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Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE BACTERIÓFAGOS QUANTO AO SEU POTENCIAL DE USO
TERAPÊUTICO EM INFECÇÕES CAUSADAS POR ENTEROBACTÉRIAS
por Assmaa El Khal
Belo Horizonte 2016
DISSERTAÇÃO MCS-CPqRR A. E. KHAL 2016
2
ASSMAA EL KHAL
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE BACTERIÓFAGOS QUANTO AO SEU POTENCIAL DE USO TERAPÊUTICO EM INFECÇÕES
CAUSADAS POR ENTEROBACTÉRIAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde do
Centro de Pesquisas René Rachou, como
requisito parcial para obtenção do título
de Mestre em Ciências - área de
concentração Biologia Celular e
Molecular.
Orientação: Guilherme Corrêa de Oliveira
Coorientação: Sara Cuadros Orellana
Belo Horizonte
2016
3
Catalogação-na-fonte Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ Biblioteca do CPqRR Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975 K45i 2016
El Khal, Assmaa.
Isolamento e caracterização genômica de bacteriófagos quanto ao seu potencial de uso terapêutico em infecções causadas por enterobactérias / Assmaa El Khal. – Belo Horizonte, 2016.
XVI, 80 f: il.: 210 x 297 mm. Bibliografia: 89 - 96 Dissertação (mestrado) – Dissertação para
obtenção do título de Mestre em Ciências pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde do Centro de Pesquisas René Rachou. Área de concentração: Biologia Celular e Molecular.
1. Diarreia/terapia 2. Escherichia coli/genética 3.
Bacteriófagos/isolamento & purificação 4. Genômica/métodos I. Título. II. Oliveira, Guilherme Corrêa de (Orientação). III. Orellana, Sara Cuadros (Coorientação).
CDD – 22. ed. – 616.342 7
4
ASSMAA EL KHAL
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE BACTERIÓFAGOS QUANTO AO SEU POTENCIAL DE USO TERAPÊUTICO EM INFECÇÕES
CAUSADAS POR ENTEROBACTÉRIAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde do
Centro de Pesquisas René Rachou, como
requisito parcial para obtenção do título
de Mestre em Ciências - área de
concentração Biologia Celular e
Molecular.
Banca Examinadora:
Dr. Guilherme Corrêa de Oliveira (CPqRR/FIOCRUZ) Orientador/Presidente
Dr. Carlos Eduardo Calzavara Silva (CPqRR/FIOCRUZ) Titular
Dr. Flávio Guimarães da Fonseca (UFMG) Titular
Dra. Marina de Moraes Mourão (CPqRR/FIOCRUZ) Suplente
Dissertação defendida e aprovada em Belo Horizonte, 27/06/2016.
6
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a Deus: porque sem a fé que tudo daria certo eu não
teria conseguido.
Aos colegas e amigos da FIOCRUZ (Anderson, Angela, Carol, Daniel,
Fabiano, Fausto, Fran, Gabriel, Juliana, Julliane, Larissa, Laura, Sara, Victor e
Wagner): pelo acolhimento e pelo carinho, seja em forma de sorrisos, olhares,
palavras carinhosas, guloseimas, ajuda e até puxões de orelha. Sem vocês e todo
o apoio e energia positiva que me passam, não sei se teria conseguido passar
pelas dificuldades do mestrado. Muito obrigada por me ajudarem e me fazerem
tão bem!
Guilherme e Sara, por aceitarem me orientar e terem me dado a
oportunidade de ser desse grupo tão especial.
Julliane: pela amizade, pelos ensinamentos e confiança depositada em mim
e em “meus fagos”, pelas várias vezes que corrigiu meu trabalho.
Gabriel e Laura: pela ajuda na montagem e análise dos genomas, pela
orientação contínua, pelo incentivo e amizade.
Eric: pela ajuda no início das análises e pela paciência para me ensinar
como rodar os comandos.
Aos colegas e amigos do LPCM: pela convivência agradável, divisão das
áreas de uso comum e pela torcida. Principalmente à Carol, Paulinha, Isabela e
Erick, vocês eu levarei para a vida!
Vivi: pela ajuda na extração do DNA, fazendo as tardes serem mais leves e
felizes.
Anna e Flávio: pelo sequenciamento do DNA, além do carinho e a
preocupação constante comigo e com o meu trabalho.
Aos meus amigos, que estiveram sempre presentes me apoiando e
distraindo nos momentos de tensão e também aos que entenderam minha
ausência nos de dedicação exclusiva. Obrigada pelo apoio e confiança:
Alessandra, Aninha, Camilinha, Nai, Nath, Sarah, Thaiana. Amo vocês!
Família: pelo amor e confiança plena de que eu seria capaz, pela
companhia nas noites mal dormidas, pelos cafés e pelas flores nas manhãs, pelas
7
horas acordados fazendo meu almoço do dia seguinte, pelas caronas para o
laboratório e pelo jeito único de demonstrarem apoio. Vocês são tudo o que
poderia pedir a Deus. Meu amor por vocês é imensurável.
À minha irmã caçula, Imane, que sempre foi meu porto seguro, me dando
os conselhos mais maduros que já ouvi, suportando meus dias de estresse.
À banca que avaliou esse trabalho, pelas sugestões, colaborando para o
aprimoramento deste.
À Plataforma de Bioinformática do Centro de Pesquisas René Rachou.
À Plataforma de Sequenciamento do Centro de Pesquisas René Rachou.
À COPASA, pelo fornecimento das amostras que serviram como fonte de
bacteriófagos.
À CAPES e à Pós-Graduação do Centro de Pesquisas René Rachou, pelo
financiamento e suporte a esse trabalho.
8
RESUMO
O crescente surgimento de resistência bacteriana aos antibióticos convencionais é
um grave problema que precisa ser enfrentado, seja pela descoberta de novas
substâncias antimicrobianas, naturais ou sintéticas, ou através da pesquisa de
terapias alternativas que sejam economicamente acessíveis. A terapia de fagos é
uma dessas alternativas. Trata-se de uma forma de controle biológico, baseado
em vírus específicos que infectam e destroem células bacterianas: os
bacteriófagos. No entanto, esta é uma fonte terapêutica ainda pouco explorada.
Esse trabalho utilizou o cultivo, isolamento e sequenciamento do genoma, além de
técnicas de genômica de alto desempenho para isolar e caracterizar o genoma de
bacteriófagos específicos para a linhagem enteroinvasiva de Escherichia coli
ATCC 43893, visando o entendimento e a definição do ciclo de infecção desses
vírus (líticos ou lisogênicos). A metodologia utilizada nessa pesquisa possibilitou o
isolamento de 12 vírus. 8 diferentes linhagens virais tiveram seu material genético
extraído e purificado, apresentando bom rendimento e quantidade reduzida de
DNA bacteriano contaminante. O sequenciamento do genoma desses 8 vírus foi
realizado usando a plataforma de nova geração MiSeq. Foi analisada a
diversidade genética desses bacteriófagos e verificou-se que são vírus da ordem
Caudovirales, sendo 2 da família Siphoviridae e 6 da família Myoviridae. Apenas
um deles mostrou potencial de ter ciclo lisogênico, os outros sete vírus não
continham nenhum gene que sugerisse isso. Entretanto, apesar dos bacteriófagos
isolados não terem apresentado genes relacionados ao ciclo lisogênico, análises
mais aprofundadas devem ser realizadas para comprovar que são realmente
exclusivamente líticos, já que muitos não apresentam seu genoma completo e
mais de 50% dos genes anotados não têm função definida.
Palavras-chave: bacteriófagos, Escherichia coli, genômica.
9
ABSTRACT
The increasing emergence of bacterial resistance to conventional antibiotics is a
serious problem that needs to be faced, either through the discovery of new
antimicrobial substances, natural or synthetic, or by searching for alternative
therapies that are affordable. The phage therapy is one of those alternatives. It is a
form of biological control based on specific viruses that infect and kill bacterial
cells: the bacteriophages. However, this therapeutic source is still poorly explored.
This study used the cultivation, isolation and sequencing of the genome, as well as
high-performance genomic techniques to isolate and characterize the genome of
specific bacteriophages for enteroinvasive Escherichia coli ATCC 43893, for the
understanding and the definition of the infection cycle (lytic or lysogenic) of these
viruses. The methodology used in this study allowed the isolation of 12 viruses. 8
different viral strains had their genetic material extracted and purified, with good
yield and reduced amount of contaminating bacterial DNA. The sequencing of the
genome of these 8 viruses was conducted using the new generation MiSeq
platform. The the genetical diversity of these bacteriophages was analyzed and it
was found that the viruses belong to the Caudovirales order, which 2 belong to the
Siphoviridae family and 6 to the Myoviridae family. Only one of them showed the
potential to have lysogenic cycle, the other seven viruses contained no gene to
suggest that. However, despite the isolated bacteriophages have not presented
genes related to lysogenic cycle, further analysis should be conducted to
demonstrate that they are really exclusively lytic, since many do not have their
genome completed and more than 50% of the annotated genes have no defined
function.
Keywords: bacteriophages, Escherichia coli, genomics.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Morfotipos dos vírus de Procariotos.....................................................23
Figura 2 – Estrutura do vírion do bacteriófago T4..................................................24
Figura 3 – Montagem dos vírions em bacteriófagos caudados.............................27
Figura 4 – Esquema ilustrativo do ciclo de infecção dos bacteriófagos.................28
Figura 5 – Etapas do ciclo lítico de infecção e respostas bacterianas à invasão
viral.........................................................................................................................31
Figura 6 – Integração e excisão do genoma de bacteriófagos ao cromossomo
bacteriano...............................................................................................................36
Figura 7 – Placas de lise geradas pelo bacteriófago F6........................................47 Figura 8 – Diluição de 1:100 do bacteriófago F1...................................................48
Figura 9 – Eletroforese em gel de agarose a 0,5%................................................49
Figura 10 – Aspecto turvo das placas de lise produzidas pelo bacteriófago F2....85
11
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Comparação dos genes possivelmente ortólogos dos bacteriófagos
utilizando a ferramenta BRIG................................................................................. 52
Gráfico 2 - Origem taxonômica dos genes usados para anotação do bacteriófago
F1........................................................................................................................... 84
Gráfico 3 - Origem taxonômica dos genes usados para anotação do bacteriófago
F10......................................................................................................................... 84
12
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrão de aderência e fatores de virulência das linhagens de E. coli
............................................................................................................................... 19
Quadro 2 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos
genes do bacteriófago F1.......................................................................................53
Quadro 3 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos
genes do bacteriófago F2.......................................................................................54
Quadro 4 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos
genes do bacteriófago F3.......................................................................................55
Quadro 5 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos
genes do bacteriófago F6.......................................................................................58
Quadro 6 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos
genes do bacteriófago F8.......................................................................................60
Quadro 7 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos
genes do bacteriófago F9.......................................................................................63
Quadro 8 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos
genes do bacteriófago F10.....................................................................................65
Quadro 9 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos
genes do bacteriófago F12.....................................................................................66
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Reagentes para a reação de PCR...................................................... 42
Tabela 2 – Quantidade de placas de lise verificadas nas diferentes coletas.........48
Tabela 3 – Rendimento do DNA isolado de bacteriófagos.....................................50
Tabela 4 – Quantidade de sequências antes e após a filtragem...........................50
Tabela 5 – Características dos genomas montados..............................................51
Tabela 6 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F1........................68
Tabela 7 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F2........................69
Tabela 8 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F3........................71
Tabela 9 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F6........................73
Tabela 10 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F8......................76
Tabela 11 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F9......................78
Tabela 12 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F10....................80
Tabela 13 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F12....................81
14
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ASM: Sociedade Americana de Microbiologia
BFP: bundle-forming pili
CDC: Centers for Disease Control and Prevention
COPASA: Companhia de Saneamento de Minas Gerais
CPqRR: Centro de Pesquisas René Rachou
CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
crRNAs: CRISPR ribonucleic acids
DAEC: E. coli difusivamente aderente
DALY: Disability-adjusted life year
dNTPs: Desoxirribonucleotídeos fosfatados
dsDNA: double stranded deoxyribonucleic acid
DVH: Doenças de Veiculação Hídrica
EAEC: E. coli enteroagregativa
EAggEC: E. coli enteroagregativa
EHEC: E. coli entero-hemorrágica
EIEC: E. coli enteroinvasiva
EPEC: E. coli enteropatogênica
ESBL: Beta-lactamases de espectro estendido
ETE-Arrudas: Estação de Tratamento de Esgoto-Arrudas
FDA: Food and Drug Administration
INCQS: Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Kbp: Kilo-base pair
LEE: locus for enterocyte effacement
NCBI: National Center for Biotechnology Information
OMS: Organização Mundial da Saúde
pb: pares de bases
RM: Restrição-modificação
TSA: Tryptic Soy Agar
TSB: Tryptic Soy Broth
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ................................................. .............. 17
1.1 Contexto epidemiológico .. ....................................................................... 17
1.2 Enterobactérias ................................................................................... ... 17
1.3 E. coli, suas características e importância médica .............................. ... 18
1.4 Resistências a drogas antimicrobianas ............................................... ... 20
1.5 Bacteriófagos: definição e características ........................................... ... 21
1.6 Classificação dos bacteriófagos .......................................................... ... 21
1.7 Mecanismos de infecção dos bacteriófagos ........................................ ... 25
1.8 Ciclos de bacteriófagos ....................................................................... ... 27
1.9 Mecanismos de defesa bacteriana à invasão por bacteriófagos ........ ... 29
1.10 Evasão da defesa bacteriana pelos bacteriófagos ............................ ... 32
1.11 Bacteriófagos e a fagoterapia ........................................................... ... 32
1.12 Emprego de bacteriófagos como bactericidas na indústria de
alimentos..........................................................................................................33
1.13 Utilização de proteínas codificadas por bacteriófagos como
antimicrobianos............................................................................................... 34
1.14 Genômica de bacteriófagos ................................................................ . 35
1.15 Fagos geneticamente modificados ....................................................... 37
1.16 Identificação de novos bacteriófagos ................................................... .38
2 OBJETIVOS ................................................................................................. 39
2.1 Objetivo Geral ........................................................................................ 39
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 39
3 METODOLOGIA ......................................................................................... 40
3.1 Coleta de amostras ............................................................................... 40
16
3.2 Linhagens bacterianas e condições de cultivo ....................................... 40
3.3 Indução de infecção bacteriana in vitro ................................................. 41
3.4 Isolamento, purificação e armazenamento dos fagos das unidades
formadoras de placa (UFP) ............................................................................. 41
3.5 Diluição seriada de fagos para utilização no isolamento de bacteriófagos
............................................................................................................................41
3.6 Titulação de fagos e determinação de virulência..................................... 42
3.7 Análise da pureza das amostras virais ................................................... 42
3.8 Eletroforese em gel de agarose ............................................................. 43
3.9 Extração do DNA de bacteriófagos ........................................................ 43
3.10 Sequenciamento e análise do material genético dos bacteriófagos ..... 44
3.11 Montagem e análise dos genomas virais ............................................. 44
4 RESULTADOS ............................................................................................. 47
4.1 Diluição seriada dos vírus ...................................................................... 47
4.2 Comparação da carga de bacteriófagos da estação de tratamento de esgoto
em diferentes coletas ...................................................................................... 48
4.3 Verificação da pureza do extrato viral .................................................... 49
4.4 Quantificação do DNA ............................................................................ 50
4.5 Caracterização dos genomas virais ....................................................... 50
5 DISCUSSÃO ................................................................................................ 83
6 CONCLUSÃO .............................................................................................. 87
7 PERSPECTIVAS ........................................................................................... 88
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 89
17
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
1.1 Contexto epidemiológico
O continente sul-americano abriga diversos países em desenvolvimento
com grandes problemas na área de Saúde Pública. Um dos maiores problemas
crônicos é a dificuldade de acesso à água potável e ao saneamento de qualidade.
Em 2015, 2,4 bilhões de pessoas não tinham acesso a sistemas de saneamento
adequados (WHO, 2015). Segundo a UNESCO, a falta de saneamento básico faz
com que muitos reservatórios de água destinados ao consumo humano sejam
contaminados com micro-organismos patogênicos, o que representa um problema
potencial de Saúde Pública. Doenças de veiculação hídrica (DVH) são
responsáveis por aproximadamente 5 milhões de mortes anuais, metade das
quais ocorre como resultado de complicações derivadas de infecções intestinais
causadas por enterobactérias (CABRAL, 2010).
As diarreias são os exemplos mais frequentes de DVH. Elas podem ser
causadas por bactérias, protozoários ou vírus (WHO, 2013). Anualmente, ocorrem
aproximadamente 1,7 bilhões de casos de diarreia, o que resulta em cerca de 1,8
milhões de óbitos e contribui com 3,6% do DALY (Disability-adjusted life year)
global (WHO, 2013). Elas são a principal causa de desnutrição e a segunda maior
causa de mortalidade em crianças, causando 760 000 óbitos/ano (WHO, 2013).
Cerca de 50% dos casos de mortalidade infantil no continente africano são
causados por essa doença (WHO, 2009).
1.2 Enterobactérias
As enterobactérias, responsáveis pelas diarreias bacterianas, são um grupo
de organismos Gram-negativos, anaeróbios facultativos, capazes de colonizar o
intestino de mamíferos (ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY, 1997).
Muitos de seus representantes, tais como alguns sorotipos de Escherichia coli,
são simbiontes e compõem a microbiota intestinal normal, porém outras linhagens
de Escherichia coli, Salmonella, Yersinia pestis, Klebsiella e Shigella, podem ser
potenciais patógenos, geralmente oportunistas, podendo causar infecção no trato
digestivo, infecção urinária, sepse, pneumonia, entre outras (ANVISA, 2004).
18
Apesar de estarem frequentemente associadas a um hospedeiro, bactérias dessa
família também podem ser de vida livre, sendo encontradas em ecossistemas
aquáticos, principalmente após a contaminação desses ambientes com esgoto
(BEAUDOIN, 2007).
1.3 E. coli, suas características e importância médica
Escherichia é o gênero tipo da família Enterobacteriaceae. E. coli é a
espécie mais estudada dessa família, e embora a maior parte das linhagens de E.
coli sejam inócuas, alguns sorotipos podem ser altamente patogênicos, sendo
responsáveis por infecções hospitalares, do trato urinário e da corrente sanguínea,
assim como infecções de origem alimentar em todo o mundo (WHO, 2014). E. coli
também é a principal causadora de diarreias no homem, sendo os sintomas da
doença considerados linhagem-dependentes (OKEKE, 2009; NATARO; KAPER,
1998).
As linhagens patogênicas de E. coli são classificadas de acordo com suas
manifestação clínicas em humanos e com o seu sítio de infecção, podendo ser:
enteropatogênicas (EPEC), uropatogênicas (UPEC) e patogênicas extra-
intestinais. Essas bactérias também podem ser agrupadas com base em sua
sorologia. Além disso, podem ser classificadas, de acordo com o mecanismo de
virulência utilizado, em: enterohemorrágica (EHEC), enterotoxigênica (ETEC),
enteroinvasiva (EIEC), enteroagregativa (EAggEC) e difusamente-aderente
(DAEC) (LUKJANCENKO et al., 2010).
Os mecanismos de virulência em E. coli são codificados por genes
cromossômicos, plasmidiais ou de bacteriófagos. Os genes envolvidos nesses
mecanismos são: eae, envolvido em lesões por adesão ou comprometimento das
microvilosidades intestinais; bfpA, relacionado a aderência localizada; ipaH, que
se relaciona a mecanismos enteroinvasivos. Genes que codificam as toxinas
Shiga (stx1 e stx2), a toxina termo-lábil (LT) e toxina termo-estável (ST) também
são associados à virulência (ARANDA; FAGUNDES-NETO; SCALETSKY, 2004).
Os padrões de aderência e fatores de virulência das linhagens de E. coli
estão apresentados no Quadro 1. As EPEC podem causar lesão por adesão,
através da síntese de fatores de virulência, que é regulada pela ativação de genes
19
localizados no lócus cromossômico LEE (Locus of Enterocyte Effacement). O LEE
é considerado uma ilha de patogenicidade e está presente em linhagens EPEC e
EHEC. (MCDANIEL et al., 1995; CLEARY et al., 2004)
As linhagens de EIEC são capazes de causar disenteria bacilar. Após a
ingestão de alimentos contaminados com fezes de humanos doentes, essas
bactérias invadem as células do epitélio do intestino. A doença resultante, cujos
sintomas aparecem após 12 a 72 horas, caracteriza-se pelo aparecimento de
sangue e muco nas fezes de pacientes infectados, podendo também ser
acompanhada de cólicas abdominais, diarreia, vômitos, febre, calafrios e mal-estar
generalizado. Uma complicação comumente associada com a infecção é a
síndrome hemolítico-urêmica (FDA, 2012).
QUADRO 1 - Padrão de aderência e fatores de virulência das linhagens de E. coli. Linhagem de E. coli Padrão de aderência Principais fatores de
virulência conhecidos
E. coli enteropatogênica (EPEC)
Localizado LEE, enterotoxina EspC, BFP (bundle forming pili), Sistema de secreção Tipo
III, Proteínas: EspABD, Intimina
E. coli enterotoxigênica (ETEC)
Difuso fraco Toxina termo-estável ao calor (ST), Toxina termo-
lábil ao calor (LT), fímbrias
E. coli enteroinvasiva (EIEC) e Shigella
Variável Enterotoxinas de Shigella, toxinas Shiga (STX; Sh
dysenteriae), exclusão em genes housekeeping
E. coli enterohemorrhagica
(EHEC)
Variável Enterohemolisina, LEE, Shiga toxinas (Stx), toxina termo-estável (EAST-1),
intimina, adesinas acessórias
E. coli enteroagregativa (EAEC ou EAggEC)
Agregativo Dispersina, toxina termo-estável (EAST-1),
adesinas acessórias
E. coli difusamente-aderente (DAEC)
Difuso Adesina difusa, outras adesinas
FONTE: elaborado pelo autor a partir de dados de CLEARY et al., 2004.
20
1.4 Resistência a drogas antimicrobianas
A primeira droga antimicrobiana, a penicilina, foi descoberta por Alexander
Fleming, no ano de 1928. Esse acontecimento foi um marco na medicina,
tornando possível o tratamento de sérias infecções bacterianas. Entretanto, o uso
descontrolado de antibióticos fez com que bactérias resistentes fossem
selecionadas, causando um grande problema, que hoje é ameaça à saúde
pública: a resistência a antibióticos (DAVIES; DAVIES, 2010).
Sabe-se que as bactérias podem ser intrinsecamente resistentes a certos
antibióticos, mas também podem adquirir resistência através de mutações em
genes cromossômicos ou através da transferência gênica horizontal (BLAIR, et al.,
2015). Alguns dos mecanismos de resistência descritos em E. coli são as
mutações (ex: resistência às fluoroquinolonas) e a aquisição de elementos
genéticos móveis (ex: resistência às penicilinas de largo espectro, como ampicilina
e amoxicilina, e cefalosporinas de terceira geração). Esta última é conferida
principalmente por enzimas conhecidas como beta-lactamases de espectro
extendido (ESBL), as quais destroem muitos antibióticos beta-lactâmicos
(ALEKSHUN; LEVY, 2007).
O relatório mais recente da Organização mundial da Saúde (OMS) deixa
claro que a resistência bacteriana tem atingido níveis alarmantes em várias partes
do mundo (WHO, 2014), incluindo o surgimento de linhagens resistentes a
múltiplos antibióticos (superbactérias), contra as quais poucos tratamentos
permanecem eficazes. De acordo com esse relatório, que teve como fonte dados
fornecidos pelos programas de vigilância de países de todo o mundo, assim como
artigos científicos, a porcentagem de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e
Staphylococcus aureus resistentes a antibióticos comumente utilizados
ultrapassou os 50% (WHO, 2014). Em se tratando de resistência de
Staphylococcus aureus a meticilinas foi verificada uma porcentagem de 90% nas
Américas e 60% na Europa. A Organização Pan-Americana da Saúde cita altos
níveis de resistência de Escherichia coli às cefalosporinas de terceira geração e às
fluoroquinolonas (WHO, 2014).
Foi descrito por Losee e colaboradores, em janeiro de 2015, um novo
antibiótico, a teixobactina, que mostrou ter excelente atividade contra patógenos
21
Gram-positivos, incluindo cepas resistentes, como enterococos, Mycobacterium
tuberculosis, Clostridium difficile e Bacillus anthracis. Essa nova droga também
teve atividade bactericida contra Staphylococcus aureus, porém mostrou ser
ineficaz contra a maioria das bactérias Gram-negativas, como é o caso das
Escherichia coli e outras enterobactérias. Nesse contexto, torna-se importante a
pesquisa e o desenvolvimento de métodos alternativos e complementares para o
tratamento de infecções por bactérias resistentes aos medicamentos
convencionais.
1.5 Bacteriófagos: definição e características
Bacteriófagos, também denominados fagos, são vírus capazes de infectar
células bacterianas, dentro das quais eles podem se replicar (D’HÉRELLE, 1917).
São considerados as entidades biológicas mais abundantes do planeta
(ROHWER; EDWARDS, 2002). Por serem incapazes de se replicar de forma
independente, são normalmente encontrados em maior número em ambientes
onde seu hospedeiro está presente (WEINBAUER, 2004). Além disso, por
apresentarem alta especificidade em relação ao hospedeiro, não são nocivos a
organismos eucariotos (SUMMERS, 2001). Além disso, os fagos geram
significativo impacto na estrutura e na função de comunidades de bactérias, seja
causando a sua morte ou realizando transferência horizontal de genes, podendo
alterar os fenótipos bacterianos e conduzir à expressão de genes de virulência
(PAUL, 1999).
1.6 Classificação dos bacteriófagos
A classificação dos bacteriófagos é ainda uma questão pouco definida.
Aproximadamente 70 propriedades de bacteriófagos são utilizadas com fins
taxonômicos, porém, as mais importantes são: natureza dos ácidos nucleicos,
morfologia da partícula viral (vírion), suas propriedades físico-químicas e dados
genômicos (ACKERMANN; EISENSTARK, 1974).
Inicialmente, em 1943, Ruska propôs um método de classificação viral
baseado em microscopia eletrônica. Mais tarde, em 1962, Lwoff, Horne e Tournier
estabeleceram que a classificação desses vírus deveria ser baseada em
22
propriedades do vírion e do material genético e propuseram um novo sistema de
nomenclatura (LWOFF et al., 1962). O Provisional Committee on Nomenclature of
Viruses (PCNV), fundado em 1965, posteriormente se tornou o International
Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), que é, atualmente, o único órgão
internacional responsável por taxonomia viral (MURPHY et al., 1995). Em 1974, os
fagos foram separados por morfotipos (Figura 1), para facilitar a identificação por
microscopia eletrônica. (ACKERMANN; EISENSTARK, 1974).
23
FIGURA 1 - Morfotipos dos vírus de Procariotos.
Acima estão representados os diversos morfotipos de bacteriófagos conhecidos. Os bacteriófagos da ordem Caudovirales (famílias Myoviridae, Siphoviridae e Podoviridae) estão localizados entre os vírus de DNA de fita dupla (dsDNA), como indicado na figura. FONTE: CLOKIE; KROPINSKI, 2009.
Apesar de ainda não existir um método universal para a classificação
desses fagos, eles são mais comumente agrupados de acordo com sua morfologia
e com a composição de seu material genético (www.ictvonline.org/).
A ordem Caudovirales, é formada de vírus caudados, que constituem mais
de 96% da população de bacteriófagos. São fagos que apresentam genoma de
DNA de fita dupla, com tamanho variando de 18 a 500 mil pares de bases. Os
vírions formados são únicos e apresentam um capsídeo icosaédrico, contendo o
DNA e uma cauda, que é responsável por fazer a ligação à célula hospedeira alvo
e pelo transporte do material genético para o interior da célula (Figura 2)
(CASJENS, 2005; ACKERMANN, 2007). A ordem Caudovirales é composta por
24
três famílias virais: Myoviridae, com o maior capsídeo (150 nm) e uma cauda
contrátil; Siphoviridae, com um capsídeo relativamente pequeno (50-60 nm) e
apresentando cauda longa, flexível e não-contrátil; e Podoviridae, caracterizada
por apresentar pequeno capsídeo (50-60 nm) e cauda curta (DRULIS-KAWA et al.,
2012). As famílias, por sua vez, são subdivididas em subfamílias, gêneros e
subgêneros utilizando-se o tamanho e as características do genoma, assim como
a gama de hospedeiros dos vírus. (NELSON, 2004). Estima-se que o número de
espécies de Caudovirales seja aproximadamente dez vezes superior ao número
espécies bacterianas. Dessa forma, uma estimativa conservadora é a de que
existam, no mínimo, cem milhões de espécies de bacteriófagos dessa ordem,
embora apenas uma pequena fração dessa diversidade tenha sido isolada e
caracterizada (ROHWER, 2003).
FIGURA 2 – Estrutura do vírion do bacteriófago T4.
Na figura acima está representada a morfologia usual de um bacteriófago da ordem Caudovirales. O material genético desses vírus encontra-se protegido pelo capsídeo viral. O pescoço faz a ligação entre o capsídeo e a cauda e as fibras da cauda são responsáveis pela ligação com receptores específicos da célula bacteriana. FONTE: MILLER et al., 2003.
25
1.7 Mecanismos de infecção dos bacteriófagos
A infecção por bacteriófagos ocorre quando há a ligação entre a partícula
viral e uma célula hospedeira suscetível. Inicialmente, ocorre a adsorção da
partícula viral a receptores de superfície do hospedeiro. Esse processo é
específico e pode ser reversível ou irreversível. A adsorção reversível é
influenciada por ações eletrostáticas. Já a irreversível tem ligações mais estáveis
e ação de enzimas hidrolíticas (DRULIS-KAWA et al., 2012; GREGORACCI,
2006).
Existem dois tipos principais de receptores bacterianos aos quais os fagos
se ligam: componentes da superfície e pílus sexual. Assim, são classificados como
bacteriófagos somáticos os fagos que têm como receptores os componentes da
superfície bacteriana (proteínas de membrana, lipopolissacarídeos,
peptidoglicanos, ácidos teicóicos, oligossacarídeos, cápsula e fímbrias do tipo IV e
o flagelo bacteriano). Já quando a ligação ocorre no pilus sexual da bactéria os
vírus são classificados como fagos RNA F+ específicos ou “male-specific”
(DRULIS-KAWA et al., 2012). No caso de vírus da ordem Caudovirales, fibras da
cauda viral geralmente são responsáveis pela ligação com os receptores
bacterianos, sendo a gama de hospedeiros desse bacteriófago definida pelo tipo
de fibras da cauda desse vírus (CHATURONGAKUL; OUNJAI, 2014; MILLER et
al., 2003).
A etapa seguinte é a injeção do material genético dos bacteriófagos no
interior da célula bacteriana (DRULIS-KAWA et al., 2012). Depois que o DNA
penetra o citoplasma, os genes precoces dos fagos redirecionam a maquinaria de
síntese bacteriana para que sejam produzidos os ácidos nucleicos e as proteínas
virais. Em seguida, ocorre a montagem e o empacotamento dos vírions (Figura 3)
(MAURICE et al., 2013).
A primeira etapa é a montagem do capsídeo viral, que é iniciada ao se
construir o procapsídeo, uma proteína estrutural composta pela proteína principal
do capsídeo (MCP). Posteriormente, a proteína de entrada (portal protein) forma
um canal em um dos vértices do procapsídeo. Um complexo ATPase se acopla a
esse canal. Esse complexo é denominado terminase e é composto por diversas
cópias da grande subunidade da terminase (TermL) e uma pequena subunidade
26
de ligação que reconhece o DNA do bacteriófago e, usando o canal da proteína de
entrada (portal protein), o transfere para dentro do procapsídeo, realizando o
empacotamento do DNA. Ao final deste processo, o complexo terminase é
desmontado. Para evitar que o material genético se disperse, a proteína de
entrada reúne outras, como a proteína adaptadora (Ad), que se liga a ela. Em
seguida há a suplementação do processo pela proteína finalizadora do capsídeo
(Hc), já que a MCP sozinha não é capaz de garantir a geometria correta do
mesmo (AKSYUK; ROSSMANN, 2011). Esta conclui a montagem das pequenas
caudas de vírus da família Podoviridae e possibilita a ligação de caudas longas
dos membros da família Myoviridae e Siphoviridae. As proteínas finalizadoras da
cauda, ou tail completion proteins (Tc) fazem a ligação entre a cauda e o
capsídeo. O pescoço dos bacteriófagos é formado pelas proteínas Hc, Tc e a
proteína de entrada, conectando a cabeça à cauda. A cauda é formada
principalmente pela proteína principal da cauda (MTP). Vírus da família Myoviridae
possui um envoltório ao redor da cauda, formado pela proteína da bainha (sheath
protein). Essa bainha se contrai no momento da infecção, para que o DNA seja
injetado na célula bacteriana (LOPES et al., 2014). As etapas seguintes dependem
do tipo de ciclo biológico de cada bacteriófago.
27
FIGURA 3 - Montagem dos vírions em bacteriófagos caudados.
A montagem dos vírios é iniciada pela proteína principal do capsídeo e é continuada com o auxílio de diversas proteínas, como a proteína de entrada, a proteína adaptadora, terminasse, proteína finalizadora do capsídeo, proteína principal da cauda, proteína de finalização da cauda e, em Myoviridae, pela proteína da bainha, que envolve a cauda viral. FONTE: LOPES et al., 2014.
1.8 Ciclos de bacteriófagos
Bacteriófagos podem apresentar diferentes ciclos biológicos. Os dois
principais são: lítico e lisogênico (DRULIS-KAWA et al., 2012).
Os fagos líticos, ou virulentos, têm altas taxas de replicação, ocorrendo
acúmulo de grande quantidade de vírus e de proteínas expressas tardiamente por
eles (endolisinas, holinas ou inibidoras da síntese de mureína), que provocam a
lise da célula bacteriana e liberação desses bacteriófagos (Figura 4) (MAURICE et
al., 2013).
Quando se trata de fagos lisogênicos (ou temperados), o material genético
do bacteriófago pode ser integrado ao da bactéria, porém esse processo é
reversível. Nele, há silenciamento da expressão de genes do fago, a partir de
28
proteínas que conferem à bactéria imunidade a esses vírus. Após ser integrado ao
genoma bacteriano, o vírus passa a ser denominado profago. Este pode sofrer
indução se a célula for submetida à ação de raios ultravioleta ou outro estresse
físico-químico. Assim, o vírus, que antes estava inserido no genoma bacteriano,
passa para o ciclo lítico. Através da lisogenia, o hospedeiro adquire imunidade à
superinfecção por fagos relacionados ao invasor, pois o genoma de alguns fagos
lisogênicos possui genes capazes de modificarem os receptores da célula
bacteriana infectada, evitando que outros vírus se adsorvam (MARKINE-
GORIAYNOFF et al., 2004). Pode também haver a aquisição de resistência a
antibióticos e de sequências que influenciem na expressão de toxinas (conversão
lisogênica), como a Shiga toxina de E. coli, aumentando a aptidão (fitness) da
bactéria. O DNA bacteriano também pode ser danificado por inserção de
elementos móveis e deleção. Esse processo é denominado transdução
especializada (MAURICE et al., 2013).
FIGURA 4 – Esquema ilustrativo do ciclo de infecção dos bacteriófagos.
O ciclo é iniciado com a adsorção do vírus à célula bacteriana. Posteriormente ele injeta seu DNA; realiza a síntese de suas proteínas; as partículas virais são montadas, produzem endolisinas e lisam a célula infectada, liberando novas partículas virais. A seta vermelha indica o ciclo lisogênico, no qual o DNA do fago é integrado ao genoma bacteriano. FONTE: STURINO; KLAENHAMMER, 2006.
29
1.9 Mecanismos de defesa bacteriana à invasão por bacteriófagos
Os bacteriófagos apresentam capacidade de infectar as células
bacterianas, porém, as bactérias, por sua vez, possuem diversos mecanismos de
defesa contra partículas ou DNA exógeno (Figura 5). Entre esses mecanismos
estão: inibição da adsorção, bloqueio da injeção do material genético, restrição-
modificação (RM), infecção abortiva, o mecanismo de CRISPRs (Clustered
Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) (KESIK- SZELOCH, et al.,
2013).
A inibição da adsorção, que torna inviável a infecção pelos bacteriófagos,
pode ocorrer por meio de mascaramento dos receptores da superfície bacteriana
ou modificação na sua estrutura. Porém, é mais comum a resistência à infecção
por fagos devido à ausência desses receptores. Tanto o cromossomo bacteriano,
como plasmídeos podem mediar os mecanismos que previnem a adsorção
(RAKHUBA et al., 2010).
O mecanismo mais bem estudado é o de restrição-modificação (RM) e está
presente em mais de 90% das bactérias. Consiste na ação de endonucleases de
restrição, que são enzimas capazes de reconhecer e clivar sequências específicas
nas moléculas de DNA (KESIK-SZELOCH, et al., 2013). As endonucleases
participam do sistema de restrição, fazendo a degradação do DNA invasor, que
não é metilado. Já as metil-transferases, responsáveis pela modificação,
introduzem um grupo metil em um sítio específico do DNA do hospedeiro,
protegendo-o de ser degradado. As sequências não metiladas são degradadas
pelas endonucleases. Os sistemas de restrição-modificação são classificados em
quatro grupos (I, II, III e IV), dependendo de sua estrutura molecular, cofatores
necessários, reconhecimento de sequências e sítio de clivagem (KRÜGER;
BICKLE, 1983).
A infecção abortiva (Abi) é o processo responsável pela defesa da célula
quando o sistema RM falha. Assim, os mecanismos de infecção abortiva têm
diferentes alvos na célula, atuando em distintas fases do ciclo (replicação,
transcrição, síntese proteica, montagem) e limitando a proliferação dos fagos
(LABRIE et al., 2010).
30
Além disso, também existe o CRISPR. O locus CRISPR e seus genes
associados (cas) codificam um mecanismo de defesa sequência-específico contra
bacteriófagos e plasmídeos. O CRISPR consiste em conjuntos de sequências
repetitivas curtas (cerca de 40 pb) que são separadas por sequências
espaçadoras derivadas de DNA exógeno. Após a clivagem, pela endoribonuclease
Cas, em sequências repetidas, conjuntos de CRISPR são transcritos como um
longo precursor. Este é processado em pequenos CRISPR RNAs (crRNAs)
(BIKARD; MARRAFFINI, 2012). Esse sistema é encontrado em 48% das Bactérias
e em 95% das Arqueas. Utilizando os crRNAs, os complexos crRNA/Cas clivam
DNA exógeno em sítios específicos, conferindo às bactérias resistência contra o
DNA invasor. A incorporação de novas sequências ao locus CRISPR é realizada
também pela ação das proteínas Cas. (BONDY-DENOMY et al., 2013).
31
FIGURA 5 - Etapas do ciclo lítico de infecção e respostas bacterianas à invasão viral.
À esquerda estão representadas as etapas do ciclo de infecção dos bacteriófagos e à direita os mecanismos de defesa bacteriana contra o agente invasor. FONTE: STURINO; KLAENHAMMER, 2006.
32
1.10 Evasão da defesa bacteriana pelos bacteriófagos
Para obter sucesso ao infectar o hospedeiro, o fago necessita evadir os
diferentes mecanismos de defesa da célula bacteriana. Entre as estratégias de
evasão mais conhecidas estão a ação de inibidores de enzimas de restrição e a
hidrólise de cofatores do sistema de RM (KESIK- SZELOCH, et al., 2013).
Outro mecanismo de evasão da defesa bacteriana por bacteriófagos
envolve cinco distintos genes “anti-CRISPR’ que foram identificados nos genomas
de fagos. Enquanto mutações no gene anti-CRISPR do fago o tornam incapaz de
infectar uma bactéria com um sistema CRISPR/Cas funcional, a adição do mesmo
gene ao seu genoma permite que esse vírus evada a defesa bacteriana (BONDY-
DENOMY et al., 2013).
Os fagos também têm a capacidade de adquirir novas mutações em genes
que codificam proteínas que se ligam aos receptores bacterianos (RBPs) ou fibras
da cauda viral em resposta às modificações que esses receptores sofrem,
mantendo assim a capacidade de infectar o hospedeiro. Para lidar com o
mascaramento de receptores da membrana bacteriana por algumas moléculas o
fago pode expressar despolimerases, que degradam a molécula mascaradora,
possibilitando a ligação do bacteriófago ao receptor-alvo (SAMSON et al., 2013).
1.11 Bacteriófagos e a fagoterapia
A terapia de fagos, também conhecida como fagoterapia é uma forma de
controle biológico, baseada em vírus específicos de bactérias. Ela foi inicialmente
proposta em 1917, por Félix d’Herelle, no Instituto Pasteur (Paris, França), mas o
interesse nessa aplicação foi reduzido significativamente quando os antibióticos
foram descobertos. Porém, com a ameaça emergente de infecções causadas por
bactérias multirresistentes e poucas perspectivas para o surgimento de novos
antibióticos, a terapia de fagos passou a ser alvo de novos estudos visando a uma
possível aplicação terapêutica (FRUCIANO; BOURNE, 2007).
Como agentes terapêuticos, os fagos poderiam substituir ou atuar como co-
adjuvantes de drogas no combate a infecções bacterianas (VIERTEL et al., 2014).
A fagoterapia já tem aplicação em alguns países, como a Rússia, onde o uso do
coquetel de fagos, medicamento composto por bacteriófagos, já é uma realidade.
33
A companhia russa Microgen desenvolve preparações de fagos em suspensão ou
em comprimidos para diversas infecções, por exemplo disenterias, infecções por
Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, além de coquetéis de
bacteriófagos (en.microgen.ru/) (MCCALLIN et al., 2013). As pesquisas nessa
área têm atraído maior interesse global e a incorporação da fagoterapia no
tratamento de infecções tem sido apoiada pelo governo de vários países. O
Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas dos Estados Unidos, por
exemplo, listou a fagoterapia como um dos sete pilares no seu plano de pesquisa
para combater a resistência aos antibióticos. Além disso, a Sociedade Americana
de Microbiologia (ASM) apoia o Phagoburn: o primeiro centro multi-núcleo geral de
clínica da fagoterapia para infecções humanas, financiado pela Comissão
Europeia, no âmbito do 7th Framework Programme for Research and
Development. O Phagoburn é um projeto inicialmente focado no tratamento de
pacientes vítimas de queimaduras e, ao mesmo tempo, portadores de infecções
por Escherichia coli ou Pseudomonas aeruginosa (phagoburn.eu/).
Algumas das vantagens observadas na fagoterapia são: melhor atividade
profilática e terapêutica se comparada aos medicamentos convencionais; ausência
de destruição da microbiota bacteriana normal dos indivíduos (tendo em vista a
especificidade dos bacteriófagos em infectar a célula de interesse) e a
possibilidade de utilização em dose única (PAISANO; BOMBONA, 2010). Além
disso, a fagoterapia não oferece perigo ao ser humano, pois esses vírus não têm a
capacidade de infectar ou causar danos a células eucarióticas (KESIK-SZELOCH
et al., 2013). Alguns trabalhos como o de McCallin e colaboradores (2013)
demonstram a eficácia e segurança da terapia de fagos.
Apesar da possibilidade de surgimento de resistência bacteriana a fagos,
essa é muito menos frequente do que a resistência a antibióticos convencionais
(hu, 2006). Dessa forma, a fagoterapia é uma alternativa eficiente e segura,
podendo ser forte aliada ao tratamento no caso de resistência bacteriana aos
antibióticos usuais (REARDON, 2014).
1.12 Emprego de bacteriófagos como bactericidas na indústria de alimentos
Além da fagoterapia, os bacteriófagos possuem diversas outras aplicações.
34
Entre elas está o uso como agentes bactericidas em alimentos (HUDSON et al.,
2005). O FSIS (Department of Agriculture’s Food Safety and Inspection Service)
aprovou o uso de uma mistura de seis bacteriófagos específicos para o patógeno
alimentar Listeria monocytogenes (ListShieldTM, fabricado pela empresa Intralytix
Inc.). Esse “coquetel de fagos” é utilizado em carnes e produtos avícolas. O
ListShieldTM é usado como aditivo alimentar, assim como outros aditivos
normalmente empregados pela indústria para manter a qualidade dos alimentos,
além de não oferecer risco à saúde humana (SHARMA, 2013).
Além disso, existem diversos outros produtos baseados em um ou em uma
combinação de bacteriófagos, como o Listex P100 (Micreos Food Safety), esse
também é reconhecido como seguro pela Food and Drug Administration (FDA),
não havendo objeções científicas para o seu uso. Esses produtos são utilizados
para inibir o crescimento de L. monocytogenes em queijos e em alimentos prontos
para o consumo (SHARMA, 2013).
Em um trabalho de Jianxiong e colaboradores, um coquetel de seis
bacteriófagos específicos para Salmonella spp., aplicado em associação com
Enterobacter asburiae reduziu a concentração de Salmonella spp. em 6 log
CFU/mL em feijões, se comparado a brotos de feijão sem o coquetel (YE et al.,
2010). As soluções de bacteriófagos são aplicadas de diferentes formas, como
spray ou imersão do alimento, sempre gerando diminuição significativa da carga
bacteriana nos produtos alimentícios (SHARMA, 2013).
1.13 Utilização de proteínas codificadas por bacteriófagos como
antimicrobianos
Outra opção ao uso direto de fagos como antimicrobianos é o uso de
proteínas codificadas por esses agentes: as endolisinas, que degradam o
peptídeoglicano; e as holinas, que rompem a membrana celular da célula
infectada. Essas proteínas demonstraram ter importantes ações antibacterianas
(YOUNG; BLÄSI, 1995; DRULIS-KAWA et al., 2015).
As lisinas não são tóxicas para a célula eucariótica e são ainda mais
promissoras que fagos isolados. Elas penetram melhor nos tecidos-alvo, têm
menor imunogenicidade, a probabilidade de desenvolvimento de resistência
35
bacteriana é menor, apresentam maior espectro de atividade, além de serem
altamente eficientes na destruição dos patógenos-alvo (DRULIS-KAWA et al.,
2012).
1.14 Genômica de bacteriófagos
Fagos com potencial de uso terapêutico necessitam ser caracterizados
biologicamente e geneticamente. O uso de vírus que não sejam exclusivamente
líticos pode levar à expressão de fatores de virulência bacterianos como resposta
adaptativa à infecção por fagos. Um exemplo é a cepa O104:H4 de E. coli, que
produz uma toxina capaz de causar diarreia e lesões no rim, a Shiga toxina. A
Shiga toxina é responsável pela síndrome hemolítico-urêmica. Os genes
envolvidos na sua produção são transferidos por bacteriófagos. Logo, após essa
transferência gênica, a bactéria torna-se patogênica (TURNER, 2011; MUNIESA
et al., 2012).
Dessa forma, é essencial a caracterização genômica dos vírus
bacteriófagos antes de qualquer ensaio clínico e uso como terapia. A
caracterização genômica possibilita saber se o bacteriófago é unicamente lítico ou
se apresenta a capacidade de se integrar ao genoma bacteriano, causando
possíveis problemas. Uma informação importante que caracteriza bacteriófagos
lisogênicos é a presença de genes que codificam a proteína integrase (Int). Essa
enzima é mediadora da recombinação entre o DNA do bacteriófago e o de seu
hospedeiro em sítios específicos (attP, de bacteriófagos e attB, no caso das
bactérias) (Figura 6). Logo fagos que apresentam essa enzima não são indicados
para uso na fagoterapia (GROTH; CARLOS, 2004; CHO et al., 2002; GRAINGE;
JAYARAM, 1999).
36
FIGURA 6 – Integração e excisão do genoma de bacteriófagos ao cromossomo bacteriano.
O Genoma da bactéria está representado em forma de elipse de cor preta e em verde está indicado o genoma do bacteriófago e seu sítio de ligação (attP). Com a ação da enzima integrase ocorre a integração do genoma viral no cromossomo bacteriano, flanqueado pelos sítios híbridos attL e attR A excisão desse genoma pode ocorrer com o auxílio das enzimas excisionase e integrase. FONTE: GROTH; CARLOS, 2004.
O avanço das plataformas de sequenciamento, bem como a redução no
custo dessa técnica tem possibilitado o avanço no campo da genômica de
bacteriófagos. Em 2012, o banco de dados de genomas do NCBI possuía
aproximadamente 600 genomas de Caudovirales (KLUMPP et al., 2012). Com
apenas 3 anos de pesquisas, esse número dobrou. Em maio de 2016 havia 1.863
genomas de bacteriófagos depositados no NCBI, sendo que para a ordem
Caudovirales havia 1.748 (www.ncbi.nlm.nih.gov/).
A bioinformática possibilita obter informações sobre genes de bacteriófagos
que ainda não foram caracterizados, o que é importante para a compreensão da
diversidade e função desses vírus. Apesar de relativamente recentes, os estudos
genômicos dos bacteriófagos têm sido essenciais para aprimorar o conhecimento
da diversidade molecular e estratégias empregadas pelos fagos caudados
(CASJENS, 2005).
A genômica funcional consiste em sequenciar o material genético dos
bacteriófagos, realizar a sua montagem, anotar o genoma e, finalmente, atribuir
funções aos produtos dos genes anotados. Portanto, a genômica funcional, a
partir da abordagem in silico (fazendo a predição de genes) ou acoplada à
experimental (analisando a função deles in vitro), tem grande potencial em
37
aperfeiçoar a anotação de genoma de fagos e, assim, melhor caracterizá-los
(KLUMPP et al., 2013).
Devido à ausência de dados experimentais complementares, mais de 50%
dos produtos gênicos de fagos são hipotéticos e não têm uma função definida.
Além disso, aproximadamente 50% das cepas bacterianas que já tiveram seu
material genético sequenciado apresentam prófagos em seu genoma, chegando a
compor cerca de 20% do genoma (KLUMPP et al., 2013).
Em Caudovirales a especificidade de um fago pelo hospedeiro é
determinada por genes que codificam proteínas da cauda e sabe-se que a
fagoterapia é limitada pela gama de hospedeiros que um bacteriófago isolado
pode infectar. Portanto, o estudo comparativo de genomas permite detectar o
possível hospedeiro pela manipulação de genes da cauda dos fagos (BRÜSSOW;
HENDRIX, 2012; SHIN et al., 2012).
Vários membros da ordem Caudovirales têm genes conservados, como o
gene que codifica terminases, proteínas de entrada e proteínas do capsídeo viral,
assim como as proteínas da cauda (proteína principal da cauda e da bainha).
Porém, a intensa recombinação genética que ocorre dá origem a mosaicismos no
genoma e dificulta a caracterização filogenética desses vírus (REYES et al., 2012).
Isso explica a ausência de uma definição exata de espécies de bacteriófagos e a
dificuldade de padronizar um esquema de classificação (CASJENS, 2005; LOPES,
2014).
Portanto, utilizando-se de estudos de genômica, podem-se esclarecer
questões essenciais a respeito de mecanismos de infecção dos bacteriófagos,
evasão da defesa bacteriana por esses vírus, assim como sobre seu ciclo e o
procedimento de replicação do material genético (KLUMPP, et al., 2013).
1.15 Fagos geneticamente modificados
As técnicas contemporâneas de engenharia genética tornam possível
desenvolver fagos com funções adicionais, desenhados para a solução de
problemas específicos como, por exemplo, degradar diferentes componentes
estruturais em biofilmes de bactérias. Sabe-se que o biofilme de E. coli é
composto principalmente por celulose, logo, fagos que expressem a enzima
38
celulase são capazes de degradá-lo. Lu e Collins, por exemplo, desenvolveram
um fago geneticamente modificado capaz de realizar a degradação do biofilme de
E. coli: o bacteriófago T7 modificado, sendo ele cem vezes mais eficiente na
remoção desse biofilme do que o fago original. (LU; COLLINS, 2007).
1.16 Identificação de novos bacteriófagos
É estimado que menos de 0,0002% da diversidade global de bacteriófagos
foi amostrada. Entretanto, apesar dos fagos serem as entidades biológicas mais
abundantes e diversas no planeta, pouco se sabe sobre este universo (IGNACIO-
ESPINOZA et al, 2013; ROHWER et al., 2009).
No entanto, apesar de haver busca ativa por bacteriófagos que infectam
bactérias patogênicas, essa é uma fonte terapêutica ainda pouco explorada. Além
disso, é importante que se busque bacteriófagos específicos para as bactérias de
interesse local, tendo em vista que para o sucesso desse método terapêutico é
necessária a utilização de fagos capazes de infectar e destruir especificamente o
organismo causador da infecção, sem afetar o restante da microbiota. Nesse
contexto, estudos que visam a identificação de novos fagos, bem como o
sequenciamento do genoma desses vírus são essenciais para o conhecimento da
sua diversidade, ainda desconhecida (ROHWER, 2003).
39
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Identificar e caracterizar o genoma de bacteriófagos capazes de infectar
enterobactérias de interesse médico.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Isolar bacteriófagos capazes de infectar a linhagem enteroinvasiva de
Escherichia coli (EIEC) ATCC 43893.
- Sequenciar, montar e anotar os genomas dos bacteriófagos isolados.
- Descrever o repertório de genes virais possivelmente envolvidos na
infecção e na evasão dos sistemas de defesa bacteriana.
40
3 METODOLOGIA
3.1 Coleta de amostras
Amostras de água residual foram coletadas na ETE-Arrudas (COPASA), a
maior estação de tratamento de esgoto da região metropolitana de Belo Horizonte.
Foram realizadas duas coletas: uma no mês de abril de 2015 e outra no mês de
agosto de 2015. A primeira coleta foi realizada tomando-se amostras da fase
intermediária e final de tratamento, estágios em que a contagem de células de E.
coli ainda é superior a 105 células/mL, e que a matéria orgânica já é reduzida.
Foram coletados 10 tubos Falcon de 15 mL cheios. As amostras foram
transportadas até o laboratório, onde foram centrifugadas a 4410 g, por 20
minutos, a 4ºC para decantação de sólidos em suspensão. Posteriormente, as
amostras foram filtradas em filtros de acetato de celulose com poros de 0,22 μm,
para remoção de células bacterianas. O filtrado recuperado, parte que contém a
fração viral (cerca de 10 mL), foi armazenado em geladeira até o momento do
processamento.
A segunda coleta foi realizada tomando-se amostras apenas da fase
intermediária do tratamento. Os procedimentos seguintes foram idênticos aos da
primeira coleta.
3.2 Linhagens bacterianas e condições de cultivo
O cultivo bacteriano foi realizado no laboratório do Grupo de Genômica e
Biologia Computacional do Centro de Pesquisas René Rachou (CPqRR). Devido à
sua importância clínica, foi utilizada como modelo a linhagem enteroinvasiva de
Escherichia coli (EIEC) ATCC 43893, provinda da Coleção de Culturas do Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS/Fiocruz). A linhagem foi
cultivada em Caldo Tríptico de Soja (Sigma-Aldrich) para sua reativação. Alíquotas
dessa cultura foram conservadas em meio TSB contendo glicerol na concentração
de 20%, a -70ºC, para uso como inóculo, quando necessário.
41
3.3 Indução de infecção bacteriofágica in vitro
Para o isolamento de bacteriófagos presentes nas amostras ambientais,
foram aplicados, em meio de cultivo semissólido aquecido (0,35% de Agar), 100
μL do filtrado resultante da coleta (que contém os fagos) e 100 μL da cultura de E.
coli em fase exponencial de crescimento (OD600nm= 0,6 a 0,9). As placas foram
incubadas em estufa a 37ºC, por 24 horas. Após esse período, foi verificado o
aparecimento de placas de lise (zonas claras dentro da camada de crescimento
bacteriano), que indicaram as áreas de ocorrência de infecção e lise celular
(KESIK-SZELOCH et al., 2013; ADAMS, 1959).
3.4 Isolamento, purificação e armazenamento dos fagos das Unidades
Formadoras de Placa (UFP)
Para a purificação dos bacteriófagos foram realizadas sete passagens
sucessivas. Para cada passagem foi retirado, com o auxílio de uma ponteira, um
pequeno pedaço de ágar do centro da placa de lise. Essa placa foi transferida
para um tubo Eppendof de 1,5 mL, contendo 1 mL de tampão SM (20 mg/L Tris-
HCl, 10 mg/L MgSO4, 10 mg/L CaCl2, 100 mg/L NaCl, pH 7,5) (ANDREWS-
PFANNKOCH et al., 2010). Esse conteúdo foi levado ao vórtex para
desprendimento dos vírus presentes nas placas de ágar e posteriormente
centrifugou-se os tubos a 4410 g, por 15 minutos, a 4ºC para decantação do ágar
e das células bacterianas. O sobrenadante foi filtrado em filtros de acetato
de celulose com poros de 0,22 μm para obtenção de partículas virais purificadas,
que foram armazenadas a 4ºC, em tampão SM. Esse processo foi realizado para
possibilitar o isolamento de uma linhagem única de bacteriófagos.
3.5 Diluição seriada de fagos para utilização no isolamento de bacteriófagos
A fim de obter uma concentração ideal de fagos para a utilização no
isolamento, foram realizadas diluições seriadas da amostra final contendo os vírus
coletados anteriormente de cada placa de lise. Dessa forma, foram transferidos
100 μL dessa amostra para um microtubo estéril contendo 900 μL de tampão SM.
A partir dessa diluição foram tomados outros 100 μL e transferidos a um novo
42
microtubo, também contendo 900 μL de tampão. Foram realizadas sete diluições
idênticas a essa e testadas para padronização da melhor diluição.
3.6 Titulação de fagos e determinação de virulência
A contagem das placas de lise observáveis a olho nu foi feita e o número de
unidades virais infecciosas (título de fagos) foi expresso como unidades
formadoras de placa por mL (UFP/mL) (KESIK- SZELOCH, et al., 2013; ADAMS,
1959).
UFP/mL = n x FC x 10*
Tendo em vista que:
n é igual ao número de placa de lises contadas;
FC é o fator de correção (numero pelo qual o valor do inoculo utilizado deve
ser multiplicado para que se obtenha 1 mL);
10* é o inverso da diluição na qual foi encontrado o valor de n.
3.7 Análise da pureza das amostras virais
Visando analisar se havia presença de contaminação das amostras virais
com DNA bacteriano, foi realizada uma reação de PCR usando os primers 515F
(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) e 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-
3′) para a região V4 do gene do 16S rRNA bacteriano. Como controle positivo, foi
utilizado DNA de E. coli. A eletroforese em gel de agarose foi feita para avaliar os
resultados da PCR.
TABELA 1 - Reagentes para a reação de PCR
Reagente Volume DNA molde (5 ng/μL) 2,5 μl Primer forward (1μM) 5,0 μl Primer reverse (1μM) 5,0 μl
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12,5 μl Total 25,0 μl
FONTE: elaborado pelo autor.
43
A reação de PCR ocorreu em um termociclador Veriti® 96-Well (Applied
Biosystems®), utilizando como programação: uma desnaturação inicial a 95ºC por
5 minutos, seguida de 25 ciclos de desnaturação a 95ºC por 30 segundos,
anelamento dos primers a 55ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC, também por
30 segundos. A extensão final à temperatura de 70ºC teve duração de 5 minutos.
3.8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose a
0,5%. Foram aplicados 25 μl dos produtos de PCR, acrescidos de 5 μl de tampão
de amostra corado com GelRed™ (Biotium). Usou-se padrão de peso molecular
de 1 kb. O gel foi submetido a eletroforese a 100 V e os resultados foram
analisados no equipamento ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Bio-Sciences).
3.9 Extração do DNA de bacteriófagos
Foram incubadas placas da passagem 7, diluição 1:10 (diluição em que foi
verificado alto título de bacteriófagos, porém foi possível a visualização de placas
de lise) com 3 mL de tampão SM, por 24 horas, a 4ºC. Após esse período, a
superfície das placas foi raspada com uma alça de Drigalsky e o tampão,
contendo uma suspensão de células bacterianas íntegras, lisadas e partículas
virais, foi recolhido com uma seringa e submetido à filtragem em filtros com poros
de 0,22 μm. O filtrado (aproximadamente 2 mL), aqui denominado lisado
bacteriano, foi transferido para um tubo Falcon de 50 mL, tratado com 5 μl de
DNAse I e 5 μl de RNAse A, e incubado a 37ºC overnight. Uma alíquota dessa
solução foi reservada para a realização de PCR, e o restante foi tratado para a lise
das partículas virais. Para isso, a cada mL de lisado bacteriano, foram adicionados
12,5 μL de MgCl2, 40 μL EDTA a 0,5 M, 5 μL de proteinase K (10 mg/mL) e 50 μL
de SDS a 10%.
A mistura foi agitada vigorosamente, utilizando um vórtex, e incubada a
55ºC por uma hora, agitando novamente os tubos a cada intervalo de 20 minutos.
Em seguida, foram feitas alíquotas de 500 μl, em tubos Eppendorf de 1,5 mL, e a
esse conteúdo foi adicionado igual volume de uma mistura de
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e os tubos foram invertidos e agitados
44
para misturar homogeneamente o conteúdo. Os tubos foram centrifugados a
21.000 g por 30 minutos, a 4ºC.
A fase aquosa superior foi coletada e transferida para um novo tubo e
novamente foi adicionado igual volume de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico
(25:24:1) e os tubos foram invertidos e agitados para misturar homogeneamente o
conteúdo.
A fase aquosa superior foi coletada e transferida para um novo tubo e o
DNA foi precipitado com o dobro do volume de isopropanol gelado e 1/10 do
volume de acetato de sódio 3M. Esse material foi armazenado overnight a 4ºC.
No dia seguinte, centrifugou-se por uma hora, a 21.000 g, a 4ºC. A fase
líquida foi removida cuidadosamente sem desfazer o pellet. Ao tubo, foram
adicionados 500 μl de etanol 70% e centrifugou-se a 21.000 g por 20 minutos, a
4ºC. A fase líquida foi removida e deixou-se o pellet secar por alguns minutos. O
DNA foi dissolvido em 25 μl de 5 mM Tris-HCl (pH 8,0 a 8,5). Os tubos foram
armazenados em geladeira, overnight, e no dia seguinte, o DNA foi quantificado
em fluorímetro (Qubit) e armazenado em freezer a -20ºC.
3.10 Sequenciamento e análise do material genético dos bacteriófagos
O DNA gênomico dos fagos passou por uma etapa de construção de
bibliotecas, no qual se deu sua fragmentação, ligação de adaptadores e índex,
utilizando o kit Nextera Library Preparation Kit (Illumina, USA). Posteriormente foi
sequenciado de maneira paired-end (2x300bp) na plataforma MiSeq (Illumina,
USA) seguindo as recomendações dos fabricantes. Essa etapa foi realizada na
plataforma de sequenciamento de nova geração do Centro de Pesquisas René
Rachou (FIOCRUZ-MG).
3.11 Montagem e análise dos genomas virais
As sequências geradas foram pré-processadas com objetivo de remover
regiões de baixa qualidade. Para tal, foi utilizada a ferramenta Trimmomatic com
os parâmetros para exclusão dos nucleotídeos próximos às extremidades 5’ e 3'
com qualidade menor que 5 na escala Phred (Q) (BOLGER et al., 2014). Também
45
foram excluídos fragmentos de sequências em que uma média do valor Q em uma
janela de 4 nucleotídeos fosse menor que 20.
As sequências remanescentes após a filtragem foram mapeadas ao
genoma da linhagem enterohemorrágica de E. coli, O157:H7 Sakai, obtido no
banco de dados do Ensembl (HERRERO et al., 2016). Esse mapeamento,
realizado pela ferramenta Bowtie2, teve como objetivo retirar as sequências do
DNA bacteriano contaminante (LANGMEAD; SALZBERG, 2012). Fragmentos não
mapeados ao genoma referência da bactéria foram selecionados aleatoriamente
de maneira a permitir uma cobertura mínima de 120 vezes. A partir dessa seleção
foram montados os genomas utilizando a ferramenta SPADES, versão 3.6, e o
parâmetro “careful” para reduzir a probabilidade de erros (BANKEVICH et al.,
2012). O procedimento foi repetido por cem vezes com o objetivo de reduzir os
erros de sequenciamento que pudessem estar super-representados devido à alta
cobertura inicial. Os cem genomas montados foram utilizados para a construção
de um consenso através da ferramenta NUCmer (DELCHER et al., 2002). A
predição de genes foi realizada pela ferramenta utilizando o modelo de predição
para genes codificados por E. coli (LUKASHIN; BORODOVSKY, 1998). Tal
modelo foi selecionado pelo fato de se tratar do hospedeiro primário dos
bacteriófagos estudados, e é esperado que os genes a serem identificados sigam
seu uso de códons.
As proteínas produzidas pelos genes preditos na etapa anterior foram
classificadas funcionalmente utilizando uma busca ao banco de dados UniProt,
executado pela ferramenta BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Os melhores
resultados foram selecionados de acordo com um critério de cobertura maior que
50% da proteína referência do banco de dados, e melhor pontuação do BLAST
(BATEMAN et al., 2015). Isso confere uma classificação mais relacionada ao
contexto geral da proteína referência do que a um domínio funcional conservado.
Cada uma das proteínas anotadas foi associada a um grupo KEGG Orthology
(KO) através de ferramenta disponível na página do UniProt. (KANEHISA et al.,
2016).
Para análise comparativa da origem dos genes, as proteínas codificadas
foram agrupadas em ortólogos utilizando a ferramenta OrthoMCL (FISCHER et al.,
46
2011). Baseado nos resultados obtidos com o OrthMCL, foi feita a comparação
das sequências dos genes ortólogos com a ferramenta BRIG visando analisar o
nível de identidade dos órtologos em cada um dos genomas (ALIKHAN et al.,
2011).
47
4 RESULTADOS
4.1 Diluição seriada dos vírus
Através da diluição seriada foi possível isolar 12 bacteriófagos, os quais
foram denominados F1 a F12. Um exemplo de placas de lise geradas por esses
bacteriófagos pode ser visto na Figura 7. Todos os bacteriófagos tiveram seu
DNA extraído.
FIGURA 7 – Placas de lise geradas pelo bacteriófago F6.
Acima está representada a placa de Ptri contendo o cultivo bacteriano juntamente com o bacteriófago denominado F6. As placas de lise geradas por esse vírus são identificadas pelas áreas claras, livres de crescimento bacteriano, como o exemplo indicado pela seta. FONTE: elaborado pelo autor.
Ao final da etapa de diluição seriada, foram determinadas as diluições
1:100 e 1:1.000 como as ideais para o isolamento de placas de lise individuais, já
que as placas geradas a partir dessas diluições não se sobrepuseram, reduzindo
assim a possibilidade de isolamento de mais de uma linhagem viral (Figura 8).
48
FIGURA 8 - Diluição de 1:100 do bacteriófago F1.
As placas de lise estão identificadas como pontos. O número de placas de lise está circulado à direita (27). As placas de lise individuais foram retiradas para uso na próxima passagem, como apontado pela seta. FONTE: elaborado pelo autor. 4.2 Comparação da carga de bacteriófagos da estação de tratamento de
esgoto em diferentes coletas
As amostras coletadas no mês de abril apresentaram maior número de
placas de lise do que as coletadas no mês de agosto (Tabela 2). Isso pode ter
ocorrido pela possível influência das variações ambientais (como a temperatura)
sobre as comunidades bacterianas nessas amostras (ADRIAENSSENS; COWAN,
2014).
TABELA 2 – Quantidade de placas de lise verificadas nas diferentes coletas.
Mês de Coleta Abril Abril Agosto Agosto
Número de placas
de lise
11 9 0 2
FONTE: elaborado pelo autor.
49
4.3 Verificação da pureza do extrato viral
A verificação da pureza dos lisados virais por PCR indicou que o DNA
extraído estava livre de contaminação por DNA genômico bacteriano. A
eletroforese do DNA extraído em gel de agarose a 0,5% indicou a presença de
uma banda fraca de tamanho superior a 12 kpb (Figura 9), que possivelmente
representa o genoma viral.
FIGURA 9 – Eletroforese em gel de agarose a 0,5%.
1 - Amplicon do gene 16S rRNA de E. coli (aproximadamente 400 pb); 2 - Produto de PCR com primers para o gene 16S rRNA bacteriano da amostra do lisado do fago F1 (ausência de amplicon). FONTE: elaborado pelo autor.
50
4.4 Quantificação do DNA
Após a extração do material genético dos bacteriófagos seguindo os
protocolos descritos na metodologia desse trabalho, o rendimento obtido pode ser
visualizado na Tabela 3.
TABELA 3 - Rendimento do DNA isolado de bacteriófagos. Identificação da amostra Rendimento do DNA
(ng) F1 10.020 F2 3.180 F3 2.840 F4 400 F5 0 F6 1.710 F7 0 F8 1.860 F9 6.200
F10 2.250 F11 0 F12 6.000
FONTE: elaborado pelo autor.
Devido à baixa concentração do DNA extraído para F4, F5, F7 e F11 o
material genético de apenas 8 dos 12 bacteriófagos isolados (F1, F2, F3, F6, F8,
F9, F10 e F12) foi submetido a sequenciamento e posterior montagem e análise
funcional.
4.5 Caracterização dos genomas virais
O sequenciamento deu origem a mais de 60.000 sequências por
bacteriófago. O número exato de sequências geradas, filtradas e utilizadas na
etapa de montagem dos genomas está indicado na Tabela 4.
TABELA 4 – Quantidade de sequências antes e após a filtragem.
Sequências ao final do sequenciamento
Sequências após filtro qualidade
Sequências após filtro E. coli
F1 1.097.008 958.383 945.841 F2 279.072 237.293 148.717 F3 2.820.550 2.330.143 2.324.383 F6 732.676 668.44 666.68
51
F8 3.127.184 2.997.162 2.993.555 F9 332.393 306.321 305.284 F10 518.159 404.552 403.014 F12 34.911 31.932 31.763 A primeira coluna da tabela contém o número total de sequências geradas ao final do sequenciemento. A segunda coluna contém o número de sequências remanescentes após ser utilizado o filtro de qualidade pela ferramenta Trimommatic. A terceira coluna contém o número final de sequências após a filtragem visando remoção de possível DNA bacteriano. FONTE: elaborado pelo autor.
O genoma do bacteriófago F1 resultou em 38 contigs, sendo o seu tamanho
aproximado igual a 93.557 pb e o conteúdo GC igual a 42%; F2 apresentou
genoma formado por 522 contigs, com tamanho aproximado de 526.978 pb, sendo
seu conteúdo GC igual a 40,4%; F3 resultou em 1 contig, com tamanho de
334.163 pb e conteúdo GC igual a 35,45%; F6 resultou em 1 contig de 677.814 pb
e conteúdo GC igual a 37,64%; F8 deu origem a 1 contig com 339.235 pb e %GC
equivalente a 37,64%; F9 resultou em 39 contigs, seu conteúdo GC foi igual a
48,90% e o tamanho do seu genoma é 191.788 pb. O bacteriófago F10 apresenta
genoma com tamanho aproximado de 58.863 pb e conteúdo GC de 43.6%; F12 é
formado por 108 contigs, tendo %GC = 47,80% e genoma com 128.523 pb. O
tamanho médio dos contigs variou de 1.199 pb a 677.814 pb. O número de genes
preditos nos genomas variou de 72 a 465. Todos os bacteriófagos tiveram mais de
50% dos seus genes sem função definida, como pode ser visto na tabela 5.
TABELA 5 – Características dos genomas montados. Bacteriófago Contigs Conteúdo G+C Tamanho total N50 Genes
F1 38 42% 93.557 pb 55.286 pb 105 67F2 522 40,40% 526.978 pb 1.199 pb 465 375F3 1 35,45% 334.163 pb 334.163 pb 254 155F6 1 37,66% 677.814 pb 677.814 pb 256 153F8 1 37,64% 339.235 pb 339.235 pb 253 147F9 39 48,90% 191.788 pb 30.599 pb 208 154F10 3 43.6% 58.863 pb 57.900 pb 72 49F12 108 47,80% 128.523 pb 1.366 pb 183 125
Genes sem função descrita
Coluna 1: identificação dos fagos; 2: número de contigs montados; 3: conteúdo G+C dos genomas; 4: tamanho total dos genomas; 5: tamanho médio dos contigs; 6: número total de genes; 7: número de genes sem função descrita na literatura. FONTE: elaborado pelo autor.
52
A comparação dos genes classificados como ortólogos pela ferramenta
OrthoMCL sugere que os ortólogos dos vírus F3, F6 e F8 possuem alta identidade
entre si, assim como os genes ortólogos dos bacteriófagos F9 e F12 (Gráfico 1).
GRÁFICO 1 – Comparação dos genes possivelmente ortólogos dos bacteriófagos utilizando a ferramenta BRIG.
A figura acima ilustra o resultado da comparação entre os genes possivelmente ortólogos. O círculo interno, em vermelho, é constituído por todos os genes dos bacteriófagos e é utilizado como referência para a comparação. Os possíveis ortólogos estão ilustrados exteriormente a ele. As diferentes cores estão relacionadas ao nome do bacteriófago e ao nível de identidade entre os genes, como pode ser visto na legenda do interior da figura. FONTE: elaborado pelo autor.
A classificação funcional dos genomas dos bacteriófagos mostrou que
todos os vírus sequenciados tiveram a presença de genes produtores de proteínas
53
líticas e apenas F2 teve a presença de genes relacionados ao ciclo lisogênico
(Quadro 2 a Quadro 9). A relação de genes encontrados em cada genoma está
na Tabela 6 à Tabela 13.
Quadro 2 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos genes do
bacteriófago F1.
Metabolismo
6-carboxy-5,6,7,8-tetrahydropterin synthase
Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotide hydrolase
GTP cyclohydrolase 1
7-cyano-7-deazaguanine synthase
Organic radical activating enzyme
Síntese, empacotamento, recombinação e reparo de DNA
DNA polymerase beta subunit
DNA polymerase elongation subunit 1
RNAse H
ATP-dependent DNA ligase
Superfamily II DNA/RNA helicase
DNA primase
ATPase
Estruturais
Tail fiber assembly protein
Side tail fiber
Tape measure protein
Terminase large subunit
Tail subunit
Tail protein
Transferase
Queuosine tRNA-ribosyltransferase
Lise
Lysis protein
FONTE: elaborado pelo autor.
54
Quadro 3 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos genes do
bacteriófago F2.
Metabolismo
Lipopolysaccharide core biosynthesis protein
Biotin sulfoxide reductase 2 (Fragment)
Bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase, nonfunctional (Fragment)
Chain length determinant protein
Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase (Fragment)
Síntese e empacotamento, recombinação e reparo de DNA
Gp61 DNA primase subunit
RNA-DNA + DNA-DNA helicase
DNA primase-helicase subunit
DNA binding protein
Gp33 T4-like late promoter transcription accessory protein
IS1 protein
Transcriptional regulatory domain protein
Transposase family protein
Resolvase, N terminal domain protein (Fragment)
Phage-related DNA-binding protein
Transposase family protein (Fragment)
VirF
Initiator RepB protein (Replication protein)
ATPase subunit of terminase family protein
Gp59 T4-like loader of gp41 DNA helicase
Transferase
Glycosyl transferase, group 2 family protein
Lipopolysaccharide glucosyltransferase I
UDP-galactose:(Glucosyl) LPS alpha-1,3-galactosyltransferase
55
Estruturais
Head completion protein
Tailspike protein
Gp15 proximal tail sheath stabilization protein
Gp59 T4-like loader of gp41 DNA helicase
Lise
Lyase
Lisogenia
Integrase
Imunidade
Colicin E1 immunity protein
FONTE: elaborado pelo autor.
Quadro 4 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos genes do
bacteriófago F3.
Metabolismo
DN 3'phosphatase
Endonuclease II
NrdB aerobic NDP reductase, small subunit
Putative homing endonuclease
Putative thymidylate synthase
Dihydrofolate reductase, phage-associated
Anaerobic NTP reductase small subunit
Síntese, empacotamento, recombinação e reparo de DNA
RNA ligase 2 (Rnl2)
RNA-DNA and DNA-DNA helicase ATPase
DNA ligase
RNA ligase 1
Ribonucleoside-diphosphate reductase
Single-stranded DNA binding protein
DNA helicase loader protein
56
Topoisomerase II medium subunit
Gp15
Gp18
DNA helicase
RNA polymerase ADP-ribosylase
Mobile nuclease
DNA primase-helicase subunit
DNA polymerase
Clamp loader subunit DNA polymerase accessory protein
RNA polymerase binding protein
Recombination endonuclease subunit
AAA domain-containing protein
Thymidine kinase
Valyl-tRNA synthetase modifier
DNA end protector during packaging
RNA ligase 2
Estruturais
Major head protein
Capsid vertex protein gp24
Putative large head outer capsid protein
Base plate protein gp25
Baseplate hub subunit
Baseplate hub assembly protein
Base plate hub subunit
Baseplate distal hub subunit
Baseplate hub subunit tail length determinator
Capsid and scaffold protein
Tail fiber protein
Hypothetical membrane protein
Phage long tail fiber proximal subunit
Tail fiber protein p36
57
Long tail fiber distal subunit
Tail fiber adhesin
Small outer capsid protein
Tail completion and sheath stabilizer protein
Head completion protein
Phage baseplate wedge
Phage baseplate wedge initiator
Gp8 base plate wedge
Phage baseplate wedge
Baseplate wedge subunit and tail pin
Neck protein
Neck protein
Tail sheath stabilizer and completion protein
Terminase small subunit
Tail sheath protein
Tail tube protein
Portal vertex of the head
Prohead core protein
Prohead core protein
Prohead core scaffold protein
Gp24 of head vertex subunit
Transferase
Deoxycytidylate 5-hydroxymethyltransferase
Alpha-glucosyl-transferase
Alpha-glucosyl-transferase
Lise
Holin lysis protein
Inhibitor of host Lon protease
Lysozyme (EC 3.2.1.17)
Nudix hydrolase
Lysozyme (EC 3.2.1.17)
FONTE: elaborado pelo autor.
58
Quadro 5 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos genes do
bacteriófago F6.
Metabolismo
Aerobic NDP reductase small subunit
Anaerobic NTP reductase large subunit
Deoxycytidylate deaminase
Deoxynucleoside monophosphate kinase
DNA endonuclease IV
dTMP thymidylate synthase
Frd (Frd dihydrofolate reductase)
Inh inhibitor of prohead protease gp21
Inhibitor of host transcription
Nucleoid disruption protein
Pin protease inhibitor
Síntese, empacotamento, recombinação e reparo de DNA
Activator of middle period transcription
Aerobic NDP reductase small subunit
AroG
Clamp loader small subunit
DNA helicase
DNA ligase
DNA polymerase (EC 2.7.7.7)
DNA topoisomerase II medium subunit
DsDNA-binding, transcription factor
Endonuclease II
Endonuclease V, N-glycosylase UV repair enzyme
Exonuclease subunit 2 (EC 3.1.11.-) (Protein Gp46)
Gp49 EndoVII packaging and recombination endonuclease VII
59
Helicase loading protein
Late promoter transcription accessory protein
Portal protein
RecA-like recombination protein
Recombination, repair and ssDNA binding protein
Ribonucleoside-diphosphate reductase (EC 1.17.4.1)
RnaseH
Single-stranded DNA binding protein
Sliding clamp
Terminase DNA packaging enzyme, large subunit
Thymidine kinase (EC 2.7.1.21)
Topoisomerase II large subunit
Transcription modulator under heat shock
Translational regulator
UvsW RNA-DNA and DNA-DNA helicase, ATPase
Vs valyl-tRNA synthetase modifier
Estruturais
Baseplate hub assembly
Baseplate hub distal subunit
Baseplate hub subunit
Baseplate hub subunit, tail length determinator
Baseplate tail tube junction
Baseplate tail tube junction
Baseplate wedge subunit
Baseplate wedge subunit and tail pin
Baseplate wedge tail fiber connector
Chaperone for tail fiber formation
Gp24 head vertex protein
Head completion protein
Head scaffolding protein
Internal head protein with nuclease inhibitor activity
60
Large head outer capsid protein
Major capsid protein
Neck protein
Phage tail fibers
Prohead core protein
Sheath completion
Tail completion and sheath stabilizer protein
Tail sheath protein
Tail tube protein
Lise
Lysozyme (EC 3.2.1.17)
Nudix hydrolase
Phage holin
FONTE: elaborado pelo autor.
Quadro 6 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos genes do
bacteriófago F8.
Metabolismo
AroG
Deoxycytidylate deaminase
NrdG
Nucleoid disruption protein
Pin protease inhibitor
Thioredoxin
Thymidylate synthase
Síntese, empacotamento, recombinação e reparo de DNA
Activator of middle period transcription
ADP-ribosylase
Aerobic NDP reductase small subunit
Clamp loader small subunit
DenV endonuclease
61
Deoxynucleoside monophosphate kinase
DNA endonuclease IV
DNA helicase
DNA ligase
DNA polymerase (EC 2.7.7.7)
DNA topoisomerase II large subunit
DsDNA-binding, transcription factor
Endonuclease II
Endonuclease subunit
Exonuclease
Exonuclease subunit 2 (EC 3.1.11.-) (Protein Gp46)
Gp49 EndoVII packaging and recombination endonuclease VII
Gp52 topoisomerase II, medium subunit
Gp61 DNA primase subunit
Gp59
Large terminase protein
RecA-like recombination protein
Recombination, repair and ssDNA binding protein
RegA translational repressor protein
Ribonuclease H
Ribonucleoside-diphosphate reductase (EC 1.17.4.1)
RNA ligase
RNA polymerase ADP-ribosylase
RNaseH ribonuclease
Single-stranded DNA binding protein
Site-specific RNA endonuclease
Sliding clamp
Terminase small subunit
Thymidine kinase (EC 2.7.1.21)
Transcription modulator under heat shock
UvsW RNA-DNA and DNA-DNA helicase, ATPase
62
Vs valyl-tRNA synthetase modifier
Estruturais
Baseplate hub assembly
Baseplate hub distal subunit
Baseplate hub subunit, tail length determinator
Baseplate hub subunit
Baseplate tail tube junction
Baseplate wedge subunit
Baseplate wedge subunit and tail pin
Baseplate wedge tail fiber connector
Capsid vertex protein
Chaperone for tail fiber formation
Head completion protein
Head scaffolding protein
Internal head protein
Large head outer capsid protein
Long tail fiber distal subunit
Major capsid protein
Neck protein
Phage tail fibers
Portal protein
Prohead core protein
Sheath completion
Sheath protein
Tail completion and sheath stabilizer protein
Tail tube
Lise
Lysozyme (EC 3.2.1.17)
63
NudE nudix hydrolase
Phage holin
FONTE: elaborado pelo autor.
Quadro 7 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos genes do
bacteriófago F9.
Metabolismo
Nucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase
Ribose-phosphate pyrophosphokinase (EC 2.7.6.1)
Transferase
Nicotinamide phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.12)
Síntese, empacotamento, recombinação e reparo de DNA
DNA binding protein
DNA helicase
DNA ligase
DNA polymerase (EC 2.7.7.7)
DNA primase-helicase subunit
DNA topoisomerase
DNA topoisomerase II (Fragment)
DnaB-like helicase C terminal domain protein
Gp16 terminase DNA packaging enzyme small subunit
Gp17 terminase DNA packaging enzyme large subunit
Gp32 T4-like ssDNA binding protein
Gp33 T4-like late promoter transcription accessory protein
Gp44 clamp loader subunit DNA polymerase accessory protein
Gp45 sliding clamp DNA polymerase accessory protein
64
Gp52 topoisomerase II medium subunit
Gp61 DNA primase subunit
Gp62 clamp loader subunit DNA polymerase accessory protein
Helicase loader
Initiator RepB protein (Replication protein)
Recombination and repair protein UvsX
RegA translational repressor protein
Ribonucleoside-diphosphate reductase (EC 1.17.4.1)
Ribonucleotide reductase of class Ia (Aerobic) beta subunit (EC 1.17.4.1)
RNA-DNA and DNA-DNA helicase UvsW
RNAseH
UvsX RecA-like recombination protein
Estruturais
Base plate family protein
Gp14 neck protein
Gp15 proximal tail sheath stabilization protein
Gp20 portal vertex protein of head
Gp22 prohead core protein
Gp23 major capsid protein (Fragment)
Gp3 tail completion and sheath stabilizer protein
Gp4 head completion protein
Gp48 putative tail tube associated base plate protein
Gp5 baseplate hub subunit and tail lysozyme
Gp53 baseplate wedge subunit
65
Gp6 baseplate wedge subunit
Major capsid protein g23 (Fragment)
Neck protein gp14 (Gene product 14) (gp14)
Tail fiber protein
Tail tube protein
Tailspike protein
Lise
Lyase (Fragment)
FONTE: elaborado pelo autor.
Quadro 8 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos genes do
bacteriófago F10.
Metabolismo
Deoxyuridine 5'-triphosphatenucleotidohydrolase
GTP cyclohydrolase 1
6-carboxy-5,6,7,8-tetrahydropterin synthase
7-cyano-7-deazaguanine synthase
Organic radical activating enzyme
Síntese, empacotamento, recombinação e reparo de DNA
Superfamily II DNA/RNA helicase
ATP-dependent DNA ligase
DNA primase
DNA polymerase elongation subunit 1
DNA polymerase beta subunit
RNAse H
ATPase
Estruturais
Terminase large subunit
Main coat protein
66
Tail protein
Tail subunit
Tape measure protein
Side tail fiber
Tail fiber assembly protein
Host specificity protein
Transferase
Queuosine tRNA-ribosyltransferase
Lise
Lysis protein
Phage holin
FONTE: elaborado pelo autor.
Quadro 9 - Classificação funcional de algumas das proteínas produzidas pelos genes do
bacteriófago F12.
Síntese, empacotamento, recombinação e reparo de DNA
Topoisomerase II large subunit (Topoisomerase II large subunit C-terminal region)
Recombination endonuclease subunit
Gp43 DNA polymerase
RNA-DNA + DNA-DNA helicase
Terminase DNA packaging enzyme large subunit
DNA primase-helicase subunit
DNA helicase
RNAseH
PhoH-like protein
Gp33 T4-like late promoter transcription accessory protein
Large terminase subunit
DNA topoisomerase 2
Gp45 sliding clamp DNA polymerase accessory protein
Gp61 DNA primase subunit
Gp52 topoisomerase II medium subunit
DNA polymerase
67
Estruturais
Tail fiber protein
Tailspike protein
Tail tube protein
Gp48 baseplate tail tube cap
Gp3 tail completion and sheath stabilizer protein
Gp53 baseplate wedge subunit
Gp15 proximal tail sheath stabilization protein
Gp5 baseplate hub subunit and tail lysozyme
Gp14 neck protein
Viral capsid assembly protein
Gp23 major capsid protein
Lise
Lyase
FONTE: elaborado pelo autor.
68
TABELA 6 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F1.
Identificador Proteína Gene Tamanho
X2KTT1 6‐carboxy‐5,6,7,8‐tetrahydropterin synthase 9g_00005 177
X2KU64 GTP cyclohydrolase 1 9g_00004 204
X2L008 Queuosine tRNA‐ribosyltransferase 9g_00003 317
X2KSN7 DNA polymerase beta subunit 9g_00002 330
X2KP98 DNA polymerase elongation subunit 1 9g_00001 657
X2KPE1 Tail fiber assembly protein 9g_00071 192
X2KTY7 Side tail fiber 9g_00070 1211
X2L058 Host specificity protein 9g_00068 1029
X2KUA9 Tape measure protein 9g_00064 1086
X2L019 Deoxyuridine 5'‐triphosphatenucleotidohydrolase
9g_00018 169
X2KPA7 RNAse H 9g_00016 196
X2KTT7 ATP‐dependent DNA ligase 9g_00015 291
X2KU72 ATPase 9g_00014 256
X2KPA5 Superfamily II DNA/RNA helicase 9g_00011 667
X2KPD4 Tail subunit 9g_00061 393
X2KUA6 Tail protein 9g_00059 139
X2KTU7 DNA primase 9g_00025 755
X2KTW4 Lysis protein 9g_00045 166
D2AJH9 IpaJ, invasion plasmid antigen ipaJ SFxv_4965 242
B3X714 Protein IpgB Sd1012_4490 113
B3X756 OspC2 Sd1012_3244 484
I6CHT0 Invasin IpaB family protein SFK315_3091 206
J2ZHD4 Spa47 domain protein spa47 SSMOSELEY_1368 68
Q55285 ORF1 60
F5P4G8 Invasin ipaA domain protein SFK227_5406 SFK227_5434
197
J2N7U0 Bacterial regulatory helix‐turn‐helix s, AraC family protein
SSMOSELEY_0002 234
J2G911 Bacterial type II/III secretion system short domain protein
SSMOSELEY_1375 199
Q8KXQ9 IpaB (Fragment) ipaB 306
F3V4P5 NleE domain protein SD15574_1405 44
F3V305 OspD1 domain protein SD15574_0797 41
B2TTA0 Protease 7 (EC 3.4.23.‐) SbBS512_A0311 326
A0A1K9 Initiator RepB protein (Replication protein) repE ERS085366_04868 UC41_06395
233
A4SH38 Colicin E1 immunity protein imm SSON_PB02 113
D8BRD0 Colicin pore forming domain protein HMPREF9551_00172 460
X2L013 Organic radical activating enzyme 9g_00008 254
X2KPA0 7‐cyano‐7‐deazaguanine synthase 9g_00006 471
B2TSZ7 MxiC SbBS512_A0180 355
FONTE: elaborado pelo autor.
69
TABELA 7 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F2.
Identificador Proteína Gene Tamanho
H9UWA1 Surface presentation of antigens protein SpaS spaS P12B_c2957 243
K3KK56 Type III secretion apparatus protein, YscR/HrcR family
epaP ECN1_3018 221
H9UWA5 Type III secretion system apparatus protein YscQ/HrcQ
epaO P12B_c2961 315
H9UQQ1 IS1 protein P12B_c0974 167
Q31SP3 Plasmid segregation protein parA SBO_P043 399
Q31SM4 IS600 ORF1 SBO_P062 100
A0A070SGH2 Transcriptional regulatory domain protein yqeI AC45_5537 139
I6FGP2 Transposase family protein SD22575_4945 249
S1I8K1 Radical SAM additional 4Fe4S‐binding SPASM domain‐containing protein
A1WS_02075 203
Q7DC26 RhsC protein in rhs element Z0848 73
A0A0B1MVP7 Surface exclusion protein PU06_18645 165
A4SH38 Colicin E1 immunity protein imm SSON_PB02 113
A0A069WWQ5
Resolvase, N terminal domain protein (Fragment)
AD16_5641 78
N2QN37 NAD‐dependent dihydropyrimidine dehydrogenase sunbunit PreT domain protein
EC2875150_2510 53
U5PUI9 DNA binding protein Marshall_98 92
W1V5I2 Fimbrial‐like protein ybgD (Fragment) Q610_ECBC00376G0001 61
T6L1D4 TraT complement resistance protein G749_05193 91
B7MDH1 Toxin of the YoeB‐YefM toxin‐antitoxin system yoeB ECS88_2116 84
B7MDH2 Antitoxin yefM ECS88_2117 83
B7MCP7 Probable transcriptional regulatory protein YeeN
yeeN ECS88_2051 238
I3VZV0 Molecular chaperone 125
H9UYH6 Glycosyl transferase, group 2 family protein waaV P12B_c3752 327
E3PMY9 Lipopolysaccharide core biosynthesis protein ETEC_3868 230
H9UYI0 Lipopolysaccharide glucosyltransferase I rfaJ P12B_c3756 331
E3PMZ1 UDP‐galactose:(Glucosyl) LPS alpha‐1,3‐galactosyltransferase
ETEC_3870 338
W1XHF8 Biotin sulfoxide reductase 2 (Fragment) Q604_UNBC15760G0001 132
K8WUM7 Phage‐related DNA‐binding protein OOA_11358 120
F5B3T4 Head completion protein gp4 SCRM01_064c 139
H8ZNH7 Gp61 DNA primase subunit 104
Q9XJ82 Gp17v (Fragment) 17v 248
W1YL15 Bifunctional acetaldehyde‐CoA/alcohol dehydrogenase, nonfunctional (Fragment)
Q604_UNBC04170G0001 60
K0X8D6 Transposase family protein (Fragment) SF148580_1305 159
Q31SN4 VirF virF SBO_P052 262
L2VDS0 Protein yiaL WCM_00987 92
I6DSJ3 Mutated periplasmic disulfide isomerase SB96558_0843 40
Q3YTS0 OspC3 ospC3 SSON_P072 484
70
Q327J0 Acid phosphatase (EC 3.1.3.2) apy phoN2 SDY_P004 246
Q3YTY8 OspB ospB SSON_P003 288
A0A1K9 Initiator RepB protein (Replication protein) repE ERS085366_04868 UC41_06395
233
U9XZE6 Chain length determinant protein HMPREF1589_03529 137
B2TT20 ISL3 family transposase SbBS512_A0206 125
B2TSM6 Killing factor SbBS512_A0024 239
Q31SS0 OspD2 ospD2 SBO_P016 569
A4SH43 Entry exclusion protein 2 exc SSON_PB07 139
B6IC08 ParB protein ECSE_P1‐0040 138
A0A0B1M885 Integrase (Uncharacterized protein) PU06_28870 SM09_00423
75
U9ZSU3 Hemagglutinin (Fragment) HMPREF1620_04091 126
K3KMD8 Sensor evgS domain protein (EC 2.7.3.‐) evgS ECN1_2506 1127
F5NW70 IbrB domain protein SFK227_2383 112
C8URC9 Probable Replication regulatory protein RepA2 ECO111_p3‐14 85
C8XUV3 SegD‐like protein orf00242 228
C8XUD1 Cd allosteric enzyme orf00033 168
I6YMU9 DNA primase‐helicase subunit 137
W1XLL6 Flagellar hook‐basal body complex protein FliE (Fragment)
Q604_UNBC14451G0001 52
K0XMD1 ATPase subunit of terminase family protein SF148580_5100 156
W1V3P7 Bacterial transcription activator, effector binding protein (Fragment)
Q610_ECBC00105G0001 122
A0A0A6ZZY1 Transposase Asd1617_04379 43
I6B9S2 Inner membrane protein CbrB cbrB SF285071_4460 118
D2AJ59 IS3 orf2 SFxv_4845 39
F3V580 Gifsy‐2 prophage protein SD15574_1593 111
F3V579 Exonuclease VIII domain protein SD15574_1592 45
W1FTA4 Phosphoglycerate transporter protein PgtP 148
C8XUP1 RegA translational repressor protein orf00162 154
W1Y4H9 Transcriptional activator feaR (Fragment) Q604_UNBC09665G0001 87
W1XX30 Low affinity tryptophan permease protein (Fragment)
Q604_UNBC10698G0001 114
W1YC61 Tryptophanase protein (Fragment) Q604_UNBC07235G0001 65
A0A029MPP8 DnaJ domain protein AB99_1984 647
C8XUD9 Gp59 T4‐like loader of gp41 DNA helicase orf00041 221
S1D332 Protein rhsA (Fragment) A1U1_03810 184
Q31SK3 TonB‐like colicin Js sensitive putative membrane protein
cjrB SBO_P083 258
W1YE43 CjrA protein (Fragment) Q604_UNBC05439G0001 63
I6D0J8 OspC3 domain protein SFK315_0965 66
V0ADC6 Fimbrial usher protein HMPREF1620_01518 273
C8UH79 Hcp‐like protein ECO111_0217 160
F4NI87 Surface composition regulator glgS SSJG_01882 68
M9ENX1 Fimbrial family protein EC174750_3347 163
W1X8I1 Phospho‐2‐dehydro‐3‐deoxyheptonate Q609_ECAC00699G0001 57
71
aldolase (Fragment)
B7L5C1 DicA protein dicA EC55989_1734 135
M2NV47 Transporter protein (Fragment) A364_23868 196
Q31SK9 OspC1 ospC1 SBO_P077 470
C8XUS2 Gp15 proximal tail sheath stabilization protein orf00199 231
E3SMV7 RNA‐DNA + DNA‐DNA helicase uvsW PHM1_126 279
I0VY98 TRAP transporter, DctM subunit ECW26_03730 310
F8X6A9 Lipopolysaccharide core biosynthesis glycosyl transferase RfaQ
HMPREF9349_00263 64
X4YGA2 Tailspike protein 185
M4MEQ6 Lyase (Fragment) gp17 713
E1JES9 Transcriptional regulator, AlpA family HMPREF9347_05485 111
C8XUH2 Gp33 T4‐like late promoter transcription accessory protein
orf00076 81
Q5GFL8 Gnd (Fragment) Gnd 86
FONTE: elaborado pelo autor.
TABELA 8 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F3.
Identificador Proteína Gene Tamanho
A0A0A0PU16 AAA domain‐containing protein HY01_0088 322
A0A097J4G8 Activator of host PrrC lysyl‐tRNA endonuclease
stp RB9_261 26
G0X5W8 Adenosylribosyl‐transferase packaged injected with DNA
697
A0A097J8M4 Alpha‐glucosyl‐transferase a‐gt RB68_063 400
A0A097J8Q6 Anaerobic NTP reductase small subunit nrdG RB68_080 156
A0A097J922 Base plate hub subunit RB68_190 390
Q712G0 Base plate protein gp25 25 132
D4Z9Z2 Baseplate distal hub subunit 28 AR1_196 191
A0A097J8Z0 Baseplate hub assembly protein RB68_189 250
G0X5V9 Baseplate hub subunit 208
A0A097J905 Baseplate hub subunit tail length determinator
RB68_192 590
A0A097J7B8 Baseplate wedge subunit and tail pin RB55_p155 602
I6ZYE7 Capsid and scaffold protein ECML134_207 111
D4Z9X5 Capsid vertex protein gp24 (Gene product 24) (gp24)
24 AR1_179 427
A0A097J8M0 Clamp loader subunit DNA polymerase accessory protein
RB68_051 319
S5M332 dCTPase 172
G1FHP2 Deoxycytidylate 5‐hydroxymethyltransferase gp42 246
I7LF46 Dihydrofolate reductase, phage‐associated g241 BN81_241 193
C3V1T0 DN 3'phosphatase pseT RB14ORF218 301
A0A097J8V4 DNA end protector during packaging RB68_149 274
A0A097J641 DNA helicase dda RB33_016 439
72
A0A0A0PSM9 DNA helicase loader protein HY01_0233 217
A0A023ZW70 DNA ligase e112_210 487
A0A097J8K9 DNA polymerase (EC 2.7.7.7) RB68_048 898
K4FCG3 DNA primase‐helicase subunit ACG‐C40_0039 475
A0A097J925 Endonuclease II denA RB68_226 136
C3V1Y3 Endonuclease IV denB RB14ORF271 185
Q8H9J6 Endoribonuclease regB 153
A0A097BWM2 Gp15 pSs1_0014 312
A0A097BWL3 Gp18 pSs1_0017 605
C3V1N5 Gp24 of head vertex subunit 24 RB14ORF173 427
A0A097BWM5 Gp29 pSs1_0028 81
Q08I13 Gp30.1 30.1 89
A0A097BWS4 Gp79 pSs1_0078 108
C3V1L6 Gp8 base plate wedge 8 RB14ORF154 334
A0A097BWT1 Gp80 pSs1_0079 66
A0A097J8Y0 Head completion protein RB68_150 150
D4ZA56 Holin lysis protein t AR1_260 218
A0A097J4K1 Homing endonuclease segG RB9_237 210
A0A097J3Z7 Inhibitor of host Lon protease pin RB9_080 161
K4FC21 Inhibitor of prohead protease ACG‐C40_0178 226
A0A060BN58 Long tail fiber distal subunit JS09_0201 1080
A0A0A0PUN6 Lysozyme (EC 3.2.1.17) HY01_0140 575
I7B328 Lysozyme (EC 3.2.1.17) ECML134_123 164
A0A0A0PUJ6 Macro domain‐containing protein HY01_0105 159
S5M3C4 Major head protein 521
A0A0A7HEC4 Mobile nuclease mobE VR5_028 218
D4Z9G8 ModB ADP‐ribosylase modB AR1_022 207
A0A097J3T3 Modifier of transcription motB RB9_011 157
A0A0A0PUH7 Mur ligase domain‐containing protein HY01_0085 135
S5M7B8 Neck protein 309
A0A023ZVH7 Neck protein e112_173 256
D4ZA33 NrdB aerobic NDP reductase, small subunit nrdB AR1_237 392
D4Z9M2 NrdH glutaredoxin nrdH AR1_076 140
D4ZA69 Nuclear disruption protein ndd AR1_273 147
D4Z9S4 Nudix hydrolase nudE AR1_128 151
I7A903 Phage baseplate wedge ECML134_145 196
I6ZYA9 Phage baseplate wedge ECML134_152 288
I7KRS9 Phage baseplate wedge initiator g159 BN81_159 1032
G1FHG6 Phage long tail fiber proximal subunit gp34 1289
G1FH59 Phage protein e.8 109
A0A097J901 Portal vertex of the head RB68_170 524
D4Z9G6 Postulated decoy of host sigma70 or sigmaS srd AR1_020 251
A0A097J8X6 Prohead core protein RB68_171 78
A0A097J8Y3 Prohead core protein RB68_172 141
A0A097J8X7 Prohead core scaffold protein RB68_174 269
I7B359 Prohead core scaffold protein and protease ECML134_168 212
73
FONTE: elaborado pelo autor.
TABELA 9 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F6.
Identificador Proteína Gene Tamanho
A0A067ZJI3 Activator of middle period transcription PhAPEC2_245 210
A0A060BN31 ADP‐ribosyltransferase JS09_0248 695
A0A067ZHI2 Aerobic NDP reductase small subunit PhAPEC2_219 392
A0A067ZJA5 Anaerobic NTP reductase large subunit PhAPEC2_75 605
C3V1D8 Anaerobic nucleotide reductase subunit nrdG RB14ORF76 156
A0A088FVY9 AroG 330
A0A088FVM3 Baseplate hub assembly 250
A0A088FVX6 Baseplate hub distal subunit 177
A0A088FRD6 Baseplate hub subunit 208
A0A088FR65 Baseplate hub subunit 390
A0A023ZUE0 Recombination endonuclease subunit e112_059 560
Q0ILH2 Ribonucleoside‐diphosphate reductase (EC 1.17.4.1)
nrdA 754
G0X5C4 RIIA protein 725
G1FHE7 RNA ligase 1 rnlA 374
P32277 RNA ligase 2 (Rnl2) (EC 6.5.1.3) Y10A 24.1 334
S5M9D8 RNA ligase 2 rnlB 334
G0X5W7 RNA polymerase ADP‐ribosylase 685
A0A023ZVR7 RNA polymerase ADP‐ribosylase e112_021 200
S5M716 RNA polymerase binding protein rpbA 129
A0A023ZUU5 RNA‐DNA and DNA‐DNA helicase ATPase e112_192 80
A0A097J8Z3 RNA‐DNA and DNA‐DNA helicase ATPase uvsW RB68_182 503
G0X593 RNase H ribonuclease 305
A0A023ZU24 Sigma factor e112_068 187
S5ML91 Single‐stranded DNA binding protein 301
A0A097J5E2 Small outer capsid protein soc RB27_030 85
A0A097J8W9 Tail completion and sheath stabilizer protein RB68_148 176
A0A097J7P2 Tail fiber adhesin RB55_p247 183
I7AU89 Tail fiber protein ECML134_209 78
I7B392 Tail fiber protein ECML134_208 102
G1FHG8 Tail fiber protein p36 gp36 221
A0A097J7A8 Tail sheath protein RB55_p164 659
A0A097J7B7 Tail sheath stabilizer and completion protein RB55_p161 272
A0A097J8X1 Tail tube protein RB68_169 163
I7A916 Terminase small subunit ECML134_160 164
A0A0A0PUJ1 Thymidine kinase (EC 2.7.1.21) HY01_0100 193
G0X5B0 Topoisomerase II medium subunit 442
A0A097J8J7 Transcription modulator srh RB68_026 67
A0A097J8H9 Transcription modulator under heat shock mrh RB68_027 161
A0A097J8T5 Valyl‐tRNA synthetase modifier vs RB68_118 113
74
A0A060BHK9 Baseplate hub subunit, tail length determinator JS09_0252 590
A0A088FRE0 Baseplate tail tube junction 369
A0A088FVM8 Baseplate tail tube junction 320
A0A060BDK5 Baseplate wedge subunit JS09_018 657
A0A060BHJ3 Baseplate wedge subunit JS09_017 1032
A0A060BHJ8 Baseplate wedge subunit JS09_022 191
E1A1H9 Baseplate wedge subunit phiAS4_ORF0131 304
A0A060BN47 Baseplate wedge subunit JS09_016 334
A0A088FSA4 Baseplate wedge subunit 132
A0A060BDK0 Baseplate wedge subunit and tail pin JS09_013 219
A0A060BGV9 Baseplate wedge subunit and tail pin JS09_014 601
A0A060BMC1 Baseplate wedge tail fiber connector JS09_015 290
A0A060BN74 Chaperone for tail fiber formation JS09_027 76
A0A060BNF8 Clamp loader small subunit JS09_0127 320
A0A088FRZ1 Clamp loader subunit 187
A0A088FRF3 Co‐chaperone for GroEL 110
A0A088FQQ8 dCTPase 173
A0A067ZHH3 Deoxycytidylate deaminase PhAPEC2_204 193
A0A060BME6 Deoxynucleoside monophosphate kinase JS09_026 244
Q7Y599 Dmd discriminator of mRNA degradation Dmd 63
A0A067ZK51 DNA endonuclease IV PhAPEC2_252 185
A0A060BHA6 DNA helicase JS09_0166 437
A0A088FR13 DNA helicase 480
A0A060BE80 DNA ligase JS09_0246 497
A0A060BH71 DNA polymerase (EC 2.7.7.7) JS09_0130 903
A0A060BNM5 DNA topoisomerase II medium subunit JS09_0188 441
A0A088FRH2 DsDNA‐binding, transcription factor 95
A0A060BNP6 dTMP thymidylate synthase JS09_0214 286
A0A060BMZ5 Endonuclease II JS09_0218 136
A0A067ZK98 Endonuclease subunit PhAPEC2_58 339
A0A067ZKE0 Endonuclease V, N‐glycosylase UV repair enzyme
PhAPEC2_113 137
Q7Y5S0 Endoribonuclease regB 152
A0A060BMT9 Exonuclease JS09_0167 225
O64299 Exonuclease subunit 2 (EC 3.1.11.‐) (Protein Gp46)
46 562
A0A060BN42 Fibritin JS09_011 482
Q7Y267 Frd (Frd dihydrofolate reductase) Frd 195
Q7Y4V9 Gp24 head vertex protein 24 427
Q7Y557 Gp49 EndoVII packaging and recombination endonuclease VII
49 157
Q7Y5A8 Gp61 DNA primase subunit 58ª 340
A0A088FR25 Head completion protein 149
A0A088FRC5 Head scaffolding protein 270
A0A067ZK36 Helicase loading protein PhAPEC2_227 217
Q7Y4V4 Inh inhibitor of prohead protease gp21 Inh 222
75
A0A067ZJ23 Inhibitor of host transcription PhAPEC2_216 187
A0A067ZJD8 Internal head protein with nuclease inhibitor activity
PhAPEC2_140 95
Q06EE8 Large head outer capsid protein hoc RB32ORF178c 376
A0A067ZKJ5 Late promoter transcription accessory protein PhAPEC2_228 112
A0A088FQU5 Late sigma transcription factor 185
A0A067ZKF7 Lysozyme (EC 3.2.1.17) PhAPEC2_148 577
A0A060BDQ1 Lysozyme (EC 3.2.1.17) JS09_054 162
A0A088FR50 Major capsid protein 522
Q7Y5B9 ModB ADP‐ribosylase modB 193
A0A067ZIU2 Modifier of transcription PhAPEC2_11 151
A0A060BNK9 mRNA metabolism modulator JS09_0173 136
A0A088FRB6 Neck protein 308
A0A088FVK3 Neck protein 254
A0A060BHC7 Nucleoid disruption protein JS09_0186 148
A0A067ZIY1 Nudix hydrolase PhAPEC2_116 152
I7LF52 Phage holin g256 BN81_256 219
I7K3Z1 Phage tail fibers g255 BN81_255 183
I7KRW6 Phage tail fibers g254 BN81_254 1038
Q7Y555 Pin protease inhibitor Pin 137
A0A088FR45 Portal protein 523
X2KLC5 Prohead core protein JS09_02 78
A0A088FS90 Prohead core protein 141
A0A067ZK06 Prohead core protein protease PhAPEC2_167 213
A0A088FQS2 RecA‐like recombination protein 390
A0A060BHI9 Recombination, repair and ssDNA binding protein
JS09_0258 156
A0A076G8C3 RI lysis inhibition regulator Av05_00199 100
A0A060BE47 Ribonucleoside‐diphosphate reductase (EC 1.17.4.1)
JS09_0216 751
A0A088FV76 RIIA protein 737
A0A060BE15 RIIB protector from prophage‐induced early lysis
JS09_0180 315
A0A060BE70 RIII lysis inhibition accessory protein JS09_0236 82
A0A067ZK08 RNA ligase PhAPEC2_172 332
A0A060BNQ3 RNA ligase A JS09_0219 374
A0A060BNK0 RNA polymerase ADP‐ribosylase JS09_0163 202
A0A088FQT7 RNA polymerase‐binding protein 138
A0A060BI41 RnaseH JS09_0205 305
A0A088FR40 Sheath completion 273
A0A067ZJ29 Single‐stranded DNA binding protein PhAPEC2_226 300
A0A088FVC1 Sliding clamp 228
A0A088FVK4 Spackle 97
A0A060BGY3 Tail completion and sheath stabilizer protein JS09_025 194
X2KQU6 Tail sheath protein JS09_05 660
A0A067ZKG3 Tail tube protein PhAPEC2_163 163
76
A0A067ZIZ4 Terminase DNA packaging enzyme, large subunit
PhAPEC2_161 611
A0A088FVV8 Terminase small subunit 164
A0A060BHR2 Thymidine kinase (EC 2.7.1.21) JS09_073 193
A0A067ZH10 Topoisomerase II large subunit PhAPEC2_4 605
A0A067ZIU6 Transcription modulator under heat shock PhAPEC2_21 154
A0A088FVL6 Translational regulator 125
Q7Y4V3 UvsW RNA‐DNA and DNA‐DNA helicase, ATPase
uvsW 504
Q7Y529 Vs valyl‐tRNA synthetase modifier VS 115
FONTE: elaborado pelo autor.
TABELA 10 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F8.
Identificador Proteína Gene Tamanho
A0A067ZJI3 Activator of middle period transcription PhAPEC2_245 210
A0A060BMT5 ADP‐ribosylase JS09_0162 193
A0A067ZHI2 Aerobic NDP reductase small subunit PhAPEC2_219 392
A0A088FVY9 AroG 330
A0A088FVM3 Baseplate hub assembly 250
A0A088FVX6 Baseplate hub distal subunit 177
A0A088FRD6 Baseplate hub subunit 208
A0A088FR65 Baseplate hub subunit 390
A0A067ZJ06 Baseplate hub subunit, tail length determinator PhAPEC2_186 590
A0A088FRE0 Baseplate tail tube junction 369
A0A088FVM8 Baseplate tail tube junction 320
A0A060BDK5 Baseplate wedge subunit JS09_018 657
A0A060BHJ3 Baseplate wedge subunit JS09_017 1032
A0A060BHJ8 Baseplate wedge subunit JS09_022 191
A0A060BN47 Baseplate wedge subunit JS09_016 334
A0A088FSA4 Baseplate wedge subunit 132
A0A060BDK0 Baseplate wedge subunit and tail pin JS09_013 219
A0A060BGV9 Baseplate wedge subunit and tail pin JS09_014 601
A0A060BMC1 Baseplate wedge tail fiber connector JS09_015 290
A0A060BDM3 Capsid vertex protein JS09_0269 427
A0A060BN74 Chaperone for tail fiber formation JS09_027 76
A0A060BNF8 Clamp loader small subunit JS09_0127 320
A0A060BHV9 Clamp loader small subunit JS09_0128 187
A0A088FRF3 Co‐chaperone for GroEL 110
A0A088FQQ8 dCTPase 173
A0A076G790 DenV endonuclease Av05_00180 137
A0A067ZHH3 Deoxycytidylate deaminase PhAPEC2_204 193
A0A060BME6 Deoxynucleoside monophosphate kinase JS09_026 244
Q7Y599 Dmd discriminator of mRNA degradation Dmd 63
A0A067ZK51 DNA endonuclease IV PhAPEC2_252 185
77
A0A060BHA6 DNA helicase JS09_0166 437
A0A088FR13 DNA helicase 480
A0A060BE80 DNA ligase JS09_0246 497
A0A060BH71 DNA polymerase (EC 2.7.7.7) JS09_0130 903
A0A060BHB9 DNA topoisomerase II large subunit JS09_0176 605
A0A088FRH2 DsDNA‐binding, transcription factor 95
A0A060BMZ5 Endonuclease II JS09_0218 136
A0A067ZK98 Endonuclease subunit PhAPEC2_58 339
A0A060BMT9 Exonuclease JS09_0167 225
O64299 Exonuclease subunit 2 (EC 3.1.11.‐) (Protein Gp46)
46 562
A0A060BN42 Fibritin JS09_011 482
Q7Y267 Frd (Frd dihydrofolate reductase) Frd 195
Q7Y557 Gp49 EndoVII packaging and recombination endonuclease VII
49 157
Q7Y4P7 Gp52 topoisomerase II, medium subunit 52 441
Q7Y5F6 Gp59 59 217
Q7Y5A8 Gp61 DNA primase subunit 58ª 340
A0A060BHL8 Head completion protein JS09_023 149
A0A088FRC5 Head scaffolding protein 270
A0A097J4K1 Homing endonuclease segG RB9_237 210
A0A067ZJ23 Inhibitor of host transcription PhAPEC2_216 187
A0A067ZJ00 Inhibitor of prohead protease PhAPEC2_176 222
A0A060BDN2 Internal head protein JS09_029 95
Q06EE8 Large head outer capsid protein hoc RB32ORF178c 376
X2KQP8 Large terminase protein JS09_06 611
A0A067ZKJ5 Late promoter transcription accessory protein PhAPEC2_228 112
A0A088FQU5 Late sigma transcription factor 185
A0A060BN58 Long tail fiber distal subunit JS09_0201 1080
A0A067ZKF7 Lysozyme (EC 3.2.1.17) PhAPEC2_148 577
A0A060BDQ1 Lysozyme (EC 3.2.1.17) JS09_054 162
A0A088FR50 Major capsid protein 522
A0A067ZIU2 Modifier of transcription PhAPEC2_11 151
A0A088FV80 mRNA metabolism modulator 136
A0A088FRB6 Neck protein 308
A0A088FVK3 Neck protein 254
Q0ILG8 NrdG nrdG 156
A0A060BHC7 Nucleoid disruption protein JS09_0186 148
Q7Y516 NudE nudix hydrolase nudE 152
I7LF52 Phage holin g256 BN81_256 219
I7K3Z1 Phage tail fibers g255 BN81_255 183
Q7Y555 Pin protease inhibitor Pin 137
A0A088FR45 Portal protein 523
X2KLC5 Prohead core protein JS09_02 78
A0A088FS90 Prohead core protein 141
A0A067ZK06 Prohead core protein protease PhAPEC2_167 213
78
FONTE: elaborado pelo autor.
TABELA 11 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F9.
Q7Y5C8 RB69ORF010c similar to motB RB69ORF010c 139
A0A060BDY0 RecA‐like recombination protein JS09_0139 390
A0A060BHI9 Recombination, repair and ssDNA binding protein
JS09_0258 156
Q7Y582 RegA translational repressor protein regA 125
A0A076G8C3 RI lysis inhibition regulator Av05_00199 100
A0A088FVR8 Ribonuclease H 305
A0A060BE47 Ribonucleoside‐diphosphate reductase (EC 1.17.4.1)
JS09_0216 751
A0A088FV76 RIIA protein 737
A0A060BE15 RIIB protector from prophage‐induced early lysis
JS09_0180 315
A0A060BE70 RIII lysis inhibition accessory protein JS09_0236 82
A0A067ZK08 RNA ligase PhAPEC2_172 332
A0A060BNQ3 RNA ligase A JS09_0219 374
A0A060BNK0 RNA polymerase ADP‐ribosylase JS09_0163 202
A0A088FVX9 RNA polymerase ADP‐ribosylase 695
A0A088FQT7 RNA polymerase‐binding protein 138
G1FHG5 RNaseH ribonuclease 45
A0A088FR40 Sheath completion 273
A0A088FRC1 Sheath protein 660
A0A067ZJ29 Single‐stranded DNA binding protein PhAPEC2_226 300
A0A088FR72 Site‐specific RNA endonuclease 152
A0A088FVC1 Sliding clamp 228
A0A088FVK4 Spackle 97
A0A067ZHE8 Tail completion and sheath stabilizer protein PhAPEC2_144 194
A0A088FVK7 Tail tube 163
A0A088FVV8 Terminase small subunit 164
A0A060BDT5 Thioredoxin JS09_094 87
A0A060BHR2 Thymidine kinase (EC 2.7.1.21) JS09_073 193
A0A067ZK35 Thymidylate synthase PhAPEC2_222 286
A0A067ZIU6 Transcription modulator under heat shock PhAPEC2_21 154
Q7Y4V3 UvsW RNA‐DNA and DNA‐DNA helicase, ATPase
uvsW 504
Q7Y529 Vs valyl‐tRNA synthetase modifier VS 115
Identificador Proteína Gene Tamanho
A0A075E0Y1 Base plate family protein DA66_0026 268
U5PUI9 DNA binding protein Marshall_98 92
U5PV36 DNA helicase Marshall_99 572
W8JKH4 DNA ligase 483
K4I3T2 DNA polymerase (EC 2.7.7.7) 999
79
Q0MUT0 DNA primase‐helicase subunit gp41 243
K4I4X1 DNA topoisomerase 637
S4TV77 DNA topoisomerase II (Fragment) SP029_01052 310
A0A059XCJ3 DnaB‐like helicase C terminal domain protein 133
C8XUS3 Gp14 neck protein orf00200 216
C8XUS2 Gp15 proximal tail sheath stabilization protein orf00199 231
C8XUS1 Gp16 terminase DNA packaging enzyme small subunit
orf00198 233
C8XUS0 Gp17 terminase DNA packaging enzyme large subunit
orf00196 736
C8XUR7 Gp20 portal vertex protein of head orf00191 563
C8XUR3 Gp22 prohead core protein orf00186 288
A8WEB1 Gp23 major capsid protein (Fragment) 214
C8XUP9 Gp3 tail completion and sheath stabilizer protein
orf00171 166
C8XUH0 Gp32 T4‐like ssDNA binding protein orf00074 343
C8XUH2 Gp33 T4‐like late promoter transcription accessory protein
orf00076 81
C8XUD4 Gp4 head completion protein orf00036 204
C8XUP3 Gp44 clamp loader subunit DNA polymerase accessory protein
orf00164 329
C8XUP4 Gp45 sliding clamp DNA polymerase accessory protein
orf00165 222
C8XUD5 Gp48 putative tail tube associated base plate protein
orf00037 322
C8XUI0 Gp5 baseplate hub subunit and tail lysozyme orf00084 536
C8XUB8 Gp52 topoisomerase II medium subunit orf00017 446
C8XUD6 Gp53 baseplate wedge subunit orf00038 184
C8XUT5 Gp6 baseplate wedge subunit orf00217 593
C8XUJ5 Gp61 DNA primase subunit orf00102 352
C8XUP2 Gp62 clamp loader subunit DNA polymerase accessory protein
orf00163 140
K4I6U3 Helicase loader 219
X4YDU4 Hemolysin‐type calcium binding protein 1013
A0A1K9 Initiator RepB protein (Replication protein) repE ERS085366_04868 UC41_06395
233
M4MEQ6 Lyase (Fragment) gp17 713
E3UVU0 Major capsid protein g23 (Fragment) 269
C8XUJ7 MobD.6 conserved hypothetical phage protein orf00104 117
K4I3N1 Molecular chaperone, HSP90 family 303
P11111 Neck protein gp14 (Gene product 14) (gp14) 14 256
K4I4P8 Nicotinamide phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.12)
554
U5PV19 Nucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase
Marshall_79 290
U5PYF5 O‐spanin Marshall_95 108
E1XTC6 Phage assiociated protein Vi01_117c 149
80
FONTE: elaborado pelo autor.
TABELA 12 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F10. Identificador Proteína Gene Tamanho
X2KTT1 6‐carboxy‐5,6,7,8‐tetrahydropterin synthase 9g_00005 177
X2KPA0 7‐cyano‐7‐deazaguanine synthase 9g_00006 471
X2KU72 ATPase 9g_00014 256
X2KTT7 ATP‐dependent DNA ligase 9g_00015 291
X2L019 Deoxyuridine 5'‐triphosphatenucleotidohydrolase
9g_00018 169
X2KSN7 DNA polymerase beta subunit 9g_00002 330
X2KP98 DNA polymerase elongation subunit 1 9g_00001 657
X2KTU7 DNA primase 9g_00025 755
X2KU64 GTP cyclohydrolase 1 9g_00004 204
X2L058 Host specificity protein 9g_00068 1029
X2KTW4 Lysis protein 9g_00045 166
X2L047 Main coat protein 9g_00053 367
X2L013 Organic radical activating enzyme 9g_00008 254
I7LF52 Phage holin g256 BN81_256 219
X2L008 Queuosine tRNA‐ribosyltransferase 9g_00003 317
X2KPA7 RNAse H 9g_00016 196
X2KTY7 Side tail fiber 9g_00070 1211
X2KPA5 Superfamily II DNA/RNA helicase 9g_00011 667
X2KPE1 Tail fiber assembly protein 9g_00071 192
X2KUA6 Tail protein 9g_00059 139
X2KPD4 Tail subunit 9g_00061 393
X2KUA9 Tape measure protein 9g_00064 1086
X2KTW9 Terminase large subunit 9g_00050 532
FONTE: elaborado pelo autor.
I7AT86 Phage lysis inhibitor 497
M4MCT7 Recombination and repair protein UvsX VPDG_00004 349
C8XUP1 RegA translational repressor protein orf00162 154
K4I3L2 Ribonucleoside‐diphosphate reductase (EC 1.17.4.1)
760
K4I6R6 Ribonucleotide reductase of class Ia (Aerobic) beta subunit (EC 1.17.4.1)
367
K4I2Z8 Ribose‐phosphate pyrophosphokinase (EC 2.7.6.1)
284
C8XUP6 RNA‐DNA and DNA‐DNA helicase UvsW orf00168 502
U5PYN2 RNAseH Marshall_101 175
R9TEF4 SegD homing endonuclease segD VPFG_00129 167
K4I3R1 Tail fiber protein 269
S6CFE9 Tail tube protein 177
X4YGA2 Tailspike protein 185
C8XUF9 UvsX RecA‐like recombination protein orf00061 361
81
TABELA 13 – Resultado da anotação dos genes do bacteriófago F12. Identificador Proteína Gene Tamanho
A4SH38 Colicin E1 immunity protein imm SSON_PB02 113
A4SH39 Colicin E1 lysis protein lys SSON_PB03 45
D8BRD0 Colicin pore forming domain protein HMPREF9551_00172 460
C8XUC4 DexA exonuclease orf00026 210
U5PV36 DNA helicase Marshall_99 572
L7TVA8 DNA polymerase (Fragment) g43 137
I6YMU9 DNA primase‐helicase subunit 137
S4TT58 DNA topoisomerase 2 (Fragment) SP029_00380 332
A0A075LAW4 Fimbrial usher protein L960_3881c 249
C8XUS3 Gp14 neck protein orf00200 216
C8XUS2 Gp15 proximal tail sheath stabilization protein orf00199 231
A8WEB1 Gp23 major capsid protein (Fragment) 214
C8XUP9 Gp3 tail completion and sheath stabilizer protein orf00171 166
C8XUH2 Gp33 T4‐like late promoter transcription accessory protein
orf00076 81
H8ZNF2 Gp43 DNA polymerase 104
H8ZNF3 Gp43 DNA polymerase 255
C8XUP4 Gp45 sliding clamp DNA polymerase accessory protein
orf00165 222
C9DFX9 Gp48 baseplate tail tube cap 7 195
C8XUI0 Gp5 baseplate hub subunit and tail lysozyme orf00084 536
C8XUB8 Gp52 topoisomerase II medium subunit orf00017 446
C8XUD6 Gp53 baseplate wedge subunit orf00038 184
C8XUJ5 Gp61 DNA primase subunit orf00102 352
X4YDU4 Hemolysin‐type calcium binding protein 1013
A0A1K9 Initiator RepB protein (Replication protein) repE ERS085366_04868 UC41_06395
233
G8GDQ5 Large terminase subunit 736
M4MEQ6 Lyase (Fragment) gp17 713
K4I3N1 Molecular chaperone, HSP90 family 303
U5PYF5 O‐spanin Marshall_95 108
E1XTC6 Phage assiociated protein Vi01_117c 149
C8XUI8 PhoH‐like protein orf00095 280
A0A067XQW4 Recombination endonuclease subunit 557
N9V9U1 Ribonucleoside‐diphosphate reductase (EC 1.17.4.1) (Fragment)
G114_09720 292
I2NM60 Ribonucleoside‐diphosphate reductase, beta subunit‐like protein (Fragment)
HMPREF1051_0404 102
E3SMV7 RNA‐DNA + DNA‐DNA helicase uvsW PHM1_126 279
U5PYN2 RNAseH Marshall_101 175
C8XUV3 SegD‐like protein orf00242 228
K4I3R1 Tail fiber protein 269
S6CFE9 Tail tube protein 177
82
X4YGA2 Tailspike protein 185
A0A0A0YRA5 Terminase DNA packaging enzyme large subunit NW77_114 580
D9IE34 Topoisomerase II large subunit (Topoisomerase II large subunit C‐terminal region)
60 T4147_003 T4GT7_003 T4Tp003 T4wild_003
160
U3M077 Viral capsid assembly protein (Fragment) g20 149
FONTE: elaborado pelo autor.
83
5 DISCUSSÃO
Os fagos F1 e F10 possuem genes codificadores de 7-ciano-7-
deazaguanina sintase, GTP ciclohidrolase, enzima ativadora de radicais orgânicos
e 6-carboxi-5,6,7,8-tetrahidropterina sintase, responsáveis pela síntese de
queuosina. A queuosina é um nucleosídeo modificado, capaz de influenciar a
estrutura e função do tRNA dos hospedeiros e danifica a transcrição. Além disso,
ela também altera processos metabólicos e fisiológicos da bactéria e parece ter
relação com a eficiência da síntese de proteínas estruturais de fagos, porém esses
processos não são muito bem compreendidos (SABRI et al., 2011). A presença
desses genes é uma característica rara encontrada no genoma do bacteriófago
9g, do fago Dp-1 e de alguns outros bacteriófagos. Este pode ser um dos
mecanismos através dos quais os bacteriófagos F1 e F10 causam a lise da célula
hospedeira (KULIKOV et al., 2014).
Os fagos F1 e F10 também apresentaram o gene radD, que produz a
proteína RadD, responsável pelo reparo do DNA. Essa proteína é de grande
importância para a adaptação do fago a situações adversas às quais é submetido
no interior do seu hospedeiro, como o estresse oxidativo (CHEN et al., 2015).
Outro gene de F1 é o sopA, que produz uma protease capaz de degradar a
proteína IcsA, importante componente da parede celular de enterobactérias como
Shigella (EGILE et al., 1997). Considerando-se as semelhanças fisiopatológicas
existentes entre Shigella spp. e Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), a presença
desse gene sugere o potencial do bacteriófago F1 de romper a célula hospedeira
(UD-DIN; WAHID, 2014).
A análise da origem dos genes utilizados para a anotação de F1 e F10
demonstrou que possivelmente são bacteriófagos semelhantes ao 9g
(NC_024146.1), descrito como capaz de infectar E. coli. O genoma de F1
apresentou 65 de seus genes anotados como pertencentes a esse fago e um gene
de Escherichia phage Seurat, também capaz de invadir enterobactérias (Gráfico
2). O bacteriófago F10 é classificado na ordem Caudovirales, família Siphoviridae.
F10 teve seus genes classificados de forma semelhante aos de F1 (Gráfico 3).
84
GRÁFICO 2 – Origem taxonômica dos genes usados para anotação do bacteriófago F1.
FONTE: elaborado pelo autor.
GRÁFICO 3 – Origem taxonômica dos genes usados para anotação do bacteriófago F10.
FONTE: elaborado pelo autor.
A partir da análise do repertório gênico dos bacteriófagos descritos nesse
trabalho é possível sugerir que os vírus F3, F6, F8, F9, F10 e F12 são
bacteriófagos líticos, pois seu genoma não apresentou genes como os que
85
sintetizam as proteínas integrase/excisionase. Além disso, esses fagos possuem
diversos genes responsáveis pela síntese, empacotamento e reparo de DNA e
todos possuem genes codificadores de proteínas líticas. A exceção foi o fago F2,
que apresentou o gene responsável pela produção da integrase (GROTH;
CARLOS, 2004). Esse fato pode ser confirmado pela análise das placas de lise
geradas pelo F2, que têm aspecto turvo, característico de fagos temperados
(Figura 10).
FIGURA 10 – Aspecto turvo das placas de lise produzidas pelo bacteriófago F2.
O aspecto turvo das placas de lise e a presença de halos (circulado de vermelho) ao redor das placas permite a classificação do fago F2 como lisogênico. FONTE: elaborado pelo autor.
Os genomas de F3, F6 e F8 contém diversos genes capazes de produzir
enzimas líticas como: nudix hidrolase, holina e lisozima, o que indica que esses
bacteriófagos apresentam grande potencial de lisar o seu hospedeiro bacteriano
após a infecção, sendo essa uma importante característica de bacteriófagos líticos
(WENLIAN et al., 2002). Os fagos F2, F3, F6 e F8, F9 e F12 apresentam genes
que sintetizam proteínas como a proteína finalizadora da cauda e a proteína
estabilizadora da bainha, capazes de sintetizar a bainha da cauda, sendo
86
classificados na família Myoviridae, já que a presença de bainha envolvendo a
cauda viral é uma característica única dessa família. A bainha ajuda no momento
da infecção, contraindo-se e facilitando a injeção do DNA no interior da célula
bacteriana (YAP; ROSSMANN, 2014).
87
6 CONCLUSÃO
- Foi possível concluir, ao final do desenvolvimento desse trabalho, que a água de
rejeitos provinda da estação de tratamento de esgoto Arrudas (ETE-Arrudas) é
uma fonte que possibilitou o isolamento de bacteriófagos capazes de infectar uma
linhagem enteroinvasiva ATCC 43893 de E. coli, usada neste trabalho como
modelo de enterobactéria patogênica.
- A metodologia utilizada nessa pesquisa possibilitou o isolamento de diferentes
vírus, assim como a extração e purificação de seu material genético com bom
rendimento e quantidade reduzida de DNA bacteriano contaminante.
- 8 desses bacteriófagos tiveram seu material genético extraído, sequenciado e
seu genoma montado e caracterizado e o repertório gênico desses vírus indicou
que são vírus da ordem Caudovirales, sendo 2 da família Siphoviridae e 6 da
família Myoviridae. Nenhum dos bacteriófagos foi classificado na família
Podoviridae.
- Apenas um bacteriófago apresentou potencial de ser temperado.
- 7 dos bacteriófagos isolados não tiveram nenhum gene relacionado à lisogenia.
- Apesar de 7 dos bacteriófagos isolados não terem apresentado genes
relacionados ao ciclo lisogênico, análises mais aprofundadas devem ser
realizadas para comprovar que são realmente exclusivamente líticos, já que
muitos não apresentam seu genoma completo e mais de 50% dos genes anotados
não têm função definida.
- É necessário também que sejam feitos estudos complementares para que o
potencial de uso dos bacteriófagos isolados como bioterápicos seja comprovado.
- Testes in vivo devem ser realizados para garantir a eficiência e segurança
desses agentes na terapia antimicrobiana.
88
7 PERSPECTIVAS
- Realizar a coleta de bacteriófagos em ecossistemas sadios onde o controle
populacional de bactérias pela infecção bacteriofágica seja mais eficiente.
- Fazer a PCR utilizando diferentes primers para analisar se há contaminação das
amostras por DNA plasmidial.
- Realizar testes de resistência dos bacteriófagos isolados à radiação ultravioleta,
à ação de hipoclorito de sódio, assim como a diferentes temperaturas.
- Fazer a confirmação da classificação dos vírus nas famílias Siphoviridae,
Myoviridae e Podoviridae utilizando imagens de microscopia eletrônica de
transmissão.
89
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