ISMAIL TEODORO DE SOUZA JÚNIOR ENG. AGRÔNOMO

Utilização de cartões FTA na extração e purificação de DNA para detecção molecular de Xanthomonas oryzae pv. oryzae e X. oryzae pv. oryzicola

ISMAIL TEODORO DE SOUZA JÚNIORENG. AGRÔNOMO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SULPROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA

FIT 00035 – FITOBACTGERIOLOGIA

PROJETO DE PESQUISA

Sumário

Introdução

Objetivo

Material e métodos

Hipóteses

Cronograma

Orçamento

Equipe

Ismail Teodoro (UFRGS)

Valmir Duarte (UFRGS)

Dana Cruz (Agronômica)

Yiuliet Franco (U. Havana)

Daniela (UFRGS)

3

Introdução

Importância da cultura de arroz

4

Introdução

8%

10%

10%

2%1%

9%60%

Norte

Nordeste

Centro-Oeste

Sudeste

Paraná

Santa Catarina

Rio Grande do Sul

Produção Nacional

Conab, 201012 milhões de toneladas

5

Introdução

Alta produtividade;

Sementes de variedades híbridas;

Importação de sementes;

Controle da qualidade fitossanitária;

Política de quarentena – Arroz (27 pragas).

6

Introdução Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( 20-30% -50%);

X. oryzae pv. oryzicola (20 a 32 %);

Comprometimento da produção;

Detectadas em sementes importadas (Uruguai, EUA,China,

Índia);

Adoção de métodos precisos de detecção.

7

Introdução Detecção

Ensaios biológicos , bioquímicos, sorológicos e moleculares;

Moleculares – oligonucleotídeos iniciadores;

A coleta de amostras e a purificação de DNA são passos,

importantes para uma análise genética e diagnóstica.

Ácidos nucléicos (DNA ou RNA) com impurezas e de baixa

qualidade podem comprometer o diagnóstico, onde

amostras e fontes valiosas podem ser perdidas.

8

Introdução

9

Os cartões FTA (Flinders Technology Associates)

Rápida coleta, purificação e análise do material genético de uma ampla

gama de materiais biológicos ;

Fixa e armazena os ácidos nucléicos diretamente dos tecidos frescos

pressionados ou homogeneizados em tampão;

Mistura de reagentes, contendo tampões fortes, agentes desnaturantes

de proteínas e quelantes de radicais livres.

Lisam as membranas celulares, envolvem o DNA , estabilizam e protegem

o DNA de nucleases, oxidação e danos causados pela luz UV, e degradação

fúngica e microbiana;

Introdução Aumenta a sensibilidade de detecção

comparada a métodos de extração

convencionais do DNA, além de propiciar

a coleta de um grande número de

amostras

9

Coleta, extração de DNA

Introdução

Bio PCR PCR - FTA

Trituração/ lavagem das sementes Trituração/ lavagem da sementes

Isolamento em meio de cultura (1dia)

FTA (50 min)Reisolamento de colônias amarelas (1 dia )

Extração de DNA ( horas – 1 dia)

PCR PCR

11

Objetivo

Padronizar e validar um método de coleta e

extração de DNA para detecção de Xanthomonas

oryzae pv. oryzae e X. oryzae pv. oryzicola a partir

de sementes de arroz.

13

Material e métodos

14

Estirpes bacterianas Estirpes bacterianas de referência

Isolado Origem

Xanthomonas oryzae pv. oryzae Índia

Xanthomonas oryzae pv. oryza China

Xanthomonas oryzae pv. orizicola Índia

Xanthomonas oryzae pv. orizicola China

15

Extração de DNA das estirpes de referência pelo método do cartão FTA

ArmazenamentoSecagem- 24 hs

100 μL (10-1 a 10-8 )Crescimento

16

Placa - UFC

Disco

Padronização e validação do método de coleta, transferênciade amostras de sementes e extração de DNA com o uso de

cartões FTA

Trituração

Lavagem

ArmazenamentoSecagem- 24 hs

17

Purificação do DNA dos cartões FTA

18

SDS 0,5% Solução TE - 1

Solução alcalina (0,1 N NaOH; 0,3 mM EDTA, pH 13.0)

Solução neutra (0,1 M Tris–HCl, pH 7.0).

Oligonucleotídeos iniciadoresOligonucleotídeos iniciadores Sequência

Xanthomonas oryzae

Xo3756F CATCGTTAGGACTGCCAGAAG

Xo3756R GTGAGAACCACCGCCATCT

X. oryzae pv. oryzae

Xoo80F GCCGCTAGGAATGAGCAAT

Xoo80R GCGTCCTCGTCTAAGCGATA

X. oryzae pv. oryzicola

Xoc3866F ATCTCCCAGCATGTTGATCG

Xoc3866R GCGTTCAATCTCCTCCATGT

Xoc3864F GCGTTCAATCTCCTCCATGT

Xoc3864R GGGATGGATGAATACGGATG

19

Condição da PCR

0,5 μl de 10 mM de DNTPs 2,5 μl de 10 X de tampão 2,0 μl de 25 mM de MgCl2 0,02 unidades de Taq polimerase 0,5 μl de 10 μM de cada primer num total de 25 μl

94 ºC/3min, (94 ºC/30s, 64 ºC/30 s e 72 ºC/ 90 s) x34 , 72 ºC /7 min

Gel de agarose a 2% - 60V/90min

20

Hipóteses

As bactérias são detectadas por PCR nas

menores concentrações;

O método do cartão FTA constitui de uma

ferramenta para certificação de sementes e

inspeção quarentenária;

12

Orçamento

22

Material permanente existente

Quantidade Especificação Valor R$

01 Computador e impressora 3.000,00

01 Câmara de fluxo laminar 12.000,00

01 Forno de microndas 520,00

01 Aparelho termociclador 8.100,0001 Geladeira 1.200,00

01 Autoclave 9.000,00

01 Câmara fotográfica 1.000,00

01 Transiluminador UV 1.600,00

01 Balança de precisão 1.900,00

01 Microcentrífuga refrigerada 15000 rpm 4.800,00

01 Máquina de gelo 4.000,00

Total de material existente 39.720,00

Material permanente solicitado

Quantidade Especificação Valor R$

01 Cuba horizontal para eletroforese 280,00

04 Micropipetas de volume variável 2.300,00

Total de material permanente 2.580,00

Orçamento

22

Material de consumo solicitado

Quantidade Especificação Valor R$1000 Placas de Petri plástica 300,002000 Ponteiras azuis 120,002000 Ponteiras amarelas 100,002000 Microtubos 0,5 ml 240,002000 Microtubos 1,5 ml 160,00

20 Suportes para microtubos 540,001000 Luvas descartáveis 60,00

01 Agarose frasco 500 g 900,00Primers 2.000,00Taq-Polimerase 1.300,00Reagentes para PCR 4.800,00Material de escritório 1.000,00

Sub-total material de consumo 11.520,00

TotaL do projeto Valor R$

Material permanente existente 39.720,00

Material permanente solicitado 2.520,00

Material de consumo solicitado 11.520,00

Imprevistos (10% sobre material consumo e manutenção) 1.500,00

SUB-TOTAL CONTRA-PARTIDA 39.720,00

SUB-TOTAL DA SOLICITAÇÃO 14.540,00

TOTAL GERAL 55.260,00

Cronograma2010

A S O N D

Obtenção de isolados de coleções

Aquisição de material

Avaliação do FTA com estirpes de referência

PCR

Análise dos resultados

Confecção do artigo

23

Referências bibliográficas Lang, J. M., Hamilton, J. P., Diaz, M. G. Q., Van Sluys, M. A., Burgos, M. R. G., Vera Cruz, C.M., Buell, C. R., Tisserat, N. A., and Leach, J. E. 2010. Genomics-based diagnostic marker development for Xanthomonas oryzae pv. oryzae and X. oryzae pv. oryzicola. Plant Dis. 94:311-319.

Whatman. FTA protocols: collect, transport, archive and access nucleic acids-all at room temperature; WB120047. Disponível em: <www.whatman.com>. Acesso em: 15 jun. 2010.

24

David O. Niño-Liu; Pamela C. Ronald; Adam J. Bogdanove. Xanthomonas oryzae pathovars: model pathogens of a model crop. Molecular Plant Pathology, (2006) 7 ( 5 ) , p.303–324.

European and Mediterranean Plant Protection Organization. Xanthomonas oryzae. 2007 OEPP/EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 37, 543–553

OBRIGADOismail.teodoro@ufrgs.br