Mtodo que utiliza a intensidade da cor para determinar a concentrao de um analitoMtodo colorimtricoA concentrao determinada pela quantidade de luz absorvida

Mtodos colorimtricosReaes colorimtricas: so aquelas em que os produtos finais tm uma cor e as intensidades das cores so medidas na faixa visvel do espectro (380nm - 680nm)

Sensao fisiolgica associada a um comprimento de onda

A luz se propaga em ondas cujo comprimento define a cor da luz, variando de 400nm a 700 nm a regio do espectro visvelNossos olhos so capazes de distinguir as diferentes ondas de comprimento da luz visvel como cores diferentes.. A onda mais longa que conseguimos ver o vermelho, as mais curtas so azul e violeta.

O prisma reflete os comprimentos de onda em diferentes quantidades, e as dispersa em um espectro que pode ser visto. A refrao maior na luz vermelha e menor na violeta.

As diferentes cores que formam a luz branca podem ser vistas quando um raio de luz refratado por um prisma.

As substncias emitem cores diferentes daquelas que elas absorvemAs cores absorvidas e refletidas so ditas complementares

Se uma soluo absorve energia luminosa de comprimentos de onda situados entre 400nm e 480nm (azul) ela aparece com cor amarela ao olho humano. Portanto o amarelo a cor complementar do azul

Tabela Cores e cores complementares na zona visvel do espectroComp. de Onda (nm) Cor Absorvida Cor Complementar (ou observada) 650 - 780 Vermelho Azul esverdeada595 - 650 Laranja Verde azulado 560 - 595 Amarelo-verde Roxo 500 - 560 Verde Roxo-vermelho490 - 500 Verde azulado Vermelho 480 - 490 Azul esverdeado Laranja 435 - 480 Azul Amarelo 380 - 435 Violeta Amarelo-verde

A maioria das anlises bioqumicas realizadas no laboratrio clnico baseia-se no princpio da quantidade de luz absorvida ou refletida

Espectrofotometria Metodologia que utiliza a luz (radiao eletromagntica) para medir a concentrao qumica de um analito.

EspectrofotometriaCapacidade de uma substncia ou produto derivado de uma reao bioqumica absorver ou emitir luz, em um determinado comprimento de onda, sob condies fsico-qumicas estabelecidas

Leis de Lambert e BeerLei de Lambert:Quando a concentrao de um analito constante, a absoro depende do comprimento do caminho pticoLei de Beer:Quando o caminho ptico constante e igual a 1, a concentrao do analito diretamente proporcional quantidade de luz absorvida

A absoro da luz tanto maior quanto mais concentrada for a soluo por ela atravessada: A soluo 20g/l absorve o dobro da soluo 10g/l.

A absorbncia diretamente proporcional concentrao do composto na soluo

O dispositivo utilizado para quantificar a energia de luz absorvida ou transmitida o ESPECTROFOTMETRO

O ESPECTROFOTMETRO um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromtica atravs de uma soluo, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa soluo. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-ris com a separao das cores da luz branca).

Mas que luz monocromtica esta?A cor da luz absorvida complementar cor observada

Ento Temos que escolher o comprimento de onda da cor complementar cor observada no produto corado

Escolha do Comprimento de ondaUma soluo VERMELHA absorve o VERDE com maior intensidade e portanto deve-se escolher o comprimento de onda correspondente ao verde para medida da soluo vermelhaDeve-se utilizar uma faixa no espectro na qual a E0 radiante seja absorvida ao mximo

Tabela Cores e cores complementares na zona visvel do espectroComp. de Onda (nm) Cor Absorvida Cor Complementar (ou observada) 650 - 780 Vermelho Azul esverdeada595 - 650 Laranja Verde azulado 560 - 595 Amarelo-verde Roxo 500 - 560 Verde Roxo-vermelho490 - 500 Verde azulado Vermelho 480 - 490 Azul esverdeado Laranja 435 - 480 Azul Amarelo 380 - 435 Violeta Amarelo-verde

Espectrofotmetro - ComponentesSelecionador de comprimento de ondaCubeta para conter a soluo a ser analisadaLuz emitente ou fonte luminosaReceptor ou sistema fotomtrico

Esquema dos principais componentes de um espectrofotmetroA amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de vidro por ter uma melhor disperso.Os detectores devem ser altamente sensveis.Fonte de luzMonocromadorCompartimento para amostraDetector e dispositivo para leitura

Esquema dos principais componentes de um espectrofotmetro

Correspondem ao resultado da atuao de um ou mais reagentes sobre o analito para formar o produto corado. Determinao da concentrao de um analitoReaes colorimtricas:

Exemplo: Dosagem de glicoseGLICOSE (soro) + Reagente de cor (KIT): tampo fosfato contendo p-Hidroxibenzoato, 4-Aminoantipirina (4-AAP), Glicose Oxidase e Peroxidase.

Processam-se as seguintes reaes:

Glicose + O2 + H2O GOD cido Glucnico + H2O2

2H2O2 + 4AAP POD 4-Antipirilquinonimina + 4 H2OProduto formado de colorao avermelhada

Mas Como a intensidade da cor vai me dar a concentrao da substncia analisada?

Determinao da concentrao de um analitoA determinao feita partir da comparao da cor obtida no teste com uma SOLUO PADRO (da mesma substncia) de concentrao conhecidaPadro de glicoseConc: 100mg/dl

TesteConc glicose: ?

Determinao da concentrao de um analitoCaractersticas da soluo padroTer estabilidadePoder ser dissolvida em gua e dessecadaComposio definidaGrau de pureza de 99% ou maisPadro ou calibrador: substncia de valor conhecido

Tabela 2 Cores e cores complementares na zona visvel do espectroComp. de Onda (nm) Cor Absorvida Cor Complementar (ou observada) 650 - 780 Vermelho Azul esverdeada595 - 650 Laranja Verde azulado 560 - 595 Amarelo-verde Roxo 500 - 560 Verde Roxo-vermelho490 - 500 Verde azulado Vermelho 480 - 490 Azul esverdeado Laranja 435 - 480 Azul Amarelo 380 - 435 Violeta Amarelo-verde

A cor avermelhada (do produto formado) medida no espectrofotmetro com absoro mxima no comprimento em 510nm

Determinao da concentrao de um analitoNo espectrofotmetro eu obtenho a absorbncia da soluo padro e do teste.

Abs Pa ---------------Concentrao do PaAbs Teste ------------Concentrao do Teste

Conc Teste = Abs Teste x Conc Pa Abs Pa

Determinao da concentrao de um analitoClculo do FATOR DE CALIBRAO (FC)FC = concentrao Paabsorbncia do PaConc Teste = Abs Teste x Conc Pa Abs Pa

Funo do Fator de CalibraoObtendo-se o fator de calibrao, multiplica-se seu valor pelas leituras de absorbncias lidas pelo espectrofotmetro de cada amostra, chegando-se na medida em unidades ( mg/dL, g/L) do analito em questo.

EXEMPLODOSAGEM DE GLICOSE EM PLASMA SANGUNEOPADRO: 100mg/dlAbsorbncia do padro: 0,210FATOR DE CALIBRAO: 100/0,210 = 833ABSORBNCIA (ABS) DA AMOSTRA = 0,095CONC. DA GLICOSE NA AMOSTRA = 0,095 x 833= 79mg/dl

Dosagem de glicose Passo a passo

Material necessrioEspectrofotmetroPipetasTubos de vidroSuporteKit de glicose

Metodologia

Identificao dos tubosBranco: usado para zerar o espectrofotmetro - normalmente gua destilada ou o reagente puro (quando este tem cor)Padro ou calibrador: substncia de valor conhecido e estvelAmostra teste: soro ou plasma do seu paciente

LeituraA densidade tica (DO) ou absorbncia do padro da glicose cuja concentrao 100 mg/dL foi: 0,347

Esta leitura ser usada para extrair o clculo do fator de calibrao;

LeituraA densidade tica(DO) ou absorbncia do teste de concentrao desconhecida foi: 0,341

Esta leitura ser usada para calcular a concentrao da amostra teste a partir da multiplicao pelo fator de calibrao;

Clculo

Fator de calibrao= 100 mg/dl Abs do padroFator = 100 mg/dl 0,347Fator = 288

ClculoConcentrao do teste: 288 x 0,341= 98,2

Porm como o valor de referncia da glicose : VR: 70 a 99 mg/dl

A concentrao do teste ser: 98 mg/dl

AutomaoMltiplos testes;Pipetagem automticaRapidezPrecisoExatidoControle de qualidade

Colorimetria/EspectrofotometriaUtilizao nas dosagens bioqumicas: Ex: glicose, uria, creatinina, colesterol, triglicrides, enzimas, ferro srico, etc

Hematologia: dosagem de hemoglobina

Sorologia: leitura final do mtodo de ELISA

VantagensRapidez e facilidade das medidasAdequadas sensibilidade e especificidadeAparelhos de baixo custoBoa adaptao para automao, com exe-cuo em larga escala.

CAUSAS DE VARIAES DOS RESULTADOS DOS EXAMES LABORATORIAISInterferentes:

Todo e qualquer fator que provoque ou favoreaa ocorrncia de alterao no resultado de umexame qualquer (drogas, alimentos, exerccio,etc).

Ao dos Interferentes

Surgem alteraes metablicas cujo resultado um aumento do analito doseado, podendo causar consequentemente dvidas em sua interpretao

Estresse Glicose;Dieta rica em protenas UriaExerccio: TriglicridesFISIOLGICA

QumicaAlguns interferentes podem atuar sobre o reativo, provocando uma alterao na reao de doseamento que aumente ou diminua a leitura espectrofotomtrica, conduzindo a um resultado errneo.

Ingesto de cido ascrbico: Glicose (GOD).Ingesto etanol: triglicrides, colesterolAo dos Interferentes

Ao dos Interferentes

FsicaMuitas vezes a turvao de um soro lipmico pode induzir a leituras espectrofotomtricas elevadas e por conseguinte, resultados elevados.Pode-se contornar o problema usando-se um branco da amostra.

Classificao dos interferentes

FASE PR-ANALTICAFASE ANALTICAFASE PS-ANALTICAPacienteColeta da amostraSeparaoArmazenamentoProcessamento da amostraLeitura espectrofotomtricaClculosEmisso de resultadosAvaliao de resultadosElaborao do laudoEntrega do laudo ao paciente

Fase pr-analticaInterferentes relacionados com o paciente: GravidezAtividade fsicaPosturaDietaIdadeUso de drogas (teraputicas ou de abuso)Infuso de frmacosLipemia e jejum

Fase pr-analticaInterferentes relacionados com a coleta da amostraAplicao de torniqueteAnticoagulantesHemliseSeparao e preparo da amostra (trocas, plasma em contato com hemcias, exposio direta da luz, etc)

Coleta de sangue

A diferena entre soro e plasma que o primeiro no contm fibrinognio, o qual foi utilizado para a formao do cogulo (fibrina).

Anticoagulantes

Substncias que impedem a coagulao do sangue in vitro

Anticoagulantes:

EDTA (sequestra o Ca) Heparina ( atua impedindo a ao da trombina) Oxalatos (removem o Ca) Citratos (captao de Ca) Fluoreto (inibidor enzimtico, impedem a gliclise)

Tubos adequados

Tubos vcuoPadronizao da cor da tampaVermelha nenhum anticoagulantePrpura clara EDTA-K3Verde heparinaAzul citrato de sdioCinza fluoreto de NaAmarela Sem anticoagulante com gel

ConsideraesO exame de laboratrio, apesar das similaridades, no pode ser considerado como um processo fabrilCada material, cada amostra e cada teste tm particularidades que exigem cuidado, ateno e conhecimento especficos

Cada diagnstico uma vida... Obrigada

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