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JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICO-MOLECULAR DAS NEOPLASIAS
MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS BCR-ABL NEGATIVAS
Orientador (es): Prof. Dra. Ilana Zalcberg Renault
Dr. Martin Hernan Bonamino
RIO DE JANEIRO
2014
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
ii
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICO-MOLECULAR DAS NEOPLASIAS
MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS BCR-ABL NEGATIVAS
Tese apresentada ao Instituto Nacional de Câncer
como parte do requisito para obtenção do título de
Doutor em Oncologia
Orientador (es): Dra. Ilana Zalcberg Renault
Dr.Martin Hernan Bonamino
RIO DE JANEIRO
2014
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
iii
FICHA CATALOGRÁFICA SERÁ ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INCA PARA A VERSÃO
FINAL DA TESE
(A ser impressa no verso da primeira folha de rosto)
INDICAR APENAS AS PALAVRAS-CHAVE NA VERSÃO APRESENTADA PARA A DEFESA
PÚBLICA DA TESE
Palavras-chave: 1. Neoplasias mieloproliferativas crônicas; 2. Caracterização molecular; 3.
Hibridização genômica comparativa (aCGH); 4. Sequenciamento completo de Exoma (WES).
iv
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICO-MOLECULAR DAS NEOPLASIAS
MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS BCR-ABL NEGATIVAS
ORIENTADOR (ES): Prof. Dra. Ilana Zalcberg Renault
Dr. Martin Hernan Bonamino
Aprovada em: _____/_____/_____
EXAMINADORES:
Prof. Dr. João Paulo de Biaso Viola - Presidente
Prof. Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira
Prof. Dr. Katia Borgia Barbosa Pagnano
Prof. Dr. Lorena Lôbo de Figueiredo Pontes
Prof. Dr. Marcelo Alex de Carvalho – Suplente I
Prof. Dr. Adriana Cesar Bonomo – Suplente II
RIO DE JANEIRO
2014
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
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CARACTERIZAÇÃO GENÉTICO-MOLECULAR DAS NEOPLASIAS
MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS BCR-ABL NEGATIVAS
RESUMO
TESE DE DOUTORADO
JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA
As neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMP) clássicas são caracterizadas por proliferação hematopoética
mielóide anormal e presença da mutação p.Val617Phe no gene JAK2 (JAK2V617F) em diferentes frequências
(Policitemia Vera-PV-95%, Trombocitemia Essencial-TE- e Mielofibrose-MF-50%). Aproximadamente 85% dos
pacientes JAK2V617F negativos apresentam inserções e deleções (INDELs) no gene da calreticulina (CALR). As
NMP podem evoluir para MF secundária (30%) ou para leucemia aguda (7%). Não existem, até o momento,
marcadores preditivos da progressão para LA. Técnicas genômicas de alta resolução representam as
ferramentas ideais possibilitam sequenciar (WES - whole exome sequencing) e avaliar a variação no número de
cópias (aCGH - array comparative genomic hybridization) de vários genes em centenas de pacientes ao mesmo
tempo, o que vai de encontro aos objetivos deste trabalho. Os objetivos deste trabalho foram: a) buscar
compreender a relação entre os biomarcadores (JAK2 e CALR) de interesse e seu papel na resposta terapêutica
dos pacientes com NMP submetidos ao tratamento com hidroxiureia (HU) e ao Ruxolitinib a partir da
implementação das técnicas para análise e quantificação destes biomarcadores; b) investigar o papel de novos
biomarcadores na progressão leucêmica secundária à NMP, utilizando técnicas genômicas de alta resolução
(aCGH e WES). Pacientes e Métodos: A partir de uma coorte central de 1236 pacientes referidos para o
diagnóstico de NMP, uma subcoorte de 162 pacientes foi utilizada neste trabalho, cujas amostras foram triadas
por PCR alelo específico para detecção da mutação p.Val617Phe. Além disso, a determinação da carga alélica
foi realizada por PCR-C (análise de fragmentos) e uma nova abordagem por q-PCR foi implementada e
comparada aos resultados obtidos por PCR-C (R²=0,9916). As amostras de 5 pacientes com TE foram
analisadas por aCGH e WES ao diagnóstico e na progressão leucêmica. Resultados: A partir da subcoorte de
162 pacientes caracterizamos que 92% PV, 46% TE e 48% MF apresentaram a mutação JAK2V617F. Em
pacientes com PV e negativos para JAK2V617F não foram encontradas mutações nos éxons 12 e 14 de JAK2.
Em contraste, em 3/45 pacientes com TE e negativos para JAK2V617F, foi detectada a mutação (p.Trp515Leu)
em MPL. Em 46% (31/68) dos pacientes V617F negativos e não PV apresentaram mutações em CALR. A
variação da carga alélica ao longo do acompanhamento mostrou dois padrões frente ao tratamento com HU:
oscilações, que não se correlacionavam com a dose de HU administrada e outro de estabilidade, também
observado nos pacientes com MF submetidos ao tratamento com Ruxolitinib. Em 3/5 pacientes com amostras ao
diagnóstico e da fase leucêmica, foram encontradas alterações cromossômicas identificadas por aCGH; Duas
alterações (+2p e del(5q)) foram recorrentes (2/3 pacientes) somente na progressão leucêmica, sugerindo que
estas alterações sejam específicas desta fase. A análise das alterações localizadas em regiões gênicas
específicas mostrou que na região da del5q estão localizados genes envolvidos na via de sinalização JAK-STAT
e na hematopoese. No chr 2, com ganho de cópia, estão posicionados genes de regulação epigenética. Dos
pacientes analisados por WES, um paciente foi positivo para a mutação JAK2V617F, outro para SF3B1
(p.Lys700Glu) (ARSA-t), e o terceiro para Ins de 5pb em CALR (p.Lys385fs*47) e com perda monoalélica de
TP53 não associada à mutação no alelo remanescente. Alterações em TP53, específicas da fase de progressão
leucêmica, foram reveladas por WES em 2/3 pacientes. A extensão deste trabalho piloto para uma coorte
JAK2V617F negativa em amostras da fase MPN mostrou que 7% (3/45) dos pacientes apresentaram mutações
em TP53, nenhuma mutação foi observada em SF3B1 e foram observados alguns polimorfismos nos éxons 11 e
12 de MAPK15. Conclusão: A redução da carga alélica de JAK2V617F é mais evidente no inicio do tratamento
com HU; O uso do inibidor de JAK2 não impacta a carga alélica, apesar da melhoria dos sintomas clínicos; Mutações em CALR foram encontradas respectivamente em 62% e 67% de pacientes com TE e MF; O evento
de transformação leucêmica mostrou-se bastante heterogêneo do ponto de vista molecular, devido à quantidade
de alterações cromossômicas e mutações encontradas por paciente, sendo a +2p e del(5q) as únicas alterações
recorrentes entre os pacientes e especificamente observadas nas amostras da fase aguda. Mutações em TP53
foram observadas preferencialmente associadas à transformação leucêmica, mas também ocorreram desde a
fase crônica.
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MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS BCR-ABL NEGATIVAS
ABSTRACT
TESE DE DOUTORADO
JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA
Myeloproliferative neoplasms (MPN) are characterized by abnormal myeloid proliferation and the presence of the
JAK2 mutation, p.Val617Phe, in 95% of Polycythemia Vera-PV, and 50% Essential Thrombocythaemia–ET and
Myelofibrosis–MF. Around 85% JAK2V617F negative patients have insertions-deletions (indels) in calreticulin
gene (CALR). MPN diseases could progress to secondary myelofibrosis (30%) or to acute leukemia (AL-7%)
although there are no predictive markers identified so far. High throughput genomic technologies are important
discovery tools because they enable whole exome sequencing (WES) and chromosome copy number variation
analysis (by SNP array or aCGH-array comparative genomic hybridization) from many patients at the same time.
Our aim was: a) study the relationship between diagnostic biomarkers (JAK2 and CALR) and their role in
monitoring therapeutic responses to hydroxyurea and Ruxolitinib and implement an analysis and quantification
assay for those MPN diagnostic biomarkers; b) investigate progression to acute leukemia secondary to MPN
using WES and aCGH. Patients and Methods: A subset group of 162 patients from a central cohort with 1236
patients referred to BioMol laboratory for MPN diagnosis was investigated in this work. First, those patients
samples were characterized by JAK2V617F mutation with allelic-specific PCR (AS-PCR) and the allelic burden
determined by fluorescent AS-PCR followed by fragment analysis (C-PCR). A q-PCR was also implemented for
comparing C-PCR results (R²=0,9916). We analyzed a subset of 5 patients that progressed from ET to AL by
aCGH and WES. Results: A 162 MPN coohort showed 92% PV, 46% ET and 48% MF patients bearing the
JAK2V617F mutation. PV JAK2V617F negative patients showed no mutations in exons 12 and 14 of JAK2 gene.
In contrast, 3/45 ET JAK2V617F negative patients showed mutations in the MPL gene (p.Trp515Leu) and 46%
(31/68) patients showed CALR indels. Allelic burden variation during follow up showed two patterns in patients
with HU use: oscillations that did not correlate with HU dose and stability, also observed in MF patients treated
with Ruxolitinib. We identified some chromosome abnormalities by aCGH in 3/5 MPN patients that progressed to
AL. Specific and recurrent AL alterations included +2p e del5q, indicating these can be specific markers. Gene
ontology analysis showed that del5q region includes some genes enrolled in JAK-STAT signaling and
hematopoietic cell lineage differentiation/proliferation while epigenetic regulator genes were mapped on the region
involved in +2p. WES results showed one patient positive to the JAK2V617F mutation while the other two tested
were negative, but one of the negative patients had a SF3B1 mutation with anemia in diagnosis, suggesting a
RARS-t. The other JAK2V617F negative patient showed a 5bp insertion in CALR (p.Lys385fs*47) and also a
monoalelic loss of TP53 without mutation in the reminiscent allele. The first two patients described had TP53
mutations specific to AL phase. An extension screening comprising JAK2V617F negative patients (ET, MF, MPN-
U and MDS) to look for TP53 mutations in chronic phase samples showed 7% (3/45) patients point mutations. We
also analyzed SF3B1 gene and did not find mutations. In MAPK15 gene we found some polymorphisms in exons
11 and 12. Conclusion: Allele burden decrease is more evident just after HU treatment; JAK2 inhibitor do not
have impact in allelic burden although improve clinical symptoms; CALR mutations are present in 62% and 67%
ET and MF patients, respectively; Acute leukemia progression is a heterogeneous molecular event with more
chromosome abnormalities and mutations in AL than MPN phase; We also found that +2p and del5q
chromosomes abnormalities are recurrent and specifically associated to AL progression. TP53 mutations were
observed preferentially associated to AL progression, but also occurred in the chronic MPN phase.
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
vii
Em memória aos meus
pais, meus grandes
incentivadores.
viii
Agradecimentos
À minha orientadora Ilana Zalcberg Renault por todo apoio e incentivo nestes
cinco anos de convivência; Obrigada por ter acreditado nesta morfologista e ter
proporcionado a chance de conhecer o mundo “genômico-molecular”; Todo o
estímulo dado foi importante em cada passo desta imensa avenida molecular que fui
apresentada, inclusive quando fui desafiada ao doutorado sanduíche; pelo incentivo
a resgatar a bioinformata que existia dentro de mim; O aprendizado advindo das
discussões foram peças importantes para meu amadurecimento profissional. E
principalmente, por toda a compreensão nos momentos mais difíceis.
Ao meu orientador Martin Hernan Bonamino que desde o primeiro contato se
mostrou um pesquisador bastante entusiasmado pela ciência, pelo incentivo
constante, pela ajuda e frutíferas discussões científicas; Por ter acompanhando este
trabalho com tanto carinho e zelo, estando sempre presente, mesmo quando
fisicamente distante. Este apoio foi de fundamental importância para minha
perseverança. E claro, obrigada por ter depositado sua confiança e me apresentado
à Dra Ilana Zalcberg.
Ao meu orientador Esteban Braggio por todo auxílio neste trabalho, que foram
além dos oito meses que trabalhei fisicamente em seu grupo. Todos os momentos
de discussões foram admiráveis, e sua atenção a cada detalhe foi impecável: desde
os preparativos pré-viagem, até as discussões de dados meses após o retorno ao
Brasil. Seu amor e carinho pela profissão são materializados na riqueza de detalhes
e precisão de suas respostas a qualquer aluno ou pesquisador que se dirigisse ao
seu escritório para discussão de dados. Muito obrigada pelo suporte durante a
instalação em Scottsdale e por ter feito meus dias longe do Brasil mais alegres ao
me apresentar três Brasileiras incríveis: Silvana, Marina e Sofia.
À Drª Eliana Abdelhay por todo incentivo e pelas discussões pontuais e
precisas.
Ao meu marido André Vidal, por ter sido um companheiro incondicional: me
apoiado desde o início quando resolvi retornar a vida acadêmica; por ter incentivado
minha ida ao laboratório americano; por todas as noites mal dormidas durante este
período do sanduíche, em que ficava acordado até tarde, por vezes até às 2h da
madrugada, só para nos falarmos via Skype; e é claro, pelo lindo arranjo de flores
que me enviou em Scottsdale no dia do meu aniversário!
ix
Ao meu pai, que sempre incentivou a lutar pelos meus objetivos e a seguir a
profissão que escolhi. Infelizmente não estará presente fisicamente em mais um
momento especial da minha vida, mas agradeço imensamente por todos os valores
ensinados.
A toda minha família e amigos por todo o carinho, apoio e preocupação, e por
estarem presentes nos preciosos e importantes momentos da vida: na alegria e na
tristeza, na saúde e na doença. Não enunciarei nomes para não arriscar me
esquecer de alguém em função dos preparativos intensos para tese que me fazem
ter a memória falha, mas vocês serão devidamente listados e agradecidos
pessoalmente num futuro próximo. Mas saibam todos, que o incentivo especial de
vocês, notadamente nos momentos mais árduos, foi inesquecível.
Aos colegas e amigos do laboratório de biologia molecular, do laboratório de
oncovirologia – CEMO – e do MartinLab (CPQ) por todo apoio, carinho e incentivo,
especialmente nos momentos mais difíceis. A caminhada com vocês foi mais
divertida! Meus sentimentos mais sinceros e profundos a todos aqueles que ficaram
até tarde no laboratório para me ajudar nos experimentos; não enunciarei nomes
para não ser injusta. Obrigada a Juliana Pontes, Natália Amaral, Ana Caroline
Coelho e Diego Coutinho pela ajuda no desenvolvimento de alguns dados e
experimentos deste trabalho. Um agradecimento especial a Michelle por todo o
apoio administrativo, como a ajuda na emissão de documentos, envio de laudos, só
para citar algumas das suas multifunções. Obrigada a Bárbara Monte-Mor por todos
os questionamentos e pelas discussões, sempre enriquecedoras e bem colocadas e
claro, pela revisão pontual desse manuscrito.
Aos colegas e amigos que fiz na Clínica Mayo-Arizona, por terem feitos meus
dias longe do Brasil mais alegres. Com certeza as reuniões e festinhas em que
Danielle, Juhi, Sinto, Martin, Jan, Leena, Victoria e Esteban organizaram tornaram a
nossa convivência muito mais lúdica. Obrigada por terem me acolhido como membro
de suas famílias, de forma bastante calorosa e acolhedora, em especial a Danielle
Miranda, minha mais nova irmã de coração.
Ao setor de quimioterapia do HUAP, em especial ao Dr. Adelmo Daumas
Gabriel, e ao setor de Hematologia do HUPE, em especial à Drª Cristiana Solza, por
todo carinho e auxílio na consulta aos prontuários dos pacientes e particularmente
por todas as discussões clínicas proporcionadas que foram muito importantes para o
x
desenvolvimento deste trabalho. Aos setores de Anatomia Patológica do HUAP e do
HUPE pela revisão das lâminas e recorte de blocos.
À Maria Emmerick Gouveia pela enérgica e alegre ajuda na coleta dos dados
clínicos e pelas discussões científicas.
Ao Dr. Alexandre Mello de Azevedo pela ajuda na elaboração das fichas
clínicas e das tabelas de coleta de dados.
Ao programa de Pós Graduação em Oncologia pelas excelentes aulas e
discussões proporcionadas; A toda equipe técnico-administrativa do Programa de
Pós-graduação em Oncologia, Danielle, Rodrigo e Andreia, por toda a ajuda e
eficácia nos mais diversos momentos e documentos solicitados.
Ao INCa, CNPq, INCT, FAPERJ e Clínica Mayo por todo apoio técnico e
financeiro para execução deste trabalho. Em especial ao INCT pela bolsa de
doutorado sanduíche.
A todos vocês a minha imensa gratidão e o mais sincero obrigada!
xi
”...a plenitude da atividade humana é
alcançada somente quando nela coincidem, se
acumulam, se exaltam e se mesclam o trabalho, o
estudo e o jogo; isto é, quando nós trabalhamos,
aprendemos e nos divertimos, tudo ao mesmo tempo
(...) é o que eu chamo de ócio criativo”
Domenico de Masi
xii
Índice RESUMO .................................................................................................................................v
ABSTRACT ................................................................................................................................ vi
Lista de tabelas ....................................................................................................................... xiv
Lista de figuras ........................................................................................................................ xv
Lista de Anexos: ..................................................................................................................... xvi
Lista de abreviaturas ............................................................................................................. xvii
1. Introdução ............................................................................................................... 1
1.1. Histórico .................................................................................................................. 1
1.2. Diagnóstico: ............................................................................................................ 4
1.2.1. Diagnóstico Molecular: .......................................................................................... 5
1.3. Via de sinalização JAK-STAT ................................................................................ 6
1.1. Mutações em NMP .................................................................................................. 7
1.1.1. JAK2 ......................................................................................................................... 7
1.1.1.1. Carga alélica da mutação JAK2 ............................................................................ 9
1.1.1.2. Metodologias para estimativa da carga alélica JAK2 ....................................... 13
1.1.2. CALR ..................................................................................................................... 15
1.1.3. MPL ........................................................................................................................ 18
1.2. Tratamento ............................................................................................................ 18
1.3. Progressões naturais nas NMP .......................................................................... 21
2. Objetivos ....................................................................................................................... 26
2.1. Principal................................................................................................................. 26
2.2. Secundários .......................................................................................................... 26
3. Metodologia .......................................................................................................... 27
3.1. Pacientes ............................................................................................................... 27
3.2. Banco de dados .................................................................................................... 28
3.3. Preparo das amostras .......................................................................................... 28
3.4. Análise de mutações em genes específicos ..................................................... 29
3.4.1. Análise de mutações no gene JAK2 ................................................................... 29
3.4.1.1. Mutação V617F - Reação qualitativa .................................................................. 29
3.4.1.2. Mutação V617F - Reação quantitativa ................................................................ 30
3.4.1.3. Análise de mutações dos éxons 12 e 14 de JAK2 ............................................ 32
3.4.2. Análise de mutações no éxon 9 de CALR .......................................................... 32
3.4.3. Análise das mutações em MPL ........................................................................... 33
3.4.4. Análise de mutações nos éxons 14 e 15 de SF3B1 .......................................... 34
3.4.5. Análise de mutações nos éxons 11 e 12 de MAPK15/ERK8 ............................ 34
3.4.6. Análise de mutações nos éxons 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 de TP53 ............................. 35
3.4.7. Análise de mutações em IDH1 e 2 ...................................................................... 35
3.4.8. Análise de mutações em TET2 ............................................................................ 36
xiii
3.4.9. Análises estatísticas ............................................................................................ 36
3.4.10. Análise de hibridização genômica comparativa em conjunto (aCGH – array
comparative genomic hybridization) .................................................................................................. 37
3.4.11. Sequenciamento completo do exoma (WES - Whole exome sequencing) .... 38
4. Resultados ............................................................................................................ 42
4.1. PCR qualitativa (alelo – específico) para a mutação JAK2V617F ................... 44
4.2. Padronização de ensaios moleculares para a detecção da carga alélica de
JAK2V617F 46
4.2. Correlação entre a carga alélica de JAK2V617F e as diferentes categorias da
OMS/WHO 50
4.3. Estabelecimento das metodologias para a detecção de mutações adicionais
em amostras de pacientes com NMP e JAK2V617F negativo ......................................................... 59
4.3.1. MPL ........................................................................................................................ 59
4.3.2. Éxon 12 de JAK2 .................................................................................................. 60
4.3.3. Éxon 14 de JAK2 .................................................................................................. 60
4.4. Análises moleculares nos pacientes com neoplasias mielóides/ NMP que
apresentaram progressão leucêmica ................................................................................................. 61
4.4.1. Análise de hibridização genomica comparativa (aCGH – array comparative
genomic hybridization) ........................................................................................................................ 65
4.4.2. Sequenciamento do exoma completo (WES - Whole exome sequencing) .... 71
4.4.3. Validação de alguns genes do WES numa coorte JAK2 negativa .................. 77
5. Discussão .............................................................................................................. 80
5.1. JAK2 ....................................................................................................................... 80
5.2. CALR ...................................................................................................................... 82
5.3. Progressão leucêmica ......................................................................................... 84
6. Conclusão ............................................................................................................. 96
7. Perspectivas ......................................................................................................... 98
8. Referências Bibliográficas .................................................................................. 99
9. Anexos ................................................................................................................. 115
xiv
Lista de tabelas
Tabela 1.1: Critérios diagnósticos das NMP .....................................................................................5
Tabela 1.2: Frequências das alterações cromossômicas recorrentes....................................... 24
Tabela 1.3: Taxa das mutações descritas em NMP ..................................................................... 24
Tabela 3.1 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de amplificação de TP53. .... 35
Tabela 3.2: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de amplificação de TET2. ... 36
Tabela 4.1: Curva de plasmídeo de JAK2 pelo método da PCR-C ........................................... 47
Tabela 4.2: Variabilidade intra e interensaio de JAK2 por PCR-C.. ........................................... 48
Tabela 4.3: Comparativo da curva de DNA por PCR-C e q-PCR ............................................... 49
Tabela 4.4: Características clínicas dos pacientes com PV. ....................................................... 52
Tabela 4.5: Comparação dos eventos adversos em PV .............................................................. 52
Tabela 4.6: Características clínicas dos pacientes com TE. ....................................................... 53
Tabela 4.7: Comparação dos eventos adversos em TE.. ............................................................ 53
Tabela 4.8: Características clínicas dos pacientes com MF. ...................................................... 54
Tabela 4.9: Comparação dos eventos adversos em MF. ............................................................ 54
Tabela 4.10: Tabela resumo das respostas hematológicas à terapia citorredutora (HU) e as
respostas de carga alélica. ............................................................................................................... 56
Tabela 4.11: Características clínicas–demográficas dos pacientes com NMP com
progressão leucêmica ........................................................................................................................ 62
Tabela 4.12: Parâmetros hematológicos dos pacientes com NMP com progressão leucêmica
............................................................................................................................................................... 62
Tabela 4.13: Eventos adversos na progressão leucêmica. ......................................................... 63
Tabela 4.14: Genes analisados na progressão leucêmica. ......................................................... 64
Tabela 4.15: Anormalidades exclusivas da progressão leucêmica observadas por aCGH ... 69
Tabela 4.16: Anormalidades observadas por aCGH desde ao diagnóstico de MPN .............. 70
xv
Lista de figuras
Figura 1.1: Representação esquemática da molécula de JAK2 ...........................................................8
Figura 1.2: Espectro de INDELS detectadas no gene CALR ............................................................... 17
Figura 4.1: Fluxograma de avaliação de mutações em NMP ............................................................... 43
Figura 4.2: Desenho experimental do estudo ....................................................................................... 44
Figura 4.3: Distribuição das NMP nos dois centros participantes ......................................................... 45
Figura 4.4: Frequência de distribuição da mutação JAK2V617F .......................................................... 45
Figura 4.5: Gráfico de correlação do PCR-C. ....................................................................................... 47
Figura 4.6: Correlação entre as metodologias (PCR-C e q-PCR) de quantificação da carga alélica de
JAK2 ...................................................................................................................................................... 50
Figura 4.7: Frequência da carga alélica da mutação JAK2V617F ........................................................ 50
Figura 4.8: Distribuição da carga alélica de JAK2 ao diagnóstico e por sexo. ..................................... 51
Figura 4.9: Variação da carga alélica de JAK2 em pacientes com PV e TE.. ...................................... 55
Figura 4.10: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F na progressão PV para
mielofibrose secundária. ....................................................................................................................... 57
Figura 4.11: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F na progressão TE para
mielofibrose secundária ........................................................................................................................ 57
Figura 4.12: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F ao longo do uso do
inibidor de JAK2 (paciente 471) ............................................................................................................ 58
Figura 4.13: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617Fao longo do uso do
inibidor de JAK2 (paciente 616). ........................................................................................................... 58
Figura 4.14: Curva de sensibilidade de detecção da mutação p.Trp515Leu em MPL por HRM. ........ 59
Figura 4.15: Cromatogramas de sequenciamento do gene MPL ......................................................... 60
Figura 4.16: Frequência das mutações nos éxons 12 e 14 do gene JAK2 e no éxon 10 do gene MPL.
............................................................................................................................................................... 61
Figura 4.17: Cromatogramas de sequenciamento do éxon 3 do gene TET2 ....................................... 64
Figura 4.18: Número de alterações total por paciente, obtido por aCGH ............................................. 66
Figura 4.19: Número e tipo de alteração por aCGH. ............................................................................ 66
Figura 4.20: Alterações identificadas por aCGH durante a fase de crônica ......................................... 67
Figura 4.21: Alterações identificadas por aCGH durante a fase de leucemia aguda secundária ........ 67
Figura 4.22: Alterações observadas no cromossoma 2 por aCGH ...................................................... 68
Figura 4.23: Alterações observadas no cromossoma 5 por aCGH ...................................................... 68
Figura 4.24: Análise de clonalidade nos pacientes analisados por WES. ............................................ 74
Figura 4.25: Análise individual da frequência alélica dos genes associados às NMP ao longo da
progressão da doença da fase crônica para fase aguda. ..................................................................... 75
Figura 4.26: Resumo dos resultados de análise genômica (aCGH e WES) ........................................ 76
Figura 4.27: Distribuição das mutações em CALR ............................................................................... 77
Figura 4.28: Distribuição das mutações em CALR de acordo com as categorias clínicas analisadas. 78
xvi
Lista de Anexos:
Anexo 1 – Tabela 1 - valores de referência hemograma normal...................................................115
Anexo 2 – Carta de Aprovação CEP-INCa ......................................................................................116
Anexo 3 – Ficha clínica.....................................................................................................................117
Anexo 4 – Publicações em colaboração relacionadas à tese – Publicação 1.............................124
Anexo 5 – Publicações em colaboração relacionadas à tese – Publicação 2.............................125
Anexo 6 - Manuscritos em preparo .................................................................................................126
Anexo 7 – Publicações em colaboração.........................................................................................127
xvii
Lista de abreviaturas
AAS - ácido acetilsalicílico ABL - abelson murine leukemia viral oncogene homolog aCGH - array comparative genomic hybridization ARSA - anemia refratária com sideroblastos em anel ARSA-t - anemia refratária com sideroblastos em anel com trombocitose AS – allelic specific AS-PCR – alelic specific PCR (PCR alelo específico) ATP – Adenosine triphosphate (adenosina trifosfato) Bcl-Xl - B-cell lymphoma-extra large BMO-biópsia de medula óssea CALR – calreticulina CEMO - Centro de Transplantes de Medula Óssea CH- clínico hematológica COSMIC - Catalog of Somatic Mutations in Cancer Ct - threshold cycle DNA - ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid) EPO – eritropoietina ERK - extracellular-signal-regulated kinases FDA – food and drug administration FERM - 4.1, Ezrina, Radixina, Moesina GATK - Genome Analyis Toolkit GM-CSF - granulocyte macrophage colony-stimulating factor HAPMAP - haplotype map Hel - human erythroleukemia HU - Hidroxiureia HUAP - Hospital Universitário Antônio Pedro HUPE - Hospital Universitário Pedro Ernesto IGF-1 insulin like growth factor IGV – integrated genomic viewer IL-3 – interleucina 3 ILD - infusão de linfócitos do doador INDELS – inserções e deleções IR – inhibitory region JAK2 – Janus Kinase2 KDEL - Lys-Asp-Glu-Leu LA – leucemia aguda LLA – leucemia linfocítica aguda LLC – leukemia linfocítica crônica LMA – leucemia mieloide aguda LMC – leucemia mielóide crônica MAPK - mitogen-activated protein kinases MF – mielofibrose MFS – mielofibrose secundária MPL - myeloproliferative leukemia virus oncogene MPN – myeloproliferative neoplasms MT – mutado NGS – next generation sequencing NMP- Neoplasias mieloproliferativas NMP-U - Neoplasias mieloproliferativas crônicas-unclassified (não classificadas)
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OMS – organização mundial de saúde OSM – oncostatina M PBS - phosphate buffer solution PCR – polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase) PCR-C – PCR capilar (análise de fragmentos) PIAS - protein inhibithors of activated STATs PTP - protein tyrosine phosphatases PV – policitemia vera q-PCR – quantitative PCR (PCR quantitativo em tempo real) RCLB - red cell lysis buffer RDC – Resolução da Diretoria Colegiada RE- retículo endoplasmático RNA - ribonucleic acid (ácido ribonucleico) Rpm – rotações por minuto SCF – stem cell factor SF3B1 - splicing factor 3b subunit 1 SH2 - Src homology 2 SMD – síndrome mielodisplásica SMD/SMP – síndrome mielodisplásica/ síndrome mieloproliferativa SNV - single nucleotide variant SOCS - suppressores of cytokine signaling SOE – sem outra especificação STAT - Signal transducers and activators of transcription TCAG - The Centre for Applied Genomics TCTH - transplante alogênico de células tronco hematopoéticas TE – trombocitemia essencial TET - ten eleven translocation TPO - trombopoetina TREAT - Targeted RE-sequencing Annotation Tool UAF – unidades arbritárias de fluorescência USA – United States of America WES - whole exome sequencing WGS - Whole genome sequencing WHO – World Health Organization WT – wild type (selvagem)
1
1. Introdução
1.1. Histórico
Neoplasia Mieloproliferativa (NMP) é o termo utilizado para caracterizar um
grupo de doenças clonais, decorrentes da transformação maligna de uma célula
tronco hematopoética, sendo caracterizadas por um aumento da proliferação de
células mielóides e um risco aumentado de desenvolvimento de Leucemia Mielóide
Aguda (LMA). Historicamente, as NMP foram classificadas de acordo com o tipo de
célula (eritrócitos, plaquetas e granulócitos) predominante no sangue periférico ou
medula óssea (DE KEERSMAECKER; COOLS, 2006; TEFFERI; VARDIMAN, 2007).
O grupo das NMP clássicas é constituído pela Leucemia Mielóide Crônica
(LMC), Policitemia Vera-PV, Trombocitemia Essencial-TE e Mielofibrose-MF,
dependendo do fenótipo apresentado.
A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) constitui o paradigma do estabelecimento
das bases genéticas do câncer a partir da identificação do cromossomo Filadélfia
(Ph). Desta identificação resultaram a clonagem dos genes BCR e ABL, justapostos
molecularmente como resultado da t(9;22), a caracterização da atividade tirosina
cinase, constitutiva do ABL do gene de fusão, e a geração da primeira terapia alvo -
específica contra o ABL (o inibidor de tirosina cinase, Imatinib).
Neste trabalho serão abordadas as NMP clássicas com exceção da LMC. Não
serão discutidas outras NMP, tais como: leucemia neutrofilica crônica, leucemia
eosinofilica crônica, mastocitose, leucemia mielomonocitica e neoplasias
mieloproliferativas não classificáveis (TEFFERI; VARDIMAN, 2007).
Nas NMP clássicas BCR-ABL negativas, a produção excessiva de células
maduras ocorre sem distúrbio óbvio de diferenciação e envolve principalmente a
linhagem eritróide na PV, a linhagem megacariocitica na TE e as linhagens
megacariocitica e granulocítica na MF. A proliferação anormal do progenitor inicial
está associada à hipersensibilidade ou independência a citocinas, incluindo
eritropoetina (EPO), interleucina 3 (IL-3), stem cell factor (SCF), insulin like growth
factor (IGF-1), granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) e
trombopoetina (TPO). Tais anormalidades de sinalização intracelular decorrem de
atividade tirosino-quinase constitutiva, resultante de translocações ou mutações
ativadoras.
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A PV é caracterizada por possuir uma expansão exacerbada da linhagem
eritrocítica e por isso os indivíduos portadores apresentam eritrocitose (hemoglobina
>16,5 e 18,5 g/dL, mulheres e homens), enquanto a TE apresenta trombocitose
(>450mil/mm3) e a MF é caracterizada por extensa fibrose medular e presença de
megacariócitos atípicos e em alta proliferação (tabela 1.1 e tabela1 do anexo 1)
(TEFFERI; VARDIMAN, 2007; TEFFERI, 2013a).
Além das NMP clássicas acima expostas, será discutida a anemia refratária
com sideroblastos em anel com trombocitose (ARSA-t), um tipo de NMP, inserida na
categoria provisória de NMP/síndrome mielodisplásica (SMD) e caracterizada por
trombocitose com diagnóstico diferencial com as TE (VARDIMAN et al., 2009;
BROSÉUS et al., 2012, 2013). Este tipo de NMP apresenta trombocitose em níveis
semelhantes à TE (>450mil/mm3), e cursa com hematócrito baixo ao diagnóstico
(inferior a 35 e 40%, em mulheres e homens). A presença de sideroblastos em anel
em 15% ou mais na medula óssea é um dos critérios diagnósticos, mas esta
característica também está presente nas ARSA sem trombocitose. A classificação da
ARSA-t como uma entidade única ainda é controversa devido aos vários critérios
sobrepostos com outras entidades e a falta de um marcador exclusivo deste grupo.
Entretanto, trabalhos multicêntricos retrospectivos na Europa defendem a hipótese
de que esta é uma entidade única (BROSÉUS et al., 2012, 2013).
A primeira proposta de categorização das NMP foi realizada por Dameshek
(DAMESHEK, 1951). Esta classificação compreendia a divisão das NMP, então
denominadas doenças mieloproliferativas, em Leucemia Granulocítica Crônica,
Policitemia Vera (PV), Metaplasia Mielóide Agnogênica ou Idiopática do baço,
Leucemia Megacariocítica e Eritroleucemia. Ao longo dos anos, a eritroleucemia foi
redefinida como leucemia eritróide aguda (LMA-M6) e as outras quatro doenças
classificadas como doenças mieloproliferativas clássicas (TEFFERI; VARDIMAN,
2008).
A primeira grande revisão da categorização das neoplasias mieloproliferativas
foi realizada pela Organização Mundial de Saúde (OMS), na terceira edição do
manual de classificação de neoplasias e foi publicada em 2001 (JAFFE; WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 2001). Este critério de classificação era subdividido em:
1) Doenças Mieloproliferativas clássicas (LMC, PV, TE, MF, Leucemia neutrofílica
crônica, Leucemia eosinofílica crônica/ síndrome hipereosinofílica e doenças
mieloproliferativas não classificáveis), 2) Síndromes Mielodisplásicas, 3) Síndromes
3
Mielodisplásicas/Mieloproliferativas e 4) doenças mastocitárias. Esta classificação foi
em pouco tempo invalidada, pois numa avaliação prospectiva, seus critérios não
demonstraram total consistência, e além disso, alguns aspectos clínicos tais como a
correlação da concentração de hemoglobina venosa (critério de classificação para
eritrocitose absoluta) com os casos de Policitemia Vera não puderam ser validados
(JOHANSSON; SAFAI-KUTTI; KUTTI, 2005).
Em 2005 foi descoberta uma mutação somática no gene que codifica a
proteína tirosina cinase JAK2, que foi demonstrada estar presente em
aproximadamente 95% dos casos de Policitemia Vera e 50% dos casos de
Trombocitose essencial e Mielofibrose primária (BAXTER et al., 2005; JAMES et al.,
2005; JOHANSSON; SAFAI-KUTTI; KUTTI, 2005; KRALOVICS et al., 2005; LEVINE
et al., 2005; ZHAO et al., 2005).
A quarta edição dos critérios da OMS, publicada em 2008 (VARDIMAN;
WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2008), primeiramente modificou o termo
“doença” por “neoplasia”, colocou as doenças mastocitárias como um subgrupo de
neoplasias mieloproliferativas (NMP) e as neoplasias mielóides associadas com
eosinofilias e anormalidades de PDGFRA, PDGFRB, ou FGFR1 constituindo um
grupo à parte. Além disso, a ARSA-t neste momento passa a figurar como entidade
provisória das neoplasias mieloproliferativas/ síndromes mielodisplásicas. Desta
forma, a classificação das neoplasias mielóides ficou assim organizada: 1) leucemia
mielóide aguda; 2) síndromes mielodisplásicas; 3) neoplasias mieloproliferativas
(LMC, PV, TE, MF primária, leucemia neutrofílica crônica, leucemia eosinofílica
crônica SOE (sem outra especificação), síndrome hipereosinofílica, doença
mastocitária e NMP não classificáveis), 4) SMD/NMP, 5) neoplasias mielóides
associadas com eosinofilias e anormalidades de PDGFRA, PDGFRB, ou FGFR1.
Esta classificação é a mais atual e compreende, além dos critérios clínicos,
diversos critérios laboratoriais tais como genéticos, morfológicos, citoquímicos e
imunofenotípicos (tabela 1.1). Entretanto, em virtude da descoberta de novos
marcadores moleculares, devido à utilização das técnicas de sequenciamento
massivo paralelo ou sequenciamento de próxima geração, vários autores têm
sugerido a atualização desta última revisão da OMS (BROSÉUS et al., 2013;
TEFFERI et al., 2014).
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1.2. Diagnóstico:
O diagnóstico de pacientes com NMP pressupõe uma abordagem
multidisciplinar: clínica-laboratorial (tamanho do baço por palpação ou
ultrassonografia), parâmetros hematológicos (hemograma e bioquímica), anatomia
patológica (biópsia de medula óssea e mielograma) e alterações genéticas
detectadas por biologia molecular (detecção de mutações). Resultados deste tipo de
análise servem para o diagnóstico e a classificação do paciente com NMP.
Algoritmos individualizados são propostos para auxiliar na discriminação entre os 3
fenótipos, PV, TE e MF, que podem se sobrepor e evoluir de forma similar
(JANSSEN et al., 1990; BERGLUND; ZETTERVALL, 1992). Assim, a incorporação
da pesquisa de mutação no gene JAK2 foi realizada rapidamente aos critérios de
classificação da OMS/WHO.
O estabelecimento do diagnóstico das NMP é difícil, por exemplo, o clínico
que não possui treinamento direcionado para hematologia provavelmente teve
pouco contato com pacientes apresentando a doença, que é de baixa incidência,
3/100.000 nos EUA (NCI, 2014), não existindo ainda uma estimativa brasileira. Além
disso, a doença tem uma história natural longa (décadas), o que faz com que o
doente seja frequentemente acompanhado por mais de um médico (SPIVAK;
SILVER, 2008). Outros complicadores para o estabelecimento do diagnóstico são
que as manifestações clínicas podem se modificar ao longo do tempo, dificultando o
diagnóstico e a classificação das NMP (JANSSEN et al., 1990) e que as
manifestações clínicas dessas doenças (PV, TE, MF primária ou secundária, ARSA-
t) podem se sobrepor e evoluir de forma similar. Por exemplo, a PV pode apresentar
eritrocitose (BERGLUND; ZETTERVALL, 1992) associada à leucocitose e à
trombocitose (SHIH; LEE, 1994), enquanto que em cerca de 20% dos casos de MF a
presença de trombocitoses isoladas ou de eritrocitose pode ser observada (BAROSI
et al., 1981; SPIVAK; SILVER, 2008). Além disso, a MF pode ser uma progressão
secundária à PV ou TE, ocorrendo em cerca de 20% dos casos (DINGLI et al., 2006;
HUSSEIN; VAN DYKE; TEFFERI, 2009). A ARSA-t apresenta níveis plaquetários
semelhantes à TE, porém se diferencia por apresentar anemia ao diagnóstico e
sideroblastos em anel, fato que pode ser negligenciado (TEFFERI; VARDIMAN,
2007, 2008; VARDIMAN et al., 2009).
Tais fatos reforçam a relevância da análise molecular na prática clínica para
determinação do diagnóstico.
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Tabela 1 Tabela1.1: critérios diagnósticos das NMP, segundo OMS/WHO (2008). BMO – biopsia de
Medula Óssea; MO medula óssea; LDH – lactato desidrogenase; H-Homens; M-mulheres;
1.2.1. Diagnóstico Molecular:
No panorama genético, nas três NMP e na ARSA-t, a origem da doença se
desenvolve de um progenitor hematopoético comum, que pode apresentar a mesma
mutação, a p.Val617Phe no éxon 14 do gene JAK2 em 98% dos pacientes com PV,
50% dos pacientes com TE, 60% das MF e 50% das ARSA-t (BAXTER et al., 2005;
JAMES et al., 2005; JOHANSSON; SAFAI-KUTTI; KUTTI, 2005; KRALOVICS et al.,
2005; LEVINE et al., 2005; ZHAO et al., 2005).
Outras mutações, menos frequentes, acometem: o éxon 12 do gene JAK2,
mais associada a PV (SCOTT et al., 2007; JONES et al., 2008; LI et al., 2008;
RAPADO et al., 2009; SCHNITTGER et al., 2009); o exon 10 do gene MPL, em 5%
das TE e 10% das MF(PARDANANI et al., 2006; PIKMAN et al., 2006; LIU et al.,
2009; RUMI et al., 2013).
Em 2011 foi descoberta a presença de mutações em SF3B1 fortemente
associadas às anemias refratárias com sideroblastos em anel com ou sem
trombocitose (PAPAEMMANUIL et al., 2011).
critérios Policitemia Vera Trombocitose essencial Mielofibrose Primária
maiores 1 - Hemoglobina: 1 - plaquetas:1 - proliferação megacariocítica, atipia e
presença de fibrose;
> 18,5g/dL (H) > 450 mil/mm³
na ausência de fibrose, as mudanças
megacariocíticas devem ser
acompanhadas com o aumento de
celularidade na MO (proliferação
granulocítica e diminuição eritrocítica)
> 16,5g/dL (M)
2 - BMO com proliferação da linhagem
megacariocítica, com megacariócitos
maduros, aumentados em tamanho e
proliferação
2 - JAK2 p.Val617Phe
2 - JAK2 p.Val617Phe3 - exclusão de critérios diagnósticos para
as outras NMPC
mutações em MPL ou outro marcador
genético clonal
4 - JAK2 p.Val617Phe ou outro marcador
genético clonalexclusão de fibrose secundária
exclusão de trombocitose reativa3 - exclusão de critérios diagnósticos para
as outras NMPC
menores BMO com panmielose leucoeritroblastose
eritopoietina sérica diminuída aumento nos níveis de LDH
formação de colônia eritróide endógena in
vitroanemia
espenomegalia palpável
Diagnóstico:2 critérios maiores e pelo menos 1
critério menor4 critérios 3 critérios maiores e 2 critérios menores
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Em dezembro de 2013, a caracterização de mutações do tipo inserções e
deleções (INDELS) no gene calreticulina (CALR) nos pacientes com NMP JAK2
negativas (TE, MF e ARSA-t) abriu uma perspectiva de melhoria no diagnóstico, pois
conjuntamente com JAK2, será possível diagnosticar, por exames de biologia
molecular, praticamente todos os pacientes com NMP, pois cerca de 67-82% dos
pacientes com TE, 80-88% dos pacientes com MF e 12,5% em ARSA-t apresentam
INDELS em CALR (KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a). Desta forma, a
caracterização molecular dos pacientes com NMP está quase completa, sendo
poucos aqueles que não apresentem um biomarcador diagnóstico.
Nos últimos anos, a classificação das NMP tem mudado, especialmente com
a incorporação de marcadores moleculares. Entretanto, a análise de mutações nos
genes SF3B1 e CALR ainda não foram incluídas como critério diagnóstico da OMS,
no entanto espera-se para breve a formalização destes critérios.
Como consequência, tem-se buscado a investigação dos processos celulares
desregulados em função das mutações encontradas, em especial, no que se refere
à via de sinalização intracelular de JAK2. A importância que esta proteína
desempenha na célula é inquestionável e sua desregulação pode trazer sérias
consequências na fisiologia celular bem como nos processos de homeostase, devido
à proliferação exacerbada de alguns tipos celulares hematopoéticos.
1.3. Via de sinalização JAK-STAT
As células eritróides e megacariocíticas são estimuladas a crescer e proliferar
quando fatores de crescimento hematopoéticos se ligam a seus receptores de
eritropoietina e trombopoietina, respectivamente. Neste momento, a proteína tirosina
cinase JAK2 associada à porção citoplasmática destes receptores de membrana é
ativada, permitindo a fosforilação de moléculas citoplasmáticas, especialmente as da
família dos transdutores de sinais e ativadores de transcrição (STATs) (AARONSON;
HORVATH, 2002).
As STATs (Signal transducers and activators of transcription) são fatores de
transcrição que se ligam aos resíduos de tirosina fosforilados do receptor, através
dos domínios SH2 (Src homology 2). Os domínios SH2 fosforilados são capazes de
reconhecer o domínio análogo em outra molécula de STAT fosforilada, ocorrendo a
dimerização de STATs e a conseqüente dissociação do receptor. As STATs
dimerizadas são importadas para o núcleo onde atuam como fatores de transcrição
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de citocinas e ativando ou reprimindo a transcrição de genes-alvo como Bcl-XL,
Ciclina D, Pim, SOCS e oncostatina M (OSM) (YOSHIMURA et al., 1996; KREBS;
HILTON, 2001; WANG et al., 2001; RAWLINGS; ROSLER; HARRISON, 2004; LIM;
CAO, 2006). Os reguladores negativos da via JAK-STAT são as proteínas SOCS
(suppressores of cytokine signalling), PIAS (protein inhibithors of activated STATs),
PTP (protein tyrosine phosphatases)/SHP e Pim.
Células eritróides e megacariocíticas positivas para mutação em JAK2, ou em
MPL, demonstram um fenótipo de hiperproliferação celular necessitando de
concentrações baixíssimas ou nula de citocinas. A via de JAK-STAT é o principal
mecanismo de sinalização de várias citocinas, tais como interferon, interleucina,
eritropoetina e GM-CSF. Desta forma, a ativação de JAK pode estimular a
proliferação, diferenciação, migração e apoptose, já tendo sido descrita na
hematopoese, desenvolvimento imune, a adipogênese, desenvolvimento das
glândulas mamárias e lactação, dentre outros (RAWLINGS; ROSLER; HARRISON,
2004).
1.1. Mutações em NMP
1.1.1. JAK2
A mutação somática de maior frequência nas NMP é a p.Val617Phe (a partir
de agora chamada de JAK2V617F). Esta mutação ocorre, no éxon 14 do gene
JAK2 (localização 9p24), pela troca de uma guanina por uma timina, que resulta na
proteína funcional mutada, p.Val617Phe, ou seja uma valina é substituída por uma
fenilalanina na posição 617. A presença da JAK2V617F está associada a um
fenótipo mieloproliferativo e tem como consequência a hiperativação da proteína
JAK2 nas células portadoras desta mutação. A pesquisa da mutação JAK2V617F, é
hoje parte integrante de uma abordagem diagnóstica para as NMP.
As proteínas JAK são formadas por sete domínios do tipo JH. O domínio JH1,
situado na região C-terminal, possui atividade catalítica de fosfotirosina cinase; e o
domínio JH2, localizado entre o SH2-like e o JH1, é um domínio pseudo-cinase, que
possui um papel importante na regulação da ativação de JAK. Os domínios JH3 e
JH4 compartilham alguma similaridade com o domínio SH2, entretanto não possuem
a habilidade de ligação fosfotirosina (SH2-like). O domínio FERM (4.1, Ezrina,
Radixina, Moesina) é formado pelas regiões JH5, 6 e 7 e está envolvido em
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interações de JAK com outras cinases. O domínio FERM regula a ligação a regiões
de box1 e box2 na porção citoplasmática dos receptores associados à membrana e
parece estar envolvido na estabilização da expressão do receptor. No domínio
pseudocinase foram descritas três regiões inibitórias: IR1(619-670), IR2 (725-757) e
IR3 (758-807) (figura 1.1) (RAWLINGS; ROSLER; HARRISON, 2004; VALENTINO;
PIERRE, 2006; SANZ et al., 2011).
Figura 1 Figura 1.1: Representação esquemática da molécula de JAK2 com a identificação dos seus
sete domínios homólogos e da localização da mutação JAK2V617F. Adaptado de QUINTÁS-CARDAMA et al. (2011).
A detecção de outras mutações em JAK2, pouco frequentes, e que não co-
ocorrem com a JAK2V617F, são apresentadas em ordem decrescente de
frequência: no éxon 12 de JAK2; no éxon 14, em posição diferente da V617F. Estas
mutações estão mais frequentemente associadas aos pacientes com PV. Desta
maneira parece correto afirmar que pacientes com PV são virtualmente 100%
positivos para mutação no gene JAK2 (GRÜNEBACH et al., 2006; SCHNITTGER et
al., 2006; LEE et al., 2009; MA et al., 2009;). Em estudo de pacientes com PV
negativos para V617F (SCOTT et al., 2007), a presença de mutações no éxon 12 foi
observada em 10/11 pacientes. Em geral, os pacientes positivos para estas
mutações apresentaram as seguintes manifestações clínicas: eritrocitose, baixos
níveis séricos de eritropoietina, com biópsia de medula óssea mostrando uma
hiperplasia eritróide com megacariopoese e neutropoese normais (SCOTT et al.,
2007). Vale ressaltar que as mutações descritas tanto para o éxon 12 quanto para
outras localizações no éxon 14 podem se posicionar em diferentes regiões. Uma
provável causa do aparecimento de mutações no éxon 12 seria o deslizamento no
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pareamento da polimerase na região do aminoácido 541, que possui duas
repetições AGA próximas e que leva à deleção de 6 pb. Outras mutações no éxon
12 incluem a troca (simples, dupla) de aminoácidos (CAZZOLA, 2007). As mutações
no éxon 14, por serem bem mais raras, não são sugeridas na inclusão diagnóstica,
mesmo em pacientes com PV, somente as mutações do éxon 12 (TEFFERI, 2013a).
1.1.1.1. Carga alélica da mutação JAK2
A mutação JAK2V617F é encontrada em PV, TE e MF e devido à presença
da mesma mutação em diferentes doenças (um único genótipo gerando diferentes
fenótipos), tem-se discutido se PV, TE e MF são doenças distintas, manifestações
diferentes de uma mesma doença ou uma combinação de características (SPIVAK;
SILVER, 2008). Uma tentativa de diferenciação destas três entidades foi através da
investigação da influencia que a quantidade de mutação (carga alélica) poderia
exercer no fenótipo apresentado.
Desta maneira, diferentes metodologias foram propostas para dosagem da
quantidade de células positivas para a JAK2V617F, obtida pelo cálculo da razão
entre alelo mutado e alelo selvagem, ao que chamamos carga ou taxa alélica.
Surpreendentemente, vários pacientes quando avaliados, apresentaram carga
alélica > 50%, implicando que, por algum motivo estes pacientes cursavam com
perda de heterozigosidade (BAROSI et al., 2007b; HUSSEIN et al., 2009; SCOTT,
2006).
O evento de perda de heterozigosidade (LOH) pode ocorrer devido à deleção
de um dos alelos ou à recombinação homóloga. Foi demonstrado que pacientes com
100% de carga alélica quase sempre possuíam os dois alelos e estes
frequentemente eram provenientes do mesmo progenitor (dissomia uniparental),
sem que existisse recorrência do alelo de um dos progenitores na população de
pacientes mutados, sugerindo a inexistência de imprinting genômico no processo de
perda de heterozigosidade. Em contraste, não foram observados pacientes com dois
alelos selvagens provenientes do mesmo progenitor, mostrando que a perda de
heterozigosidade só acontece no alelo mutado (KRALOVICS et al., 2005).
A homozigose é mais frequentemente observada em pacientes com PV (25-
30%) comparada aos com TE (2-4%) (JONES et al., 2005; SCOTT, 2006; TEFFERI
et al., 2006; VANNUCCHI et al., 2007b). Em TE, a perda de heterozigosidade nos
progenitores hematopoéticos foi observada após a transformação para PV (SCOTT,
2006; HUSSEIN et al., 2009). Em MF, também foi observada a progressão da carga
10
tumoral (mudança do padrão de heterozigose para homozigose em algumas células)
e esta mudança não esteve associada a nenhuma aquisição de mutação adicional
(BAROSI et al., 2007b).
Os pacientes que possuem carga alélica de JAK2 V617F mutada acima de
50% apresentam um maior tempo de evolução da doença se comparados aos que
possuem carga alélica abaixo dos 50%, mostrando que a aquisição da mutação em
homozigose em alguns clones, requer tempo para que os eventos genéticos
aconteçam; estes eventos ocorrem com a evolução natural da doença (KRALOVICS
et al., 2005). A maior proporção de pacientes portadores da JAK2V617F em
homozigose na PV pode ser atribuída ao fato desses pacientes demorarem muito
tempo para serem diagnosticados, repercutindo numa fase de pré-diagnóstico maior,
ou pode ser devido a uma maior suscetibilidade desses pacientes à recombinação
homóloga (SCOTT, 2006). Este fato é fortalecido pela observação de que pacientes
portadores da mutação JAK2V617F ao diagnóstico são mais velhos do que os que
apresentam o gene JAK2 na sua versão selvagem, inclusive nos casos NMP
familiares (CAMPBELL et al., 2005; BELLANNE-CHANTELOT, 2006; VANNUCCHI
et al., 2007b; ANTONIOLI et al., 2008).
Alguns trabalhos também avaliaram a influência do sexo na distribuição da
carga alélica e da doença: PV, onde virtualmente todos os pacientes são portadores
da mutação JAK2V617F, é mais frequente em homens (MARCHIOLI, 2005) em
contraste, TE JAK2V617F positiva, é mais frequente em mulheres (ANTONIOLI et
al., 2005; CAMPBELL et al., 2005; ANTONIOLI et al., 2008). Em pacientes com
trombose venosa esplênica, a mutação é mais frequente em mulheres (COLAIZZO
et al., 2011).
Assim, vários grupos buscaram estudar associações entre a carga do alelo
mutado, parâmetros clínico-laboratoriais, e resposta ao tratamento. Níveis elevados
do alelo mutado foram relacionados a um risco aumentado para eventos
cardiovasculares ao diagnóstico e durante o acompanhamento. Por exemplo, a
carga alélica acima de 50% é um fator de risco aumentado para eventos trombóticos
arteriais ao diagnóstico na TE (VANNUCCHI et al., 2007a, 2007c; ANTONIOLI et al.,
2008), para eventos trombóticos arteriais em NMP familial (BELLANNE-
CHANTELOT, 2006), para eventos trombóticos, especialmente arteriais em MF
(BARBUI et al., 2012), para eventos trombóticos venosos (CAMPBELL et al., 2005;
DE STEFANO et al., 2010). Níveis de carga alélica maiores que 25% são associados
11
a sintomas e eventos microvasculares (TEFFERI et al., 2007; ANTONIOLI et al.,
2008;); e maior risco de trombose venosa esplênica em mulheres (LEVINE et al.,
2005; COLAIZZO et al., 2011;). Entretanto, pacientes com maior susceptibilidade à
trombose venosa e acidente vascular cerebral isquêmico, mas sem indícios
evidentes de NMP concomitante, possuem baixa prevalência da mutação
JAK2V617F (XAVIER et al., 2008). No entanto, 22% (24/108) dos pacientes com
trombose venosa esplâncnica (trombose venosa portal e síndrome de Budd-Chiari)
apresentaram a mutação JAK2V617F com carga alélica não superior a 50%. Destes,
9/24 foram enquadrados nos critérios diagnósticos de NMP ao longo do estudo
(XAVIER et al., 2010).
A presença de carga alélica de JAK2V617F acima de 50% também foi
correlacionada com esplenomegalia (BAROSI et al., 2007b; VANNUCCHI et al.,
2007a; ANTONIOLI et al., 2008;), aumento de prurido em PV (TEFFERI et al., 2006;
VANNUCCHI et al., 2007a) e em MF(BAROSI et al., 2007b), alta taxa de
transformação fibrótica (BELLANNE-CHANTELOT, 2006; TEFFERI et al., 2006;
VANNUCCHI et al., 2007a), aumento do hematócrito e dos níveis de hemoglobina ao
diagnóstico, leucometria total e número de neutrófilos aumentados, eritropoiese e
granulopoiese medular aumentadas, mas com diminuição no número de plaquetas
em pacientes com TE e PV (ANTONIOLI et al., 2005; CAMPBELL et al., 2005;
CAMPBELL, 2006; TEFFERI et al., 2006; VANNUCCHI et al., 2007a, 2007b;
ANTONIOLI at al., 2008).
Através da presença da JAK2V617F foi possível diferenciar subtipos de TE:
portadores da mutação V617F possuem similaridades fenotípicas com a PV, ou seja,
eritrocitose, observada através dos níveis de hemoglobina e hematócrito
aumentados em contraste aos pacientes que possuem o alelo selvagem, entretanto
a eritrocitose observada na TE JAK2V617F positiva não atinge os mesmo níveis
encontrados na PV (CAMPBELL et al., 2005; PALANDRI et al., 2009).
Entretanto, quando o grupo JAK2V617F foi subdivido em dois grupos de
acordo com a carga alélica, <12,5% (baixa) e >12,5% (alta), uma associação inversa
foi observada entre níveis baixos de hemoglobina, hematócrito e número de
plaquetas e taxa alélica alta. Uma possível explicação para este quadro foi à
presença de displasia medular nas três linhagens, e presença de doença mais
severa. Estes pacientes também apresentaram um número aumentado de
micromegacariócitos (PICH et al., 2012).
12
Os pacientes com MF JAK2V617F positivos necessitam menos transfusão
sanguínea, mas cursam com sobrevida global menor quando comparados aos
negativos para a mutação (CAMPBELL, 2006). Dentre as diferenças apontadas em
relação a sobrevida global e livre de progressão, pacientes com MF e baixa carga de
alelo mutado (quartil inferior) em MF apresentam doença mais agressiva (TEFFERI
et al., 2008).
Pacientes com a carga alélica da mutação JAK2V617F acima de 50% tem
risco aumentado para progressão para MF e leucemia aguda secundária
(CAMPBELL et al., 2005; KRALOVICS et al., 2005; BELLANNE-CHANTELOT, 2006;
VANNUCCHI et al., 2007b).
A relevância da quantificação da carga alélica para fins de pesquisa é
inquestionável, embora ainda controversa em relação a nortear a conduta clínica–
terapêutica (ANTONIOLI et al., 2010). Entretanto, alguns pacientes conseguem
atingir a resposta molecular completa após a terapia com hidroxiureia (HU)
(GIRODON et al., 2008), interferon-alfa (HASSELBALCH, 2011) ou inibidores de
JAK2 (PARDANANI et al., 2011, 2013). O valor, a longo prazo, do desaparecimento
molecular do clone JAK2 ainda é uma questão em aberto, o que faz com que
recentemente a quantificação da V617F venha ganhando relevância (SCOTT et al.,
2007; GIRODON et al., 2008;).
Pacientes JAK2V617F positivos são mais sensíveis ao tratamento e requerem
doses de HU menor do que os pacientes JAK2V617F negativos (CAMPBELL et al.,
2005; BONAMINO et al., 2009;). Este fato foi atribuído a uma rápida diminuição da
carga alélica logo após o início do tratamento citorredudor com HU (RICKSTEN et
al., 2008). Outro trabalho mostrou que mulheres apresentaram maior sensibilidade
ao tratamento com drogas citorredutivas associadas a uma maior redução da carga
alélica ao longo do tratamento (GIRODON et al., 2008). Um estudo de quantificação
da carga alélica em neutrófilos e plaquetas de homens e mulheres mostrou que os
neutrófilos femininos tendem a apresentar carga alélica mais baixa, podendo explicar
a maior sensibilidade destas células ao tratamento (BAROSI et al., 2007b;
PEMMARAJU et al., 2007; VANNUCCHI et al., 2007a, 2007b).
Estudos de acompanhamento da carga alélica ao longo do curso da doença
inicialmente sugeriram que o clone tumoral permanecia estável durante anos
(CAMPBELL et al., 2006; GALE et al., 2006; ANTONIOLI et al., 2008; HUSSEIN et
al., 2009; LARSEN et al., 2009; ANTONIOLI et al., 2010). Alguns estudos mostraram
13
que pode ocorrer aumento do clone JAK2 mutado ao longo dos anos, sendo esse
aumento mais pronunciado em PV do que TE tanto no sangue periférico como na
medula óssea (TEFFERI et al., 2007; CAROBBIO et al., 2009).
Em contraste, outros grupos utilizando amostras sequenciais do mesmo
paciente mostraram uma maior redução da carga alélica inicial logo após o início da
terapia citorredutiva e uma flutuação mais sutil ao longo dos anos (GIRODON et al.,
2008; RICKSTEN et al., 2008; THEOCHARIDES et al., 2008; ZALCBERG et al.,
2011). Estas variações parecem ser mais frequentes entre o 2º e 3º quartis
(ZALCBERG et al., 2011). Pacientes mais idosos tem carga alélica mais alta e
possuem tendência a aumento da carga alélica com o tempo (ANTONIOLI et al.,
2008). Alguns pacientes conseguem atingir a resposta molecular completa, ou seja,
níveis indetectáveis de JAK2V617F durante o acompanhamento (GIRODON et al.,
2008; RICKSTEN et al., 2008).
Além disso, o uso da quantificação da carga alélica, para avaliação de doença
residual mínima, no monitoramento pós transplante alogênico de células tronco
hematopoéticas (TCTH) em pacientes JAK2V617F positivos tem aumentado. A
presença de carga alélica >1% no dia 28 pós transplante e a falha de obtenção de
uma resposta molecular completa em 6 meses pós TCTH, tem se mostrado um
parâmetro precoce de recidiva e utilizado para guiar o uso de infusão de linfócitos do
doador (ILD). O monitoramento da doença residual mínima pode ser realizado tanto
em amostras de medula óssea e de sangue periférico com a mesma eficiência.
(LANGE et al., 2013). Pacientes com MF negativos para JAK2V617F apresentam
sobrevida menor quando comparados ao grupo JAK2V617F positivo. (KROGER et
al., 2006; BENJAMINI et al., 2008; GIRODON et al., 2008; KROGER et al., 2009;
ALCHALBY et al., 2010; LANGE et al., 2013).
Desta maneira, vale ressaltar a importância do desenvolvimento e
uniformização de métodos moleculares para a quantificação de JAK2V617F, a fim de
utilizá-los na prática clínica.
1.1.1.2. Metodologias para estimativa da carga alélica JAK2
Estudos visando relacionar a carga alélica com as características clínico-
laboratoriais se basearam, inicialmente, na presença da mutação em hetero ou
homozigose. A metodologia utilizada baseava-se na amplificação do éxon 14 de
JAK2 seguida de digestão com a enzima BsaXI.
14
A primeira técnica semiquantitativa desenvolvida para a quantificação da
carga alélica utilizou um PCR, com iniciadores fluorescentes, para a amplificação
das regiões alvo, seguido de análise de fragmentos. Embora bastante específica, é
uma técnica demorada, por envolver múltiplas etapas, e de pouca precisão para
quantificar amostras com baixa carga tumoral (<5%), embora a sensibilidade da
técnica possa chegar a 1% (VANNUCCHI et al., 2006; LIPPERT et al., 2009;
HUIJSMANS et al., 2011).
Recentemente, a análise por PCR quantitativo em tempo real vem sendo
utilizada (q-PCR) (LARSEN et al., 2007a). Esta técnica é a que oferece maior
sensibilidade, detectando até 0,01% do alelo mutado, e envolve somente um
procedimento. Entretanto, requer uma padronização meticulosa a fim de que sejam
obtidos resultados que possam nortear tomadas de decisão clínica. Neste caso, a
escolha da curva padrão controle é o parâmetro mais importante (LIPPERT et al.,
2009).
Uma variação do q-PCR é a análise por HRM (temperatura de melting ou high
resolution melting) (RAPADO et al., 2009). Este procedimento é simples e envolve
uma padronização com apenas dois controles: uma amostra com o gene JAK2 na
forma selvagem (WT) e outra com a V617F. A quantificação é estabelecida através
da comparação da temperatura de desnaturação do DNA teste com uma curva de
calibração contendo proporções diferentes dos DNAs-controle.
Finalmente, alguns laboratórios utilizam o sequenciamento de Sanger ou o
piro-sequenciamento como metodologia de avaliação da carga alélica. Entretanto,
estas metodologias têm sido abandonadas devido à baixa sensibilidade que
oferecem. Um ponto positivo deste tipo de abordagem é permitir um processamento
rápido de um grande número de amostras (LIPPERT et al., 2009).
Fóruns destinados a validação interlaboratorial das metodologias de
quantificação da carga alélica definiram a metodologia de q-PCR, com sondas
Taqman, como a mais sensível (1%); em relação a precisão (variação inter e intra-
ensaio), o q-PCR e o PCR-Alelo específico (AS) seguido de análise de fragmentos
por eletroforese capilar (PCR-C) foram as metodologias sugeridas. O q-PCR com
oligonucleotídeos AS foi o método que atingiu a maior sensibilidade (0,2%).
Este estudo chama atenção para alguns parâmetros técnicos importantes: a)
o uso da linhagem HEL como controle, que possui mais de duas cópias do gene
JAK2. De fato, alguns trabalhos relatam em torno de 8 cópias (QUENTMEIER et al.,
15
2006a). Desta forma, o uso desta linhagem para a confecção de uma curva padrão
para a quantificação de JAK2 não seria o mais apropriado, e caso esta linhagem
fosse utilizada seria necessário a geração um fator de correção capaz de normalizar
o número de cópias do gene JAK2; b) utilização de um gene controle para
estabelecimento da porcentagem do número de cópias do alelo JAK2 mutado (taxa
alélica de 100% é definida quando há o mesmo número de cópias do gene controle
e JAK2); geram variações na quantificação da carga alélica que podem sub ou super
estimar a carga alélica.
Em 2013, a rede européia LeukemiaNet e o consórcio MPN&MPNr-EuroNet,
realizaram uma avaliação interlaboratorial com 9 técnicas diferentes de quantificação
da carga alélica. Foram distribuídos entre os centros: a) os padrões utilizados:
plasmídeos (comercial) e DNA de linhagens celulares (HEL ou UKE-1 e K562); b) os
reagentes para reação de q-PCR; c) as condições de realização de cada ensaio.
Os resultados mostraram que a uniformidade entre os ensaios continua sendo
um grande problema, pois uma amostra teste distribuída pelo laboratório central de
controle de qualidade, que foi estimada como tendo 10% de carga alélica, foi
quantificada pelos grupos mostrando resultados conflitantes, que variavam, dentre
os laboratórios, em um intervalo de 23 a 80%.
Ao final das sete rodadas de controle de qualidade, o ensaio baseado na
publicação de LARSEN et al. (2007b) foi eleito como mais sensível, de maior
acurácia e performance. Este ensaio de q-PCR envolve a utilização de
oligonucleotídeos alelo específicos e sondas do tipo TaqMan, em duas reações
independentes. Este ensaio foi eleito como o mais confiável na detecção de cargas
alélicas abaixo de 1% e por isso o mais indicado para o monitoramento pós
transplante.
1.1.2. CALR
A CALR é um gene localizado no cromossomo 19, contendo 9 éxons, com
tamanho de 4,6kb. Este codifica uma proteína, a Calreticulina, que é uma chaperona
ligante de cálcio, de localização luminal no reticulo endoplasmático, sendo altamente
conservada entre espécies. A proteína possui um peso de 46kDa e três domínios
com diferentes propriedades funcionais e estruturais: a) um domínio N-terminal
globular, ligante de lectinas que possui uma sequência de endereçamento da
proteína ao retículo endoplasmático (RE); b) uma região intermediária rica em
prolina (domínio-P); c) e uma região acídica c-terminal (carregada negativamente),
16
que contém a sequência KDEL de endereçamento de proteínas da região cis do
complexo de Golgi para retorno ao retículo endoplasmático, e também com alta
capacidade de ligação ao Cálcio (Ca2+), sendo assim responsável pela homeostase
do Ca2+ intracelular (CHI et al., 2013a; GUGLIELMELLI et al., 2014).
Recentemente, alterações do tipo inserção e deleção (indels) foram descritas
no gene CALR (CHI et al., 2013a; KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a).
Cerca de 40 diferentes indels foram relatadas no exon 9 (figura 1.2), sendo a mais
frequente uma deleção de 52pb, que tem início no aminoácido leucina, na posição
367. Como resultado desta inserção, ocorre uma troca na fase de leitura que resulta
em um códon de parada, que ocorre 46 aminoácidos após a deleção. A deleção de
52 pb é chamada de tipo 1, e é encontrada com maior frequência nas MF. A
segunda alteração mais frequente é uma inserção de 5pb (TTGTC) com início no
aminoácido lisina, na posição 385. Esta inserção resulta em troca da fase de leitura
que resulta num códon de parada a 47 aminoácidos após a inserção e é
denominada de tipo 2, e é mais comumente observada nas TEs. Os indels em CALR
estão presentes em cerca de 67 a 82% dos pacientes com TE e 80 a 88% dos
pacientes com MF, negativos para a mutação V617F em JAK2 (CHI et al., 2013b;
KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a).
Desta forma, alterações em um único gene (CALR), discriminam um outro
grande grupo, dentre as NMP JAK2V617F negativas. Alterações gênicas em CALR e
JAK2 são mutuamente excludentes.
Em relação aos parâmetros hematológicos, é descrita a associação positiva
entre menores níveis de hemoglobina e leucócitos; níveis elevados de plaquetas ao
diagnóstico; risco diminuído para trombose e maior sobrevida em pacientes com TE
portadores de indels em CALR.
Na MF, indels em CALR estão associados à leucopenia, trombocitose e
aumento da sobrevida (KLAMPFL et al., 2013). A carga alélica tumoral de CALR
parece ser mais baixa em TE do que em pacientes com MF secundária à TE (32% X
50%). Pacientes com TE e CALR mutado tem menor incidência de transformação
tanto para PV como para leucemia aguda. Em relação ao sexo, os homens
apresentam maior incidência de mutações em CALR (KLAMPFL et al., 2013).
Ensaios in vitro com células Ba/F3 transduzidas com a mutação mais frequente de
CALR (del 52pb), mostraram ativação de STAT5 e crescimento independente de IL3
(KLAMPFL et al., 2013).
17
Praticamente todos os indels descritos em CALR geram deleção do domínio
KDEL, podendo, portanto, afetar a localização proteica. A expressão em membrana
de CALR parece mediar os sinais de “coma-me”, ao ser exposta na superfície de
células com sinal de morte por apoptose (GARDAI et al., 2005), e também por
mediar a fagocitose de blastos (CHAO et al., 2010). Entretanto, ao contrário do que
se esperaria, a CALR, em presença de deleção do domínio KDEL, permanece no RE
(NANGALIA et al., 2013a).
Figura 2 Figura 1.2: Figura ilustrativa do espectro de INDELS detectadas no gene CALR. A barra em
cinza representa o exon 9 do gene Calreticulina; as barras vermelhas indicam as deleções, as letras
azuis indicam os nucleotídeos inseridos, e em laranja as substituições somáticas adquiridas. Estão
ressaltadas as alterações mais frequentes: Tipo 1 (Type 1), deleção de 52pb e tipo 2 (type 2),
inserção de 5pb. Adaptado de KLAMPFL et al. (2013).
Mutações em CALR não são exclusivas das NMP, estando presentes em
baixa frequência em outras neoplasias mielóides que são parte do diagnóstico
diferencial com as NMP. Como exemplo: ARSA-t (3/24-12%) (KLAMPFL et al.,
2013), SMD (anemia refratária, anemia refratária com excesso de blastos, ARSA),
leucemia mielóide crônica atípica e leucemia mielomonocítica crônica (NANGALIA et
al., 2013a). Alterações em CALR não foram observadas em controles normais,
neoplasias linfóides, leucemia mielóide aguda e tumores sólidos, mostrando ser
desta forma, pela alta especificidade, um relevante biomarcador diagnóstico
(GUGLIELMELLI et al., 2014).
18
1.1.3. MPL
O receptor de trombopoietina é codificado pelo gene MPL, que está localizado
no braço curto do cromossoma 1, na região p24. As mutações mais frequentes em
MPL estão no éxon 10, mais especificamente nos códons 505 – p.Ser505Asn e 515
- p.Trip515Leu/Lys. Mutações em MPL estão presentes em pacientes com sintomas
clínicos das neoplasias mieloproliferativas, mas que, em geral, são negativos para a
mutação JAK2V617F. As mutações em MPL são observadas em 10% dos pacientes
com mielofibrose idiopática (PARDANANI et al., 2006; PIKMAN et al., 2006), e em 1-
5% dos pacientes com trombocitemia essencial (PARDANANI et al., 2006).
PARDANANI et al. (2006) detectaram mutações em MPL em 20/1182 pacientes,
sendo que 6/20 pacientes possuíam mutações concomitantes em JAK2 e MPL.
Anormalidades citogenéticas, megacariócitos displásicos e risco de transformação
para mielofibrose ou leucemia mielóide aguda foram observados em pacientes com
TE, negativos para JAK2V617F, e positivos para mutações em MPL (SCOTT et al.,
2007).
Em resumo, atualmente apenas uma pequena parcela de pacientes com
suspeita clínica de NMP (16,5% dos pacientes com TE e 6% dos pacientes com MF)
não pode ser caracterizada ao diagnóstico por um marcador molecular, utilizando as
mutações nos genes aqui apresentados (KLAMPFL et al., 2013).
Esta pequena fração, ainda é de difícil diagnóstico, porque o conjunto de
sinais e sintomas clínicos é pouco específico. A procura de novos biomarcadores do
diagnóstico continua e o entendimento atual aponta para que esta pequena fração
venha a ser caracterizada por alterações em diferentes genes de muito baixa
frequência.
1.2. Tratamento
A Hidroxiureia (HU) é um composto orgânico simples, sintetizado por Dresler
e Stain em 1869 e aprovado pela FDA (Food and Drug Administration /USA) em
1967. Em pacientes com NMP, o tratamento padrão no Brasil é a utilização de
Hidroxiureia em doses proporcionais à massa do paciente e ao nível de
desregulação dos parâmetros hematológicos.
O monitoramento do tratamento dos pacientes é realizado através de
hemogramas frequentes, como forma de obter uma normalização, mesmo que
parcial, dos parâmetros hematológicos. Quando há uma diminuição nos valores de
19
alguns dos parâmetros, tais como hematócrito, plaquetas e leucócitos, que estejam
fora dos limites mínimos considerados normais, a utilização do fármaco é
interrompida até que o referido parâmetro encontre-se novamente normalizado.
Alguns pacientes não respondem satisfatoriamente à HU ou tornam-se refratários ao
longo do tratamento. Conforme descrito na literatura (ANTONIOLI et al., 2010;
ZALCBERG et al., 2011), a carga alélica de JAK2 não é diretamente afetada pela
HU, apesar das flutuações observadas nos parâmetros hematológicos ao longo do
tempo. A carga alélica de JAK2 possui maiores flutuações no intervalo inicial do
tratamento ou em períodos curtos de observação. Em pacientes com carga alélica
entre o 2º e 3º quartis esta flutuação parece ser mais evidente (ZALCBERG et al.,
2011).
Recentemente, inibidores para as tirosinas cinases da família JAK foram
descritos. Pelo menos quatro compostos já foram utilizados em testes clínicos, e foi
comprovado que cada um deles possui uma ação mais seletiva entre as diferentes
proteínas da família JAK. Os inibidores disponíveis são Ruxolitinib (INCB018424,
Axon MedChem; Jakafi™, Incyte e Novartis), TG101348 (SAR302503, Fedratinib,
Sanofi), Lestaurtinib (CEP-701, Cephalon) e XL019 (Exelixis).
O Ruxolitinib® possui potente atividade inibitória para JAK1/2, atividade
moderada para TYK2 e praticamente nenhuma atividade para JAK3. O tempo médio
para observar-se um efeito terapêutico é de 15 meses. A toxicidade não
hematológica (graus 1 e 2) foi relatada em menos de 10% dos pacientes (QUINTÁS-
CARDAMA et al., 2011).
Estudos clínicos de fase 3 com este inibidor demonstraram a redução do baço
em praticamente todos os pacientes do grupo que utilizou o inibidor, com média de
redução de 31,6% após 24 semanas de tratamento, com manutenção do tamanho
do baço por pelo menos 48 semanas. O grupo tratado com placebo teve um
aumento médio de 8,1% do tamanho do baço. O grupo tratado com o inibidor
também teve maior redução no escore total de sintomas quando comparado ao
grupo placebo (49,5% X 5,3%). Este estudo também analisou a redução da carga de
JAK2V617F nos dois grupos: os pacientes tratados com o inibidor tiveram uma
redução de 10,9% e 21,5% após 24 e 48 semanas de tratamento, enquanto que o
grupo placebo apresentou aumento médio de 3,5% e 6,3% na carga alélica após
mesmo intervalo de análise (VERSTOVSEK et al., 2012).
20
A partir de julho de 2008, o inibidor Ruxolitinib obteve aprovação nos EUA
para uso em pacientes com PV refratários ou intolerantes à terapia com HU. No total
foram eleitos 34 pacientes no estudo, que foram tratados, em média, por 3 anos. Em
quatro semanas, o hematócrito foi reduzido para <45% e os sintomas também
melhoraram substancialmente tais como prurido e sudorese noturna. Clinicamente
os pacientes também apresentaram redução no perfil de citocinas inflamatórias e de
ativação granulocítica (VERSTOVSEK et al., 2014).
O inibidor TG101348 (SAR302503, fedratinib, Sanofi) é um inibidor
competitivo do sítio de ATP de JAK2 WT e mutado (V617F), que possui maior
seletividade entre os membros da família de JAK. Os estudos de fase I mostraram
redução da carga alélica à metade nos pacientes estudados. Quatro pacientes
JAK2V617F positivos tiveram aumento da carga alélica (PARDANANI et al., 2011).
No estudo de fase III (JAKARTA), o principal resultado foi a taxa de resposta
do baço (diminuição em > 35% do volume em relação ao diagnóstico após 24
semanas) que foi de 47% (400mg) e 49% (500mg) em 24 semanas e de 36% (400
mg) e 40% (500 mg) após 28 semanas. Os pacientes tratados com inibidor também
tiveram melhoras consideráveis nos sintomas, quando comparados ao grupo
controle (p>0,0001) (PARDANANI et al., 2013). Entretanto, em 18 de novembro de
2013, o estudo do inibidor teve de ser descontinuado devido ao desenvolvimento de
encefalopatia de Wernicke, o que fez com que a análise de risco-benefício não fosse
favorável. O FDA aconselhou a Sanofi a colocar todos os estudos com a droga em
espera clínica.
Outros inibidores como o Lestaurtinib® (CEP-701, Cephalon), XL019
(Exelixis) e CYT3387 vem sendo testados em diferentes fases de ensaios clínicos.
Atualmente existem outros inibidores em desenvolvimento, chamados de segunda
geração, que estão, inclusive, com testes clínicos em andamento, tais como
SB1518, AZD1480, INCB028050, INCB16562, Tasocitinib, NVP-BSK805
(PASSAMONTI; MAFFIOLI; CARAMAZZA, 2012).
Em 2009, um grupo de pesquisadores europeus patrocinados pela Rede de
trabalho Comunitária de Excelência ou LeukemiaNet desenvolveu um guia para a
definição do grau e da qualidade da resposta ao tratamento em PV e TE (BAROSI et
al., 2009). O grupo desenvolveu três categorias de resposta: a) clínico-hematológica
(CH); b) molecular; c) histológica; estas categorias são ainda agrupadas em:
completa, parcial e ausência de resposta.
21
Na TE, a resposta clínico-hematológica (CH) representa: redução/
normalização dos níveis de plaquetas (<400mil/mm³); ausência de sintomas
relacionados à doença (distúrbios microvasculares, prurido e dor de cabeça);
redução/ normalização da esplenomegalia em exames de imagem; redução/
normalização do número de leucócitos (< 10mil/mm³). Desta forma, a resposta CH
completa representa a conquista de todos os requisitos; a resposta parcial em uma
diminuição dos níveis de plaqueta para < 600mil/mm³ ou diminuição de > 50% do
nível ao diagnóstico; e a resposta histológica no desaparecimento da hiperplasia
megacariocítica.
A avaliação terapêutica por métodos moleculares na TE depende da
determinação prévia de um marcador molecular. A redução dos níveis do marcador
é observada com o uso de metodologias quantitativas para detecção da
anormalidade molecular detectada ao diagnostico. Desta maneira, classifica-se
como resposta completa aquela onde a redução dos níveis é tal que o marcador
molecular não pode ser detectado pelas metodologias moleculares; parcial quando
há uma redução de mais de 25% ou 50% da carga alélica observada ao diagnóstico,
para pacientes que possuíam carga alélica <50% ou >50%, respectivamente.
Na PV, a resposta clínico-hematológica (CH) é obtida quando os seguintes
critérios são obtidos: hematócrito <45% sem flebotomia; níveis de plaquetas <
400mil/mm³; leucócitos < 10mil/mm³; baço de tamanho normal ao exame de imagem
e nenhum dos sintomas, distúrbios microvasculares, prurido e dor de cabeça, são
observados. Desta forma, a resposta completa é aquela onde todos os parâmetros
acima relacionados são alcançados, uma resposta parcial quando o hematócrito
<45% sem flebotomia ou 3 ou mais critérios são atingidos. A resposta histológica
requer a normocelularidade ajustada para a idade e ausência de fibrose reticulínica.
Finalmente, a resposta molecular na PV segue os mesmos critérios de TE.
1.3. Progressões naturais nas NMP
As NMP clássicas, PV, TE e MF, conforme já introduzido anteriormente,
podem ter uma evolução tumoral, passando de um estado em que a maioria dos
clones apresenta heterozigose em JAK2 para um estado de perda de
heterozigosidade e aquisição de alguns clones com JAK2 mutados em homozigose,
sugerindo um percurso de evolução natural da doença. Em TE, já discutimos que a
presença desta carga alélica acima de 50% está relacionada com a aquisição de
fenótipos mais semelhantes à PV. Na PV, a carga alélica acima de 50% está
22
associada à maior propensão a fibrose medular, sugerindo uma evolução para MF
secundária. Pacientes com TE também podem evoluir para MF secundária, que
pode ser um estágio intermediário para evolução para leucemia aguda (BAROSI et
al., 2007a). A progressão para MF secundária ocorre em cerca de 20-30% dos casos
(DINGLI et al., 2006; HUSSEIN; VAN DYKE; TEFFERI, 2009) e a progressão
leucêmica é um evento mais raro, ocorrendo em cerca de 5-7% dos casos
(ABDULKARIM et al., 2009), sendo um evento altamente agressivo, com prognóstico
altamente adverso, e que até o momento não existe um marcador preditivo de
progressão (MESA; TIBES, 2012).
A progressão leucêmica ou leucemia aguda secundária (LA) ou fase blástica,
é um estágio de progressão das NMP e das SMDs, que possui prognóstico muito
desfavorável, com risco de morte em pouco tempo (dias ou meses) após o
diagnóstico de LA. Em comparação com a LMA de novo, a transformação advinda
das NMP apresenta um desfecho ainda mais adverso (SEKERES et al., 2009;
MILOSEVIC et al., 2012;).
A taxa de transformação leucêmica em NMP clássica é de cerca de 7%
(ABDULKARIM et al., 2009), enquanto que na SMD pode chegar a 30% dos casos
(GREENBERG et al., 1997). Quanto a origem da progressão leucêmica dentro das
NMP, a taxa de prevalência da LA proveniente de PV ou TE é de 6% e após a MF é
de 16% (ABDULKARIM et al., 2009).
Tipicamente, a leucemia aguda secundária evolui a partir de uma MF
secundária, ou após uma fase fibrótica intermediária. Somente cerca de 10-30%
desses casos evoluem para LA (BAROSI et al., 2007a). Apenas a minoria dos casos
transformam diretamente de uma PV ou TE, sem passar pelo estágio fibrótico
(MESA; TIBES, 2012). O panorama é de que nos primeiros 10 anos após o
diagnóstico, entre 8 a 23% dos pacientes com MF progridem para LA, e em cerca de
18 anos, 4-8% dos pacientes com PV e TE evoluem para LA (GAIDANO et al., 1994;
NAJEAN; RAIN, 1997; MESA, 2004; ABDEL-WAHAB et al., 2010;).
Alguns eventos já foram associados à progressão leucêmica, como a
presença de JAK2V617F, especialmente quando a carga alélica se apresenta acima
dos 50% (CAMPBELL et al., 2005; KRALOVICS et al., 2005; BELLANNE-
CHANTELOT, 2006; VANNUCCHI et al., 2007b). Em geral, é mais comum um
paciente JAK2V617F positivo se tornar negativo durante a progressão leucêmica
devido ao aparecimento de um novo clone não carreador da mutação JAK2V617F
23
do que um paciente V617F negativo adquirir a mutação (CAMPBELL et al., 2006;
THEOCHARIDES et al., 2007). Em alguns casos, os dois clones, o responsável pela
NMP e o responsável pela LA secundária, apresentam a mesma origem, conforme
observado por estudos de marcadores microssatélites (THEOCHARIDES et al.,
2007). Sabe-se também que a contagem de blastos periféricos superior a 3% ou
contagem de plaquetas inferior a <100 mil ao diagnóstico podem ser considerados
fatores preditivos de transformação leucêmica para pacientes com MF (HUANG et
al., 2008).
Sobre a influência do tratamento na progressão leucêmica, sabe-se que a
sobrevida livre de leucemia em pacientes com diagnóstico de MF não é afetada pelo
tratamento com HU, interferon alfa, talidomida, lenalidomida e corticoisteróides,
entretanto a progressão leucêmica foi menor em pacientes tratados com
estimuladores de eritropoiese (HUANG et al., 2008).
Alterações citogenéticas são detectadas em pacientes com NMP e mais
comumente em SMD, sendo ainda mais frequente na progressão leucêmcia
proveniente de SMD. Em TE é descrito que 5-15% dos pacientes apresentam
anormalidades citogenéticas, 15-35% na PV e 40-50% na MF. A frequência de
alterações citogenéticas pode variar de acordo com a técnica empregada, se
citogenética convencional (TEFFERI et al., 2001; STEENSMA; TEFFERI, 2002;
GANGAT et al., 2008) ou hibridização genômica comparativa (array-based
comparative genomic hybridization - aCGH). Esta última é mais específica, sensível
e permite uma análise global cromossômica mais precisa, entretanto não detecta
translocações (TEFFERI et al., 2009).
As anormalidades citogenéticas comuns descritas nas NMP são as trissomias
do cromossomo 8 e do 9, deleções do 12p, do 13q e do 20q, e parcial duplicação do
1q (BENCH et al., 1998; PANANI, 2007). A complexidade cariotípica aumenta na
progressão para MF secundária e LA (MILOSEVIC; KRALOVICS, 2012). Algumas
das anormalidades citogenéticas comuns na LA também estão presentes na MF, o
que pode refletir a história de evolução natural da doença. São elas: deleção do
cromossoma 20q, deleção do 13q23 (ambas associadas com prognóstico favorável),
trissomia do cromossoma 8 e do 9, e anormalidades do cromossoma 1 e 7 (BENCH
et al., 1998; NAJFELD et al., 2002). Anormalidades tais como 9p24.3 (dissomia
uniparental) (31%), 9p24 (13%), 1q32.1 (13%), 6p23 (10%), 6p22.3 (10%) são
observadas na LA secundária de evolução das NMP. Outras alterações são
24
observadas frequentemente na LA, mas também são compartilhadas com a LA
proveniente de SMD (MILOSEVIC et al., 2012) (tabela 1.2).
localização cromossômica
frequência
NMP-LA (%) SMD-LA(%)
5q31 20,8 16,2
7q36.1 20,8 24,3
5q14->q15 18,8 13,5
7q22.1 16,7 27
Tabela 2 Tabela 1.2: Tabela comparativa das frequências das alterações cromossômicas recorrentes
nas evoluções para leucemia aguda provenientes de NMP e SMD. Adaptado de MILOSEVIC et al.
(2012).
Do ponto de vista molecular, distintas mutações em diferentes genes têm sido
sugeridas como associadas ao processo de transformação leucêmica. Os genes
mais frequentemente citados são: TP53, ASXL1, CBL, FLT3, IDH1, IDH2, KRAS,
RUNX1, TET2, EZH2, LNK (tabela 1.3) (ROCQUAIN et al., 2010; MARTÍNEZ-
AVILÉS et al., 2011; TEFFERI; NOEL; HANSON, 2011).
Colunas1 JAK2 p.Val617Phe JAK2 exon12 MPL TET2 IDH1/2 ASXL1 EZH2 CBL DNMT3 IKZF1 LNK
PV 96% 3% NA 16% 2% NA 3% RARO 7% NA RARO
TE 55% NA 3% 5% 1% 3% NA RARO NA NA RARO
MF 65% NA 10% 17% 4% 13% 7% 6% 7% NA RARO
CRISE BLÁSTICA 50% NA 5% 17% 20% 18% NA NA 14% 19% 10% Tabela 3 Tabela 1.3: Taxa das mutações descritas em NMP. Adaptado de Tefferi et al. (2011). PV -
Policitemia Vera; TE – Trombocitose essencial; MF – mielofibrose.
No entanto, a maior parte dos estudos disponíveis foram decorrentes da
progressão leucêmica secundária à SMD (GONDEK et al., 2007a, 2007b; BEER et
al., 2009;HEINRICHS et al., 2009) ou não especifica qual doença de base a LA
ocorreu (SANTANA-DAVILA et al., 2008a); ou analisa a progressão leucêmica de
SMD e NMP conjuntamente como se fosse um mesmo fenômeno (GONDEK et al.,
2007a, 2007b; STEGELMANN et al., 2009; KLAMPFL et al., 2011; RUMI et al.,
2011). Mesmo em situações onde existe um esforço em discriminar melhor os
subgrupos, pela raridade do evento, poucas amostras por doença foram até hoje
analisadas (PV, TE e MF) (REILLY et al., 1997; TEFFERI et al., 2005; DINGLI et al.,
2006; GANGAT et al., 2008, 2009; ABDULKARIM et al., 2009; BEER et al., 2009;
HUSSEIN; VAN DYKE; TEFFERI, 2009; KNOOPS et al., 2009; STEGELMANN et al.,
25
2009; TEFFERI et al., 2009; ABDEL-WAHAB et al., 2010; THOENNISSEN et al.,
2010; VISANI et al., 2011).
Desta forma, é de grande importância que mais estudos sejam focados em
subgrupos específicos a fim de melhorar o entendimento dos mecanismos
subjacentes à progressão para leucemia aguda secundária nas NMP. Avaliações
seriadas de pacientes ao longo da evolução das NMP são necessárias para este tipo
de estudo. É neste contexto, em um agrupamento de doenças englobadas sob a
mesma denominação, mas altamente heterogêneas, no momento de maior evolução
clonal, que este trabalho está inserido.
26
2. Objetivos
2.1. Principal
O objetivo principal deste trabalho foi identificar perfis moleculares
diferenciados em pacientes com NMP pela presença ou ausência de mutações nos
genes JAK2, CALR e MPL, correlacioná-los aos padrões de resposta terapêutica
além de identificar mecanismos genéticos subjacentes à progressão leucêmica
revelados por técnicas genômicas de alta resolução.
Para isto, foram propostos os seguintes objetivos secundários:
2.2. Secundários
Estabelecer um banco de dados clínicos de um grupo de pacientes com NMP
para estudos de correlação e associação com biomarcadores moleculares;
Estabelecer metodologias para detecção de mutações descritas na literatura:
mutações do exon 12 e 14 do gene JAK2, inserções e deleções no gene CALR e
mutações no gene MPL;
Correlacionar a presença e a frequência das mutações encontradas com o
curso clínico dos pacientes no grupo estudado;
Analisar a carga alélica da mutação p.val617phe em JAK2 e correlacioná-la
com resposta ao tratamento e progressão da doença;
Avaliar a presença de mutações em IDH1, IDH2 e TET2 em subgrupos de
pacientes de NMP com progressão leucêmica e correlacionar com aspectos clínicos;
Avaliar a variação do número de cópias (alterações cromossômicas) em
pacientes com NMP com progressão leucêmica por técnicas de alta resolução
(aCGH – array comparative genomic hybridization);
Avaliar, através de técnicas de sequenciamento massivo paralelo (WES –
Whole exome sequencing), a presença de mutações pontuais, inserções e deleções
visando avaliar o possível papel preditivo destas para o diagnóstico, prognóstico e
principalmente como marcador preditivo ou associado à progressão leucêmica;
Analisar a arquitetura clonal da NMP de acordo com a evolução clonal nos
casos de progressão leucêmica;
Iniciar a análise de algumas das mutações encontradas pelo WES em uma
subcoorte de NMP.
27
3. Metodologia
3.1. Pacientes
A coorte central deste estudo é composta de 1.892 amostras provenientes de
1.236 pacientes com suspeita diagnóstica de NMP enviadas e registradas ao
laboratório de Biologia Molecular (LabBioMol) do Centro de Transplantes de Medula
Óssea (CEMO) para análise molecular da mutação p.Val617Phe no gene JAK2 de
janeiro de 2007 a 12 de novembro de 2013. Esta coorte central possui 25 centros de
diversos Estados brasileiros (RJ, BA, CE, RS, ES).
No presente estudo foi avaliada uma subcoorte retrospectiva e prospectiva de
218 pacientes com NMP (38 PV, 91 TE, 33 MF, 43 NMP-U, 13 SMD) contendo 883
amostras sendo 70 pacientes provenientes do Hospital Universitário Pedro Ernesto
(HUPE/UERJ) e 148 pacientes do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP/UFF)
durante o período de janeiro de 2007 a 12 de novembro de 2013. Além da amostra
inicial / diagnostico, sempre que possível foram avaliadas trimestralmente amostras
prospectivas de pacientes positivos para referida mutação para fins de
acompanhamento/ progressão da doença, bem como de resposta ao tratamento à
hidroxiureia e com inibidores específicos de JAK1/2 (Ruxolitinib). A partir desta
coorte selecionamos uma coorte de estudo utilizando-se dois centros (HUAP/n=101
e HUPE/n=61), formada por 162 pacientes (38 PV, 91 TE e 33 MF) (figura 4.2 –
resultados). Esta seleção foi realizada tendo-se como base a colaboração cientifica
com os clínicos destes serviços, o que permitiu o acesso a uma caracterização
clínica detalhada dos pacientes, além de revisão dos critérios diagnósticos para
categorização das NMP (PV, TE e MF) pelo patologista de referência dos dois
serviços escolhidos. A caracterização clínica detalhada foi realizada a partir da
criação de um banco de dados construído a partir dos dados inseridos em uma ficha
clínica específica para este estudo (anexo 3). Uma busca ativa foi realizada por um
trabalho junto ao corpo clínico associado à consulta aos prontuários no setor de
Hematologia de cada um dos hospitais. Desta forma, os parâmetros clínicos,
hematológicos, patológicos e moleculares ajudaram no diagnóstico final dos
pacientes através dos critérios da OMS/WHO 2008.
Os pacientes utilizados neste estudo foram identificados em nosso banco de
dados através de uma identificação numérica única, que será utilizada neste
trabalho, quando tivermos a necessidade de citarmos especificamente um paciente.
28
Um termo de consentimento livre e esclarecido foi assinado pelo paciente ou
por seu responsável legal. As amostras de sangue periférico e/ou biópsia de medula
óssea foram coletadas dos pacientes para diagnóstico (ou exame de
acompanhamento) e as amostras excedentes foram utilizadas para pesquisa.
O presente estudo obedece às diretrizes de pesquisa envolvendo seres
humanos do Conselho Nacional de Saúde (RDC nº196/1996) e encontra-se
aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer sob o nº
62/08 (anexo 2).
3.2. Banco de dados
Os dados clínicos dos pacientes foram coletados através da consulta aos
prontuários dos pacientes, onde uma ficha clínica desenvolvida para este trabalho foi
preenchida para fins de alimentação do banco de dados clínicos (anexo 3).
3.3. Preparo das amostras
As amostras de sangue periférico e de biópsia de medula óssea foram
centrifugadas em gradiente de Ficoll-Hypaque® para a separação das frações de
granulócitos e células mononucleares. A fração de granulócitos foi retirada e tratada
com solução para lise de eritrócitos (red cell lysis buffer - RCLB) de 5 a 10 min a
4ºC. A seguir, a solução foi centrifugada (300g por 10min a 20ºC), o pellet de
granulócitos foi ressuspendido em PBS (phosphate buffer solution) e centrifugado
(200g por 10min a 20ºC) para a retirada de plaquetas. A seguir os granulócitos foram
centrifugados (4000 rpm por 10min) com solução hipotônica (20 mM Tris HCl - pH
8.0, 10 mM EDTA) a 4ºC. O DNA genômico foi extraído com 1mL de DNAzol® (1-3 X
107 células), precipitado com 500 L de etanol absoluto, lavado (2X) com etanol
75%, solubilizado em 8mM de NaOH, neutralizado com HEPES e o DNA
armazenado a 4ºC.
Quando não foi possível a separação da porção de granulócitos, a amostra foi
tratada diretamente com RCLB e o DNA genômico de todas as linhagens celulares
foi extraído com uma solução de DNAzol® ou Trizol® segundo as especificações do
fabricante.
29
3.4. Análise de mutações em genes específicos
De maneira geral, as amostras foram submetidas a uma reação em cadeia da
polimerase (PCR – polimerase chain reaction) para amplificação de fragmentos
contendo a região de interesse, utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores
específicos. A seguir, estes fragmentos foram visualizados em gel de agarose 2%
através de uma eletroforese convencional e os géis foram documentados através do
sistema de transiluminação Gel Doc XR (BioRad®) utilizando-se o software Quantity
One (BioRad®). Para as reações de sequenciamento pelo método de Sanger, os
fragmentos foram purificados em kits comerciais que utilizam a metodologia de
coluna, seguindo as especificações do fabricante. Os produtos purificados foram
semiquantificados em gel de agarose utilizando-se o marcador de peso molecular
low mass (Invitrogen®), e submetidos à reação de sequenciamento de Sanger
utilizando-se o reagente Big Dye V3.1, conforme especificações do fabricante. As
reações de PCR foram realizadas no termociclador Veriti® 96 poços (Applied
Biosystems). A corrida eletroforética de sequenciamento capilar foi realizada no
analisador genético 3130xl (Applied Biosystems). Os eletroferogramas foram
analisados utilizando-se os softwares Chromas V2.32 (Technelysium Pty Ltd) e
Mutation Surveyor V3.3 (SoftGenetics LLC).
3.4.1. Análise de mutações no gene JAK2
3.4.1.1. Mutação V617F - Reação qualitativa
As amostras foram submetidas a uma reação em cadeia da polimerase (PCR
– polimerase chain reaction) alelo específica qualitativa para detecção da mutação
p.Val617Phe no éxon 14 do gene JAK2 conforme descrito por BAXTER et al. (2005)
com algumas alterações. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados nesta reação
são um reverso comum (R – 5’ CTG AAT AGT CCT ACA GTG TTT TCA GTT TCA
3’), um controle interno (IC) que se anela no íntron a montante do éxon 14 (IC – 5’
ATC TAT AGT CAT GCT GAA AGT AGG AGA AAG 3’) e um iniciador direto que se
anela no alelo mutado (F – 5’ AGC ATT TGG TTT TAA ATT ATG GAG TAT ATT 3’).
Foi utilizada a concentração de 1M para o oligonucleotídeo
para os oligonucleotídeos interno e direto. A reação produz dois amplicons, um de
364pb comum a todos os pacientes e outro de 203pb presente somente nos
indivíduos com a mutação. O perfil térmico utilizado é uma desnaturação inicial de
94ºC durante 5 min, e 36 ciclos com temperatura de desnaturação de 94ºC durante
30
30s, temperatura de anelamento de 57ºC durante 30s e temperatura de extensão de
72ºC durante 1min e extensão final de 10min.
3.4.1.2. Mutação V617F - Reação quantitativa
As amostras positivas para a mutação p.Val617Phe foram quantificadas pelo
método de análise de fragmentos utilizando-se uma PCR multiplex alelo específica e
o sequenciador MegaBACE 1000 DNA Analysis System (GE Healthcare) ou a
plataforma 3130xl (Applied Biosystems®) para corrida de eletroforese capilar. A
reação de PCR foi realizada segundo descrito por VANNUCCHI et al. (2006) e os
resultados foram analisados no software Peak Scanner V1.0® (Applied
Biosystems®). A quantificação foi determinada através da seguinte equação: % alelo
mutado = (mt/(wt+mt)).
Nesta reação foram utilizados os seguintes oligonucleotídeos iniciadores não
marcados a 1,6M de concentração final FO – 5’ TCC TCA GAA CGT TGA TGG
CAG 3’/ RO – 5’ ATT GCT TTC CTT TTT CAC AAG AT 3’ e os seguintes iniciadores
marcados com 6 carboxifluoresceína (6FAM) a 0,8M de concentração final Rm* -
5’ GTT TTA CTT ACT CTC GTC TCC ACA AAA 3’/ FI-1* - 5’ GCA TTT GGT TTT
AAA TTA TGG AGT ATA TG 3’.
Os oligonucleotídeos FO e RO se anelam nas extremidades, formando um
amplicon de 452 pb que foi utilizado como controle de amplificação. O
oligonucleotídeo FI-1 se anela à sequência selvagem (WT), produzindo um amplicon
de 228 pb e o oligonucleotídeo Rm se anela ao alelo mutado, produzindo um
amplicon de 278 pb. O perfil térmico possui desnaturação inicial de 5 min a 94ºC,
seguido de 30 ciclos com temperatura de desnaturação de 94ºC durante 30s,
temperatura de anelamento de 53ºC durante 30s e temperatura de extensão de
72ºC durante 45s e extensão final de 20 min. AS placas para eletroforese capilar
foram preparadas utilizando-se 8,7L de formamida, 0,3L de Liz500 (Applied
Biosystems) e 1,0L de produto de PCR diluído 1:5.
A fim de verificar a acurácia da técnica foi construída uma curva de
plasmídeos mutado e não mutado, diluídos um contra o outro nas seguintes
proporções: 100%, 95%, 90%, 70%, 50%, 30%, 10%, 5% e 0% de alelo mutado.
Para tal, um paciente com 100% de alelo mutado e um doador de medula
óssea tiveram seu DNA amplificado pelos oligonucleotídeos iniciadores FO e RO e o
amplicon inserido no plasmídeo comercial TA cloning® Kit (Invitrogen) de acordo
31
com as especificações do fabricante. A bactéria competente XL1 foi transformada,
selecionada, plaqueada, algumas colônias selecionadas, triadas, o plasmídeo
extraído por lise alcalina e purificado por PEG 8000 a 13% (protocolo recomendado
pela Applied Biosystems).
De maneira similar, outra técnica foi estabelecida para a quantificação da
mutação JAK2V617F por PCR em tempo real com química Taqman®. Para esta
técnica foram empregadas duas curvas padrão, uma de plasmídeo e outra de
linhagens celulares. A curva de plasmídeos construída em nosso laboratório já foi
descrita previamente e a curva de linhagem foi construída a partir de DNA da
linhagem celular Hel (human erythroleukemia) diluída em DNA da linhagem K562. As
células da linhagem Hel são proveniente de uma eritroleucemia humana, derivada
do sangue periférico de um paciente com doença de Hodgkin que desenvolveu uma
eritroleucemia secundária. Esta linhagem foi estabelecida a partir das células
mononucleares do sangue periférico e possui o alelo JAK2 mutado (p.Val617Phe)
em homozigose e com a presença de mais de 8 cópias do alelo mutado (MARTIN;
PAPAYANNOPOULOU, 1982; QUENTMEIER et al., 2006a). A linhagem K562,
também é uma linhagem de leucemia mielogênica com células do tipo eritroleucemia
humana. Esta linhagem celular foi estabelecida a partir de uma crise blástica de uma
paciente de 53 anos com leucemia mielogênica crônica. As células derivadas dessa
linhagem possuem o alelo selvagem de JAK2, mas apresentam o gene de fusão
BCR-ABL.
Para a reação de q-PCR foram empregados os seguintes oligonucleotídeos
iniciadores na concentração final de 300nmol/L: direto - 5’-
CTTTCTTTGAAGCAGCAAGTATGA-3’/ reverso wildtype (wt) (selvagem) - 5’-
GTAGTTTTACTTACTCTCGTCTCCACAtAC-3’/ reverso mutado (mt) - 5’-
ACTTACTCTCGTCTCCACAtAA-3’ e a seguinte sequência para a sonda taqman, na
concentração final de 200nmol/L: 6-FAM-
TGAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT-TAMRA. O perfil térmico utilizado foi
uma desnaturação inicial a 95ºC por 10min, seguido de 40 ciclos de 15s a 95ºC e
60s a 60ºC. Para a reação foi utilizado o master mix de PCR TaqMan® universal
(Applied Biosystems) na concentração final de 1x e 30ng/uL de DNA. Todas as
reações foram realizadas em duplicatas. Para quantificação, foi utilizada uma curva
padrão de plasmídeos de 107 cópias a 101. Para fins de sensibilidade da técnica,
também foi utilizada uma curva padrão utilizando-se DNA de uma linhagem
32
contendo apenas o alelo selvagem (K562) e de uma linhagem contendo o alelo
mutado (Hel) em diluições seriadas. As diluições continham de 10.000 cópias a 10
cópias da mutação p.Val617Phe em JAK2 (Hel) e da cópia selvagem de JAK2
(K562). As reações foram realizadas no sistema de detecção ABI PRISM® 7000.
Os resultados foram analisados através da seguinte fórmula, extraída da
equação da reta da curva padrão y=-ax+b, onde a é a inclinação da reta (slope), e b
o intercepto. A seguir é feita uma diferença entre os logs do alelo selvagem (wt) e do
alelo mutado (mt), utilizando a seguinte equação: y=b1x+a1-(b2x+a2), onde b1 é o
intercepto do alelo wt, a1 é a inclinação da reta da curva padrão wt, b2 é o intercepto
do alelo mt, a2 é a inclinação da reta da curva padrão mt. A esta diferença foi
aplicado o cálculo de eficiência, elevando-se à potência de 10 a diferença entre os
logs, para estabelecimento da proporção de cada alelo.
3.4.1.3. Análise de mutações dos éxons 12 e 14 de JAK2
Os pacientes negativos para a mutação p.Val617Phe de JAK2 que tiveram o
diagnóstico de Policitemia Vera ou os pacientes com diagnóstico de NMP/SMD, que
foram negativos para indels no gene CALR foram submetidos à testagem de
mutações nos éxons 12 e 14 do gene JAK2. As amostras foram amplificadas
utilizando-se os seguintes oligonucleotídeos iniciadores para o éxon 12: direto
5’AGTTCAATGAGTTGACCCCT3’ / Reverso 5’TTTGCTAACATCTAACACAAGGT3’
e para o éxon 14: direto 5’ GGGTTTCCTCAGAACGTTGA 3’/ Reverso 5’
TCATTGCTTTCCTTTTTCACAA 3’ (UGO et al., 2010). Todos os oligonucleotídeos
foram utilizados na concentração final de 0,4M. O perfil térmico utilizado foi uma
extensão inicial a 94ºC por 4 min, seguida de 36 ciclos de desnaturação a 94º por
30s, anelamento a 55ºC por 30s e extensão a 72ºc por 1min, com extensão final de
20min. O produto de PCR do éxon 12 possui 464pb e o do éxon 14, 460pb. A seguir
os fragmentos seguiram o protocolo previamente descrito para a reação de
sequenciamento de Sanger.
3.4.2. Análise de mutações no éxon 9 de CALR
As amostras negativas para a mutação p.Val617Phe foram triadas para busca
de indels no gene CALR pelo método de análise de fragmentos utilizando-se a
plataforma 3130xl (Applied Biosystems®) para corrida de eletroforese capilar. Os
oligonucleotídeos, descritos por KLAMPFL et al. (2013), foram utilizados para
ampllificação do produto na concentração final de 0,4M. O oligonucleotídeo direto
33
foi marcado com 6carboxifluoresceína (6-FAM). O perfil térmico utilizado foi de uma
extensão inicial a 95ºC por 4 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95º por
30s, anelamento a 67ºC por 30s e extensão a 72ºc por 1min, com extensão final de
10min. O produto de PCR selvagem possui 263pb.
A seguir, as placas para eletroforese capilar foram preparadas e analisadas
conforme descrito anteriormente. Foram considerados como uma possível mutação
(indel) qualquer variação de tamanho em relação ao alelo selvagem, desde que
tivesse um pico com altura similar ao alelo selvagem (wt).
As amostras também foram analisadas pelo métodos de sequenciamento de
Sanger para fins de validação dos resultados da análise de fragmentos, utilizando-se
os seguintes oligonucleotídeos na concentração final de 0,4mM: direto
5’TAACAAAGGTGAGGCCTGGT3’ / Reverso 5’TCTTAGCTCCCCTCCAACCT3’ . O
perfil térmico utilizado foi uma extensão inicial a 95ºC por 4 min, seguida de 35 ciclos
de desnaturação a 95º por 30s, anelamento a 65ºC por 45s e extensão a 72ºc por
1min, com extensão final de 10min.
3.4.3. Análise das mutações em MPL
Os pacientes negativos para a mutação p.Val617Phe e para indels em CALR
que possuíam diagnóstico de trombocitemia essencial, mielofibrose ou SMD/SMP
foram submetidos à testagem de mutações em MPL. Primeiramente um grupo de
pacientes foi analisado pelo método de sequenciamento de Sanger, utilizando-se os
seguintes oligonucleotídeos iniciadores: direto- 5’TCCTAGCCTGGATCTCCTTGG 3’/
Reverso–5’CACAGAGCGAACCAAGAATGCC3’. O perfil térmico utilizado para
reação de amplificação foi uma extensão inicial a 94ºC por 3 min, seguida de 34
ciclos de desnaturação a 94º por 30s, anelamento a 54ºC por 30s e extensão a 72ºc
por 1min, com extensão final de 10min. O produto de 186pb foi submetido a reação
de sequenciamento, conforme protocolo previamente descrito.
Após o estabelecimento de pelo menos um controle mutado, a triagem foi
realizada através da técnica de High Resolution Melting (HRM) utilizando-se o
termociclador Rotor-GeneQ 6000. Para reação de amplificação seguida de HRM foi
utilizado o kit de PCR Type-it HRM PCR Kit (Qiagen) na concentração final de 1x,
0,5mM MgCl2 e os oligonucleotídeos iniciadores foram: direto
5’TAGCCTGGATCTCCTTGGTG3’/ Reverso 5’GCGGTACCTGTAGTGTGCAG3’
(BOYD et al., 2010) na a concentração final de 0,7pmol/L e 30ng/L de DNA por
reação. O produto final de amplificação possui 107pb. Os DNAs testes de pacientes
34
foram corridos em duplicata. O perfil térmico utilizado foi uma desnaturação inicial a
95ºC por 7 min, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95ºC por 15s, anelamento a
60ºC por 30s e extensão a 72ºC por 20s. A seguir a reação passou por uma etapa
de HOLD a 50ºC por 30s e uma etapa de HRM de 80ºC a 88ºC, com aquisição de
dados a cada 0,03ºC. As barras de normalização foram ajustadas para as posições
84,28-84,48 e 85,32-85,52. Os dados foram analisados no software Rotor-GeneQ
Series V.1.7 build94 (Qiagen) e Screen-Clust HRM Software V1.10.1.3 (Qiagen). Os
produtos de PCR foram purificados, quantificados e submetidos à reação de
sequenciamento de Sanger conforme descrito anteriormente para confirmação e
identificação da mutação encontrada.
3.4.4. Análise de mutações nos éxons 14 e 15 de SF3B1
Os pacientes com diagnóstico de eritrocitose, trombocitose essencial,
trombocitose e anemia, mielofibrose secundária à trombocitose, anemia, diagnóstico
não classificável e outros diagnósticos foram submetidos à testagem de mutações
nos éxons 14 e 15 do gene SF3B1. As amostras foram amplificadas utilizando-se os
seguintes oligonucleotídeos iniciadores para os éxons 14 e 15 direto
5’TAGAGTGGAAGGCCGAGAGA3’ / Reverso 5’GGTTTGGCTGCTTTCTTGAA3’
(CUI et al., 2012). O perfil térmico utilizado foi uma extensão inicial a 95ºC por 4 min,
seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95º por 30s, anelamento a 63ºC por 1min e
extensão a 72ºc por 1min, com extensão final de 10min. O produto de PCR possui
1120pb. Em seguida os produtos foram submetidos à reação de sequenciamento de
Sanger, conforme especificado previamente.
3.4.5. Análise de mutações nos éxons 11 e 12 de MAPK15/ERK8
Os pacientes com NMP JAK2V617F negativos foram submetidos à testagem
de mutações nos éxons 11 e 12 do gene MAPK15. As amostras foram amplificadas
utilizando-se os seguintes oligonucleotídeos iniciadores, desenhados pelo nosso
grupo, para os éxons 11 e 12 (na concentração final de 0,4M,): direto
5’CCTATGTCAGAGACCCCCAAAC3’ / Reverso
5’TCTGCACCTTTCAGTGACCCT3’. O perfil térmico utilizado foi uma extensão
inicial a 95ºC por 4 min, seguida de 40 ciclos de desnaturação a 95º por 30s,
anelamento a 65ºC por 30s e extensão a 72ºc por 45s, com extensão final de 10min.
O produto de PCR dos éxons 11-12 possui 571pb. Os produtos foram submetidos à
reação de sequenciamento de Sanger conforme protocolo especificado previamente.
35
3.4.6. Análise de mutações nos éxons 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 de TP53
Os pacientes com NMP foram submetidos à testagem de mutações dos éxons
2 a 8 do gene TP53. As amostras foram amplificadas utilizando-se os seguintes
oligonucleotídeos iniciadores na concentração final de 0,4M (“IARC TP53
Database”):
exon Foward Reverso amplicon
2-3 GTGGGAAGCGAAAATTCCAT ATGAGACTTCAATGCCTGGC 506
4-5 TGTTCACTTGTGCCCTGACT TCTCTGGGAGGAGGGGTTAA 467
6 GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA TCCACCTCTCATCACATCCC 390
7-8 GACAAGGGTGGTTGGGAGTA GTTTTACCTGCAATTGGGGC 500 Tabela 4: Tabela 3.1 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de amplificação de TP53.
O perfil térmico utilizado foi uma extensão inicial a 94ºC por 2 min, seguida de
50 ciclos de desnaturação a 94º por 30s, anelamento a 61ºC para os exons 2-3, 4-5
e 7-8 e de 65ºC para o éxon 6 por 45s e extensão a 72ºc por 45s, com extensão final
de 10min. Os produtos foram submetidos à reação de sequenciamento de Sanger
utilizando-se protocolo previamente descrito.
3.4.7. Análise de mutações em IDH1 e 2
Os pacientes que leucemizaram foram submetidos à testagem de mutações
no éxon 4 dos genes IDH1 e IDH2. Primeiramente o grupo de pacientes foi
analisado pelo método de sequenciamento de Sanger, utilizando-se os seguintes
oligonucleotídeos iniciadores (concentração final 0,4M): éxon 4 do gene IDH1 –
direto - 5’TGCCACCAACGACCAAGTCA 3’ /Reverso–
5’TGTGTTGAGATGGACGCCTATTTG3’ e para o éxon 4 do gene IDH2 direto – 5’
GGGGTTCAAATTCTGGTTGA 3’ / Reverso – 5’ CTAGGCGAGGAGCTCCAGT 3’
(WAGNER et al., 2010). O perfil térmico utilizado para reação de amplificação foi
uma extensão inicial a 94ºC por 3 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94º
por 30s, anelamento a 60ºC por 30s e extensão a 72ºc por 1min, com extensão final
de 10min. O amplicon de IDH1 possui 437pb e o IDH2 251pb. Ambos foram
submetidos à reação de sequenciamento pelo método de Sanger.
36
3.4.8. Análise de mutações em TET2
Os pacientes que leucemizaram foram submetidos à testagem de mutações
nos éxons 3 e 9 do gene TET2 pelo método de sequenciamento de Sanger,
utilizando-se os seguintes oligonucleotídeos iniciadores (ROCQUAIN et al., 2010) na
concentração final de 0,4M:
Nome do oligo Sequência do oligonucleotídeo iniciador Tamanho do fragmento
TET2 ex3 PCR1F 5'-TGAACTTCCCACATTAGCTGGT-3'
TET2 ex3 PCR1R 5'-GAAACTGTAGCACCATTAGGCATT-3' 955pb
TET2 ex3 PCR1seq 5'-GATAGAAATAAACACATTTT-3'
TET2 ex3 PCR2F 5'-CAAAAGGCTAATGGAGAAAGACGTA-3' 836pb
TET2 ex3 PCR2R 5'-GCAGAAAAGGAATCCTTAGTGAACA-3'
TET2 ex3 PCR3F 5'-GCCAGTAAACTAGCTGCAATGCTAA-3' 846pb
TET2 ex3 PCR3R 5'-TGCCTCATTACGTTTTAGATGGG-3'
TET2 ex3 PCR4F 5'-GACCAATGTCAGAACACCTCAA-3' 867pb
TET2 ex3 PCR4R 5'-TTGATTTTGAATACTGATTTTCACCA-3'
TET2 ex3 PCR5F 5'-TTGCAACATAAGCCTCATAAACAG-3' 788pb
TET2 ex3 PCR5R 5'-ATTGGCCTGTGCATCTGACTAT-3'
TET2 ex3 PCR6F 5'-GCAACTTGCTCAGCAAAGGTACT-3' 781pb
TET2 ex3 PCR6R 5'-TGCTGCCAGACTCAAGATTTAAAA-3'
TET2 ex9F 5'-TGTCATTCCATTTTGTTTCTGGATA-3' 361pb
TET2 ex9R 5'-AAATTACCCAGTCTTGCATATGTCTT-3'
Tabela 5: Tabela 3.2: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de amplificação de TET2.
Os perfis térmicos utilizados possuíam uma desnaturação inicial de 94ºC por
3min, seguida de 35 ciclos com desnaturação de 94ºC por 30s, etapa de anelamento
por 30s e extensão a 72ºC por 1min, seguida de extensão final a 72ºC por 10min. A
temperatura de anelamento foi de 55ºC para as PCRs 4 e 5 do éxon 3 e para o éxon
9; de 60ºC para as PCRs 1 e 3 do éxon 3; e 65ºc para as PCRs 2 e 6 do éxon 3.
3.4.9. Análises estatísticas
Para comparação entre os valores hematológicos em cada subgrupo de
doença estudado foi utilizado o teste-t ou o teste de Mann-Whitney não pareado
bicaudal, com 95% de intervalo de confiança, para dados paramétricos e não-
paramétricos, respectivamente. Para comparação entre os valores hematológicos
entre a fase crônica e aguda dos pacientes que evoluíram para leucemia aguda foi
utilizado o teste pareado bicaudal de Wilcoxon, com intervalo de confiança de 95%.
O nível de significância utilizado em todos os testes foi de p<0.05. As análises
estatísticas foram realizadas no programa Prisma V5.00.
37
3.4.10. Análise de hibridização genômica comparativa em conjunto
(aCGH – array comparative genomic hybridization)
Os pacientes que progrediram para leucemia aguda tiveram a amostra ao
diagnóstico ou a primeira amostra enviada para o laboratório e a amostra da
progressão leucêmica estudadas por aCGH. Havendo disponibilidade, uma amostra
intermediária também foi analisada.
As amostras de DNA que não possuíam uma taxa de pureza 260/280 entre
1,8 e 1,9 e 260/230 acima de 1,9 foram submetidas à purificação através do kit
Gentra®Puregene®Cell Kit (Qiagen®), segundo especificações do fabricante.
As amostras ao diagnóstico e do estado leucêmico dos pacientes com NMP
que progrediram para leucemia (DNA tumoral) foram hibridizadas contra o DNA de
referência, utilizando-se uma lâmina de microarranjo de alta resolução 244k (Agilent
Technologies©, Palo Alto, CA, USA) contendo 236.231 alvos distintos, 5.000 alvos
de elementos repetitivos e 5.045 alvos de controle interno, permitindo uma resolução
de 19Kb. Todas as lâminas foram lidas no escâner Agilent Sure Scan e analisadas
no programa Genomic Workbench.
DNA referência foi obtido a partir de uma mistura de amostras de DNAs de
linhagens linfoblastóides do repositório Coriell provenientes de nove indivíduos
normais (mulheres).
Para tal, 1,2µg do DNA tumoral e do DNA referência foram digeridos
separadamente utilizando-se a enzima DNAseI (Ambion®, Austin, TX, USA) durante
12 min a temperatura ambiente. O DNA tumoral foi marcado com o fluoróforo
AlexaFluor5 e o DNA referência com AlexaFluor3 (Invitrogen™, Carlsbad, CA, USA)
através de uma reação de nicktranslation utilizando-se iniciadores randômicos e
fragmentos de exo-Klenow (Invitrogen™, Carlsbad, CA, USA) a 37ºC durante 2h. Os
DNAs marcados foram purificados pelo kit de colunas Bioprime® Total for Agilent
(Invitrogen™, Carlsbad, CA, USA) e os DNAs tumoral e referência foram
hibridizados entre si por 30 min e depois hibridizados nas lâminas de microarranjo de
DNA de alta-resolução a 65ºC por 40h. As lâminas foram lavadas em tampão de
lavagem OligoaCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 e 2 (Agilent Technologies) e
escaneadas no escâner de microarranjo (Agilent Technologies). A extração dos
dados foi realizada utilizando-se o programa Feature extraction versão 10.7.3.1
(Agilent Technologies). Os dados foram analisados utilizando-se o programa
Genomic Workbench versão 5.0.14 (Agilent Technologies). O número de cópias das
38
anormalidades foi calculado utilizando-se o módulo de detecção de anormalidades
ADM-1, com um limiar de 6,0. Para detecção de anormalidades foi utilizado um filtro
com os seguintes parâmetros: detecção de pelo menos 5 sondas consecutivas com
taxa de log2 acima de 0,25. A taxa de log2 é calculada utilizando-se a razão entre o
número de cópias do DNA tumoral e o DNA referência. A fim de identificar e eliminar
as variações polimórficas de número de cópias (CNV) germinativas foi utilizado um
banco de dados de CNVs criado pelo grupo do Dr Rafael Fonseca (Clínica Mayo-
Scottsdale) que incluía as variações reportadas nos estudos recentes de alta-
resolução de número de cópias (usando a plataforma SNP6.0) e estudos de
seqüenciamento disponíveis no portal de dados do Centro para Genômica Aplicada
(The Centre for Applied Genomics - TCAG) e nos estudos do próprio grupo utilizando
10 amostras controles do estudo HAPMAP empregando o chip de microarranjo
Sureprint G3 arrays.
3.4.11. Sequenciamento completo do exoma (WES - Whole exome
sequencing)
Os pacientes que progrediram da fase crônica para leucemia aguda e
apresentaram alterações pela técnica de aCGH tiveram a amostra ao diagnóstico, ou
a primeira amostra enviada para o laboratório, e a amostra da progressão leucêmica
estudadas por WES.
Para tal, 3µg de DNA genômico de amostras de pacientes com NMP que
progrediram para leucemia foram preparadas para o sequenciamento do exoma
(WES-whole exome sequencing). O exoma foi enriquecido através do kit SureSelect
Human All Exon V4, segundo especificações do fabricante, utilizando-se a estação
de trabalho NGS (Agilent Technologies) e o sequenciamento foi realizado na
plataforma Illumina HiSeq2000. O sequenciamento, as análises primária e
secundária das amostras foram realizados no centro de bioinformática da Clínica
Mayo (Rochester, Minesota, EUA). A análise terciária seguiu uma fluxo de trabalho
definido pelo grupo de Hematologia e Oncologia da Clínica Mayo (Scottsdale,
Arizona, USA) e a análise de clonalidade foi realizada através dos pacotes Mclust,
clValid, fpc do programa R.
Brevemente, as amostras foram sonicadas em fragmentos entre 150 e 200pb
utilizando-se colunas apropriadas (Covaris) no ultra sonicador M220 Focused-
ultrasonicator™ que utiliza a tecnologia AFA (adaptative-focused acoustics). Os
fragmentos obtidos foram purificados utilizando-se beads magnéticas Agencourt
39
AMPure XP (Beckman Coulter). Os fragmentos foram quantificados e a qualidade
verificada através do analisador 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies, Inc). A
seguir, foram adicionadas pontas cegas, caudas “poli A” e adaptadores aos
fragmentos para que as bibliotecas pudessem ser amplificadas. Após a amplificação,
os produtos da biblioteca passaram por mais uma etapa de purificação por beads
magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter), por mais uma etapa de
quantificação e verificação da qualidade da biblioteca amplificada através do
Bioanalyser. Uma massa equivalente a 750ng da biblioteca foi concentrada a vácuo
e ressuspendida em 3,4ul de água livre de nucleases. O tampão de hibridização e
captura de biblioteca contendo as iscas biotiniladas foi acrescentado à biblioteca e
hibridizado por 24h a 65ºC. Em seguida, os híbridos biblioteca de captura - DNA
genômico foram capturados utilizando beads magnéticas revestidas por
estreptavidina. A seguir as bibliotecas capturadas foram indexadas com etiquetas,
amplificadas e capturadas por beads magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman
Coulter). A qualidade e quantificação da biblioteca indexada foi verificada pelo
Bioanalyser, e seguiu para o sequenciamento.
A análise primária consistiu no controle de qualidade do processo químico do
sequenciamento e foi avaliado através do programa FastQC (Babraham Institute,
Cambridge, UK). As leituras com pelo menos 100pb foram alinhadas contra o
genoma humano (versão hg19) utilizando o programa Novoalign (Novocraft
Technologies, Malaysia). Após o alinhamento, as taxas de duplicação do PCR e a
porcentagens das leituras mapeadas nos alvos foram usadas para acessar a
qualidade de preparação das amostras. A análise secundária consistiu o
realinhamento, a recalibração e a chamada de variantes que foram realizados
seguindo o protocolo de boas práticas do kit de ferramentas de análise genômica
(GATK - Genome Analyis Toolkit - Broad Institute, Boston, USA) para detecção de
variantes V3.
As variantes germinativas foram determinadas através do programa
SomaticSniper e as inseções e deleções (indels) foram chamadas pelo algoritmo do
detector de indels do GATK. Cada variante detectada nas regiões exônicas do
genoma tiveram a sua previsão do efeito determinada pelo programa SnpEff e
PolyPhen-2. As variantes encontradas foram anotadas utilizando o fluxo de trabalho
TREAT, desenvolvido pelo grupo de bioinformática da Clínica Mayo (Rochester)
(ASMANN et al., 2011). Uma das funções dessa ferramenta é associar às variantes
40
do seqüenciamento a frequência alélica reportada nos bancos de dados tais como:
dbSNP, 1000 genomes, HAPMAP (populações Caucasianas (CEU),Yoruban (YRI), e
leste asiático (CHB/JPT)), the Exome Variant ServerNHLBI GO Exome Sequencing
Project (ESP)(Seattle, WA; http://evs.gs.washington.edu/EVS/) , BGI – Danish
Sequencing Project.
A análise terciária foi realizada seguindo um fluxograma que se inicia na
retirada das variantes reportadas nos bancos de dados citados anteriormente,
exceto se esta variante também estivesse reportada no banco de dados COSMIC. A
seguir foram excluídas as variantes que possuíam menos de 10 leituras. Variantes
não exônicas foram excluídas das análises. Ao final, a inspeção visual foi realizada
no Visualizador Genômico Integrativo (Integrative Genomics Viewer – IGV) para
confirmação das variantes e para retirada de SNPs germinativos observados em
material não tumoral de 25 amostras.
Para descoberta de variantes que pudessem estar implicados na progressão
leucêmica, foram consideradas somente as variantes que possuíam uma razão entre
as freqüências alélicas da amostra da progressão leucêmica e a amostra do
diagnóstico maior ou igual a 1.
A análise de clonalidade foi realizada somente nas variantes somáticas com
pelo menos 50 leituras, utilizando o pacote clValid (BROCK et al., 2011) do
programa R (R CORE TEAM, 2012). Este pacote utiliza 9 algoritmos de
agrupamento tais como agrupamento hierárquico (KAUFMAN; ROUSSEEUW,
1990), k-means (HARTIGAN; WONG, 1979), DIANA, PAM, CLARA (KAUFMAN;
ROUSSEEUW, 1990), FANNY (KAUFMAN; ROUSSEEUW, 1990), SOM
(KOHONEN, 1997), Expectation-Maximization (FRALEY; RAFTERY, 2001), SOTA
(DOPAZO; CARAZO, 1997) da base de distribuição do R, além de pacotes
adicionais como cluster (KAUFMAN; ROUSSEEUW, 1990; MAECHLER et al., 2013),
kohonen (WEHRENS; BUYDENS, 2007), mclust (FRALEY; RAFTERY, 2006;
FRALEY; RAFTERY; SCRUCCA, 2013;), e uma função para implemenatção do
SOTA (DOPAZO; CARAZO, 1997). Além dos pacotes de agrupamento, clValid tem
funções de validação interna e de medida de estabilidade do agrupamento. As
medidas de validação interna medem a qualidade do agrupamento como
compactação, conectividade e separação das partições dos agrupamentos. Neste
estudo foram utilizadas as medidas de conectividade, Dunn (DUNN, 1974) e
Silhoueta (ROUSSEEUW, 1987). Como foram analisadas duas amostras por
41
paciente, não foi possível rodar os algoritmos de medição da estabilidade do
agrupamento do pacote clValid. Para tal empregamos do pacote fpc (Flexible
procedures for clustering) a função de bootstrap e utilizamos as medidas de força da
predição, o melhor número de agrupamentos, os valores de instabilidade média para
cada agrupamento e a matriz com os valores de instabilidade para cada rodada de
bootstrap. A análise de ontologia de genes foi realizada através do banco de dados
de anotação, visualização e descoberta integrada V6.7 (DAVID- Database for
Annotation, Visualization and Integrated Discovery) do Instituto Nacional de Alergia e
Doenças Infecciosas (NIAID - National Institute of Allergy and Infectious Diseases,
NIH) (HUANG; SHERMAN; LEMPICKI, 2009a, 2009b).
42
4. Resultados
No período de 2007 a 2009 foram referidas ao LabBioMol 370 amostras para
diagnóstico de NMP, sendo aproximadamente 130 amostras/ano. Desta maneira,
estimávamos uma entrada de 560 amostras, oriundas dos 9 centros parceiros
participantes do grupo de estudo inicial, ao longo do período deste estudo (2010-
2013). É de se notar, que após termos estreitado o grupo de estudo original para
dois centros, ainda assim, a entrada de amostras superou nossas estimativas
originais perfazendo um total de 513 amostras (diagnóstico e acompanhamento)
relativas a 162 pacientes classificados como NMP.
Desta forma, no período entre janeiro de 2007 a 12 de novembro de 2013
foram referidas 1892 amostras ao LabBioMol relativas a 1236 pacientes (coorte
central) com suspeita de NMP para análise da mutação p.Val617Phe no gene JAK2
(figura 4.2). Amostras com leucocitose com suspeita de NMP, seguiram o seguinte
algoritmo laboratorial: i) PCR multiplex para avaliação de transcritos BCR-ABL, este
quando positivo, estabeleceu o diagnóstico de LMC. Quando negativo, as amostras
seguiram o fluxograma abaixo (figura 4.1): PCR qualitativo para detecção da
mutação JAK2V617F; as amostras negativas para JAK2V617F e com suspeita de
PV foram testadas para presença de mutação no gene JAK2 no éxon 12 ou no éxon
14 para mutações diferentes da JAK2V617F. Da mesma maneira, pacientes com
suspeita clínica de TE negativos para JAK2V617F, foram também, testados para
presença de mutação no éxon 9 do gene CALR e no éxon 10 do gene MPL.
Finalmente, pacientes com suspeita de anemia refrataria associada à trombocitose
(ARSA-T) foram também avaliados para mutações nos éxons 14 e 15 do gene
SF3B1.
O desenho experimental do estudo encontra-se simplificado na figura 4.2.
Brevemente, a partir de uma coorte central de 1236 pacientes, identificamos 218
pacientes provenientes de dois hospitais universitários parceiros – HUPE e HUAP –
dos quais coletamos os dados clínicos e hematológicos. A partir destes dados e em
conjunto com os dados de BMO e diagnóstico molecular, estes pacientes receberam
um diagnóstico final pelo clínico responsável pelo acompanhamento dos pacientes.
Após esta etapa, obtivemos 162 pacientes, sendo 38 PV, 91 TE e 33 MF. Destes,
tivemos 8 pacientes que transformaram para leucemia aguda secundária. Entretanto,
somente 5 pacientes possuíam amostra da fase de NMP (crônica) e da
transformação leucêmica (aguda) e estas foram estudadas por aCGH e WES.
43
Figura 3 Figura 4.1: Fluxograma de avaliação de mutações em NMP. Retângulos representam
ensaios diagnósticos para detecção de mutações em determinados genes. Círculos ou ovais verdes representam subgrupos de NMP. Como as mutações somáticas em JAK2, CALR e MPL são excludentes, uma vez detectada a mutação JAK2V617F, a análise de uma NMP foi considerada finalizada.
44
Figura 4 Figura 4.2: Desenho experimental do estudo. O laboratório de Biologia Molecular do
CEMO recebeu de 2007 a novembro de 2013, amostras 1236 pacientes para o diagnóstico molecular
da mutação V617F em JAK2 provenientes de 25 centros parceiros. Para o presente estudo,
escolhemos uma subcoorte contendo dois centros (HUPE e HUAP) nos quais tivemos 218 pacientes
que receberam o diagnóstico final de NMP/SMD pelo clínico responsável por cada um dos centros.
Destes, 162 pacientes tiveram o diagnóstico de PV, TE ou MF confirmados através de exames
hematológicos, moleculares e de anatomia patológica (critérios da OMS/WHO). Destes, 8 pacientes
progrediram para leucemia aguda secundária, mas enfatizamos nesta gravura, somente aqueles
pacientes que tiveram suas amostras estudadas molecularmente. As setas indicam quais as
metodologias empregadas em cada etapa do estudo.
4.1. PCR qualitativa (alelo – específico) para a mutação JAK2V617F
Após a análise da mutação JAK2V617F em 162 pacientes com diagnóstico
final de PV, Te e MF, observamos uma distribuição semelhante das categorias
clínicas abordadas neste estudo nos dois centros envolvidos, demonstrando uma
homogeneidade na distribuição dos pacientes, independentemente do centro (figura
4.3).
45
Figura 5 Figura 4.3: Distribuição das NMP, BCR-ABL negativas, clássicas (PV, TE e MF primária ou
secundária), de acordo com a Classificação da OMS/WHO-2008, nos dois centros participantes deste
estudo. PV- Polictemia Vera; TE-Trombocitemia Essencial; MF-Mielofibrose; HUPE – Hospital
Universitário Pedro Ernesto (UERJ); HUAP – Hospital Universitário Antônio Pedro (UFF).
A frequência da distribuição da mutação JAK2V617F entre as categorias
clínicas mostrou que 92% dos pacientes com PV e que 46% e 48% dos pacientes
com TE e MF apresentavam a mutação JAK2V617 (figura 4.4).
Figura 6 Figura 4.4: Frequência de distribuição da mutação JAK2V617F por cada uma das categorias
de NMP de acordo com a Classificação da OMS/WHO-2008. PV- Polictemia Vera; TE-Trombocitemia
Essencial; MF-Mielofibrose; HUPE – Hospital Universitário Pedro Ernesto (UERJ); HUAP – Hospital
Universitário Antônio Pedro (UFF).
46
4.2. Padronização de ensaios moleculares para a detecção da carga
alélica de JAK2V617F
A padronização da quantificação da mutação JAK2V617F foi realizada por
duas metodologias: PCR com oligonucleotídeos fluorescentes seguido de análise de
fragmento (PCR-C) e por PCR em tempo real (q-PCR). A escolha da PCR-C foi por
ser esta, em um primeiro momento, uma abordagem de baixo custo e alta
especificidade e a q-PCR, por ser hoje a mais largamente utilizada pela maioria dos
grupos (LIPPERT et al., 2009).
Para a quantificação da mutação JAK2V617F por PCR-C, uma curva padrão
foi confeccionada a partir de diluições seriadas de um plasmídeo contendo o alelo
mutado contra um plasmídeo contendo o alelo selvagem clonados, em nosso
laboratório. Estes plasmídeos foram clonados a partir de uma amostra de um doador
de medula óssea e de um paciente portador da mutação JAK2V617F em
homozigose (XAVIER et al., 2008).
A quantificação realizada sempre foi comparada com a curva padrão de DNA
plasmidial. Para tal, foi realizada uma diluição seriada do DNA plasmidial, nas
seguintes concentrações do alelo mutado: 0%, 10%, 30%, 50%, 70%, 90%, 95%,
100%, na qual o N da tabela 4.1 representa o número de amostras testadas para
cada diluição. A variação do número de amostras testadas para cada uma das
concentrações se deve ao fato de que todas as diluições não foram incluídas em
todos os ensaios, mas os pontos de 0% e 100% foram sempre testados (tabela 4.1).
A curva foi criada para avaliar a eficiência da reação e o limite de detecção da carga
alélica do nosso ensaio que foram de R²=0,9941 e 10%, respectivamente (figura
4.5). O gráfico representa a correlação entre os valores teóricos esperados a partir
da diluição seriada entre os plasmídeos com 0% e 100% de alelo mutado e os dados
obtidos experimentalmente. Cada ponto representa a média de cada amostra
utilizada em cada ponto da curva.
47
pontos da curva (% alelo mutado)
Média Desvio médio
N
0 0 0 49
10 6,1525 0,5793417 20
30 30,26744 1,247185 39
50 53,70474 2,219058 19
70 70,04642 1,151473 28
90 83,642 1,442174 5
95 92,772 2,197432 5
100 99,6952 0,1991292 50
Tabela 6 Tabela 4.1: Representação da média de leitura dos pontos da curva de plasmídeo de JAK2
pelo método da PCR-C. O N corresponde ao número de amostras para cada ponto da curva.
Figura 7 Figura 4.5: Gráfico de correlação entre o dado teórico e o obtido experimentalmente por
análise de fragmentos. Cada ponto representa a média obtida em cada um dos pontos da curva
padrão gerada a partir da diluição dos plasmídeos que contém 0% do alelo selvagem e 100% do alelo
mutado para JAK2V617F.
Da mesma maneira, os produtos fluorescentes da PCR foram testados para
estabelecimento da melhor concentração de uso em duas plataformas utilizadas
neste estudo: sequenciador MegaBACE 1000 DNA Analysis System (GE Healthcare)
e sequenciador 3130xl (Applied Biosystems®). Para a primeira, foi estabelecida a
diluição de 1:10 do produto e para a segunda a melhor diluição foi de 1:5. Os
critérios adotados para validação das corridas do PCR-C foram: a) qualidade do
marcador Liz 500 (Sizing Quality – SQ) linear (próximo a 1); b) Picos selvagens (wt)
com intensidade entre 1000 e 8000 unidades arbitrárias de fluorescência (UAF); c)
Picos mutados (mt) com intensidade mínima de 50 UAF. Como regra geral, amostras
48
com carga alélica inferior a 30%, verificada por eletroforese em gel de agarose, não
necessitaram de diluição para visualização dos produtos por eletroforese capilar. Na
prática, uma correlação entre uma carga alélica <30% e a intensidade da banda
visualizada em gel de agarose pode ser utilizada para o planejamento das diluições.
Para validações intra e interensaios foram utilizadas amostras da coorte
central sendo avaliadas 74 e 54 amostras, respectivamente. As diluições foram
separadas por quartil e calculadas as médias e o desvio das médias dos valores
encontrados para as amostras em cada quartil (tabela 4.2). Para a variação
intraensaio foi considerada a diferença para cada uma das triplicatas, enquanto que
a variação interensaio foi mensurada comparando-se cada ensaio.
Quartil da carga alélica
n intra ensaio
Média da variação
intra ensaio
desvio médio
n inter ensaio
Média da variação inter
ensaio
desvio médio
75-100 6 0,32 0,41 5 1,06 0,67
50-75 18 1,66 1,26 8 2,22 1,38
25-50 24 1,35 0,87 16 2,73 1,25
0-25 26 1,23 0,85 25 1,41 0,80 Tabela 7 Tabela 4.2: Ensaio para avaliar a variabilidade intra e interensaio de JAK2 por PCR-C. Para
cada quartil foi calculada a média e o desvio médio de cada amostra.
A técnica padrão ouro para a quantificação da mutação JAK2V617F utiliza
diluição de linhagens celulares positivas para esta mutação contra linhagens
negativas (LIPPERT et al., 2009; JOVANOVIC et al., 2013;). A fim de comparar a
quantificação pela diluição de DNA plasmidial com a de linhagens celulares uma
nova curva foi construída a partir de diluições seriadas (0%, 25%, 50%, 75% e 100%
mt) de DNA da linhagem HEL (JAK2V617F positiva) contra DNA de K562
(JAK2V617F negativa).
Para cada ponto da diluição foi avaliada a porcentagem do alelo mutado
observado tanto pelo método de análise de fragmento (PCR-C) quanto pelo Real
Time (q-PCR). A eficiência para cada um desses ensaios foi bem semelhante:
0,7353 e 0,7233, respectivamente (Tabela 4.3). Os resultados obtidos com a curva
padrão plasmidial mostraram uma eficiência de reação bem similar entre o
plasmídeo selvagem (0,995) e mutado (0,9834) (resultados não mostrados).
Analisando a diluição de 50%, pela técnica de PCR-C, que esperaríamos
encontrar uma razão entre o alelo JAK2 mutado contra o alelo JAK2 selvagem igual
49
a 1, observou-se que o valor obtido no alelo mutado era 8 vezes maior do que o
esperado. Tal fato esta de acordo com a literatura que descreve a presença de um
maior número de cópias de JAK2 na linhagem celular HEL (JELINEK et al., 2005;
QUENTMEIER et al., 2006b). Desta forma, consideramos um fator de correção 8,
para equalizar os resultados obtidos com a curva HEL, que quando aplicado gerou
uma quantificação bem próxima da esperada, e uma eficiência de reação de 0,9991
(tabela 4.3).
De forma similar ao descrito para PCR-C, na diluição de 50%, no qPCR
(quando esperaríamos encontrar um mesmo Ct de amplificação para os alelos
mutado e selvagem), foi observado uma diferença de 3 Cts de amplificação entre Ct
JAK2 selvagem e Ct JAK2 mutado (tabela 4.3). Esta diferença é indicativa de um
aumento de número de cópias do alelo mutado de JAK2 na linhagem HEL, e similar
àquela obtida por PCR-C (2³ = 8). Após correção dos resultados obtidos por qPCR,
observamos valores semelhantes ao esperado, e a eficiência da reação foi de R² de
0,9965 (tabela 4.3).
A fim de comparar a quantificação da mutação de JAK2 pela curva padrão da
HEL pelas técnicas de PCR-C e q-PCR foi realizada uma regressão linear antes e
depois dos valores corrigidos (figura 4.6 A e B), podendo-se observar uma
correlação positiva tanto antes (R2 = 0,9995), quanto depois (R2 = 0,9916) da
aplicação do fator de correção.
Estes resultados demonstraram que para utilização de uma curva padrão a
partir de linhagens, estas devem ser sabidamente diplóide para JAK2, ou, caso
contrario, o número de cópias seja conhecido e utilizado como fator de correção.
Diluição análise de
fragmentos (observado)
real time (observado)
diferença ct observado
entre wt-mt
quantitativo esperado
para 8 cópias
análise de fragmentos (corrigido)
real time (corrigido )
Hel 100% 99,00 99,88 9,68 100,00 100,00 99,03
Hel 75% 95,40 97,00 5,02 96,00 72,14 80,22
Hel 50% 88,50 89,11 3,04 89,00 49,12 50,65
Hel 25% 71,00 73,65 1,49 72,00 23,41 25,95
K562 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
R² 0,7353 0,7233 0,9991 0,9965
Tabela 8 Tabela 4.3: Comparativo da curva de DNA de células da linhagem Hel diluídas em DNA de
células da linhagem K562 nas duas metodologias padronizadas e o quantitativo corrigido pelo número
de cópias extras em Hel.
50
Figura 8 Figura 4.6: Correlação entre as metodologias (PCR-C e q-PCR) de quantificação da carga
alélica de JAK2 utilizando a curva padrão de Hel diluída em K562. A) Correlação entre as
metodologias antes da aplicação do fator de correção e após o ajuste (B).
4.2. Correlação entre a carga alélica de JAK2V617F e as diferentes
categorias da OMS/WHO
A análise da carga alélica nas três diferentes categorias de NMP (PV, TE e
MF) evidenciou variações de carga alélica características a cada uma das categorias
distribuídas ao longo de todos os quartis. A mediana da carga alélica dos pacientes
com TE foi mais baixa do que a de pacientes com PV (p= 0,0002) e MF (p= 0,0090)
(figura 4.7). Quando comparada a distribuição da carga alélica entre os sexos não foi
observada diferença significativa entre as medianas (figura 4.8).
Figura 9 Figura 4.7: Frequência da carga alélica da mutação JAK2V617F nas três categorias clínicas
analisadas: PV- Polictemia Vera; TE-Trombocitemia Essencial; MF-Mielofibrose; As medianas das
51
cargas alélicas foram comparadas pelo teste de Mann-Whitney não pareado bicaudal (95% IC,
p<0,05) * - p<0,05; ** - p<0,01; ***- p<0,001.
Figura 10 Figura 4.8: Distribuição da carga alélica de JAK2 ao diagnóstico entre os subgrupos de NMP
e por sexo. Uma amostra com carga alélica abaixo de 50% foi considerada como contendo clones em
heterozigose do alelo de JAK2; em contraste carga alélica acima de 50% foi associada à presença de
subclones contendo alelos de JAK2V617F em homozigose. PV-Polictemia Vera; TE-Trombocitemia
Essencial; MF-Mielofibrose; M-mulher; H-homem.
A PV foi mais frequente em mulheres do que em homens. Além disso, a
análise dos parâmetros hematológicos mostrou que pacientes positivos para
JAK2V617F cursaram com número de plaquetas mais alto que os pacientes
portadores do alelo selvagem (JAKV617F negativos) (p=0,03). Pacientes com PV e
JAK2V617F com carga alélica >50% apresentaram hematócrito mais altos que os
pacientes com carga alélica <50% (p=0,0145). Pacientes com a mutação
JAK2V617F tem mais chances de cursarem com esplenomegalia do que aqueles
que apresentam o alelo selvagem.
A análise de outros parâmetros clínicos (trombose, prurido, hemorragia) -
hematológicos (tabela 4.4 e 4.5) tais como níveis de hemoglobina, neutrófilos e
plaquetas não mostrou diferença estatisticamente significativa entre os pacientes
com carga alélica acima ou abaixo de 50%.
52
CARGA ALÉLICA JAK2 V617F
PV TOTAL (n) NEG POS p TOTAL (n) HETEROZIGOSE (n±dp) HOMOZIGOSE (n±dp) p
CARACTERÍSTICAS
PACIENTES 36 3 33 30 11 19
IDADE (média ±dp) 66,2±11,3 55±15 67±11 0,1515 66,6+-10,9 63,3+- 15,6 68,7+-6,6 0,2048
IDADE (Mediana - min-max) 68 (40-85) 55 (44-66) 69 (40-85) 69 (40-85) 65 (40-85) 69,5 (49-78)
SEXO (Fem/masc) 22/14 1/2 21/12 19/12 7/4 12/7
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
HEMATÓCRITO (%) 57,7±8,2 59,7±6,8 57,5±8,4 0,6717 58,1+-8,5 53,2+-6,6 60,9+-8,4 0,0145
HEMOGLOBINA (g/dL) 18,7±2,1 19,8±1,8 18,6±2,1 0,335 18,8+-2,2 17,9+-2,0 19,3+-2,1 0,0861
LEUCÓCITOS (/mm3) 11906±5632 7733±1106 12285±5730 0,1839 12471+-5427 12847+-6360 12800+-5026 0,6613
NEUTRÓFILOS (%) 68,2±10,7 62±10,4 62±10,4 0,3002 69,9+-9,3 66,1+-9 72,2+-8,9 0,0852
LINFÓCITO (%) 20,2±10,6 28,3±9,3 19,4±10,5 0,1654 18,3+-8,9 22,3+-9,6 16+-7,7 0,0609
MONÓCITO (%) 6,6±3,4 8,0±1,4 6,4±3,5 0,5524 6,4+-3,6 7,5+-4,6 5,8+-3 0,3132
PLAQUETAS (/mm³) 474919±264434 16333±46543 502412±257966 0,0312 490567+-250875 598909+-240869 427842+-240504 0,0711
Descrição das características clínicas-hematológicas do pacientes com PV
JAK2 V617F
Tabela 9 Tabela 4.4: Características clínicas dos pacientes com PV. As características analisadas
foram comparadas pelo teste t não pareado bicaudal (95% IC, p<0,05).
PV TOTAL (N-%) V617F (N-%) JAK2 NEG (N-%) RR (95% IC) OD (95% IC)
EVENTOS DURANTE O ACOMPANHAMENTO 37 34 3
EMAGRECIMENTO 4 (11%) 4 (12%) 0% 1,033 (0,04538 - 23,50)
HEMORRAGIA 1 (3%) 1 (3%) 0% 0,3134 (0,01061 - 9,257)
TROMBOSE 8 (22%) 7 (21%) 1 (33%) 0,6176 (0,1093 - 3,489) 0,5185 (0,04085 - 6,581)
PARESTESIA 4 (11%) 3 (9%) 1 (33%) 0,2647 (0,03837 - 1,826) 0,1935 (0,01330 - 2,816)
PRURIDO 3 (8%) 3 (9%) 0% 0,7778 (0,03290 - 18,39)
ESPLENOMEGALIA 10 (27%) 10 (29%) 0% 3 (0,1420 - 63,40)
HEPATOMEGALIA 2 (5%) 2 (6%) 0% 0,5385 (0,02128 - 13,63)
Comparação dos eventos adversos durante o acompanhamento entre os pacientes com PV JAK2V617F positivos e negativos
Tabela 10 Tabela 4.5: Comparação dos eventos adversos em qualquer momento ao diagnóstico ou
durante o acompanhamento dos pacientes com PV. RR – risco relativo; OD-odds ratio; IC- intervalo de confiança.
A TE foi mais frequente em mulheres do que em homens não tendo sido
encontrada uma associação significativa entre idade e positividade para
JAK2V617F.
Pacientes TE JAK2V617F positivos (alelo mutado) apresentaram hematócrito
(p= <0,0001), níveis de hemoglobina (p=0,0001) mais altos quando comparado a
pacientes JAK2V617F negativos (alelo selvagem). Já o número de linfócitos teve
correlação inversa (p= 0,0432).
A quantidade de alelo mutado maior que 50% em TE foi estatisticamente
significativa para o número de linfócitos mais baixos (p=0,0211) (tabela 4.6). Não
foram observadas outras associações significativas em relação às características
demográficas ou parâmetros hematológicos.
Os pacientes TE JAK2V617F positivos possuem mais chances de terem
eventos adversos como hemorragia, trombose, emagrecimento, parestesia e
organomegalias (baço e fígado) quando comparados aqueles JAK2V617F negativos
(tabela 4.7).
53
TE TOTAL (n) NEG POS p HETEROZIGOSE (n±dp) HOMOZIGOSE (n±dp) p
CARACTERÍSTICAS
PACIENTES 87 49 40 26 9
IDADE (média ±dp) 62,7±15,9 59,6±17,2 66,1±13,8 0,0615 64,8±13,8 74,4±11,6 0,0663
IDADE (Mediana - min-max) 62,5 (19-88) 59 (19-88) 67 (38-88) 65 (38-88) 73 (56-86)
SEXO (Fem/masc) 65/22 38/11 27/11 21/8 6/3
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
HEMATÓCRITO (%±dp) 39,6±6,1 37,2±5,2 42,6±5,8 <0,0001 42,1±5,5 43,5±6,9 0,5429
HEMOGLOBINA (g/dL±dp) 12,9±2,0 12,1±1,7 13,7±2,0 0,0001 13,7±2,0 13,7±2,1 0,9192
LEUCÓCITOS (/mm3±dp) 11777±13553 11360±17249 12277±7122 0,7539 11022±6286 15937±9649 0,0913
NEUTRÓFILOS (%±dp) 62,9±10,1 62,5±10,0 63,3±10,4 0,7563 62,0±8,5 65,6±15,0 0,3732
LINFÓCITO (%±dp) 23,7±8,5 25,5±8,2 21,6±8,5 0,0432 23,7±7,8 16,0±8,0 0,0211
MONÓCITO (%±dp) 8,9±6,2 8,8±6,0 8,9±6,4 0,955 9,8±6,8 6,9±4,6 0,2673
PLAQUETAS (/mm³±dp) 1016216±392486 995429±338103 1042333±455004 0,5805 1002862±391024 1111571±585980 0,554
Descrição das características clínicas-hematológicas do pacientes com TE
JAK2 V617F CARGA ALÉLICA JAK2 V617F
Tabela 11 Tabela 4.6: Características clínicas dos pacientes com TE. As características analisadas
foram comparadas pelo teste t não pareado bicaudal (95% IC, p<0,05).
TE TOTAL (N-%) V617F (N-%) JAK2 NEG (N-%) RR (95% IC) OD (95% IC)
EVENTOS DURANTE O ACOMPANHAMENTO 79 38 41
EMAGRECIMENTO 10 (13%) 9 (24%) 1 (3%) 9,711 (1,290 - 73,11) 12,41 (1,488 - 103,5)
HEMORRAGIA 8 (10%) 7 (18%) 1 (3%) 7,553 (0,9735 - 58,60) 9,032 (1,055 - 77,36)
TROMBOSE 13 (16%) 11 (29%) 2 (5%) 5,934 (1,405 - 25,07) 7,944 (1,628 - 38,76)
PARESTESIA 6 (8%) 5 (13%) 1 (3%) 5,395 (0,6595 - 44,13) 6,061 (0,6739 - 54,51)
PRURIDO 0% 0% 0%
ESPLENOMEGALIA 16 (20%) 13 (34%) 3 (7%) 4,675 (1,443 - 15,15) 6,587 (1,702 - 25,49)
HEPATOMEGALIA 7 (9%) 6 1 (3%) 6,474 (0,8161 - 51,35) 7,5 (0,8581 - 65,55)
Comparação dos eventos adversos durante o acompanhamento entre os pacientes com TE JAK2V617F positivos e negativos
Tabela 12 Tabela 4.7: Comparação dos eventos adversos em qualquer momento ao diagnóstico ou
durante o acompanhamento dos pacientes com TE. RR – risco relativo; OD-odds ratio; IC- intervalo de confiança.
Na MF, pacientes positivos para JAK2V617F apresentaram número de
neutrófilos significativamente mais altos em comparação ao grupo JAK2V617F
negativo (p= 0,017). A análise de outros parâmetros hematológicos (tabela 4.8) tais
como hematócrito, níveis de hemoglobina, neutrófilos e plaquetas não mostrou
diferença estatisticamente significativa entre pacientes JAK2V617F positivos e
negativos. Da mesma forma, os níveis de carga alélica não impactaram os
parâmetros hematológicos. A esplenomegalia foi o evento mais frequente em
pacientes com MF (86%), entretanto, nenhum evento adverso teve maiores chances
de ocorrência entre os pacientes portadores ou não da mutação JAK2V617F (tabela
4.9).
54
JAK2 V617F CARGA ALÉLICA JAK2 V617F
MF TOTAL (n) NEG POS p HETEROZIGOSE (n) HOMOZIGOSE (n±dp) p
CARACTERISTICAS
PACIENTES 25 14 11 4 7
IDADE (média ±dp) 56,2±13,2 54,8±14,3 57,3±11,1 0,6262 59,5±11,7 59,2±10,2 0,9588
IDADE (Mediana - min-max) 56,5 (21-75) 56 (21-75) 62 (41-71) 64,5 (42-67) 62 (45-71)
SEXO (Fem/masc) 13/12 9/5 4/7 2/2 2/5
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
HEMATÓCRITO (%) 34,5±13,2 30,3±6,3 38,5±16,8 0,0964 30,0±13,2 43,2±21,0 0,2905
HEMOGLOBINA (g/dL) 11,0±3,8 9,8±1,9 12,1±4,7 0,1063 9,5±4,3 13,2±5,7 0,2825
LEUCÓCITOS (/mm³) 12101±11955 11902±15925 12286±7090 0,9329 13100±7559 12800±7961 0,9526
NEUTRÓFILOS (%) 63,6±12,0 58,3±12,5 68,9±9,2 0,017 69,3±10,4 72,2±5,3 0,57
LINFÓCITO (%) 20,5±8,0 23,3±9,0 17,7±5,8 0,0558 18,5±7,5 16,2±6,3 0,6085
MONÓCITO (%) 9,7±5,8 10,0±5,4 9,4±6,3 0,7998 10,3±3,3 6,8±5,1 0,2755
PLAQUETAS (/mm³) 374393±334745 354846±339012 3913335±341953 0,7796 632250±458542 369000±310023 0,2811
Descrição das características clínicas-hematológicas do pacientes com MF
Tabela 13 Tabela 4.8: Características clínicas dos pacientes com MF. As características analisadas
foram comparadas pelo teste t não pareado bicaudal (95% IC, p<0,05).
MF TOTAL (N-%) V617F (N-%) JAK2 NEG (N-%) RR (95% IC) OD (95% IC)
EVENTOS DURANTE O ACOMPANHAMENTO 29 15 14
EMAGRECIMENTO 12 (41%) 6 (40%) 6 (43%) 0,9333 (0,3925 - 2,219) 0,8889 (0,2025 - 3,902)
HEMORRAGIA 0% 0% 0%
TROMBOSE 1 (3%) 1 (7%) 0% 3 (0,1125 - 79,98)
PARESTESIA 0% 0% 0%
PRURIDO 1 (3%) 1 (7%) 0% 3 (0,1125 - 79,98)
ESPLENOMEGALIA 25 (86%) 14 (93%) 11 (79%) 1,188 (0,8754 - 1,612) 3,818 (0,3472 - 41,99)
HEPATOMEGALIA 7 (24%) 2 (13%) 5 (36%) 0,3733 (0,08588 - 1,623) 0,2769 (0,04365 - 1,757)
Comparação dos eventos adversos durante o acompanhamento entre os pacientes com MF JAK2V617F positivos e negativos
Tabela 14 Tabela 4.9: Comparação dos eventos adversos em qualquer momento ao diagnóstico ou
durante o acompanhamento dos pacientes com MF. RR – risco relativo; OD-odds ratio; IC- intervalo de confiança.
A variação da carga alélica foi estudada em amostras seriadas ao longo do
acompanhamento de pacientes positivos para JAK2V617F. Como resultados foram
observados padrões de oscilação ou estabilidade da carga tumoral.
Em nosso trabalho recente (ZALCBERG et al., 2011) (anexo 4), analisamos a
variação da carga alélica, entre a primeira e a última amostra disponível no
laboratório, de pacientes submetidos a tratamento com Hidroxiureia (HU). A
comparação da carga alélica da amostra inicial de pacientes virgens de tratamento
com a última amostra de acompanhamento, disponível no laboratório, sugere que a
carga alélica inicial é maior, em pacientes com PV e TE. Já as variações observadas
em pacientes cuja primeira amostra disponível era após o início do tratamento esta
variação foi mais sutil (figura 4.9).
Análises de acompanhamento de alguns pacientes mostraram que a dose de
HU utilizada no tratamento teve impacto nos parâmetros hematológicos (pacientes 3-
PV, 4-TE, 6-TE, 7-PV, 10-TE, 11-TE, 31-TE e 63-PV) sem que houvesse uma
correlação direta entre a dose de HU utilizada e os níveis de JAK2V617F. Os
pacientes 1-PV e 2-PV mostraram um aumento da carga alélica, apesar de
55
apresentarem uma resposta hematológica em resultado ao uso de HU (anexo 4,
publicação 1).
De modo geral, nossos resultados mostraram que a carga tumoral permanece
estável durante o tratamento com HU. Pacientes com níveis de carga alélica
situados no 1º e 4º quartis (53-PV; 62-TE; 31-TE; 34-TE; 51-TE e 54-TE) tendem a
apresentar maior estabilidade dos níveis de carga alélica, enquanto que os
pacientes com níveis intermediários (2º e 3º quartil) apresentam maiores variações
(pacientes 3-PV e 12-PV) (tabela 4.10). Alguns pacientes que necessitaram
interromper o tratamento em função dos parâmetros hematológicos (número de
plaquetas, hematócrito baixo), apresentaram um aumento da carga tumoral
(pacientes 3-PV e 8-TE) (anexo 4, publicação 1).
Os pacientes 53-PV, 62-PV, 4-TE, 10-TE, 11-TE, 17-TE, 34-TE e 54-TE
apresentaram oscilações discretas da carga alélica. Em função da observação que
pacientes com PV apresentaram carga alélica mais alta (4º quartil) em comparação
aos com TE (1º quartil), propusemos uma correlação entre níveis de carga alélica e
categoria de NMP (anexo 4, publicação 1).
Figura 11 Figura 4.9: Variação da carga alélica de JAK2 em pacientes com PV e TE. À esquerda está
demonstrada a dinâmica entre uma amostra inicial do diagnóstico (sem tratamento) e a última amostra de acompanhamento disponível no laboratório. À direita a mesma dinâmica é demonstrada com a diferença de que na data da coleta da amostra inicial os pacientes já haviam iniciado o tratamento. As análises foram realizadas utilizando o teste pareado não paramétrico de Wilcoxon.
56
Paciente Doença Resposta hematológica às modificações nas doses de HU Resposta JAK2V617 às modificações nas doses de HU
2 PV oscilação oscilação V617F não relacionada à HU
3 PV oscilação oscilação V617F não relacionada à HU
9 PV oscilação discreta ausência de modificações (4º quartil)
53 PV oscilação discreta ausência de modificações (4º quartil)
63 PV oscilação discreta variação independente de V617F
6 TE oscilação ausência de modificações (2º quartil)
13 TE oscilação oscilação relacionada à HU
17 TE oscilação ausência de modificações (1º quartil)
31 TE oscilação modificação induzida por HU? (1º-2º-1º quartil)
34 TE oscilação ausência de modificação
51 TE oscilação oscilação V617F não relacionada à HU
54 TE oscilação oscilação discreta (1º quartil)
18 TE-LA ausência de variações modificação discreta (3º-2º-3º quartil)
Tabela 15 Tabela 4.10: Tabela resumo de alguns pacientes ressaltando as respostas hematológicas à
terapia citorredutora (HU) e as respostas de carga alélica.
Durante o acompanhamento, cinco pacientes evoluíram para mielofibrose
secundária. O diagnóstico inicial dos pacientes era: PV(2) e TE(3). O paciente #192,
portador de TE, cursou com níveis baixos de carga alélica, sendo a inicial de 10% e
durante o acompanhamento oscilando em torno de 5%. Este paciente ainda se
encontra em acompanhamento para avaliar se um aumento da carga alélica é
observado, como o esperado, em uma progressão de TE para mielofibrose
secundária (MFS). A carga alélica do paciente #714, portador de PV aumentou
durante o acompanhamento sendo observada uma mudança dos níveis da
JAK2V617F de < 50% para >50%. Entretanto a mudança de padrão não foi preditiva
ou concomitante ao aparecimento de MFS, sendo esta detectada somente 4 anos
após o aumento da carga alélica de JAK2V617F acima dos 50% (figura 4.10). Para o
paciente #341, portador de TE, com carga alélica próxima a 100% na amostra inicial,
não foi possível avaliar o comportamento da carga alélica ao longo da doença até a
transformação para MFS por perda de seguimento. Em contraste, para o paciente
#502 portador de PV, estavam disponíveis somente amostras do acompanhamento
após o período da transformação para MFS, quando a carga alélica era próxima a
100%. Para o paciente #144, portador de TE, várias amostras do seguimento
estavam disponíveis. A análise seriada destas amostras, ao longo do tratamento
com HU, mostra uma diminuição de clones JAK2V617F positivos com reflexo na
diminuição da carga alélica após o primeiro ciclo de HU e um aumento da carga
alélica, com níveis similares ao do diagnóstico, um ano antes da progressão. A
última amostra analisada após a transformação apresentou níveis de carga alélica
mais elevados do que a carga inicial (figura 4.11).
57
Figura 12 Figura 4.10: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F do paciente
#714, portador de PV e progressão para mielofibrose secundária (janeiro de 2013).
Figura 13 Figura 4.11: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F do paciente
#144 portador de TE e progressão para mielofibrose secundária (junho de 2012).
O uso compassivo do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib), aprovado em 2012 pela
ANVISA, e revogado em 2013, em três pacientes, permitiu avaliar se o uso do
Ruxolitinib apresentava impacto na carga alélica de JAK2V617F em pacientes
positivos para a mutação. As figuras 4.12 e 4.13 mostram a cinética da carga alélica
ao longo do tratamento em 2/3 pacientes submetidos ao inibidor de JAK2V617F
positivo. É de se notar a não alteração dos níveis de JAK2V617F, sugerindo uma
não diminuição relevante do clone mutado. Em contraste, os pacientes
apresentaram uma melhora global dos sintomas clínicos. O terceiro paciente
58
negativo para JAK2V617F, submetido ao inibidor de JAK2 também apresentou
melhora global dos sintomas, apesar das intercorrências diretas (neutropenia) ou
indiretas (acentuação dos eventos adversos: microcirculação vascular – ferida no pé
associada à diabetes; lesão hipocrômica associada à hanseníase), associadas ao
tratamento. O paciente continua em uso do inibidor, com melhora das lesões,
parâmetros hematológicos estáveis e diminuição do baço.
Figura 14 Figura 4.12: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F do paciente
#471 portador de mielofibrose ao longo do uso do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib).
Figura 15 Figura 4.13: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2V617F, do paciente #
616 portador de mielofibrose, ao longo do uso do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib).
59
4.3. Estabelecimento das metodologias para a detecção de mutações
adicionais em amostras de pacientes com NMP e JAK2V617F negativo
Amostras de pacientes com NMP e JAK2V617F negativo foram testadas para
a presença de outras mutações somáticas, de forma hierárquica, de acordo com a
suspeita clínica (figura 2). Desta forma, o rastreamento para mutações em MPL foi
realizado em pacientes com TE e MF e o rastreamento para mutações no gene
JAK2 no éxon 12 e ao longo de todo o exon 14 foi realizado nos casos de PV e MFS
à PV. A análise do status mutacional foi primeiramente realizada pelo método de
sequenciamento direto de Sanger. Os casos com mutações identificadas pelo
sequenciamento direto foram utilizados para padronização da técnica de HRM
utilizada posteriormente como de triagem.
4.3.1. MPL
A técnica de HRM para MPL foi padronizada utilizando-se amostras de
pacientes saudáveis doadores de medula óssea e de uma amostra, de padrão em
homozigose definido por sequenciamento direto, positiva para a mutação
p.Trp515Leu (W515L). Para fins de determinação de sensibilidade da técnica foi
realizada uma curva com diluições seriadas do DNA da amostra mutada contra a
amostra do tipo selvagem (100%, 75%, 50%, 25%, 10%, 5%, 1% e 0%mt). O gráfico
mostra que amostras positivas para a mutação p.Trp515Leu em MPL podem ser
diferenciadas daquelas do tipo selvagem quando presentes em um percentual ≥ 5%
(figura 4.14).
deg.
84,2 84,4 84,6 84,8 85,0 85,2 85,4 85,6 85,8 86,0 86,2 86,4 86,6
Norm
alis
ed m
inus w
t
0
-5
-10
-15
-20
-25
Figura 16 Figura 4.14: Curva de sensibilidade de detecção da mutação p.Trp515Leu em MPL por
HRM.
60
Uma vez estabelecida esta metodologia foi utilizada para a triagem e
identificação de pacientes portadores de mutações no éxon 10 de MPL. Desta
forma, 45 pacientes negativos para JAK2V617F foram avaliados por HRM para a
presença de mutações no éxon 10 de MPL. A mutação p.Trp515Leu foi observada
em três pacientes (figura 4.16). Pacientes cuja positividade para a mutação foi obtida
por HRM foram também avaliados por sequenciamento direto (figura 4.15). A análise
do cromatograma definiu a mutação em heterozigose nos três pacientes avaliados.
Figura 17 Figura 4.15: Cromatogramas de sequenciamento do gene MPL: (A) amostra tipo selvagem;
(B) mutação em homozigose (TGG TTG), (C) mutação em heterozigose.
4.3.2. Éxon 12 de JAK2
Os estudos para pesquisa de mutações no éxon 12 de JAK2 foram realizados
em três pacientes por sequenciamento direto. Dos pacientes testados, todos foram
negativos para a presença de mutação nesta região (figura 4.16). A ausência de
identificação de portadores de mutações se deve à baixa incidência das mutações
no éxon estudado, já relatada na literatura (SCHNITTGER et al., 2009).
4.3.3. Éxon 14 de JAK2
Para pesquisa de outras mutações no éxon 14 que não sejam a JAK2V617F
foram testados três pacientes com diagnóstico de PV, não tendo sido encontrados
pacientes portadores de mutações na região estudada (figura 4.16).
61
Figura 18: Figura 4.16: Frequência das mutações nos éxons 12 e 14 do gene JAK2 e no éxon
10 do gene MPL.
4.4. Análises moleculares nos pacientes com neoplasias mielóides/ NMP
que apresentaram progressão leucêmica
No grupo de estudo dos 162 pacientes, um subgrupo de 12 pacientes cursou
com evolução clínica associada à transformação para leucemia aguda além dos
cinco pacientes discutidos anteriormente e que evoluíram para MFS. Dos 12
pacientes, dois evoluíram para SMD, dois com diagnóstico de SMD transformaram
para LMA secundária e oito pacientes com NMP clássica transformaram para
leucemia aguda secundária. Destes últimos, sete com o diagnóstico inicial de TE e
um com diagnóstico de NMP-U (U=não classificável). O tempo médio para
progressão para leucemia aguda desde o diagnóstico de NMP foi de cinco anos e
meio com mediana de quatro anos (intervalo de 2 a 11 anos). Os pacientes que
progrediram para leucemia aguda possuíam a média de idade semelhante à média
de idade obtida nas três categorias clínicas estudadas (PV, TE e MF). Os pacientes
foram em sua maioria mulheres (88%) e negativos para a mutação JAK2V617F
(88%). A evolução da leucemia foi muito agressiva, com sobrevida média de 82 dias
(16 - 299) (tabela 4.11). A fase leucêmica, como esperado, foi caracterizada por
anemia e linfopenia periférica aumento da leucometria e presença de blastos (tabela
4.12). O evento adverso mais comum durante a fase crônica foi hemorragia (29%) e
em menor frequência trombose, esplenomegalia e emagrecimento. O evento
trombótico ocorreu no paciente com a maior contagem plaquetária, sendo este o
único paciente positivo para a mutação JAK2V617F (tabela 4.13). Destes oito
62
pacientes, cinco possuíam amostras da fase crônica (NMP), e da fase de progressão
leucêmica, um paciente com amostra somente da progressão leucêmica e dois
pacientes com amostras relativas ao período anterior à progressão leucêmica, ainda
em vigência de NMP.
Leucemia aguda secundária à NMP
JAK2
V617F
CARACTERÍSTICAS TOTAL (n) NEG POS
PACIENTES 8 7 1
IDADE (diagnóstico-média) 57±8,5 56,1±8,8 63
IDADE (diagnóstico-mediana-min-max) 59,5 (41-66) 59 (41-66)
IDADE (leucemização secundária-média) 62,5±8,5 61,4±8,6 70
IDADE (leucemização secundária-mediana-min-max) 63 (51-74) 62 (51-74)
SEXO (Fem/masc) 7/1 7/0 0/1
Tempo para transformação (anos)(média±dp) 5,6±3,1 5,4±3,3 7
Tempo para transformação (anos)(mediana-min-max) 4(2-11) 4(2-11)
Duração da leucemia aguda secundária (dias)(média±dp) 82,13±90,3 88,8±95,4 35
Duração da leucemia aguda secundária (dias)(mediana-min-máx) 64 (16-299) 72 (16-99)
Tabela 16 Tabela 4.11: Características clínicas–demográficas dos pacientes com NMP que
progrediram para leucemia aguda (n=8).
leucemização aguda
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DIAGNÓSTICO LEUCEMIZAÇÃO p NEG POS
HEMATÓCRITO (%) 35,7±6,8 24,6±3,9 0,0156 35,8±7,3 34,6
HEMOGLOBINA (g/dL) 11,25±2,1 8,2±1,6 0,0298 11,3±2,2 10,5
LEUCÓCITOS (/mm³) 20400±16300 44400±36041 0,0078 18230±16337 35600
NEUTRÓFILOS (%) 56,3±12,6 29,8±13,2 0,0313 57,0±13,6 52
LINFÓCITO (%) 24,0±1,4 14,4±4,5 0,0313 23,8±1,5 25
MONÓCITO (%) 10,7±13,4 13,8±15,2 0,75 11,7±14,4 5
PLAQUETAS (/mm³) 1070250±637219 240250±151732 0,0078 881000±373422 2395000
BLASTOS (%) 33,5±6,3
JAK2 V617F
Descrição das características clínicas-hematológicas dos pacientes leucemizados
Tabela 17 Tabela 4.12: Parâmetros hematológicos dos pacientes com NMP que progrediram para
leucemia aguda (95% IC, p<0,05, teste de Wilcoxon).
63
Descrição dos eventos adversos durante a fase crônica dos pacientes leucemizados
Leucemia aguda secundária à NMP TOTAL (N-%)
EVENTOS DURANTE O ACOMPANHAMENTO 7
EMAGRECIMENTO 1
HEMORRAGIA 2
TROMBOSE 1
PARESTESIA 0
PRURIDO 0
ESPLENOMEGALIA 1
HEPATOMEGALIA 0 Tabela 18 Tabela 4.13: Eventos adversos em qualquer momento ao diagnóstico ou durante o
acompanhamento (fase crônica) dos pacientes com NMP que progrediram para leucemia aguda.
A procura de um marcador preditivo da progressão leucêmica teve início pela
busca de mutações nos genes IDH1 e IDH2, estas descritas em trabalhos anteriores
(MARDIS et al., 2009; ANDRULIS et al., 2010; GREEN; BEER, 2010;) como
associadas à progressão leucêmica. O estudo em amostras antes e na progressão
leucêmica, para mutações pontuais no éxon 4 dos genes IDH1 e 2, nos 5 pacientes
em questão não revelou positividade para estas mutações. Desta forma a presença
de mutações na região codificante de TET2, outro gene envolvido na regulação
epigenética, foi investigada. A alteração p.Pro363Leu no éxon 3 de TET2 do
paciente #834 foi observada nas duas amostras estudadas (figura 4.17). Após a
consulta em bancos de dados (100genomas, dbSNP, UniProt) relativos a frequência
populacional, esta troca de um único nucleotídeo foi caracterizada como
polimorfismo (tabela 4.14). A presença deste SNV (troca simples de nucleotídeo)
ocorreu no paciente com a menor contagem de plaquetas durante a progressão
leucêmica.
64
JAK2 JAK2 MPL IDH1 IDH2
diagnóstico
leucemização
diagnóstico
leucemização
diagnóstico
leucemização
diagnóstico
leucemização
diagnóstico
leucemizaçãoneg neg neg neg
neg neg neg neg
neg
TET2
Éxon 3 Éxon 9
neg neg neg
neg
neg
719 + neg
negneg negneg
249 neg
neg
neg
neg847 neg neg neg
negneg
883 neg neg
Paciente AmostraJAK2
V617F Éxon 12 Éxon 14
neg
834 neg neg neg
Éxon 10
neg
Éxon 4
neg negp.Pro363
Leu
Éxon 4
neg
Tabela 19 Tabela 4.14: Genes analisados para presença de mutações em amostras pré e no
momento da progressão leucêmica em pacientes com NMP que progrediram para leucemia aguda. Identificação do polimorfismo p.Pro363Leu no éxon 3 de TET2 (+ positivo; neg – negativo).
Figura 19 Figura 4.17: Cromatogramas de sequenciamento do éxon 3 do gene TET2, (A) forma
selvagem (WT), (B e C) presença de SNV em heterozigose em amostras do paciente 834 durante a
fase crônica (B) e de progressão para leucemia aguda secundária (C).
Mediante a complexidade, morosidade e baixa sensibilidade do
sequenciamento direto para análises de genes grandes como o TET2, e pelo grande
número de genes possivelmente envolvidos no processo de progressão leucêmica,
sugeridos na época de elaboração deste trabalho, partimos para a investigação
desta questão, ou seja, a definição de marcadores moleculares preditivos de
transformação, com técnicas genômicas de alta resolução.
65
4.4.1. Análise de hibridização genomica comparativa (aCGH – array
comparative genomic hybridization)
Dos oito pacientes que progrediram para leucemia aguda, cinco pacientes
com diagnóstico de TE possuíam amostras da fase crônica (NMP), e da fase de
progressão leucêmica, e foram analisados pela técnica de aCGH. Destes cinco
pacientes, três apresentaram alterações (amplificações e deleções) na amostra da
progressão leucêmica e por isso também tiveram o DNA da amostra ao diagnóstico
analisado por aCGH. O paciente #883 possuía uma amostra intermediária, 10 meses
após o diagnóstico de NMP e cinco meses anterior ao diagnóstico de leucemia
aguda e desta forma teve também esta amostra analisada.
Os resultados mostraram que 3/5 dos pacientes apresentaram alterações
cromossômicas detectáveis pela técnica de aCGH com chips de alta resolução
(244k). A mediana do tamanho mínimo teórico (resolução) detectável por este chip
são alterações de 19Kb. Como esperado, o número de alterações cromossômicas foi
maior na fase de leucemia aguda do que na fase de NMP, sendo o evento de perda
cromossômica o mais recorrente (figura 4.18 e figura 4.19). A média do número de
alterações/paciente foi de 6,3 (5 - 8) nas amostras na leucemia aguda e de 2,5 (1-
10) ao diagnóstico (figura 4.20 e 4.21 e tabelas 4.16 e 4.17). Nas amostras durante a
progressão leucêmica os pacientes tinham na média 29,3 Mb alterados, 2,3
amplificações/paciente, sendo o tamanho médio das amplificações de 33,3Mb
(mediana de 27,5Mb, variando de 1Mb a 71,5Mb). Dentre as deleções foi observado
uma média de 4 deleções/paciente sendo que o tamanho médio das deleções foi de
27 Mb (mediana de 14,6Mb, variando de 80kb a 92Mb) (figura 4.20 e 4.21 e tabelas
4.16 e 4.17).
Interessantemente, duas alterações (+2p e del(5q)) foram especificas da
leucemia aguda e ambas recorrentes com co-ocorrência em 2/3 pcs (figuras 4.22 e
4.23). Estas alterações não foram identificadas no diagnóstico em nenhum dos
casos, estando inclusive ausente na amostra intermediária do paciente #883 relativa
a 5 meses antes da progressão leucêmica (tabela 4.17). A presença desta alteração
esteve associada a níveis de hemoglobina e hematócrito mais altos, quando
comparados os pacientes positivos para estas alterações com os que não
apresentavam estas duas alterações.
Foi observado que 2/3 pacientes apresentaram alterações desde o
diagnóstico, que foram exclusivas, a cada um deles, ou seja, não se mostraram
66
recorrentes entre eles. A comparação entre as amostras da fase NMP e da
progressão leucêmica mostrou em um paciente, 10 alterações, e no outro, uma
alteração comum entre as duas fases. As alterações observadas eram em sua
maioria do tipo deleção (del), e com um comprimento médio de 2,7Mb (848Kb-
6,4Mb). Somente um ganho de 500Kb foi observado (tabela 4.17 e figura 4.21).
Os outros dois pacientes analisados não apresentaram alterações do número
de cópias nas amostras de progressão leucêmica e por isso não tiveram a amostra
ao diagnóstico investigada.
Figura 20 Figura 4.18: Gráfico mostra o número de alterações total por paciente, obtido por aCGH, em
amostras da progressão leucêmica e da fase crônica (NMP) da doença. NMP- amostra da fase de NMP; LA- amostra da fase de leucemia aguda.
Figura 21 Figura 4.19: Gráfico mostra o número e tipo de alteração (ganho ou perda) encontrada na
fase de leucemia aguda dos pacientes estudados por aCGH.
67
Figura 22 Figura 4.20: Alterações identificadas por aCGH durante a fase de crônica das amostras
estudadas. Chr-cromossomo; CNV – copy number variation
Figura 23 Figura 4.21: Alterações identificadas por aCGH durante a fase de leucemia aguda (LA) das
amostras estudadas. Notar que as alterações do cromossoma 2 e 5 estão localizadas na mesma região e são recorrentes. Chr-cromossomo; CNV – copy number variation
68
Figura 24 Figura 4.22: Resultado de aCGH mostrando as alterações observadas no cromossoma 2
dos 3 pacientes com rearranjos cromossômicos. Cada cor de linha representa um paciente: azul – paciente #883; lilás – paciente #249; vermelho – paciente #719. No eixo das abcissas, temos a representação do cromossoma 2, sendo à esquerda o braço curto e à direita o braço longo. No eixo das ordenadas temos o valor de log2 da razão entre o número de cópias do DNA tumoral e o DNA referência
Figura 25 Figura 4.23: Resultado de aCGH mostrando as alterações observadas no cromossoma 5
dos 3 pacientes com rearranjos cromossômicos. Cada cor de linha representa um paciente: azul – paciente 883; lilás – paciente 249; vermelho – paciente 719. No eixo das abcissas, temos a representação do cromossoma 5, sendo à esquerda o braço curto e à direita o braço longo. No eixo das ordenadas temos o valor de log2 da razão entre o número de cópias do DNA tumoral e o DNA referência
69
paciente #883
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
chr2 p25.3 - p13.3 ganho 71,46132
chr5 q23.3 - q35.3 perda 53,123196
chr7 q32.3 perda 0,160687
chr10 p15.1 - p14 perda 7,063712
chr12 q24.31 perda 0,090047
chr17 q25.1 - q25.3 perda 9,846114
paciente #249
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
chr2 p25.3 - p25.1 perda 9,881828
chr9 p21.3 - p11.2 perda 19,422864
chr9 q13 - q34.3 perda 69,912548
chr18 q12.1 perda 0,085504
chr18 q12.3 - q23 perda 36,338132
paciente #719
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
chr2 p25.3 - p16.1 ganho 55,610263
chr3 q23 - q29 ganho 56,230282
chr5 q14.3 - q35.3 perda 92,121742
chr6 p25.3 - p22.1 perda 26,713382
chr6 p22.1 - p12.1 ganho 27,558361
chr8 q23.2 - q23.3 ganho 1,065098
chr8 q24.13 - q24.3 ganho 19,67531
chr17 p13.3 ganho 1,3239 Tabela 20 Tabela 4.15: anormalidades exclusivas da progressão leucêmica observadas pela técnica
de aCGH
70
paciente #883
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
chr1 p36.31 - p36.23 perda 2,000608
chr1 p32.3 perda 1,000292
chr3 p25.1 - p24.3 perda 6,155235
chr3 p22.2 perda 0,848593
chr3 p21.31 perda 3,95882
chr3 q21.3 - q22.1 perda 2,186143
chr7 q22.1 perda 2,003467
chr13 q12.12 ganho 0,49895
chr17 p13.3 - p13.1 perda 6,400794
chr17 q11.2 perda 1,807016
paciente #249
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
chr12 q24.31 perda 1,080697
paciente #719
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
ausência de alterações comuns Tabela 21 Tabela 4.16: Anormalidades presentes na amostra ao diagnóstico de MPN e que
permaneceram na leucemia aguda observadas pela técnica de aCGH.
Nas amostras da fase de leucemia aguda secundária foram observadas
alterações na via JAK-STAT como a perda monoalélica de SOCS3 (região 17q25.1 -
q25.3), que é um regulador negativo da via, no paciente #883 e ganho no gene da
trombopoetina (região 4q23 - q29), THPO, no paciente #719. Foram observadas
deleções em diversos cromossomas afetando genes de regulação epigenética do
complexo polycomb2 e em proteínas que participam ou interagem com o complexo
SET: PHF1, PHF19, JARID2, SETD1B, WDR5, CXXC1, associados à repressão da
transcrição.
Dos genes alterados desde o diagnóstico de NMP, podemos destacar a perda
monoalélica de eritropoietina (EPO) (região7q22.1), SUZ12 (17q11.2), TP53,
POLR2A (17p13.3 - p13.1) e SETD1B (12 q24.31).
A análise de processos biológicos dos genes das regiões comumente
alteradas na fase de leucemia aguda secundária mostrou que no cromossomo 5q há
71
9 genes deletados envolvidos na via de JAK-STAT (CSF2, TSLP, IL3, IL4, IL5, IL9,
IL13, IL12B, SPRY4) e 4 desses genes também envolvidos na via de diferenciação
hematopoética (CSF2, IL3, IL4, IL5). No cromossoma 2 foi observado o ganho em
genes de regulação epigenética (DNMT3A, ASXL2 e DPY30) e de reparo de
mismatch (MSH2).
4.4.2. Sequenciamento do exoma completo (WES - Whole exome
sequencing)
Pela a técnica de WES foram analisadas seis amostras (NMP e leucemia
aguda) dos três pacientes que apresentaram alterações cromossômicas na fase de
leucemia aguda pela técnica de aCGH. Neste momento, foram analisados três
pacientes com diagnóstico inicial de TE (um JAK2 V617F e dois negativos para esta
mutação). Após o alinhamento das leituras de 100 pb de cada paciente, o exoma
sequenciado foi alinhado contra o genoma humano, versão hg19, do qual obtivemos
os seguintes resultados:
O WES teve em média: 71 milhões de regiões exônicas de 100pb mapeadas;
cobertura de 99,6x por nucleotídeo; qualidade de 80% das regiões-alvo
seqüenciadas; 7% de regiões duplicadas. Foram observadas em média 199
mutações exônicas somáticas não sinônimas / paciente (144 mutações pontuais e
55 INDELS).
Foram observadas em média 10752 variações não sinônimas, sendo 924
ainda não reportadas em bancos de dados (dbSNP, HAPMAP, 1000 genomas etc) e
12057 variações sinônimas, sendo 844 não reportadas. A razão entre mutações não
sinônimas/ sinônimas foi em média de 0,89. Após a triagem dos dados, com
enriquecimento das variações somáticas (após exclusão das SNV reportadas em
banco de dados), observamos uma taxa de variações não sinônimas/ sinônimas de
1,8, 2,3 e 1,6 para os pacientes 883, 249 e 834, respectivamente. A taxa de
transições/transversões foi de 2,4 e de 2,2 para as variações únicas de nucleotídeos
conhecidos (já reportados em banco de dados) e novos, respectivamente.
Dentre as mutações já sabidamente associadas às NMP encontramos JAK2 e
CALR. O paciente 719 apresentou JAK2 V617F e o paciente 883 apresentou CALR.
O resultado de JAK2 por WES confirmou os dados que já tínhamos do PCR alelo
específico (qualitativo) e do quantitativo (PCR-C). A carga alélica de JAK2 por WES
foi de 40% e de 52%, com uma taxa de cobertura de 77 e 27 leituras (reads), no
diagnóstico e na fase de leucemia aguda, respectivamente. Por PCR-C a carga
72
alélica estimada foi de 37% e 66%. A mutação em CALR encontrada foi a
p.K385fs*47, que é a mais frequente em TE. A frequência da carga alélica de CALR
por WES neste paciente mostrou variação de 44% para 29%, com 16 e 48x
cobertura, para a amostra de NMP e da leucemia aguda, respectivamente.
Mutações em alguns genes tais como TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, DNMT3A já
foram associados à NMP, principalmente à progressão leucêmica. Desta forma, já
havíamos escolhido os éxons acometidos com maior frequência por mutações (hot
spots) dos genes TET2, IDH1 e IDH2 para a busca de mutações, através de
sequenciamento direto utilizando o método de Sanger. Como discutido, quando
analisados por sequenciamento direto, não foram observadas mutações exônicas
nestes genes. O sequenciamento por WES confirmou e ampliou estes resultados,
mostrando ausência de mutações nos éxons analisados por sequenciamento direto
e nos outros éxons cobertos pelo WES, dos genes previamente estudados (TET2,
IDH1 e IDH2) e também nos genes ASXL1 e DNMT3A.
Entretanto, mutações nas diferentes isoformas dos genes TET3, ASXL2,
DNMT3B foram observadas.
Um gene recorrentemente mutado em 2/3 pacientes foi o TP53, no paciente
719, JAK2V617F positivo, que apresentou duas mutações em TP53, p.Tyr236Asp e
p.Arg267Trp, e o paciente 249 que apresentou a alteração p.Ser106fs (deleção de
1pb). A mutação p.Tyr236Asp é descrita no COSMIC (Catalog of Somatic Mutations
in Cancer) em 2/7 pacientes com neoplasias linfoides (B e T) e a mutação
p.Arg267Trp descrita em 1/30 amostras de leucemia linfoide aguda (LLA-B). Para a
posição 106, estão descritas somente quatro tipos de mutações, tendo sido
encontrada somente uma descrição com o mesmo tipo de mutação que
encontramos, e esta associada a câncer de esôfago.
Com relação à categoria de genes associados ao spliceossoma, encontramos
mutações no gene SF3B1 e nas isoformas de outros genes desta categoria, já
descritos em SMD e NMP, tais como os genes U2AF1L4 e SRSF3. Mutações em
SF3B1 foram descritas como fortemente associadas à presença de sideroblastos em
anel nos subtipos de SMD, ARSA (85%) e ARSA-t (87%). Nós encontramos a
mutação descrita como de maior frequência, p.Lys700Glu, no paciente #249. Ao
diagnóstico, este paciente apresentava trombocitose (plaquetas >450mil/mm³) e
anemia (hemoglobina < 12g/dL). A presença de sideroblastos em anel não pode ser
verificada porque a coloração de Perls na BMO não funcionou, muito provavelmente
73
devido ao efeito deletério do ácido no processo de descalcificação e o mielograma
do paciente não estava acessível para análise. De fato, a recomendação para
realização da técnica para evidenciar sideroblastos em anel é no material de
mielograma para que sejam evitados problemas, do tipo que nos deparamos,
decorrentes do pré-analíticos.
Com relação à descoberta de novas mutações que possam estar implicadas
na progressão da fase crônica de uma NMP para leucemia aguda, foram observadas
uma média de 16 mutações exônicas/paciente (13 SNV e 3 INDELS), que possuem
pelo menos 1,5X de aumento na amostra leucêmica, quando comparada à amostra
ao do diagnóstico de NMP. Se ampliarmos a análise para todos os clones que
aumentaram na progressão leucêmica, observamos uma média de 85 mutações
exônicas/paciente (69 SNV e 16 INDELS) e 13 mutações que foram estáveis entre o
diagnóstico e a progressão leucêmica (12 SNV e 1 INDEL).
A análise da evolução clonal mostrou que há dois clones que permanecem
em equilíbrio (frequência alélica estável), mesmo após a leucemogênese (figura
4.24). O clone dominante está presente em cerca de 70% do tumor e apresenta
mutações diretoras encontradas nas NMP associadas a mutações em JAK2, a
clássica V617F, e uma nova (p.Arg1063Cys) localizada no domínio cinase e
revelada pela primeira vez neste trabalho (figura 4.25). O outro clone ocupa o
restante dos 30% do tumor e carrega as mutações subclonais associadas a
leucemia aguda (figura 4.24). Neste clone temos um subclone que regride de
tamanho na leucemia aguda e que carrega a mutação em CALR, outro que se
prolifera e que apresenta mutações em TP53, MDM4 e MAPK15 (figura 4.25). O
paciente #719 apresenta uma evolução clonal convergente, pois na amostra ao
diagnóstico ele já apresentava uma mutação pontual em TP53 em 66% do tumor
que regrediu na progressão leucêmica, entretanto o outro subclone adquiriu uma
nova mutação em TP53.
74
Figura 26 Figura 4.24: Análise de clonalidade nos pacientes analisados por WES. A análise individual
dos pacientes mostrou o mesmo padrão clonal em todos eles, com um clone majoritário ocupando 70% do tumor e um clone minoritário ocupando o restante do tumor. Os clones também se apresentaram em equilíbrio ao longo da progressão da doença da fase crônica para fase aguda.
75
Figura 27 Figura 4.25: Análise individual da frequência alélica dos genes associados às NMP ao longo
da progressão da doença da fase crônica para fase aguda. Notar que as mutações presentes no clone majoritário são as mutações classicamente associadas às NMP. Na fase aguda, observamos dois pacientes com mutações em TP53 que são específicas desta fase. No paciente JAK2V617F, observamos uma mutação em TP53 desde a fase de NMP, mas o clone que contém esta mutação tem uma perda proliferativa na fase aguda. O paciente com ins 5pb em CALR não apresentou mutação em TP53.
76
Avaliando a possibilidade de existirem recorrências de genes mutados nos
três pacientes analisados, observamos que 28 genes apresentavam-se nesta
condição, sendo que 16 deles possuíam mutações exclusivas, que algumas vezes
apresentava-se como indel em um paciente e como SNV em outro; os outros 12
genes possuíam o mesmo tipo de mutação entre os pacientes. Apesar de termos
excluído as variantes reportadas em bancos de dados de SNPs e termos
confrontado nossos dados com 25 controles, a possibilidade de serem SNPs não
pode ser refutada, uma vez que não foi utilizado nenhum tecido não tumoral do
mesmo paciente para exclusão das variantes germinativas.
A análise de ontologia de genes baseando-se nos dados de anotações
funcionais mostrou que as mutações somáticas encontradas remetem para vias de
transcrição, regulação da transcrição e regulação do processo metabólico do RNA
(108 genes estão na via de RNA / 295 genes com mutações somáticas = 36%). A
análise somente com os genes associados ao mecanismo de progressão leucêmica
mostrou um agrupamento e recorrência de genes envolvidos na via de regulação da
transcrição e regulação de RNA. Estes genes eram praticamente todos pertencentes
à família dedo de zinco.
A figura 4.26 mostra um resumo integrativo dos resultados de aCGH e WES
dos três pacientes que progrediram para leucemia aguda.
Figura 28 Figura 4.26: Resumo dos resultados de análise genômica utilizando as técnicas de aCGH e
WES nos três pacientes com diagnóstico inicial de TE que progrediram para leucemia aguda. Em cada círculo estão representados os genes alterados que já possuem alguma associação com NMP. As interseções representam os achados recorrentes. O paciente 719 possui duas mutações pontuais em TP53 e o paciente 249 apresentou um indel em TP53 que ocasionou mudança na fase de leitura. Na amplificação do 2p e no círculo menor denominado del17 estão representados os genes situados na região alterada (número de cópias) que possuem associação previamente descrita com NMP.
77
4.4.3. Validação de alguns genes do WES numa coorte JAK2 negativa
Para validar alguns de nossos achados, escolhemos dentro do subgrupo de
estudo HUPE-HUAP os pacientes JAK2V617F negativos, com diagnóstico inicial de
TE, MF, NMP-U e SMD para validação dos resultados. Optamos para validação a
inclusão dos seguintes genes e éxons: CALR (éxon9), SF3B1 (éxons 14 e 15), TP53
(éxon 2 a 8) e MAPK15/ERK8 (éxon 11 e 12).
Para CALR estudamos 66 pacientes JAK2V617F negativos e os resultados
mostraram que 46% dos pacientes possuem alterações do tipo INDEL em CALR e
54% possuem o alelo na sua versão selvagem (figura 4.27).
Figura 29 Figura 4.27: Distribuição das mutações em CALR em um subgrupo de pacientes
JAK2V617F negativos proveniente de 2 centros (HUPE e HUAP). wt- wild type (selvagem).
Nesta validação inicial conseguimos cobrir, do total de pacientes JAK2V617F
negativos, 70% das TE, 35% das MF, 88% das NMP-U e 44% das SMD presentes
em nosso subgrupo de estudo HUPE-HUAP com 332 pacientes.
Em TE observamos que 62% dos pacientes JAK2V617F negativos
apresentaram indels em CALR, sendo a inserção de 5pb (p.K385fs*47) a mais
frequente. Em MF, observamos indels em CALR em 67% dos pacientes, que neste
caso apresentou deleção de 52pb (p.L367fs*46) como a mais frequente. Nos casos
de NMP-U observamos somente 23% dos pacientes portadores de indels, sendo
neste caso a mais recorrente a inserção de 5pb. Em SMD não conseguimos detectar
indels em CALR (figura 4.28).
78
Figura 30 Figura 4.28: Distribuição das mutações em CALR de acordo com as categorias clínicas
analisadas. Em TE, a ins5pb e a del52pb estão presentes em 41% e em 21% dos pacientes, respectivamente. Em MF, a ins5pb e a del52pb estão presentes em 17% e 50% dos pacientes. Em NMP-U observamos 18% e 5% das mutações sendo ins5pb e del34pb, respectivamente. TE-trombocitemia essencial; MF – mielofibrose; NMP-U – neoplasia mieloproliferativa crônica não classificável; SMD – síndrome mielodisplásica; wt – wild type (selvagem).
Adicionalmente foram avaliados quatro pacientes JAK2V617F positivos que
serviram como controles negativos para mutações no éxon 9 de CALR. Os
resultados destes quatro pacientes confirmaram os achados de outros grupos
publicados previamente em que as mutações em JAK2V617F e CALR são
excludentes. Esses quatro pacientes testados possuem o diagnóstico de TE e MF.
O segundo gene testado foi SF3B1, que está mutado em 86% dos casos de
ARSA e ARSA-t e somente 2% dos casos de TE e MF. Os éxons 14 e 15 deste gene
foram avaliados em 51 pacientes, todos apresentando a versão selvagem do alelo.
Alterações no gene TP53 têm alta prevalência no câncer, e também na
leucemia mielóide aguda secundária. É de se notar que, na comparação dos genes
candidatos encontrados neste trabalho, associados a progressão para leucemia
aguda, com os genes encontrados em outros trabalhos que utilizaram técnicas de
sequenciamento massivo paralelo em NMP, este foi o único gene recorrente. Nesta
parte do trabalho quando analisamos os éxons 2 a 8, por sequenciamento direto,
observamos 3/45 (7%) pacientes portadores de mutações em TP53. As mutações
encontradas foram: p.Trp146*, p.Cys242Gly, p.Arg273Cys. Na posição 242
encontramos a mutação p.Cys242Gly reportada previamente, no COSMIC, em
casos de neoplasias hematológicas de origem linfóide e em cânceres de origem não
79
hematológica. O paciente da nossa coorte, portador deste tipo de mutação,
apresentava o diagnostico de TE. A mutação p.Arg273Cys também foi observada
em um paciente com diagnóstico de TE, e este tipo de mutação tem sido
classicamente associada a Síndrome de Li Fraumeni. No banco de dados COSMIC,
a mutação p.Arg273Cys tem 477 ocorrências, sendo 23 relatadas em tecidos
hematopoéticos. Há 40 descrições da mutação p.Trp146* (c.437G>A) no COSMIC,
sendo que 5 dessas mutações foram observadas em amostras de tecido
hematopoético. Neste trabalho, o paciente portador desta mutação foi diagnosticado
com MF.
Para os éxons 11 e 12 de MAPK15/ERK8 triamos 49 pacientes, sendo que 40
(82%) deles portavam o alelo selvagem e 9 (18%) o alelo variante (p.Pro358Leu,
p.Gly385Asp, p.Ala373Pro, p.Leu424Pro). Dos que portavam o alelo selvagem em
MAPK15, 17 possuíam indels em CALR e dois apresentaram mutação em MPL. Dos
pacientes que apresentaram variações em MAPK15 (p.Pro358Leu, p.Gly385Asp), 5
possuíam indels em CALR (p.L367fs*46, p.K368fs*51, p.K385fs*47). As variações
encontradas em MAPK15, em geral foram muito recorrentes, sugerindo tratarem- se
de polimorfismos. A variação mais frequente neste gene a p.Pro358Leu, possui uma
frequência de 5% reportada no projeto 1000genomas, e foi encontrada em 4/49
(8%) dos pacientes (3 TE e 1 MF) deste estudo. A variação p.Gly385Asp foi
observada em 2/49 (4%) pacientes (1 TE e 1 NMP-U) e é reportada no banco de
dados 1000genomas em frequência de 1% dos indivíduos. A variação p.Ala373Pro
foi observada em 1/49 (2%) pacientes e no 1000 genomas em 5% das 1088 pessoas
estudadas. A variação p.Leu424Pro foi observada em 1/49 pacientes (NMP-U) neste
estudo e com frequência de 3% no 1000genomas, sugerindo que esta variação
também seja um polimorfismo. Esta variação também foi observada no paciente
#249 no estudo de WES. No início desse estudo, os dados do 1000genomas ainda
não estavam disponíveis para consulta.
Os três pacientes com mutações em MPL não apresentaram mutações
adicionais em nenhum dos éxons dos genes estudados.
80
5. Discussão
5.1. JAK2
A análise da frequência da mutação V617F em JAK2 e da sua carga alélica
frente ao tratamento, bem como a descoberta de biomarcadores que possam servir
como marcador de diagnóstico e monitoramento da resposta terapêutica em NMP
têm sido alvo de estudo durante anos. De forma semelhante, nosso estudo visou
comparar a nossa coorte com os resultados já descritos na literatura e aprofundar o
estudo em alguns aspectos ainda não completamente elucidados, como a
investigação sobre alguns dos mecanismos responsáveis pela progressão da fase
crônica para a fase aguda (leucemia) em NMP.
Dessa forma, este trabalho implementou e aprimorou no laboratório algumas
das metodologias de diagnóstico em NMP e estabeleceu alguns exames que não
estavam disponíveis anteriormente a este trabalho. Como exemplo, temos os
ensaios de detecção de mutações em MPL, éxon 12 e 14 de JAK2, CALR, IDH1/2,
TET2, em que alguns deles já estão incluídos na rotina diagnóstica. A quantificação
da carga alélica de JAK2V617F foi aprimorada e validada por outras metodologias e
permitiu a análise da flutuação da carga alélica frente ao tratamento com hidroxiureia
durante o acompanhamento de pacientes JAK2V617F, que culminou em dois
trabalhos de colaboração. O estudo da progressão leucêmica usando tecnologias
genômicas de alta resolução é pioneiro e trouxe novas informações sobre o
entendimento da heterogeneidade clonal em NMP.
A avaliação da frequência de JAK2 na coorte de estudo mostrou resultados
semelhantes à literatura, em que a frequência da mutação JAK2V617F em PV é
acima de 95%, em TE cerca de 50% e em MF por volta de 60%. Em nosso subgrupo
de estudo, tivemos em PV 92% dos pacientes portando a mutação JAK2V617F, em
TE 46% e em MF 48%. Na literatura, para PV, é demonstrado que praticamente
todos os pacientes possuem mutações em JAK2, seja no éxon 12 ou 14. Em nosso
subgrupo não encontramos pacientes portadores de mutações em JAK2 que não
fossem a p.Val617Phe. Nestes casos, além de uma revisão criteriosa da biópsia de
medula óssea, também é recomendada a dosagem de eritropoietina (TEFFERI,
2013a). Entretanto, este exame laboratorial raramente é realizado nos hospitais que
nos enviaram as amostras e por isso vários pacientes não possuem este dado
laboratorial em seus prontuários. Além disso, utilizamos o sequenciamento direto
81
pelo método de Sanger modificado para detecção das mutações no éxon 12 de
JAK2. Dessa forma, é possível que a sensibilidade do ensaio por nós realizado não
seja suficiente para detectar mutações no éxon 12 em todos os pacientes. Relatos
na literatura mostraram uma maior prevalência de mutações no éxon 12 de JAK2
quando o ensaio é realizado especificamente no DNA extraído da linhagem
eritrocítica e por isso a extração de DNA de colônias eritróides seria mais
recomendado do que a utilização de granulócitos (CAZZOLA, 2007).
Através da dosagem da carga alélica de JAK2V617F foram evidenciadas
algumas associações descritas na literatura, tais como: a) maior homozigosidade em
PV; b) cargas alélicas abaixo de 50% em TE; c) PV é mais frequente em homens e
TE em mulheres; d) os pacientes com carga alélica mais alta possuem maior
tendência a apresentar eventos trombóticos; e) os pacientes com TE e com carga
alélica mais alta (>50%) geralmente apresentam níveis de hematócrito,
hemoglobina, leucócitos e neutrófilos mais altos e número de plaquetas mais baixo
do que os pacientes que apresentam o alelo em heterozigose (CAMPBELL et al.,
2005; CAMPBELL, 2006; BAROSI et al., 2007b; VANNUCCHI et al., 2007c;
ANTONIOLI et al., 2008;).
Em vista desses dados, foi possível comparar nosso subgrupo de estudo com
alguns já descritos na literatura. Em geral, os nossos resultados estão em
conformidade com os descritos na literatura. Por exemplo, observamos que a
maioria dos pacientes com PV apresentou carga alélica da mutação V617F acima
dos 50% e hematócrito mais alto em relação aos pacientes com carga alélica abaixo
dos 50%. O número de plaquetas costuma ser mais baixo nos pacientes com PV
com carga alélica acima de 50% do que aqueles com carga alélica abaixo dos 50%.
Nesse sentido, nosso resultado foi controverso, mas há relatos na literatura de que
pacientes com PV podem cursar com trombocitose e ter um maior risco de eventos
trombóticos (OHYASHIKI et al., 2007). De fato, os eventos trombóticos foram o
segundo evento adverso mais frequente em PV. Desta forma, estes dados podem
sugerir que tenhamos um subgrupo de pacientes que cursam com trombocitose,
sendo interessante estendermos as nossas análises. Outro dado em contradição
com a literatura foi a observação da PV sendo mais frequente em mulheres do que
em homens.
Em TE observamos um maior número de pacientes com carga alélica da
mutação abaixo dos 50%, e em nossa coorte os pacientes mais velhos
82
apresentaram carga alélica mais alta. Além disso, a TE também se apresentou mais
frequente em mulheres do que em homens, reforçando os dados publicados
previamente por outros grupos (ANTONIOLI et al., 2005, 2008; CAMPBELL et al.,
2005).
Com relação à flutuação da carga alélica ao longo do acompanhamento,
nossos resultados foram semelhantes à literatura com relação a uma maior
diminuição da carga alélica na primeira administração da hidroxiureia após o
diagnóstico. Já a manutenção da hidroxiureia ao longo do tratamento resultou em
variações mais sutis da carga alélica. Nosso grupo foi o primeiro a demonstrar que
as maiores variações parecem estar nos pacientes com carga alélica entre o 2º e 3°
quartis (ZALCBERG et al., 2011).
A frequência de mutações em MPL na nossa coorte também foi semelhante à
literatura, com frequência de 7% em TE.
5.2. CALR
Em dezembro de 2013 foi descrito pela primeira vez, que pacientes
JAK2V617F negativos podem apresentar Indels na CALR em cerca de 67-82% dos
pacientes com TE, 80-88% dos pacientes com MF e 12,5% em ARSA-t (KLAMPFL
et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a) o que demonstra a importância que a
detecção molecular destas alterações terão no auxílio ao diagnóstico das NMP. Este
novo marcador recentemente descrito nos levou a avaliar em nossa coorte
JAK2V617F negativa a frequência dessas alterações, para que pudéssemos
correlacionar o seu impacto no prognóstico e na caracterização genética desses
pacientes.
A nossa análise inicial no subgrupo de estudo mostrou a inserção de 5pb
(p.K385fs*47) em 62% das TE, e a deleção de 52pb (p.L367fs*46) em 67% das MF,
o que foi semelhante aos resultados relatados nos estudos que descreveram este
novo marcador (KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013b). Neste subgrupo de
validação, resolvemos avaliar as NMP-U por ser um grupo de difícil diagnóstico e no
qual a caracterização da mutação poderá ajudar na decisão clínica quanto ao
diagnóstico final. Assim, foi possível observar que 23% dos casos de NMP-U eram
portadores de indels em CALR, sendo a inserção de 5pb a mais recorrente. Este
dado será importante numa possível correlação desta mutação com o fenótipo
destes pacientes, principalmente naquelas entidades clínicas que apresentam a
trombocitose como manifestação clínica, tais como a TE, a MFS à TE, e a ARSA-t.
83
Por exemplo, em um dos pacientes com NMP-U detectamos a presença de uma
deleção de 34pb (p.K368fs*51) que foi observada anteriormente em casos de TE e
MF primária (NANGALIA et al., 2013a) mostrando, dessa forma, a importância do
rastreamento molecular de mutações para o direcionamento do diagnóstico clínico.
Apesar da literatura relatar uma baixa frequência de indels em CALR em
SMD, em nossa pesquisa inicial não detectamos indels em CALR.
Um fato curioso são os baixos relatos de INDELS em CALR em pacientes
com progressão da doença tanto para MFS quanto para LA (KLAMPFL et al., 2013),
diferentemente do que observamos em nossa coorte na qual tivemos um paciente
com TE que progrediu para LA. A identificação de mutações em genes na LA com
frequência superior à fase crônica sugere a relação desses genes com o processo
de progressão leucêmica. Desta forma, a análise adicional desses genes deve ser
realizada para avaliar a importância destes como marcadores prognósticos.
Do ponto de vista celular, a calreticulina é uma proteína imunogênica
fortemente associada a sinais de apoptose da célula neoplásica, induzindo a
fagocitose mediada por células dendríticas (GARDAI et al., 2005; TESNIERE et al.,
2007; ZITVOGEL et al., 2008; KEPP et al., 2009; CHAO et al., 2010). Entretanto, os
resultados dos estudos funcionais com células COS-7 transfectadas com a proteína
CALR mutante mostraram que a CALR permanece no RE (NANGALIA et al., 2013a).
Células tumorais tratadas com antraciclinas ou radiação induzem a expressão de
CALR na superfície, como sinal de morte. Seria interessante observar se a proteína
mutada possui esta função preservada após o tratamento com antracilinas, o que
poderia torná-la um alvo terapêutico.
A deleção do domínio KDEL em 21 proteínas de localização no RE resultou
na secreção/ exposição na superfície de somente três destas, demonstrando que
outros mecanismos são necessários para causar distúrbios na localização celular de
proteínas que apresentam este peptídeo de localização. Proteínas como CALR e
CALR3 podem formar complexos que fazem com que elas permaneçam no RE,
mesmo com a perda do domínio KDEL c-terminal. A deleção do domínio KDEL em
CALR3 não afetou a localização no RE, indicando que este domínio não é
determinante para o sinal de localização desta proteína (RAYKHEL et al., 2007). O
paciente que apresentou a inserção de 5pb também apresentou uma mutação
pontual em CALR3. Investigar o efeito da interação entre essas duas proteínas
84
mutantes pode ser interessante na busca de um entendimento mais profundo da
biologia da doença.
Estudos in vitro com células Ba/F3 transduzidas com a mutação mais
frequente de CALR (del 52pb), mostraram ativação de STAT5 e crescimento
independente de IL3 (KLAMPFL et al., 2013). Estes resultados mostram que a via
JAK2-STAT5, que sabidamente está ativada nos pacientes JAK2V617F positivos,
parece ser uma via de ativação comum dos pacientes com NMP independente da
mutação encontrada (LAUBACH et al., 2009; OKU et al., 2010).
5.3. Progressão leucêmica
As progressões de NMPs para as leucemias são eventos raros e ocorrem em
cerca de 5-7% dos casos (ABDULKARIM et al., 2009). A evolução mais comum é
uma transição de TE e PV para MF secundária e, a partir da MF, a evolução para
leucemia aguda. Semelhante aos dados descritos na literatura, observamos em
nosso grupo de estudo uma frequência de progressão para LA de 7%.
Há relatos na literatura sobre a presença de anormalidades citogenéticas na
fase de NMP, sendo detectada de 5-15% em TE, 15-35% em PV e 44-50% em MF
(TEFFERI et al., 2001; STEENSMA; TEFFERI, 2002; GANGAT et al., 2008, 2009;
TEFFERI et al., 2009). Em nosso estudo, foi observada uma maior complexidade
citogenética na fase de leucemia aguda, com um aumento do número e da
amplitude das anormalidades, o que demonstra a severidade da progressão
leucêmica. Vale ressaltar que um dos pacientes apresentou, desde a amostra ao
diagnóstico, muitas alterações em diversos cromossomos, e mesmo na fase de
leucemia aguda este paciente apresentou aumento das regiões alteradas, com
aquisição da +2p e del5q. O número de regiões alteradas não superou o número de
anormalidades cromossômicas ao diagnóstico, mas o tamanho das novas alterações
adquiridas foi, em geral, maior.
Diferentemente dos casos já descritos na literatura, não observamos
mutações no éxon 4 dos genes IDH1 e 2, já amplamente associadas à leucemia
aguda, e também não observamos as alterações citogenéticas recorrentes tais como
del(20q), del(13q), que possuem prognóstico mais favorável (DINGLI et al., 2006),
+8, +9, e anormalidades nos cromossomas 1 e 7 (BENCH et al., 1998; NAJFELD et
al., 2002).
Encontramos recorrência nas alterações de +2p e del5q. A +2p possui raras
descrições prévias na literatura (BRECQUEVILLE et al., 2013; GANGAT et al.,
85
2009), mas a del 5q é bastante recorrente (SANTANA-DAVILA et al., 2008a, 2008b;
GANGAT et al., 2009; THOENNISSEN et al., 2010; MILOSEVIC et al., 2012;
BRECQUEVILLE et al., 2013), principalmente na SMD, onde constitui uma entidade
clínica distinta e de bom prognóstico (GIAGOUNIDIS et al., 2004; LEHMANN et al.,
2007; EBERT, 2009;).
As características da síndrome do 5q, como a doença é conhecida, são
anemia macrocítica, número de plaquetas normal ou elevado, micromegacariócitos
hipolobados, contagem de neutrófilos normal ou discretamente diminuída, e um
baixo índice de progressão para leucemia aguda (GIAGOUNIDIS et al., 2004;
EBERT, 2009, 2011;). A região comum minimamente deletada do 5q possui mais de
40 genes, com vários genes supressores de tumor inclusos. Nesta região há duas
deleções mais comuns, uma mais proximal e outra mais distal. A proximal está na
região q31 e inclui genes como EGFR1 e a distal, q33, onde estão genes como
RPS14, que causa o bloqueio da diferenciação eritróide e, como consequência, o
desenvolvimento de anemia macrocítica. O gene RPS14 codifica a subunidade
ribossomal 40S (EBERT et al., 2008).
Outro alvo importante desta região são os microRNAs, miR145 e miR146a,
que, após o knockdown, foram apontados como responsáveis pelo fenótipo de
megacariócitos hipolobados e trombocitose periférica em camundongos. Em
humanos foi observada a baixa expressão desses dois miRNAs em pacientes com
SMD (STARCZYNOWSKI et al., 2009). Os pacientes que analisamos apresentaram
anemia durante a progressão leucêmica, mas não podemos afirmar que era
macrocítica por falta de uma descrição detalhada do hemograma. A BMO dos
pacientes ressalta o aumento de megacariócitos, mas não descreve com maior
riqueza de detalhes a morfologia dessas células. Outro fato interessante é o próprio
prognóstico dos pacientes que apresentaram a del5q na progressão leucêmica. Na
SMD, a del 5q é tida como fator de bom prognóstico e de menor risco de progressão
para leucemia aguda. Nesta síndrome, no entanto, a del5q é encontrada isolada,
fato que não observamos em nossos pacientes. A presença de outras alterações
cromossômicas junto com a del5q parece modificar o prognóstico e o fenótipo da
doença, que neste caso se mostra muito mais agressiva.
A análise de agrupamento de genes na região deletada do cromossoma 5q
mostrou 9 genes deletados envolvidos na via de JAK-STAT (IL4, CSF2, TSLP, IL3,
IL5, IL9, IL13, IL12B, SPRY4) e 4 desses genes também envolvidos na fisiologia
86
hematopoética (CSF2, IL3, IL4, IL5). Alguns estudos apontam o papel que a
modulação de citocinas em tumores sólidos pode desempenhar no recrutamento de
linfócitos, gerando um microambiente tumoral que pode ser importante no controle
da proliferação tumoral (FINN, 2008). No caso de tumores líquidos como as NMP,
essa modulação pode estar ocorrendo diretamente no plasma, gerando um efeito
sistêmico ou ainda no microambiente da medula óssea. A variação no número de
cópias dos genes de citocinas e de receptores de citocinas em câncer colorretal
mostrou que a diminuição de expressão de IL15 e de genes de citocinas agrupados
no cromossoma 4 modula a quantidade de linfócitos T e B infiltrantes e, como
conseqüência, há uma maior proliferação tumoral e maior risco de recorrência e
metástase (MLECNIK et al., 2014). O impacto das deleções que descrevemos neste
trabalho ainda devem ser avaliadas sob o ponto de vista tanto da função na
maturação da célula mutada, quanto nas interações com outras populações
celulares.
Vários genes de citocinas estão localizados nos cromossomas 1, 5 e 9 e já é
sabida a existência de vários pacientes com NMP com alteração do número de
cópias nos cromossomas 5 e 9. Desta forma, estes resultados sugerem um papel
potencial das citocinas nestas doenças, aspecto ainda pouco explorado. De fato, o
tratamento de pacientes refratários ao uso de hidroxiureia com interferon alfa tem-se
mostrado eficaz (HASSELBALCH et al., 2014). Os dados do tratamento de pacientes
com ruxolitinib, que inibe JAK1 e JAK2, mostrou a diminuição do nível sérico de
várias citocinas pró-inflamatórias tais como a proteína C reativa (VERSTOVSEK et
al., 2010).
A região amplificada do cromossoma 2p nos pacientes analisados mostrou
ganho em genes da maquinaria de controle epigenético, tais como DNMT3A,
ASXL2, DPY30, o que pode representar um aumento no padrão de metilação global
do DNA caso esses genes estejam funcionando de forma exacerbada devido a uma
desregulação estequiométrica. De fato, mutações em genes da maquinaria
epigenética já foram associados à fase crônica de NMP (VANNUCCHI; BIAMONTE,
2011) e com frequência aumentada na fase aguda ou blástica (TEFFERI; NOEL;
HANSON, 2011). Desta forma, seria interessante aprofundar o estudo nesta região,
utilizando um maior numero de casos, a fim de observar a frequência da del2p e
tentar associar esta deleção com a progressão da doença.
87
A perda do padrão de metilação com a consequente hipermetilação global do
genoma é um fenômeno amplamente associado ao processo de carcinogênese
(SHEN; LAIRD, 2013). O padrão de metilação aberrante foi observado na leucemia
aguda promielocítica, mas não parece ser o evento chave, tendo um papel
secundário na leucemia aguda secundária (SCHOOFS et al., 2013). A desregulação
da expressão de genes através da alteração dos mecanismos epigenéticos da célula
foi observada como um dos principais processos patogênicos na SMD e na LMA
secundária, mas que ainda não é bem entendido. Sabe-se que há mutações em
diversos genes que regulam a maquinaria epigenética, tais como TET2, IDH1/2,
EZH2, DNMT3A, e que essas mutações estão pouco associadas às neoplasias
linfoproliferativas (VOSO et al., 2013).
Em NMP, um estudo com 35 amostras de fase crônica, TE e PV, não mostrou
padrão de metilação aberrante ou diferencial entre as doenças estudadas. Desta
forma, a alteração no padrão de metilação não parece ser um evento essencial na
fase crônica das NMP clássicas (BARRIO et al., 2011). Entretanto, diversos estudos
tentaram mostrar que reguladores negativos da via JAK-STAT poderiam estar
silenciados através de metilação do gene, alterando, portanto a sua expressão
(JOST et al., 2007; FOUROUCLAS et al., 2008).
No caso da transformação leucêmica dos pacientes que estudamos, uma
investigação adicional será necessária para obtermos dados sobre o padrão de
metilação desses pacientes. Dessa forma poderemos saber se a evolução para
leucemia aguda está induzindo algum padrão aberrante de metilação e se este
padrão está presente desde a fase crônica ou se seria um evento específico da
progressão leucêmica. Em geral, as alterações encontradas em reguladores
epigenéticos sugerem perda de função, como no caso de DNMT3A na leucemia
aguda (LEY et al., 2010). No nosso caso, estas alterações, diferente do esperado,
tiveram como consequência um aparente aumento de função. De forma adicional,
não foram encontradas mutações nos genes da maquinaria de metilação
classicamente associados às NMP, somente nas suas isoformas. Faz-se, portanto,
necessário um estudo funcional destas alterações novas a fim de que seja possível
um melhor entendimento do papel destas mutações na patogênese da doença.
Mutações em genes de maquinaria de splicing também já foram reportadas
em NMP (BRECQUEVILLE et al., 2012), e na leucemia aguda (MAKISHIMA et al.,
2012), mas estas mutações são mais frequentes na SMD ou na leucemia linfocítica
88
crônica (LLC) (GRAUBERT et al., 2011; PAPAEMMANUIL et al., 2011; QUESADA et
al., 2011; WANG et al., 2011; LANDAU et al., 2013). O gene mais recorrentemente
mutado é o SF3B1 que compõe a subunidade U2 da maquinaria de splicing, mas há
outros genes como o U2AF1 que também estão largamente associados à SMD.
Nos casos que estudamos, encontramos a mutação mais frequentemente
reportada em SF3B1, a p.Lys700Glu, que está fortemente associada à ARSA (85%)
e ARSA-t (87%). A descoberta da mutação em SF3B1 conjuntamente com os dados
clínicos que mostraram trombocitose e anemia ao diagnóstico no paciente que
estudamos, são fortes indícios de que o diagnóstico final deste paciente
provavelmente seja uma anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitose
(ARSA-t). Infelizmente não conseguimos ter acesso ao mielograma para realizarmos
a coloração de Perls a fim de evidenciar os depósitos de ferro nos eritrócitos.
Tivemos acesso aos blocos da BMO, mas a coloração não funcionou, muito
provavelmente devido ao efeito deletério do ácido na descalcificação (THAM;
COUSAR, 1993; STUART-SMITH, 2005). Este caso ilustra o impacto da
investigação de lesões moleculares e mutações na determinação do diagnóstico
hematológico correto, especialmente para entidades complexas em que pode haver
diagnósticos imprecisos.
A análise de clonalidade mostrou que a mutação em SF3B1 está presente no
subclone majoritário e que praticamente não há flutuação de carga alélica entre a
fase crônica e aguda. De fato, resultados recentes da literatura corroboram nossos
dados, mostrando que as mutações em SF3B1 são adquiridas desde o diagnóstico e
que a progressão da doença ocorre com a aquisição de mutações em outros genes
(LIN et al., 2014). Ao procurarmos mutações em SF3B1 nos pacientes que possuíam
evidências de trombocitose e anemia ao diagnóstico, não observamos nenhum outro
paciente portador de mutação neste gene. No trabalho de LIN et al. (2014), a
detecção de mutações em SF3B1 em dois pacientes só foi possível a partir da
clonagem do DNA amplificado dos mesmos. O grupo reportou a presença de
mutações em SF3B1 em 10% dos pacientes analisados com diagnóstico de SMD
(48/479), sendo 62% das mutações presentes em ARSA. Já o trabalho de WANG et
al. (2014) mostrou a presença de mutações em SF3B1 em 2/31 pacientes com PV.
A taxa de incidência da ARSA-t é baixa (e.g. 21 casos em 20 anos em
Duesseldorf) (WARDROP; STEENSMA, 2009), sendo que de 10 a 20% dos
pacientes com ARSA apresentam trombocitose. Tais dados demonstram a
89
dificuldade em se ter um bom diagnóstico e uma coorte de ARSA-t que possibilite a
descoberta de marcadores que melhor diferenciem ARSA-t da TE e da ARSA. O
caso que estudamos apresentou mutação em U2AF1L4, que também faz parte da
maquinaria de splicing, sugerindo que pacientes que apresentem fenótipo de doença
com características mais relacionadas à SMD parecem apresentar genes
relacionados à maquinaria de splicing mais frequentemente mutados.
Trinta e um a 76% dos pacientes com ARSA-t também podem apresentar
mutações em JAK2 (BOISSINOT, 2006; JEROMIN et al., 2013) e, em alguns casos
(13%), podem não apresentar mutação em SF3B1, mas apresentar somente a
mutação clássica em JAK2 (JEROMIN et al., 2013). No paciente que analisamos,
não foi detectada a mutação clássica de JAK2, mas observamos uma mutação não
reportada previamente, no domínio cinase de JAK2 (p.Arg1063Cys), que foi definida
como mutação pela análise in silico por ter um potencial efeito deletério na função
proteica.
Previamente, o domínio cinase de JAK2 foi estudado e foram observados
3/93 pacientes com diagnóstico de PV com mutações somáticas não sinônimas no
mesmo resíduo (p.Arg1063His), mas gerando uma modificação diferente da
alteração que encontramos (LEVINE et al., 2005). Recentemente foram descritas
duas mutações no domínio cinase de JAK2, p.Arg867Gln e p.Arg938Gln, ambas em
casos de trombocitose familiar. Estas mutações mostraram, em estudos funcionais
com células da linhagem Ba/F3-MPL, crescimento espontâneo e ativação de STAT1
(MARTY et al., 2014). No caso em que estudamos, não foi possível obter maiores
dados sobre os familiares do paciente, pois este declarou durante as anamneses
que não possuía contato com outros parentes além de seu filho, impossibilitando
uma análise mais aprofundada da nova mutação identificada com a hereditariedade.
Estudos funcionais que investiguem o efeito da mutação, bem como se há algum
efeito aditivo quando uma célula apresenta a mutação clássica em SF3B1 e a
mutação no domínio cinase de JAK2, contribuirão para um maior entendimento da
patogênese.
Buscando correlacionar a presença de genes mutados que pudessem
participar de vias de sinalização previamente descritas nas NMP, tais como JAK-
STAT, MAPK e PI3K, pudemos detectar pelo sequenciamento do exoma mutações
em MAPK15 em 3 pacientes. Uma das alterações encontradas foi prevista in silico
como tendo um efeito danoso. Após o início do nosso estudo de validação de
90
mutações nos éxons 11 e 12 de MAPK15 numa coorte de 49 pacientes JAK2V617F
negativos, os dados do projeto 1000 genomas para este gene se tornaram
disponíveis. Neste momento, pudemos comprovar que as duas mutações
observadas fora do domínio cinase pela técnica do WES eram polimorfismos e, de
fato, a previsão in silico era de um efeito benigno dessas alterações.
Apesar de MAPK15/ERK7/ERK8 ter sido a última molécula da família a ser
descrita (ABE et al., 2002), sua função já foi associada com o controle do ciclo
celular (GROEHLER; LANNIGAN, 2010; YANG et al., 2013), do fuso mitótico através
de ativação de proteínas que se ligam aos telômeros (CERONE et al., 2011),
ativação de ciclina D1(GROEHLER; LANNIGAN, 2010) e à transformação maligna
de linhagens de câncer de cólon (XU et al., 2010). O papel mais importante atribuído
a esta proteína foi na promoção da instabilidade genômica, e da proliferação celular,
tendo como resultado a transformação celular. Uma das funções atribuídas à
MAPK15 é interagir com PCNA, inibindo a ligação de HDM2 (GROEHLER;
LANNIGAN, 2010; NGUYEN; BIELINSKY, 2010). Mutações com perda de função em
ERK8 podem causar a degradação de PCNA através da sua poliubiquitinação
promovida por HDM2. A perda de função de PCNA no reparo do DNA causa
acúmulo de mutações e instabilidade genômica, o que pode resultar em
transformação celular. A ativação de ERK8 parece ser mediada pela quebra do DNA
em fita simples, recrutando-a para o reparo do DNA (KLEVERNIC; MARTIN;
COHEN, 2009).
Pouco se sabe sobre os reguladores da via que estão tanto a montante
quanto a jusante de ERK8. Sabe-se que ERK8 se autofosforila e não parece ter
reguladores a montante. Proteínas fosfateses parecem regular negativamente a
molécula (ABE et al., 2002; KLEVERNIC et al., 2006). Também já foi descrita uma
homologia proteica com ERK1/2/5 no motivo Thr-Glu-Tyr no loop de ativação
(KLEVERNIC et al., 2006). Além disso, sabe-se que em linhagens de câncer de
mama foi observada a perda de imunoreatividade à ERK8 e essa perda foi
correlacionada com a progressão tumoral, onde foi observada uma diminuição na
expressão de ERK8 sem que houvesse diminuição de ER1/2. Por isso tem-se
considerado a possibilidade de que ERK8 atue como um supressor tumoral
(HENRICH et al., 2003).
A presença de um mesmo perfil de sinalização que ativa a via JAK-STAT em
pacientes mutados para JAK2 e CALR sugere uma via comum de transformação
91
entre esses pacientes (RAMPAL et al., 2014). Assim, MAPK15 poderia estar
desempenhando um papel anterior a JAK2 na transformação neoplásica nas NMP.
Papel semelhante foi observado com TET2, que parece ser um evento anterior à
aquisição de mutações em JAK2 e a outras mutações associadas às NMP
(DELHOMMEAU et al., 2009).
O estudo de clonalidade sugere que a mutação em MAPK15 está presente no
mesmo clone de JAK2 e que a flutuação de carga alélica da fase crônica para a fase
aguda é praticamente imperceptível. Estudos visando agrupar as diferentes NMP de
acordo com as vias de sinalização ainda não conseguiram demonstrar uma
correlação clara entre a ativação de diferentes vias (STAT1, 3 e 5, AKT e PI3K), o
genótipo JAK2V617F mutado e o subtipo clínico de NMP (TEOFILI et al., 2007;
GRIMWADE et al., 2009; LAUBACH et al., 2009; MEYER et al., 2009; CHEN et al.,
2010; ANAND et al., 2011;). Um estudo recente utilizando arrays de expressão
mostrou expressão diferencial entre os pacientes mutados para JAK2, CALR e TET2
e doadores saudáveis. Para JAK2 também foi possível observar genes
diferencialmente expressos entre os pacientes com carga alélica de JAK2V617F
acima ou abaixo dos 50%. No entanto, os estudos de agrupamentos hierárquicos
não conseguiram agrupar de forma clara os diferentes subgrupos de NMP clássicas
de acordo com os perfis de expressão observados. PV foi o grupo mais homogêneo,
mas o resultado foi mais bem interpretado levando-se em consideração o efeito da
carga alélica em JAK2 acima de 50% que estes pacientes apresentam (RAMPAL et
al., 2014). Este fato reforça a heterogeneidade molecular observada entre os
subgrupos de NMP.
O primeiro artigo publicado em NMP utilizando técnicas genômicas de
sequenciamento de alta resolução tinha a proposta de sequenciamento de células
únicas (single cell) para estudo da heterogeneidade clonal. O grupo sequenciou as
células de um paciente com diagnóstico de TE, JAK2 negativo e que também não
apresentou mutações em outros genes classicamente associados às NMP tais como
TET2, MPL, ASXL1, CBL, IDH, e IKZF1 (HOU et al., 2012).
Quanto à heterogeneidade clonal, este trabalho sugeriu, através de
simulações de modelos matemáticos de evolução mono ou policlonal, a existência
de um único clone, com frequência alélica de mutações somáticas em torno de 50%,
resultado semelhante ao que observamos em nosso estudo de progressão
leucêmica. Eles também comentam que resultados sugerindo a presença de
92
somente um clone também podem ser encontrados quando um clone específico
possui uma vantagem seletiva maior que os demais, promovendo uma alta
proliferação deste clone majoritário. Por isso o grupo não descarta a possibilidade de
existir um subclone minoritário. Além disso, a análise de frequências alélicas de
mutações somáticas mostra um enriquecimento de mutações na frequência de 10 a
20% e um outro pico entre 50 e 60%. Este resultado de evolução clonal está
alinhado ao resultado que encontramos em nosso estudo de progressão leucêmica,
onde observamos a presença de um clone majoritário que compõe cerca de 70% do
tumor e um clone minoritário compondo 30%. O clone majoritário apresentou as
mutações que dirigem o tumor das NMP e o clone minoritário exibiu as mutações
mais fortemente associadas ao subclone leucêmico, como TP53. Ao final, o grupo
propõe uma lista de quatro genes (SESN2, ST13, DNAJC17 e TOP1MT)
considerados de interesse biológico para a patogênese da doença, mas nenhuma
validação destes genes foi realizada (HOU et al., 2012). Comparando esta lista de
genes com a lista dos genes que encontramos com aumento da frequência alélica
em pelo menos 1,5 vezes na amostra da fase aguda, não foi possível observar
correspondência, sugerindo que estes genes não participam na promoção da
leucemogênese.
O trabalho de BRECQUEVILLE et al. (2013) sequenciou 23 genes e analisou
por aCGH 80 pacientes com mielofibrose durante a fase crônica e a fase aguda com
progressão para mielofibrose secundária e para fase blástica. O estudo mostrou
alterações recorrentes, tais como del20q, del17 e del12p, que já haviam sido
descritas anteriormente. Os genes mais frequentemente mutados foram JAK2,
ASXL1, TET2, EXH2 e NF1. Os autores também enfatizaram que a análise global
dos resultados aponta para uma heterogeneidade genômica nos casos de MF,
apesar de algumas alterações recorrentes. Dentro desta diversidade apresentada,
pudemos observar semelhanças deste estudo aos resultados encontrados em nosso
trabalho, como um paciente apresentando ganho no 2p25.3p14, que foi a mesma
região recorrente nos dois pacientes que analisamos (+2p25.3p16.1 e
+2p25.1p13.3). O mais interessante nessas três amostras é a recorrência da região
de quebra. Este paciente que apresentou +2p também apresentou mutação em
TP53, e a ausência de del5q, bem como ausência da mutação clássica em JAK2.
Em nosso estudo, o paciente com +2p também apresentou o alelo selvagem de
93
JAK2, mas com perda monoalélica de TP53, sem mutação no alelo remanescente. A
comparação destes dados só reforça ainda mais o quanto as NMP são um grupo
bastante heterogêneo do ponto de vista genético.
O estudo de MERKER et al. (2013) se propôs a sequenciar o genoma
completo (WGS- whole genome sequencing) de um paciente com MF, que possuía o
alelo selvagem de JAK2, mas apresentava a mutação pTrp515Lys em MPL. Este
estudo mostrou 6 genes candidatos que apresentaram mutações e expressão
diferencial após análise de WGS e RNAseq. A validação dos 6 genes em uma coorte
de 178 pacientes com NMP (PV, TE e MF) não mostrou recorrência de mutação em
nenhum dos genes analisados. A comparação desses 6 genes candidatos com a
nossa lista de genes candidatos também não apontou nenhuma recorrência.
O trabalho de LUNDBERG et al. (2014) sequenciou 104 genes em uma coorte
de 197 pacientes com NMP. Os resultados mostraram que não houve aumento
expressivo de genes mutados entre as amostras do diagnóstico e do
acompanhamento dos pacientes analisados e que as mutações somáticas em TP53
com perda de heterozigosidade estavam fortemente associadas à transformação
leucêmica. Essas mutações em TP53 foram observadas desde a fase inicial da
doença e permaneceram com frequência alélica baixa até o momento da perda de
heterozigosidade, quando o clone leucêmico se expandiu rapidamente. Dos genes
selecionados neste trabalho, 3 foram recorrentes nas nossas análises (JAK2, TP53 e
GDF15).
Mutações em TP53 têm sido associadas à progressão leucêmica em cerca de
30% dos casos, mas a maioria das descrições mostrou associação das mutações
em TP53 com pacientes que também continham a mutação clássica em JAK2
(HARUTYUNYAN et al., 2011; TEFFERI, 2013b). ZHANG et al. (2012) mostrou
mutações em TP53 em 6/17 pacientes com NMP, sendo que somente um paciente
era positivo para JAK2V617F e também apresentava mutação em SRSF2. Dois
pacientes tinham co-ocorrência de mutações em SRSF2, e três com mutações
concomitantes em TET2 e TP53. No estudo de BRECQUEVILLE et al.(2013)
também foi observada a presença de 2 casos com mutação em TP53 em pacientes
com MF JAK2 positivos e 2 casos de fase blástica de MF secundária à TE com JAK2
WT (BRECQUEVILLE et al., 2013). Em nosso trabalho, observamos por WES
mutações em TP53 no paciente com diagnóstico de RARS-t e TE-JAK2V617F
positivo, sendo que o paciente TE apresentou um caso interessante com duas
94
mutações em TP53 com diferentes frequências alélicas. Uma delas presente na fase
crônica, com redução do clone na fase aguda, e a outra mutação específica da fase
aguda. Um caso semelhante foi observado num paciente com leucemia linfocítica
crônica (LLC) que apresentou del11q13 e mutações em SF3B1 (p.Gly742Asp) e
DDX3X (p.Glu196fs) no clone anterior ao tratamento quimioterápico. Após a terapia,
o clone não apresentava níveis detectáveis, o que poderia representar uma
subclonalidade. Entretanto, na recaída o paciente reapresentou um novo subclone
com del11q13 e outras mutações em SF3B1 (p.Lys700Glu) e DDX3X (p.Leu21fs)
(OJHA et al., 2013). No estudo de validação de mutações em TP53 em nossa coorte
mostramos a ocorrência de mutações em TP53 em 3/45 (7%) pacientes JAK2V617F
negativos. Devido à ampla associação de alterações em TP53 com os mecanismos
neoplásicos e a recorrência de mutações TP53 em NMP, principalmente em casos
que sofrem progressão da fase crônica para fase aguda, tem-se sugerido cada vez
mais a utilização da caracterização de mutações neste gene como um marcador de
prognóstico ruim para as NMP (TEFFERI, 2013b; LUNDBERG et al., 2014; WANG et
al., 2014)
A comparação da lista dos nossos genes candidatos com a lista de genes dos
trabalhos de sequenciamento do exoma que evidenciaram as mutações em CALR
(KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a) mostrou que 26 genes estavam
mutados em nosso trabalho e em pelo menos mais um e por isso sugerimos que
estes genes podem ser importantes no processo de leucemogênese. Devido a esses
achados, planejamos a validação futura desses genes em nossa coorte de pacientes
com NMP clássicas.
A análise detalhada da lista de genes candidatos gerada por este trabalho
mostra três recorrências em genes “drivers” ou diretores (genes envolvidos em vias
celulares fundamentais para a sobrevivência da célula tumoral) descritos por
VOGELSTEIN et al. (2013) em câncer: MLL3, TP53 e JAK2. As alterações
recorrentes em JAK2 e P53 foram as únicas encontradas neste trabalho que foram
também evidenciadas como alterações recorrentes no trabalho de NANGALIA et al.
(2013). Comparando nossos achados com os de KLAMPFL et al. (2013), três genes
recorrentes foram evidenciados (MYBPC1, KIF12, C10orf71). Quando a comparação
deste trabalho foi feita contra os genes descritos por LUNDBERG et al., (2014),
foram encontrados dois genes recorrentes: JAK2 e TP53. O resultado da
comparação dos genes encontrados neste trabalho contra os trabalhos até hoje
95
disponíveis apontam três genes, JAK2, TP53 e C10orf71, em comum e participantes
da progressão leucemogênica. Estes genes foram encontrados em pelo menos dois
trabalhos além do nosso.
96
6. Conclusão
A análise integral dos resultados nos permitiu concluir que:
1) A frequência da distribuição da mutação JAK2V617F nas neoplasias
mieloides clássicas, BCR-ABL negativas, da classificação da OMS/WHO, foi
de 92% em pacientes com PV, 46% e 48% em pacientes com TE e MF
respectivamente. Na TE e na MF, pacientes JAK2V617F positivos
apresentaram maiores chances de ocorrência de eventos adversos quando
comparados aqueles JAK2V617F negativos.
2) A carga alélica de pacientes com TE é mais baixa do que a de pacientes com
PV (p= 0,0002) e MF (p= 0,0090). A quantificação do clone mutado realizada
PCR-C ou QPCR forneceu informação complementar sobre o papel do
tamanho clone, características clínicas e parâmetros hematológicos.
3) A redução da carga alélica de JAK2V617F, durante o tratamento com HU, é
mais evidente no inicio do tratamento, sendo pouco relevante ao longo da
utilização da droga. O uso do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib) não impacta a
carga alélica, apesar da melhoria dos sintomas clínicos.
4) A incorporação de mutações somáticas recém descritas (JAK2, CALR, MPL)
em algoritmos de análise para as NMP permitiu definir, até o presente
momento, 73% e 61% dos casos de TE e MF, respectivamente, apesar da
análise de mutações em CALR nos pacientes JAK2V617F negativos ainda
não ter sido concluída. Mutações no gene CALR foram encontradas
respectivamente em 62% e 67% de pacientes com TE e MF negativos para
JAK2V617F analisados.
5) As técnicas de alta resolução genômica evidenciaram a heterogeneidade
molecular nos casos analisados e permitiram identificar lesões moleculares e
mutações nas amostras analisadas.
6) As alterações cromossômicas +2p e del (5q) foram específicas das amostras
de fase aguda, mostrando-se preferencialmente associadas à transformação
leucêmica. Análises destas regiões revelaram a presença de genes
envolvidos na regulação epigenética (DNMT3A, ASXL2 e DPY30) e em genes
das vias de proliferação e diferenciação hematopoética (CSF2, TSLP, IL3,
IL5, IL4, IL9, IL13, IL12B, SPRY4)
7) No presente trabalho, foram identificados 26 genes com status mutacional
diferenciado entre a fase crônica (NMP) e fase leucêmica. Alterações em 3
97
destes genes, CALR, MAPK15 e TP53 foram confirmadas por
sequenciamento direto.
8) Mutações em TP53 foram observadas desde a fase crônica, mas a presença
de mutações que aparecem preferencialmente na fase aguda pode estar
relacionada/ou ser preditiva da progressão leucêmica.
De maneira geral, podemos concluir que nas NMP clássicas a utilização
exclusiva da carga alélica de JAK2 para previsão da progressão da doença ainda é
controversa, pois não há um padrão previsível. Pacientes portadores de PV, TE e
MF podem progredir para leucemia aguda secundária portando mutações em JAK2,
CALR, ou não apresentar nenhuma mutação previamente associada à patogênese
das NMP. O processo de progressão para leucemia aguda secundária também
parece apresentar um panorama bastante heterogêneo devido à presença de
diversas lesões genéticas/moleculares, e a presença escassa de lesões recorrentes
e específicas da fase de leucemia aguda secundária nos três pacientes analisados.
98
7. Perspectivas
1) Estudo de validação dos 26 genes com frequência aumentada na progressão
leucêmica (fase aguda) em uma coorte de NMP, incluindo casos de
progressão para mielofibrose e leucemia aguda, a fim de verificarmos a
potencial associação desses genes com a evolução e o prognóstico dos
pacientes;
2) Estudo de validação da del2p e +5q em amostras de células de sangue
periférico de pacientes com NMP através da técnica de FISH;
3) Avaliar a frequência da nova mutação no domínio cinase de JAK2
(p.Arg1063Cys) em uma coorte de pacientes NMP e SMD e correlaciona-la
com parâmetros clínico-hematológicos;
4) Estudar o papel de ERK8 nas quatro diferentes NMPs (PV, TE, MF e ARSA-t),
gerando dados sobre a expressão e a frequência de mutações em uma coorte
de pacientes;
5) Realização de estudos funcionais das mutações de ERK8 encontradas nos
pacientes com a expressão concomitante de mutações em JAK2 e CALR;
6) Estudo comparativo do perfil proteico de pacientes NMP entre pacientes
JAK2V617F, CALR mutados, e pacientes que não possuam mutações em
JAK2, CALR e MPL através da técnica de proteômica.
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XAVIER, S. G. et al. Low prevalence of the JAK2V617F in patients with ischemic stroke or cerebral venous thrombosis. Blood coagulation & fibrinolysis: an international journal in haemostasis and thrombosis, v. 19, n. 5, p. 468–469, jul. 2008.
XAVIER, S. G. et al. JAK2V617F mutation in patients with splanchnic vein thrombosis. Digestive Diseases and Sciences, v. 55, n. 6, p. 1770–1777, jun. 2010.
XU, Y. M. et al. Extracellular Signal-Regulated Kinase 8-Mediated c-Jun Phosphorylation Increases Tumorigenesis of Human Colon Cancer. Cancer Research, v. 70, n. 8, p. 3218–3227, 14 abr. 2010.
YANG, S.-W. et al. The Distribution and Possible Role of ERK8 in Mouse Oocyte Meiotic Maturation and Early Embryo Cleavage. Microscopy and Microanalysis, v. 19, n. 01, p. 190–200, 28 jan. 2013.
YOSHIMURA, A. et al. Mouse oncostatin M: an immediate early gene induced by multiple cytokines through the JAK-STAT5 pathway. The EMBO Journal, v. 15, n. 5, p. 1055–1063, 1 mar. 1996.
ZALCBERG, I. R. et al. Hydroxyurea dose impacts hematologic parameters in polycythemia vera and essential thrombocythemia but does not appreciably affect JAK2-V617F allele burden. Haematologica, v. 96, n. 3, p. e18–20, mar. 2011.
ZHANG, S.-J. et al. Genetic analysis of patients with leukemic transformation of myeloproliferative neoplasms shows recurrent SRSF2 mutations that are associated with adverse outcome. Blood, v. 119, n. 19, p. 4480–4485, 10 maio 2012.
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ZITVOGEL, L. et al. Immunological aspects of cancer chemotherapy. Nature Reviews Immunology, v. 8, n. 1, p. 59–73, jan. 2008.
114
115
9. Anexos
Anexo 1 – Tabela 1
valores de referência hemograma normal
Homens Mulheres Unidade
Hemacias 4,40 a 5,90 4,00 a 5,20 milhoes/mm3
Hemoglobina 13,0 a 18,0 12,0 a 16,0 g/dL
Hematocrito 40,0 a 54,0 36,0 a 48,0 %
% /mm3
Leucocitos: 4,0 a 11,0 mil/mm3
Basofilos: 0 a 1% 0 a 110 /mm3
Eosinofilos: 1 a 5% 40 a 550 /mm3
Bastoes: 1 a 7% 40 a 770 /mm3
Segmentados: 40 a 65% 1600 a 7150 /mm3
Linfocitos: 22 a 45% 880 a 4950 /mm3
Monocitos: 2 a 10% 80 a 1100 /mm3
Plaquetas 150 a 450 mil/mm3
SERIE VERMELHA
SERIE BRANCA
116
Anexo 2 – Carta de Aprovação CEP-INCa
117
Anexo 3 – Ficha Clínica
FICHA DE COLETA DE DADOS GRUPO DE PESQUISA JAK2
DADOS GERAIS
Nome:__________________________________________ Matrícula: ___________ Instituição: (1) INCA (2) HUCFF (3) HUPE (4) HUGG (5) HSRC-ES (6) HEMORIO (7) OUTRO: ________________________ Sexo: (0) Fem (1) Masc Data de nascimento: __ / __ / ____ Data de diagnóstico: __ / __ / ____ Município de origem: _____________________________ Estado de origem: _____ Profissão: ___________________________ Avaliação inicial? (0) Não (1) Sim
EXAMES AO DIAGNÓSTICO
Data: __ / __ / ____ Hemograma:
Hemoglobina
Hematócrito
RDW
Reticulócitos %
Leucócitos
Blastos %
Bastões %
Neutrófilos %
Eosinófilos %
Basófilos %
118
Linfócitos %
Monócitos %
Plaquetas
Coagulograma:
PTT-R
PT-RNI
Suspeita clínica: ___________________________
DADOS CLÍNICOS AO DIAGNÓSTICO
Peso (Kg): ____________ Febre: (0) Não (1) Sim Emagrecimento: (0) Não (1) Sim Perda de peso (kg): ____________ Hemorragia: (0) Não (1) Sim Local: _______________________ Trombose ao diagnóstico:(0) Não (1) Sim Local: _______________________ Parestesia ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Prurido ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Baço palpável ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Tamanho do baço à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média Fez US abdominal? Comprimento do baço ao US?(0) Não (1) Sim ______ cm Fígado palpável ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Tamanho do fígado à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCD e umbigo (3) Na FID ou além da linha média
119
EXAMES ESPECÍFICOS AO DIAGNÓSTICO
Saturação arterial de O2 ao ar ambiente ( ) Não realizado
Eritropoetina sérica ( ) Não realizado
Ferro sérico ( ) Não realizado
Ferritina sérica ( ) Não realizado
Vitamina B12 ( ) Não realizado
Ácido úrico ( ) Não realizado
LDH ( ) Não realizado
Cariótipo normal (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Cromossomo Filadélfia (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Rearranjo bcr-abl (0) Neg (1) Pos (-1) não realizado
Dacriocitose (HMG) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Leucoeritroblastose (HMG) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Diseritropoese (Mielo) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Disgranulopoese (Mielo) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Dismegacariocitopoese (Mielo) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Blastos % (Mielo)
Fibrose (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Grau de fibrose (BMO) (0) (1) (2) (3) (4)
Hiperplasia eritróide (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Hiperplasia granulocítica (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Hiperplasia megacariocítica (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Diagnóstico final: ___________________________________ Outro diagnóstico final: ____________________________________
TRATAMENTO E COMPLICAÇÕES
Já recebeu tratamento específico anteriormente? (0) Não (1) Sim Tratamento 1: ________________________________ Início: __ / __ / ____ Tratamento 2: ________________________________ Início: __ / __ / ____ Tratamento 3: ________________________________ Início: __ / __ / ____ Tratamento 4: ________________________________ Início: __ / __ / ____ Tratamento 5: ________________________________ Início: __ / __ / ____
120
Ocorreu transformação leucêmica? (0) Não (1) Sim Evoluiu com neutropenia não-associada ao tratamento? (0) Não (1) Sim Evoluiu com trombocitopenia não-associada ao tratamento? (0) Não (1) Sim Evoluiu com trombose? (0) Não (1) Sim Evoluiu com sangramento? (0) Não (1) Sim
ÚLTIMOS EXAMES
Data do último exame: __ / __ / ____ Hemograma:
Hemoglobina
Hematócrito
RDW
Reticulócitos %
Leucócitos
Blastos %
Bastões %
Neutrófilos %
Eosinófilos %
Basófilos %
Linfócitos %
Monócitos %
Plaquetas
Coagulograma:
PTT-R
PT-RNI
SITUAÇÃO ATUAL
Peso (Kg) atual ____________ Febre: (0) Não (1) Sim Hemorragia: (0) Não (1) Sim Trombose: (0) Não (1) Sim
121
Baço palpável: (0) Não (1) Sim Tamanho do baço à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média Fez US abdominal? Comprimento do baço ao US?(0) Não (1) Sim ______ cm Fígado palpável: (0) Não (1) Sim Tamanho do fígado à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCD e umbigo (3) Na FID ou além da linha média Necessitando atualmente de transfusão de hemácias? (0) Não (1) Sim Necessitando atualmente de sangria terapêutica? (0) Não (1) Sim Em uso atualmente de aspirina? (0) Não (1) Sim Em uso atualmente de hidroxiuréia? (0) Não (1) Sim Qual a dosagem? ___________ Data de coleta da amostra para pesquisa de JAK-2: __ / __ / ____ JAKV617F qualitativo: (0) Neg (1) Pos JAK2 % (quantitativa): ____________ JAK2 12 (qualitativo): (0) Neg (1) Pos JAK2 14 (qualitativo): (0) Neg (1) Pos MPL (qualitativo): (0) Neg (1) Pos Ficha preenchida por: ______________________________________________ Data: __ / __ / ____
122
FICHA DE COLETA DE DADOS GRUPO DE PESQUISA JAK2
FICHA DE ACOMPANHAMENTO
DADOS GERAIS
Nome:______________________________________________ Matrícula: ___________ Instituição: (1) INCA (2) HUAP (3) HUPE (7) OUTRO: ________________________ Sexo: (0) Fem (1) Masc Diagnóstico: (1)PV (2)TE (3)MF (4)SMP/SMD (5)outro Qual?_______________
Data de consulta: ___/___/___
SITUAÇÃO CLÍNICA ATUAL
Hemorragia (0) Não (1) Sim
Trombose (0) Não (1) Sim
transformação leucêmica (0) Não (1) Sim
neutropenia associada ao tratamento (0) Não (1) Sim
trombocitopenia associada ao tratamento (0) Não (1) Sim
transfusão de hemácias (0) Não (1) Sim Transfusão de plaquetas (0) Não (1) Sim outros Qual?_____________ Baço palpável? (0) Não (1) Sim ______ cm
123
Tamanho do baço à palpação: (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média Fígado palpável: (0) Não (1) Sim (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média
TRATAMENTO
sangria terapêutica? (0) Não (1) Sim uso de aspirina? (0) Não (1) Sim Início: __ / __ / ____ Fim: __ / __ / ____ uso de hidroxiuréia? (0) Não (1) Sim Início: __ / __ / ____ Fim: __ / __ / ____ Outro tratamento? (0) Não (1) Sim Qual?_________________
Exame atual
Data: __ / __ / ____ Hemograma:
Hemoglobina
Hematócrito
eritroblasto
Reticulócitos %
Leucócitos
Blastos %
Bastões %
Neutrófilos %
Eosinófilos %
Basófilos %
Linfócitos %
Monócitos %
Plaquetas
124
Anexo 4 – Publicações relacionadas à tese
Publicação 1
Zalcberg IR, Ayres-Silva J, de Azevedo AM, Solza C, Daumas A, Bonamino M. Hydroxyurea
dose impacts hematologic parameters in polycythemia vera and essential thrombocythemia but
does not appreciably affect JAK2-V617F allele burden. Haematologica, v. 96, n. 3, p. e18–20, mar.
2011
125
Anexo 5 – Publicações relacionadas à tese
Publicação 2
Kaeda J, Bonamino M, Ayres-Silva J, Solza C, Ringel F, Blau O, Daumas A, Oberender C, Dörken
B, le Coutre P, Zalcberg I. JAK2 V617F allele burden quantified by real time quantitative polymerase
chain reaction and competitive polymerase chain reaction in patients with chronic
myeloproliferative neoplasia. Leukemia & lymphoma, v. 55, n. 1, p. 128–135, jan. 2014.
126
Anexo 6 - Manuscritos em preparo
1. Ayres-Silva, J.P.; Gouveia, M.E.; Praxedes, M.L.; Daumas, A.H.; Solza, C; Monte-Mor, B;
Bonamino, M.H.; Zalcberg, I.R.; Braggio, E. Genomic landscape of leucemogenesis in
myeloproliferative neoplasia
2. Ayres-Silva J.P; Monte-Mor, B; Coelho, A.C.; Bonamino, M.H.; Zalcberg, I.R. Study of CALR mutations in Brazilian Cohort (provisório)
127
Anexo 7 – Publicações em colaboração
1. Coutinho DF, Diniz C, Filgueiras RL, Baptista RL, Ayres-Silva JP, Monte-Mór BC, Bonamino MH, Zalcberg IR. Case Report A novel TET2 mutation in a patient with refractory cytopenia with multilineage dysplasia. Genetics and Molecular Research, v. 12, n. 4, p. 5858–5862, 2013.
2. Juhi Ojha, Jackline Ayres, Charla Secreto, Renee Tschumper, Kari Rabe, Daniel Van Dyke, Susan Slager, Tait Shanafelt, Rafael Fonseca, Neil Kay, Esteban Braggio
Deep sequencing identifies high genetic heterogeneity and recurrent convergent evolution in chronic lymphocytic leukemia
Será submetido à Blood ou Leukemia como Artigo completo. Manuscrito em preparo.
3. Dr. Juhi Ojha , Charla Secreto , Dr. Renee Tschumper, Ms. Kari Rabe , Jackline Ayres-
Silva, Dr. Daniel Van Dyke , Dr. Susan Slager , Dr. Rafael Fonseca , Dr. Tait SHANAFELT , Dr. Neil KAY. Monoclonal B-cell lymphocytosis (MBL) is characterized by mutations in CLL putative driver genes and clonal competition many years prior to disease progression.
Submetido à Leukemia (JILL14-LEU-0231) como letter to the editor, aceito para publicação.
4. Dr. Brian O'Neill , Mr. Scott Van Wier , Dr. Juhi Ojha , Dr. Ellen Remstein McPhail , Dr. Yan Assmann , Dr. Jan Egan , Jackline Ayres-Silva , David Schiff , Dr. Beatriz Lopes , Mr. Paul Decker , Dr. Riccardo Valdez , Dr. Raoul Tibes , Bruce Eckloff , Dr. Thomas Witzig , Dr. A. Keith Stewart , Dr. Rafael Fonseca.
Genome-wide analysis uncovers novel recurrent alterations in primary central nervous system lymphomas
Submetido à Leukemia (14-LEU-0369R) como Original Article.
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