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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA FIT 00035 – FITOBACTGERIOLOGIA. PROJETO DE PESQUISA. Utilização de cartões FTA na extração e purificação de DNA para detecção molecular de Xanthomonas oryzae pv. oryzae e X. oryzae pv. oryzicola. - PowerPoint PPT Presentation
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Utilização de cartões FTA na extração e purificação de DNA para detecção molecular de Xanthomonas oryzae pv. oryzae e X. oryzae pv. oryzicola
ISMAIL TEODORO DE SOUZA JÚNIORENG. AGRÔNOMO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SULPROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
FIT 00035 – FITOBACTGERIOLOGIA
PROJETO DE PESQUISA
Sumário
Introdução
Objetivo
Material e métodos
Hipóteses
Cronograma
Orçamento
Equipe
Ismail Teodoro (UFRGS)
Valmir Duarte (UFRGS)
Dana Cruz (Agronômica)
Yiuliet Franco (U. Havana)
Daniela (UFRGS)
3
Introdução
Importância da cultura de arroz
4
Introdução
8%
10%
10%
2%1%
9%60%
Norte
Nordeste
Centro-Oeste
Sudeste
Paraná
Santa Catarina
Rio Grande do Sul
Produção Nacional
Conab, 201012 milhões de toneladas
5
Introdução
Alta produtividade;
Sementes de variedades híbridas;
Importação de sementes;
Controle da qualidade fitossanitária;
Política de quarentena – Arroz (27 pragas).
6
Introdução Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( 20-30% -50%);
X. oryzae pv. oryzicola (20 a 32 %);
Comprometimento da produção;
Detectadas em sementes importadas (Uruguai, EUA,China,
Índia);
Adoção de métodos precisos de detecção.
7
Introdução Detecção
Ensaios biológicos , bioquímicos, sorológicos e moleculares;
Moleculares – oligonucleotídeos iniciadores;
A coleta de amostras e a purificação de DNA são passos,
importantes para uma análise genética e diagnóstica.
Ácidos nucléicos (DNA ou RNA) com impurezas e de baixa
qualidade podem comprometer o diagnóstico, onde
amostras e fontes valiosas podem ser perdidas.
8
Introdução
9
Os cartões FTA (Flinders Technology Associates)
Rápida coleta, purificação e análise do material genético de uma ampla
gama de materiais biológicos ;
Fixa e armazena os ácidos nucléicos diretamente dos tecidos frescos
pressionados ou homogeneizados em tampão;
Mistura de reagentes, contendo tampões fortes, agentes desnaturantes
de proteínas e quelantes de radicais livres.
Lisam as membranas celulares, envolvem o DNA , estabilizam e protegem
o DNA de nucleases, oxidação e danos causados pela luz UV, e degradação
fúngica e microbiana;
Introdução Aumenta a sensibilidade de detecção
comparada a métodos de extração
convencionais do DNA, além de propiciar
a coleta de um grande número de
amostras
9
Coleta, extração de DNA
Introdução
Bio PCR PCR - FTA
Trituração/ lavagem das sementes Trituração/ lavagem da sementes
Isolamento em meio de cultura (1dia)
FTA (50 min)Reisolamento de colônias amarelas (1 dia )
Extração de DNA ( horas – 1 dia)
PCR PCR
11
Objetivo
Padronizar e validar um método de coleta e
extração de DNA para detecção de Xanthomonas
oryzae pv. oryzae e X. oryzae pv. oryzicola a partir
de sementes de arroz.
13
Material e métodos
14
Estirpes bacterianas Estirpes bacterianas de referência
Isolado Origem
Xanthomonas oryzae pv. oryzae Índia
Xanthomonas oryzae pv. oryza China
Xanthomonas oryzae pv. orizicola Índia
Xanthomonas oryzae pv. orizicola China
15
Extração de DNA das estirpes de referência pelo método do cartão FTA
ArmazenamentoSecagem- 24 hs
100 μL (10-1 a 10-8 )Crescimento
16
Placa - UFC
Disco
Padronização e validação do método de coleta, transferênciade amostras de sementes e extração de DNA com o uso de
cartões FTA
Trituração
Lavagem
ArmazenamentoSecagem- 24 hs
17
Purificação do DNA dos cartões FTA
18
SDS 0,5% Solução TE - 1
Solução alcalina (0,1 N NaOH; 0,3 mM EDTA, pH 13.0)
Solução neutra (0,1 M Tris–HCl, pH 7.0).
Oligonucleotídeos iniciadoresOligonucleotídeos iniciadores Sequência
Xanthomonas oryzae
Xo3756F CATCGTTAGGACTGCCAGAAG
Xo3756R GTGAGAACCACCGCCATCT
X. oryzae pv. oryzae
Xoo80F GCCGCTAGGAATGAGCAAT
Xoo80R GCGTCCTCGTCTAAGCGATA
X. oryzae pv. oryzicola
Xoc3866F ATCTCCCAGCATGTTGATCG
Xoc3866R GCGTTCAATCTCCTCCATGT
Xoc3864F GCGTTCAATCTCCTCCATGT
Xoc3864R GGGATGGATGAATACGGATG
19
Condição da PCR
0,5 μl de 10 mM de DNTPs 2,5 μl de 10 X de tampão 2,0 μl de 25 mM de MgCl2 0,02 unidades de Taq polimerase 0,5 μl de 10 μM de cada primer num total de 25 μl
94 ºC/3min, (94 ºC/30s, 64 ºC/30 s e 72 ºC/ 90 s) x34 , 72 ºC /7 min
Gel de agarose a 2% - 60V/90min
20
Hipóteses
As bactérias são detectadas por PCR nas
menores concentrações;
O método do cartão FTA constitui de uma
ferramenta para certificação de sementes e
inspeção quarentenária;
12
Orçamento
22
Material permanente existente
Quantidade Especificação Valor R$
01 Computador e impressora 3.000,00
01 Câmara de fluxo laminar 12.000,00
01 Forno de microndas 520,00
01 Aparelho termociclador 8.100,0001 Geladeira 1.200,00
01 Autoclave 9.000,00
01 Câmara fotográfica 1.000,00
01 Transiluminador UV 1.600,00
01 Balança de precisão 1.900,00
01 Microcentrífuga refrigerada 15000 rpm 4.800,00
01 Máquina de gelo 4.000,00
Total de material existente 39.720,00
Material permanente solicitado
Quantidade Especificação Valor R$
01 Cuba horizontal para eletroforese 280,00
04 Micropipetas de volume variável 2.300,00
Total de material permanente 2.580,00
Orçamento
22
Material de consumo solicitado
Quantidade Especificação Valor R$1000 Placas de Petri plástica 300,002000 Ponteiras azuis 120,002000 Ponteiras amarelas 100,002000 Microtubos 0,5 ml 240,002000 Microtubos 1,5 ml 160,00
20 Suportes para microtubos 540,001000 Luvas descartáveis 60,00
01 Agarose frasco 500 g 900,00Primers 2.000,00Taq-Polimerase 1.300,00Reagentes para PCR 4.800,00Material de escritório 1.000,00
Sub-total material de consumo 11.520,00
TotaL do projeto Valor R$
Material permanente existente 39.720,00
Material permanente solicitado 2.520,00
Material de consumo solicitado 11.520,00
Imprevistos (10% sobre material consumo e manutenção) 1.500,00
SUB-TOTAL CONTRA-PARTIDA 39.720,00
SUB-TOTAL DA SOLICITAÇÃO 14.540,00
TOTAL GERAL 55.260,00
Cronograma2010
A S O N D
Obtenção de isolados de coleções
Aquisição de material
Avaliação do FTA com estirpes de referência
PCR
Análise dos resultados
Confecção do artigo
23
Referências bibliográficas Lang, J. M., Hamilton, J. P., Diaz, M. G. Q., Van Sluys, M. A., Burgos, M. R. G., Vera Cruz, C.M., Buell, C. R., Tisserat, N. A., and Leach, J. E. 2010. Genomics-based diagnostic marker development for Xanthomonas oryzae pv. oryzae and X. oryzae pv. oryzicola. Plant Dis. 94:311-319.
Whatman. FTA protocols: collect, transport, archive and access nucleic acids-all at room temperature; WB120047. Disponível em: <www.whatman.com>. Acesso em: 15 jun. 2010.
24
David O. Niño-Liu; Pamela C. Ronald; Adam J. Bogdanove. Xanthomonas oryzae pathovars: model pathogens of a model crop. Molecular Plant Pathology, (2006) 7 ( 5 ) , p.303–324.
European and Mediterranean Plant Protection Organization. Xanthomonas oryzae. 2007 OEPP/EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 37, 543–553