EspectofotometriaEspectofotometriaProf. Alessandra Daur

PRINCÍPIOS DE INSTRUMENTAÇÃO

ESPECTROFOTOMETRIA

Muitas determinações feitas no laboratório clínico são baseadas em medições da intensidade de energia radiante absorvida ou transmitida sob condições controladas.

O setor de bioquímica representa dentro da rotina do laboratório aproximadamente 50 – 60% do movimento em exames.

O equipamento usado para medir a energia absorvida ou emitida é o ESPECTROFOTÔMETRO.

O que é SOLUÇÃO PADRÃO?

- Solução elaborada (adquirida comercialmente) de forma a proporcionar uma concentração de analito exatamente conhecida para ser usada no ajuste (calibração) de um sistema analítico.

- Deve ser ajustada dentro da faixa de sensibilidade e linearidade da metodologia.

O que são PADRÕES / CALIBRADORES ?

• Soluções cujas concentrações de analitos são exatamente conhecidas, destinando-se a atuar no ajuste (calibração) de um sistema analítico.

- Monocalibradores (padrão primário): está presente em um único analito.

- Multicalibradores (calibrador liofilizado): estão presentes na mesma solução diversos analitos.

• Padrões: soluções aquosas (são dissolvidos em água, álcool ou outros solventes) contendo quantidade exatamente conhecida de um analito, destinando-se à calibração de um sistema analítico manual ou semi-automático.

- ex: Normalmente acompanham o kit.

• Calibradores: possuem matriz protéica (semelhante ao soro/plasma) por isso são recomendados para automação.

- ex: de matriz proteíca: Calibrador 1 (multicalibrador)

-Soluções com valores de analitos exatamente conhecidos, utlilizadas para verificação de exatidão e precisão de uma metodologia analítica. Podem ser usados para verificar a linearidade da metodologia.

-Ex: Controle Normal

Controle Patológico

O que são CONTROLES?

FOTOMETRIA-A fotometria é a metodologia analítica que utiliza-se da medição da quantidade de luz monocromática absorvida ou transmitida por uma solução aquosa, visando a determinação de um analito em uma determinada amostra.

A concentração das soluções é proporcional à quantidade de luz absorvida.

-Os equipamentos usados em fotometria são:

fotocolorímetro / espectrofotômetro.

- Luz : radiação eletromagnética. Na luz visível, cada cor corresponde a um comprimento de onda. * Ultra Violeta (invisível): abaixo de 400 nm * Violeta (visível): 350 – 430 nm azul amarelado * Azul (visível): 430 – 475 nm amarelo * Azul esverdeado (visível): 475 – 495nm laranja * Verde azulado (visível): 495 – 505 nm vermelho * Verde (visível): 505 – 555 nm púrpura * Amarelo esverdeado (visível): 555 – 575 nm violeta * Amarelo (visível): 575 – 600 nm azul * Laranja (visível): 600 – 650 nm azul esverdeado * Vermelho (visível): 650 – 700 nm verde azulado * Infravermelho (invisível): acima de 700 nm

OBS: para uma solução que absorve luz de uma determinada cor, a cor observada dessa solução será sua cor complementar.

Ex: Glicose (método oxidase) cor desenvolvida é rosa forte. Filtro usado = 505 nm.

TRANSMITÂNCIA

Quando um raio incide sobre uma solução colorida a intensidade de luz emergente (que sai = I1) é menor que a luz incidente (I0) =

parte da luz foi absorvida

T = I1 / I0

Se I0 for 100% a I1 pode ser medida como porcentagem de transmitância

%T = TX100

ABSORBÂNCIA

Mede-se a intensidade de luz absorvida por uma solução colorida pela redução da medida de intensidade de luz transmitida

A= quantidade de luz absorvida

T = fração da luz transmitida

A e T = inversamente proporcionais

A = -log %T/100

A = (log %T – log 100)

A = (log %T +2)

A = -log %T +2

A = 2 – log %T

*** A não é uma quantidade medida diretamente = calculada!!!

%T = Tx100

T = I1/I0

• LEI DE BEER – a intensidade de um feixe de luz que atravessa uma solução colorida, decresce exponencialmente à medida que a espessura da cubeta ou a concentração da solução aumenta arimeticamente.

It = Io . 10 – acd onde:

It = quantidade de luz transmitida

Io = quantidade de luz incidente

a = absortividade (própria de cada substância)

c = concentração (quanto mais molécula na solução, mais irá absorver)

d = espessura da cubeta

- Mantendo-se constante a espessura do meio que contém a solução em análise, a quantidade de luz monocromática absorvida ou transmitida por esta é proporcional à sua concentração. A= a.c.d

- Absorbância: quantidade de luz absorvida.

- Transmitância: quantidade de luz transmitida.

A

concentração

+ usado e + preciso

Linear = é diretamente proporcional

exponencial

Lei de BeerLei de Beer

A concentração de uma substancia é diretamente proporcional à quantidade de luz absorvida e inversamente proporcional ao logarítimico da luz transmitida

A = a x b x c

A = absorbância

a= absortividade (capacidade de absover)

b= percurso da luz em cm

c= concentração da substância em interesse

No laboratório = são lidas as absorbâncias da solução teste e da solução padrão (conhecida) e aplicada....

Lei de BeerLei de Beer

No laboratório = são lidas as absorbâncias da solução teste e da solução padrão (conhecida) e aplicada....

Concentração do padrão (Cp) = Concentração do teste (Ct)

Abosrvância do padrão (AP) abosrvância do teste (AT)

Concentração do teste = CpXAt

At

Aqui a espessura das cubetas é constante.

O teste e o padrão tem ser lidos em células iguais.

Luz incidente Io Meio de contenção

Luz transmitida It

QUANTO MAIOR A ESPESSURA DO MEIO DE

CONTENÇÃO, MENOR A QUANTIDADE DE LUZ

TRANSMITIDA E VICE-VERSA.

- Esta lei é uma relação da idéia matemática, que tem algumas limitações na prática, onde:

- A concentração do soluto deve estar dentro dos limites da linearidade, caso contrário = dilui-se a amostra.

Linear até uma determinada concentração

A

concentraçãosensibilidade

-Essencialmente, esta lei será seguida somente se a radiação incidente for monocromática, seleciona-se um comprimento de onda para leitura.

0.000

1 2 3 4

1. FONTE LUMINOSA (lâmpada de tungstênio, deutério/halogênio (U.V.) e mercúrio (raias de emissão espectral).

o filamento pode variar: lampada de tungstênio (menos na UV e mais em IV, barata duradoura) , deutério e halogênio (muito caro e tempode vida curtos, apenas para UV) ou mercúrio (não tem emissão contínua, vários raios espectrais, não tem emissão em todas as regiões)

5

0.000

1 2 3 4

2. MONOCROMADOR (filtro, prisma, grade de difração ou filtro de interferência.

Filtro – de vidro colorido (pouco utilizado – produz banda larga), filtros de interferência - feitos de prata semi transparente (quando a luz passa muda o comp de onda, produz picos muito específicos,

pois seleciona os comp de onda que se quer analisar, Grade de difração - feito de uma grade de vidro com estrias bem definidas

- pode-se associar filtros

5

0.000

1 2 3 4

3. Meio de contenção da amostra (CUBETA)Material: vidro (região do visível), vidro optico (UV), plástico (UV-

tem que ser descartavel) e quartzo (melhor)Forma: redondos ou quadrados (padrão)

4. FOTOCÉLULA (fotodetector) - a luz chega e tira um eletron, que chega ao fotmultiplicador que permite analisar baixas concentrações

5. REGISTRADOR (display) – digital ou analógico

5

• FUNCIONAMENTO:

- Os raios luminosos emitidos pela lâmpada tornam-se

monocromáticos e atravessam a cubeta, sendo

transformados pela fotocélula em sinais elétricos

registrados por display, ponteiro ou outro dispositivo,

em escala de transmitância ou absorbância.

Diferença de Equipamentos:

FOTOCOLORÍMETRO ESPECTROFOTÔMETRO- Trabalha com luzmonocromática emfaixas de comprimentode onda de luz visível. - Utilizam como monocromadoresos filtros.

- Trabalha com luz monocromática em comprimento de onda definido, permitindo leituras de absorbância mais exatas, do u.v. ao infra-vermelho.

- Utilizam prisma, grade de difração ou filtro de interferência.

REAÇÕES DE PONTO FINAL (luz visível)

- Reações em que forma-se (ou se consome) uma quantidade fixa de produtos após tempo determinado de reação. Ex: glicose, col, tri, prot, alb

• ANALITO + REAGENTES produtos corados

• Condições controladas: - Proporção amostra / reagentes

- Tempo e temperatura de reação.

• Cálculo:

[ANALITO] = Concentração padrão_________________Absorbância padrão

x Absorbância Teste

- Note que na fórmula existe uma constante que se repete em todos os cálculos, Concentração/Absorbância do padrão... chamada fator de calibração.

- Então multiplica-se o fator de calibração pela absorbância do teste e obtém-se a concentração do teste.

REAÇÕES CINÉTICAS (luz U.V.)Ex: TGO, TGP, FAL, GGT, CPK, LDH

-Existem casos em que a velocidade de consumo de substrato ou formação de produtos é constante e não linear.

- Não se aplica o conceito de reação de ponto final.

- Determina-se a variação (delta) média minuto a minuto obtendo-se a concentração do analito.

- Com reagentes bem formulados, controlados o comprimento de onda, cubeta, volume de amostras e de reagentes, pode-se estabelecer um FATOR CONSTANTE que dispensa o uso de calibradores.

- Fator cinético:

Fator = 1 x 1 x

Amostra + ReagentesVolume

Volumeamostra

• Variando-se qualquer componente, o fator é alterado automaticamente.

• O fator deve ser alterado quando:

- O aparelho apresentar variações significativas.

- Os resultados de controles se mostrarem incompatíveis.

- Haverem alterações de volume de reagentes ou amostras.

= A /c.d, onde é absortividde molar e d é caminho óticot . d

X 1000

INTERFERENTES:

• Reagentes expostos a luz direta, temperaturas altas, poeira, etc.

• Resíduos de detergentes.

• Vapores de ácidos ou álcalis (amônia).

QUALIDADE DA ÁGUA REAGENTE:

• Condutividade inferior a 0,5 µS/cm

• Lâmpada: acende a partir de 2 µS/cm

• A vida útil da coluna deionizadora varia de acordo com a quantidade de impurezas presentes na água da rede e de acordo com o tipo de equipamento (no caso de acordo com a vazão-capacidade de deionização).

• A troca portanto deve ocorrer dentro do intervalo

previsto anteriormente (em geral até 6-10 horas de uso

efetivo).

• As resinas com o passar do tempo acumulam

microrganismos que podem contaminar o reagentes

(por isso recomenda-se troca mensal mesmo que a

condutividade seja aceitável).