BCM13042Fundamentos de Análises de Proteínas

• Docentes– Célia R Carlini

– Charley C. Staats

– Diogo R Demartini

– Hugo Verli

• Súmula– Aminoácidos e peptídeos: estrutura; estereoquímica; propriedades físico-químicas; curva de

titulação; ponto isoelétrico; ligação peptídica

– Proteínas: arquitetura de proteínas; tipos de estrutura secundária; enovelamento; modificações pós-traducionais; mobilidade eletroforética; flexibilidade; catálise

– Métodos para determinação da estrutura de proteínas: RMN; cristalografia de raios-X; Dicroísmo circular

– Espectometria de massas: metodologias de ionização; metodologias de análise.

– Métodos para determinação da quantidade de proteínas: gravimétrico; absorbância; fluorescência; ninhidrina; biureto; lowry; azul de comassie; acido bicinchônico.

– Métodos de separação, purificação se sequenciamento de proteínas, peptídeos e aminoácidos: precipitação; salting in; salting out; eletroforese; cromatografia liquida, ultracentrifugação; química de Edman; métodos de separação de aminoácidos.

BCM13042Fundamentos de Análises de Proteínas

• 22/11 Aminoácidos e peptídeos: Charley

• 23/11 Estrutura e determinação da estrutura de proteínas: Hugo

• 24/11 Métodos de quantificação, análise e purificação de proteínas: Célia

• 25/11 Espectrometria de massas e proteômica

• 29/11 – 02/12 Seminários– 1 tópico por dia

– 5 grupos por tópico

• Tópico 1 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos1. Papéis Biológicos de D-Aminoácidos

2. Determinação de sequencia de aminoácidos/peptídeos (Edman, MS-MS, Dansylação)

3. Assinalamento de padrões (bioinformática)

4. Modificações pós-traducionais: tipos, funções e impactos em análises

5. Síntese de peptídeos para avaliação biológica

• Tópico 2 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos6. Eletroforeses (1D, 2D, nativa, zimogramas)

7. Cromatografia (troca iônica, hidrofóbica, fase reversa, afinidade)

8. Metodologias de quantificação de proteínas

9. Precipitação fracionada

10. Métodos Imunoquímicos

• Tópico 3 – Espectrometria de massas e proteômica11. MudPit / GELC – MS

12. Proteômica quantitativa comparativa

13. Metaloproteômica

14. Fosfoproteômica

15. Interatoma

• Tópico 4 – Determinação de estrutura16. RMN

17. Dicroísmo circular

18. Fluorometria

19. Cristalografia – Raios X

20. Determinação de motivos estruturais

BCM13042Fundamentos de Análises de Proteínas

Avaliação

•Apresentação de 1 item referente a cada tópico

•Respostas aos questionários aplicados pelos colegas

•Cada aluno deverá formular 1 questão sobre o item apresentado

•Os demais alunos deverão escolher 2 questões referentes a cada tópico para responder

•As questões devem ser embasadas em um artigo científico. Espera-se que a questão seja formulada a partir de um gráfico ou tabela presente no artigo científico.

•O autor da questão será responsável pela correção.

•Aulas serão disponibilizadas junto ao endereço

www.ufrgs.br/laprotox

Sorteio

Amino-Ácidos

Estrutura geral dosAminoácidos

Quantos aminoácidos existem em sistemas biológicos?

20 aminoácidos definidos por seu códon no mRNA

Grupo R 5 grupos distintos

2 aminoácidos não usuaisInserção depende de um elemento

cis no mRNA

Apolar - lipídicoApolar - lipídico

Polar - aquosoPolar - aquoso

Polar - aquosoPolar - aquoso

Selenocystein

Pyrrolysine

Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a context-Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a context-dependent UAG codon.dependent UAG codon.

Ibba M , Söll D Genes Dev. 2004;18:731-738Ibba M , Söll D Genes Dev. 2004;18:731-738

©2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press©2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press

Formação de pontes de enxofre

carbon is a carbon is a chiral centerchiral center

Two stereoisomers are called Two stereoisomers are called enantiomers.enantiomers.

The solid wedge-shaped bonds The solid wedge-shaped bonds project out of the plane of paper, project out of the plane of paper, the dashed bonds behind it.the dashed bonds behind it.

The horizontal bonds project out of The horizontal bonds project out of the plane of paper, the vertical the plane of paper, the vertical bonds behind.bonds behind.

Estereoisomeros

The Stereochemistry of Amino Acids

http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/gifs/amino_acids_chiral.gif

D-aminoácidos existem e são metabolizados

Serine-racemase

D-amino ácidos em proteínas?

Características físico-químicas dos aminoácidos

Absorbância na região UV de aminoácidos aromáticos

Changes in Changes in low density lipoprotein receptor low density lipoprotein receptor intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition.intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition.

Dirlam-Schatz K A , Attie A D J. Lipid Res. 1998;39:402-411Dirlam-Schatz K A , Attie A D J. Lipid Res. 1998;39:402-411

©1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology©1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Estudos conformacionais – Try fluorescence

Zwitterion = íon híbrido

Voet Biochemistry 3e© 2004 John Wiley & Sons, Inc.

Efeito sobre o pKa do ambiente químico

Protonated form Unprotonated form (conjugate base)

Henderson/Hasselbach equation and pKa

HA ↔ H+ + A-

Ka = [H+] [A-] / [HA]

[H+] = Ka [HA]/ [A-]

-log [H+] = -log (Ka [HA]/ [A-])

-log [H+] = -log Ka -log ([HA]/ [A-])

pH = p Ka - log ([HA]/ [A-])

Titulação de um

aminoácido

Curva de titulaçãoGlutamato

Curva de titulação> HistidinaCurva de titulação> Histidina

Anel indólicoAnel indólico

Peptídeos

Formação da ligação peptídica

Níveis estruturais das proteínas

Como se definem estruturas secundárias?

Ligação peptídica tem 50% de carácter de dupla ligação rígida e coplanarLigação peptídica tem 50% de carácter de dupla ligação rígida e coplanar

Ressonância eletrônicaRessonância eletrônica

Distâncias interatômicas na ligação peptídicas são Distâncias interatômicas na ligação peptídicas são menores que as de uma ligação amida comummenores que as de uma ligação amida comum

Cadeias Cadeias lateraislaterais

Ângulos de rotação da cadeia polipeptítica em torno de um carbono alfaÂngulos de rotação da cadeia polipeptítica em torno de um carbono alfa

AA BB CC DD

EE FFGráfico de RamachandranGráfico de Ramachandran

AA BB

CC DD

EE

FF

O que é um domínio protéico?

Procura de domínios conservados

Localização da proteína pode trazer informações sobre a sua função