Espectofotometria Prof. Alessandra Daur. PRINCÍPIOS DE INSTRUMENTAÇÃO ESPECTROFOTOMETRIA Muitas...

EspectofotometriaEspectofotometriaProf. Alessandra Daur

PRINCÍPIOS DE INSTRUMENTAÇÃO

ESPECTROFOTOMETRIA

Muitas determinações feitas no laboratório clínico são baseadas em medições da intensidade de energia radiante absorvida ou transmitida sob condições controladas.

O setor de bioquímica representa dentro da rotina do laboratório aproximadamente 50 – 60% do movimento em exames.

O equipamento usado para medir a energia absorvida ou emitida é o ESPECTROFOTÔMETRO.

O que é SOLUÇÃO PADRÃO?

- Solução elaborada (adquirida comercialmente) de forma a proporcionar uma concentração de analito exatamente conhecida para ser usada no ajuste (calibração) de um sistema analítico.

- Deve ser ajustada dentro da faixa de sensibilidade e linearidade da metodologia.

O que são PADRÕES / CALIBRADORES ?

• Soluções cujas concentrações de analitos são exatamente conhecidas, destinando-se a atuar no ajuste (calibração) de um sistema analítico.

- Monocalibradores (padrão primário): está presente em um único analito.

- Multicalibradores (calibrador liofilizado): estão presentes na mesma solução diversos analitos.

• Padrões: soluções aquosas (são dissolvidos em água, álcool ou outros solventes) contendo quantidade exatamente conhecida de um analito, destinando-se à calibração de um sistema analítico manual ou semi-automático.

- ex: Normalmente acompanham o kit.

• Calibradores: possuem matriz protéica (semelhante ao soro/plasma) por isso são recomendados para automação.

- ex: de matriz proteíca: Calibrador 1 (multicalibrador)

-Soluções com valores de analitos exatamente conhecidos, utlilizadas para verificação de exatidão e precisão de uma metodologia analítica. Podem ser usados para verificar a linearidade da metodologia.

-Ex: Controle Normal

Controle Patológico

O que são CONTROLES?

FOTOMETRIA-A fotometria é a metodologia analítica que utiliza-se da medição da quantidade de luz monocromática absorvida ou transmitida por uma solução aquosa, visando a determinação de um analito em uma determinada amostra.

A concentração das soluções é proporcional à quantidade de luz absorvida.

-Os equipamentos usados em fotometria são:

fotocolorímetro / espectrofotômetro.

- Luz : radiação eletromagnética. Na luz visível, cada cor corresponde a um comprimento de onda. * Ultra Violeta (invisível): abaixo de 400 nm * Violeta (visível): 350 – 430 nm azul amarelado * Azul (visível): 430 – 475 nm amarelo * Azul esverdeado (visível): 475 – 495nm laranja * Verde azulado (visível): 495 – 505 nm vermelho * Verde (visível): 505 – 555 nm púrpura * Amarelo esverdeado (visível): 555 – 575 nm violeta * Amarelo (visível): 575 – 600 nm azul * Laranja (visível): 600 – 650 nm azul esverdeado * Vermelho (visível): 650 – 700 nm verde azulado * Infravermelho (invisível): acima de 700 nm

OBS: para uma solução que absorve luz de uma determinada cor, a cor observada dessa solução será sua cor complementar.

Ex: Glicose (método oxidase) cor desenvolvida é rosa forte. Filtro usado = 505 nm.

TRANSMITÂNCIA

Quando um raio incide sobre uma solução colorida a intensidade de luz emergente (que sai = I1) é menor que a luz incidente (I0) =

parte da luz foi absorvida

T = I1 / I0

Se I0 for 100% a I1 pode ser medida como porcentagem de transmitância

%T = TX100

ABSORBÂNCIA

Mede-se a intensidade de luz absorvida por uma solução colorida pela redução da medida de intensidade de luz transmitida

A= quantidade de luz absorvida

T = fração da luz transmitida

A e T = inversamente proporcionais

A = -log %T/100

A = (log %T – log 100)

A = (log %T +2)

A = -log %T +2

A = 2 – log %T

*** A não é uma quantidade medida diretamente = calculada!!!

%T = Tx100

T = I1/I0

• LEI DE BEER – a intensidade de um feixe de luz que atravessa uma solução colorida, decresce exponencialmente à medida que a espessura da cubeta ou a concentração da solução aumenta arimeticamente.

It = Io . 10 – acd onde:

It = quantidade de luz transmitida

Io = quantidade de luz incidente

a = absortividade (própria de cada substância)

c = concentração (quanto mais molécula na solução, mais irá absorver)

d = espessura da cubeta

- Mantendo-se constante a espessura do meio que contém a solução em análise, a quantidade de luz monocromática absorvida ou transmitida por esta é proporcional à sua concentração. A= a.c.d

- Absorbância: quantidade de luz absorvida.

- Transmitância: quantidade de luz transmitida.

A

concentração

+ usado e + preciso

Linear = é diretamente proporcional

exponencial

Lei de BeerLei de Beer

A concentração de uma substancia é diretamente proporcional à quantidade de luz absorvida e inversamente proporcional ao logarítimico da luz transmitida

A = a x b x c

A = absorbância

a= absortividade (capacidade de absover)

b= percurso da luz em cm

c= concentração da substância em interesse

No laboratório = são lidas as absorbâncias da solução teste e da solução padrão (conhecida) e aplicada....

Lei de BeerLei de Beer

No laboratório = são lidas as absorbâncias da solução teste e da solução padrão (conhecida) e aplicada....

Concentração do padrão (Cp) = Concentração do teste (Ct)

Abosrvância do padrão (AP) abosrvância do teste (AT)

Concentração do teste = CpXAt

At

Aqui a espessura das cubetas é constante.

O teste e o padrão tem ser lidos em células iguais.

Luz incidente Io Meio de contenção

Luz transmitida It

QUANTO MAIOR A ESPESSURA DO MEIO DE

CONTENÇÃO, MENOR A QUANTIDADE DE LUZ

TRANSMITIDA E VICE-VERSA.

- Esta lei é uma relação da idéia matemática, que tem algumas limitações na prática, onde:

- A concentração do soluto deve estar dentro dos limites da linearidade, caso contrário = dilui-se a amostra.

Linear até uma determinada concentração

A

concentraçãosensibilidade

-Essencialmente, esta lei será seguida somente se a radiação incidente for monocromática, seleciona-se um comprimento de onda para leitura.

0.000

1 2 3 4

1. FONTE LUMINOSA (lâmpada de tungstênio, deutério/halogênio (U.V.) e mercúrio (raias de emissão espectral).

o filamento pode variar: lampada de tungstênio (menos na UV e mais em IV, barata duradoura) , deutério e halogênio (muito caro e tempode vida curtos, apenas para UV) ou mercúrio (não tem emissão contínua, vários raios espectrais, não tem emissão em todas as regiões)

5

0.000

1 2 3 4

2. MONOCROMADOR (filtro, prisma, grade de difração ou filtro de interferência.

Filtro – de vidro colorido (pouco utilizado – produz banda larga), filtros de interferência - feitos de prata semi transparente (quando a luz passa muda o comp de onda, produz picos muito específicos,

pois seleciona os comp de onda que se quer analisar, Grade de difração - feito de uma grade de vidro com estrias bem definidas

- pode-se associar filtros

5

0.000

1 2 3 4

3. Meio de contenção da amostra (CUBETA)Material: vidro (região do visível), vidro optico (UV), plástico (UV-

tem que ser descartavel) e quartzo (melhor)Forma: redondos ou quadrados (padrão)

4. FOTOCÉLULA (fotodetector) - a luz chega e tira um eletron, que chega ao fotmultiplicador que permite analisar baixas concentrações

5. REGISTRADOR (display) – digital ou analógico

5

• FUNCIONAMENTO:

- Os raios luminosos emitidos pela lâmpada tornam-se

monocromáticos e atravessam a cubeta, sendo

transformados pela fotocélula em sinais elétricos

registrados por display, ponteiro ou outro dispositivo,

em escala de transmitância ou absorbância.

Diferença de Equipamentos:

FOTOCOLORÍMETRO ESPECTROFOTÔMETRO- Trabalha com luzmonocromática emfaixas de comprimentode onda de luz visível. - Utilizam como monocromadoresos filtros.

- Trabalha com luz monocromática em comprimento de onda definido, permitindo leituras de absorbância mais exatas, do u.v. ao infra-vermelho.

- Utilizam prisma, grade de difração ou filtro de interferência.

REAÇÕES DE PONTO FINAL (luz visível)

- Reações em que forma-se (ou se consome) uma quantidade fixa de produtos após tempo determinado de reação. Ex: glicose, col, tri, prot, alb

• ANALITO + REAGENTES produtos corados

• Condições controladas: - Proporção amostra / reagentes

- Tempo e temperatura de reação.

• Cálculo:

[ANALITO] = Concentração padrão_________________Absorbância padrão

x Absorbância Teste

- Note que na fórmula existe uma constante que se repete em todos os cálculos, Concentração/Absorbância do padrão... chamada fator de calibração.

- Então multiplica-se o fator de calibração pela absorbância do teste e obtém-se a concentração do teste.

REAÇÕES CINÉTICAS (luz U.V.)Ex: TGO, TGP, FAL, GGT, CPK, LDH

-Existem casos em que a velocidade de consumo de substrato ou formação de produtos é constante e não linear.

- Não se aplica o conceito de reação de ponto final.

- Determina-se a variação (delta) média minuto a minuto obtendo-se a concentração do analito.

- Com reagentes bem formulados, controlados o comprimento de onda, cubeta, volume de amostras e de reagentes, pode-se estabelecer um FATOR CONSTANTE que dispensa o uso de calibradores.

- Fator cinético:

Fator = 1 x 1 x

Amostra + ReagentesVolume

Volumeamostra

• Variando-se qualquer componente, o fator é alterado automaticamente.

• O fator deve ser alterado quando:

- O aparelho apresentar variações significativas.

- Os resultados de controles se mostrarem incompatíveis.

- Haverem alterações de volume de reagentes ou amostras.

= A /c.d, onde é absortividde molar e d é caminho óticot . d

X 1000

INTERFERENTES:

• Reagentes expostos a luz direta, temperaturas altas, poeira, etc.

• Resíduos de detergentes.

• Vapores de ácidos ou álcalis (amônia).

QUALIDADE DA ÁGUA REAGENTE:

• Condutividade inferior a 0,5 µS/cm

• Lâmpada: acende a partir de 2 µS/cm

• A vida útil da coluna deionizadora varia de acordo com a quantidade de impurezas presentes na água da rede e de acordo com o tipo de equipamento (no caso de acordo com a vazão-capacidade de deionização).

• A troca portanto deve ocorrer dentro do intervalo

previsto anteriormente (em geral até 6-10 horas de uso

efetivo).

• As resinas com o passar do tempo acumulam

microrganismos que podem contaminar o reagentes

(por isso recomenda-se troca mensal mesmo que a

condutividade seja aceitável).