• Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com
detergente (SDS)
• Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular
Eletroforese, etapas
1.Preparação do gel
2.Aplicação das amostras
3.Eletroforese
4.Coloração
5. Análise dos resultados
Preparação do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
Aplicação das amostras
Definição do mapa das amostras por canaleta
Corrida do gel• Aplicação do campo elétrico
• Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão
• Terminais positivo e negativo
• Tempo adequado, senão o DNA sai do gel
Coloração das moléculas
• Prata– Gel SDS-PAGE
• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
– Melhor resolução
• Coomassie blue, etc• Brometo de etídio– Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
– Composto fluorescente à luz UV– Gel de agarose
Eletroforese de um resultado de cromatografia
O marcador de peso molecular• Comprado de uma empresa
– Possui proteínas de peso molecular bem conhecido
• Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra
Geis bidimensionais
• Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois vira-se-o e corre-se em outra dimensão
• Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra– Maiores géis dão maiores
resolução
Proteínas não separadas podem ser quantificadas
• Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa
• Deve-se poder medir o produto da ação enzimática
• Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC
Estrutura primária das proteínas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Níveis estruturais das proteínas
As estruturas primárias das proteínas são conhecidas
• Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo
• As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas– E principalmente dentro da
mesma
Sequenciamento de peptídeos• Degradação de Edman– Marca e remove apenas o
resíduo N-terminal
• Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas
• Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina
Produção de peptídeos
• Purificação a partir de tecidos
• Engenharia genética
• Síntese química direta
Alinhamento de sequências
• Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas)– Derivam do ancestral
comum entre os organismos
• O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína
Evolução molecular
• Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente
Árvore molecular da vida
Conclusões
• Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas
• Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenasou milhares para formar peptídeos e proteínas
• As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente• As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e
afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese
• As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida)
• As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra