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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PATRICK SIMÃO CARLOS
MORFOLOGIA DO NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS SUBMETIDOS À IMOBILIZAÇÃO DE PATA
FORTALEZA – CEARÁ
2012
2
PATRICK SIMÃO CARLOS
MORFOLOGIA DO NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS SUBMETIDOS À IMOBILIZAÇÃO DE PATA
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Área de Concentração: Ciências Biológicas II
Orientador: Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso
FORTALEZA – CEARÁ
2012
3
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
C284m Carlos, Patrick Simão Morfologia do nervo isquiático de ratos submetidos a
imobilização de patas / Patrick Simão Carlos. – 2011. 70 f. : il. color., enc. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do
Ceará, Centro de Ciências da Saúde, Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas, Fortaleza, 2011.
Área de Concentração: Ciências Biológicas II. Orientação: Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso. 1. Imobilização. 2. Nervo isquiático. 3. Morfologia. I.
Título.
CDD: 591.4
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PATRICK SIMÃO CARLOS
MORFOLOGIA DO NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS SUBMETIDOS À
IMOBILIZAÇÃO DE PATA
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Área de Concentração: Ciências Biológicas II
Aprovado em 12 / 04 / 2011
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________
Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso (Orientador) Universidade Estadual do Ceará -UECE
____________________________________________
Profa. Dra. Vânia Marilande Ceccatto Universidade Estadual do Ceará - UECE
___________________________________________
Profa. Dra. Carolina Madeira Lucci Universidade de Brasília - UNB
5
À minha esposa, Daniele de Araújo Oliveira Carlos, que
desde o início foi minha grande incentivadora e
colaboradora para a realização dessa conquista,
mostrando que, com paciência, disponibilidade e amor,
obstáculos são superados e ideais alcançados.
Aos meus pais, Simone e João, por nunca medirem
esforços para dar um ensino de qualidade e por
acreditarem que a educação é uma das maiores riquezas.
6
AGRADECIMENTOS
À Deus, por se fazer presente em todas as horas.
Aos meus irmãos, pelo apoio silencioso e a lembrança permanente de que a música deve
estar presente.
Ao Prof. Henrique Leal, meu orientador, pela sensibilidade, a atenção plena, a confiança e
a paciência. Pelas palavras de incentivo, pelas críticas, os elogios e as ricas sugestões.
Por me acompanhar, lado a lado, no enfrentamento desse grande desafio, encorajando-me
a ser quem sou.
À Dra. Vânia Marilande Ceccatto, pela motivação e incentivo durante todo período do
mestrado.
À Dra. Carolina Madeira Lucci, pela atenção e compreensão prestada ao trabalho.
Aos amigos, por incentivarem e acreditarem que eu chegaria aqui.
Aos funcionários do Mestrado, pelo apoio e disponibilidade em ajudar.
7
Gosto de ser gente porque, inacabado, sei que sou um
ser condicionado mas, consciente do inacabamento, sei
que posso ir mais além dele.
Paulo Freire
8
Resumo
Os tecidos do corpo humano passam por constante reorganização, assim, a maioria dos
tecidos sofrem adaptações às novas demandas. Nesse contexto o objetivo do estudo foi
analisar morfologicamente o nervo isquiático de ratos imobilizados. Trata-se de uma
pesquisa longitudinal, experimental. Onde foram utilizados 6 animais divididos em GI e GC,
cada grupo contendo 3 animais. A imobilização manteve a pata do animal em extensão por
um período de 15 dias. A análise do material se deu através de microscopia eletrônica. Os
resultados mostraram que houve desintegração de fibras e o aparecimento de “cluster” de
axônios. Na distribuição de frequência ocorreu uma diminuição de 17% na faixa de maior
diâmetro e um aumento de 16% na faixa de menor diâmetro. Assim, concluímos que um
período de imobilização foi capaz de ativar a plasticidade neural gerando modificações
morfológicas nas fibras do nervo isquiático.
Palavras – chave: Imobilização. Nervo Isquiático. Morfologia.
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Abstract
The human body tissues change constantly, so the majority of them adapt to the new
demand. The study objective is the morphological analysis of immobilized rats sciatic nerve.
This is an experimental and longitudinal research which took 6 animals dividing them in GI
and GC groups. Each group containing 3 animals. The immobilization kept the animal’s paw
in extension for 15 days. The material analysis was done through an electronic microscope.
The results presented fiber disintegration and appearance of axons clusters. In the
frequency distribution occurred a 17% decrease in the major diameter band and a 16 %
increase in the minor diameter band. Afterwards it is clear that an immobilization period is
able to activate the neural plasticity generating morphological changes in the sciatic nerve
fibers.
Keywords: Immobilization. Sciatic nerve. Morphology.
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Página a. Grupo Controle Aumento 10000x 32 b. Grupo Imobilizado Aumento 15000x 32 c. Grupo Imobilizado Aumento 12000x 32
Barra de referência 2µm Figura 2 Diâmetro médio das fibras danificadas 33 Figura 3
d. Grupo Controle Aumento 5000x 34 e. Grupo Imobilizado Aumento 3000x 34 f. Grupo Imobilizado Aumento 3000x 34
Barra de referência 5µm Figura 4 Distribuição de frequência por faixa de diâmetro 35 Figura 5 Distribuição de frequência por faixa de diâmetro, comparativo entre faixas. 35 Figura 5.1 Distribuição de frequência do GI . 41 Figura 6 Área média das fibras do nervo isquiático 36 Figura A (Citada de Alves 2010) Traçado eletrofisiológico do potencial de ação composto do nervo isquiático GC 41 Figura B (Citada de Alves 2010) Traçado eletrofisiológico do potencial de ação composto do nervo isquiático GI 41
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LISTA DE ABREVIATURAS
SN Sistema Nervoso
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Sistema Nervoso Periférico
GI Grupo Imobilizado
GC Grupo Controle
PFA Paraformaldeido
Caco Cacodilato de Sódio
HCl ácido clorídrico
nm nanômetro
µm micrômetro
H2O água
12
SUMÁRIO
1 Introdução 13
1.1 Sistema Nervoso 13
1.2 Morfologia do Sistema Nervoso Periférico 19
1.3 Plasticidade Neural 21
1.4 Imobilização 23
2 Relevância 26
3 Objetivos 27
3.1 Objetivo Geral 27
3.2 Objetivo Específico 27
4 Materiais e Métodos 28
4.1 Local de Execução e Tipo de Estudo 28
4.2 Animais 28
4.3 Amostra 29
4.4 Tratamento 29
4.5 Sacrifício 29
4.6 Processamento do Tecido 30
4.7 Análise 31
4.8 Estatística 31
5 Resultados 32
6 Discussão 37
7 Conclusão 44
Referências 45
Anexo 50
13
1 Introdução
1.1 Sistema Nervoso
O Sistema Nervoso (SN) é o sistema com a maior complexidade dentro do
organismo humano. Gerencia a constante manutenção da homeostase, além disso, é
encarregado pela geração dos comportamentos reflexos, comportamento alimentar, sono,
vigília, luta, defesa, fuga, comportamentos reprodutivos, dentre vários (BERNE, 2004;
GUYTON, 2002).
O SN é um tecido originário de um folheto embrionário denominado ectoderme, mais
precisamente de uma área diferenciada deste folheto embrionário, a placa neural.
Inicialmente a placa neural contêm cerca de 125 mil células, que darão origem a um
sistema composto por aproximadamente 100 bilhões de neurônios (MOORE, 2004)
A placa neural, por volta da 3º semana de gestação, se fecha, formando um tubo
longitudinal denominado tubo neural que em sua região anterior, sofre uma dilatação que
dará origem a uma parte fundamental do Sistema Nervoso Central (SNC), o encéfalo. Nos
pontos de encontro ou fechamento das extremidades da placa neural, no recém formado
tubo neural, forma-se a crista neural que dá origem a componentes que a neuro-anatomia
denomina como elementos periféricos e componentes celulares gliais (MOORE, 2004).
O SN pode ser dividido baseando-se tanto em características funcionais como
anatómicas. Do ponto de vista funcional temos o sistema somático, que atua em todas as
relações que são percebidas por nossa consciência. E o visceral ou vegetativo que, por
sua vez, age de forma inconsciente no controle e na percepção do meio interno e vísceras
(SILVERTHORN, 2003). Tanto o somático quanto o vegetativo, possuem componentes
sensitivos e motores. Anatomicamente o SN pode ser dividido em Sistema Nervoso Central
14 (SNC) e Sistema Nervoso Periférico (SNP). O SNC é a porção do SN que se localiza no
crânio e na medula espinhal (GUYTON, 2002). Dentre suas funções estão: a integração
das atividades corpóreas, armazenamento de experiências, controle do ambiente interno,
controle de movimentos voluntários, programação de reflexos da medula espinhal, entre
outros (LENT, 2004).
O SNP é constituído basicamente por gânglios nervosos e prolongamentos do SNC
denominados fibras nervosas. As fibras nervosas se dividem em três tipos: As Sensitivas
ou sensoriais que tem o papel de gerar e transmitir alguns impulsos nervosos dos órgãos
receptores até ao SNC; As fibras Motoras são responsáveis por conduzir o impulso
codificado no encéfalo, até o órgão efetor e as Mistas são uma junção dos nervos
sensitivos e motores ao mesmo tempo (BERNE, 2004; GUYTON, 2002).
O SNP gera e transmite impulsos ao SNC, informando-o sobre o estado dos órgãos,
além de receber informações do SNC e transmiti-las a órgãos efetores estabelecendo uma
interface do meio interno com o meio externo. Duas vias possibilitam essa interface: A via
eferente e a via aferente. Na via eferente o impulso nervoso decorrente de uma alteração
elétrica gerada no soma neural é transmitido ao longo do axônio até o órgão efetor. E na
via aferente o impulso é gerado nos receptores e transmitido ao SNC (BARROS, 2002).
Uma via aferente normalmente possui uma terminação nervosa sensível ao estímulo
que caracteriza a via, um trajeto periférico, um trajeto central e uma área de projeção
cortical onde neurônios corticais interpretam a informação (LENT, 2004).
Quando as informações sensoriais chegam ao SNC, podem ser imediatamente
processadas no local, resultando na elaboração de comandos motores reflexos, bem
como, serem retransmitidas para estações sinápticas mais cefálicas através de neurônios
de projeção (KANDEL, 2003).
15
Em cada estação de retransmissão dos sistemas sensoriais, o estímulo aferente é
processado localmente por excitação e inibição, proporcionando diferentes níveis de
análise. Em quase todos os sistemas sensoriais ocorrem inibições sobre os próprios
receptores bem como, sobre as vias aferentes, influenciando o nível de excitabilidade do
canal sensorial (LENT, 2004).
Cada tipo de receptor está habilitado para informar o SN apenas sobre
determinados aspectos ou dimensão do meio ambiente, funcionando como um filtro
sensorial e altamente sensível ao estímulo que lhe é adequado. Dentro de cada
modalidade sensorial é possível distinguir diversas qualidades, desse modo o sistema
sensorial avalia vários aspectos de uma mesma modalidade (BERNE, 2004). Com a visão,
por exemplo: pode-se perceber cores, profundidade, relevos, entre outros.
As diferentes modalidades sensoriais enviam as respectivas informações sensoriais
para áreas específicas do córtex sensorial e ocorre a constituição completa do meio
ambiente (GUYTON, 2002).
A principio, ocorre dois tipos de receptores sensoriais: os neurônios sensoriais
periféricos que tem em sua extremidade periférica uma estrutura modificada para a
detecção dos estímulos e células sensoriais epiteliais associados a um neuro-epitélio. Os
receptores sensoriais podem converter os estímulos físicos e químicos do ambiente em
impulsos elétricos e funcionam como transdutores de energia. Através dos prolongamentos
periféricos dos neurônios aferentes as informações sensoriais são conduzidas para o SNC
onde serão percebida e interpretada (KANDEL, 2003).
Os receptores são classificados em função de três critérios: o primeiro é de acordo
com a sua morfologia. Receptores especiais estão associados a um neuro-epitélio e fazem
parte dos órgãos dos sentidos especiais como visão, olfação, gustação, audição e
equilíbrio, todos localizados na cabeça. Possuem células receptoras especializadas não
16 nervosas, associadas às células nervosas propriamente ditas. Receptores gerais ocorrem
em todo o corpo, principalmente na pele e são menos complexos na estrutura podendo ser
classificados em dois tipos: receptores livres e receptores encapsulados. Estes não
possuem células sensoriais secundárias (BARROS, 2002; GUYTON, 2002).
A segunda função seria a classificação de acordo com a localização da fonte
estimuladora. Os exteroceptores são localizados na superfície do corpo, são ativados por
estímulos externos ao corpo como luz, som, pressão, entre outros. Os proprioceptores
estão localizados nos tecidos mais profundos do corpo como músculos, cápsulas
articulares, tendões, ligamentos, são ativados por estímulos mecânicos. E os
Interoceptores localizados nos vasos e órgãos cavitários do corpo. Baseado neste critério é
fácil perceber que os proprioceptores e exteroceptores são responsáveis pelas sensações
somáticas e os interoceptores, pelas sensações viscerais. E ainda, as sensações viscerais,
proprioceptivas e interoceptivas são também consideradas como profundas e as evocadas
pelos exteroceptores de superficiais (BARROS, 2002).
E por fim, classifica-se de acordo com o estímulo mais apropriado. Dado que os
receptores respondem mais especificamente a determinados estímulos funcionando como
filtros seletivos e específicos, os receptores podem ser classificados: fotorreceptores,
glicorreceptores, eletrorreceptores, entre vários (GUYTON, 2002).
A geração de um potencial de ação ocorre quando um estímulo atinge a região
receptora, e gera uma alteração na membrana do receptor semelhante ao de baixa
voltagem que neste caso é denominado potencial receptor. Se a propagação eletrotônica
desta atividade chegar até a zona de gatilho e atingir o limiar para desencadear o potencial
de ação, o impulso nervoso será enviado ao SNC. Como o potencial receptor é um
fenômeno graduado, quanto maior o estímulo, maior será a amplitude de sua resposta e
17 maior será a frequência de descargas dos potenciais de ação na fibra aferente (BERNE,
2004).
A membrana dos diferentes receptores sensoriais possui mecanismos altamente
específicos que convertem os estímulos em potencial receptor. Esses estímulos físicos ou
químicos abrem ou fecham canais iônicos específicos causando ou interrompendo fluxos
iônicos e como consequência, mudanças temporais no potencial de ação (BARROS,
2002).
Além de qualidade e quantidade dos estímulos, a percepção sensorial resulta
também em uma definição temporal do estímulo como, por exemplo, a duração e taxa de
variação de um determinado estímulo. Finalmente, outro aspecto importante é que o
sistema sensorial é capaz de detectar a origem dos estímulos sensoriais e informar-nos
sobre a nossa posição no espaço e nos fornecer informações sobre o nosso mapa corporal
(KANDEL, 2003).
A duração de uma sensação depende das propriedades do receptor. Se um
determinado estímulo persiste por muito tempo, com o tempo ficamos com a sensação de
que ele diminui ou desapareceu. Esta propriedade é denominada de adaptação. Há dois
tipos de receptores percebendo não só o aumento na intensidade do estímulo como
também a sua duração sensorial quanto à capacidade de adaptação: Receptores tônicos
são aqueles cujo potencial receptor é mantido enquanto durar o estímulo e, por
conseguinte, são adequados para realizar a análise de intensidade do estímulo. Já os
Receptores fásicos ou de adaptação rápida são aqueles que se adaptam rapidamente ao
estímulo. Logo, se o estímulo persistir por muito tempo, os potenciais receptores não serão
mais gerados, bem como, os potenciais de ação nas fibras aferentes primárias. A
sensação detectada é de aparente ausência de estímulo (GUYTON, 2002).
18
Na ausência de estímulos as células do SN, são dotadas de cargas iônicas
negativas em seu interior, comparando-se com o meio externo, a esse estado dá-se o
nome de potencial de repouso. A magnitude do potencial de repouso da membrana vária
de -40 a -75mv dependendo das características da célula (SILVERTHORN, 2003; BERNE,
2004).
Como vimos anteriormente, as células que encontramos no SN têm a capacidade de
gerar e transmitir impulsos elétricos ou potenciais de ação. O potencial de ação é gerado
devido a uma alteração brusca e rápida da diferença de potencial transmembrana
(GUYTON, 2002). Essa alteração se dá quase sempre pela abertura de canais que
permitem a passagem para o interior da célula, através da membrana citoplasmática, de
íons dotados de carga positiva, e assim, alterando a diferença de potencial elétrico
transmembrana de maneira a positivar o interior da célula. O limiar de voltagem é o ponto
crítico de voltagem transmembrana que, uma vez atingido, promove a deflagração do
potencial de ação. Uma vez gerado o potencial de ação no soma da célula ou em algum
sitio axonal próximo ao receptor sensorial, ele é transmitido através dos axônios.
Igualmente à geração do potencial de ação, a sua transmissão também ocorre por uma
entrada de íons dotados de cargas positivas no interior do axônio. Assim, ele é transmitido
ao longo da estrutura até as ramificações axonais mais periféricas, fazendo com que o
estimulo nervoso, ou seja, o potencial de ação gerado se propague com a mesma
amplitude inicial. Já a transmissão do impulso elétrico de um neurônio para os neurônios
seguintes se processa, na maioria dos casos (transmissão sináptica química), através da
reconstituição do potencial de ação no neurônio pós-sináptico e dessa maneira é levado
até o órgão efetor. A condução e transmissão do impulso nervoso pode ser através das
fibras nervosas mielinizadas ou não mielinizadas (HUANG, 2001; BERNE, 2004;
SILVERTHORN, 2003).
19
A função primordial da mielina é o aumento na velocidade de condução do impulso
nervoso. Isto se dá pela disposição da mielina em intervalos regulares, alternados com
nódulos de Ranvier, transmitindo o impulso entre os nódulos de maneira eletrônica, com
recriação do potencial de ação em cada nódulo. Essa forma de condução do potencial nas
fibras mielinizadas é chamada de forma saltatória. A constituição da mielina presente no
SNP se assemelha, em composição geral, tanto de proteínas como lipídios, à mielina
encontrada no SNC; logo, a mielina do SNP é dotada de uma maior quantidade de
esfingomielina e glicoproteínas (LIU, 1997; SILVERTHORN, 2003).
1.2 Morfologia do Sistema Nervoso Periférico
Macroscopicamente, os nervos do SNP apresentam-se como feixes ou fascículos
brancos e brilhantes que, por sua vez, são unidos por tecido conjuntivo.
Os neurônios não trabalham isolados, mas sim em conjuntos que quando
associados formam redes neurais. Como toda célula, o neurônio apresenta uma membrana
plasmática que envolve um citoplasma contendo organelas com diferentes funções e um
núcleo onde encontra-se o material genético. O que diferencia os neurônios das demais
células é sua morfologia adaptada para o processamento de informações e a variedade
dos seus tipos morfológicos (LENT, 2001).
Uma das principais funções do neurônio é a capacidade de gerar impulsos elétricos
que, por sua vez, funcionam como unidades de informações que processam informações a
respeito do meio ambiente externo e interno comandando assim ações musculares,
ativando glândulas e códigos complexos que veiculam pensamentos, emoções, e memória
no ser humano (GARTNER, 1999).
20
O corpo celular ou pericário do neurônio contém um núcleo e o citoplasma. O
núcleo é quase sempre esférico ou ovóide e está localizado no centro, apresentando
cromatina dispersa, indicando intensa atividade de síntese, embora neurônios menores
geralmente apresente a cromatina heterocondensada. O nucléolo é bem visível
(ROMRELL, 1993; GARTNER, 1999).
O citoplasma tem sua constituição bastante complexa e ocupa todo o interior da
célula nervosa. Nele se encontram proteínas dispostas na forma de fibrilas, que compõem
o citoesqueleto responsável pela manutenção da forma do neurônio e da mobilização dos
neurônios jovens durante o desenvolvimento, de forma a garantir sua migração das regiões
germinativas para sítios distantes do organismo embrionário. O citoesqueleto é um dos
responsáveis por emitir, alongar ou retrair ativamente os prolongamentos dos neurônios,
constituindo um sistema de transporte de moléculas sinalizadoras, nutrientes, fatores
tróficos e de vesículas membranosas que se movem do soma até as extremidades dos
prolongamentos assim como no sentido oposto (LENT, 2001).
No citoplasma encontra-se abundante retículo endoplasmático rugoso com muitas
cisternas paralelas, principalmente em neurônios motores, estas cisternas juntamente com
os poliribossomos, aparecem como aglomerados de material basófilo, quando corados com
corante básico, denominados de corpúsculos de Nissl (LENT, 2001; GARTNER, 1999;
ROMRELL, 1993)
Em secções dos nervos periféricos, é possível observar a arquitetura intrincada
desse tecido. Os axônios e células de Schwann localizam-se em compartimentos
endoneurais, que são rodeados pelo perineuro; este por sua vez forma fascículos
individuais que são envoltos por tecido fibroso epineural (ORTIZHIDALGO & WELLER,
1997).
21
Dentre os vários tipos celulares que constituem o SNP as células de Schwann, são
as principais. Elas são confinadas ao SNP e em situações normais raramente são vistas no
SNC. As células de Schwann assumem a função de mielinizar ou envolver os axônios do
SNP, são células extremamente lábeis, que exercem um papel fundamental na formação
dos nervos, além de auxiliarem o SNC e o SNP nos processos regenerativos (MIRSKY &
JESSEN, 2001).
1.3. Plasticidade Neural
Historicamente, em meados de 1800, a hipótese da neuroplasticidade começou a
ser descrita quando estudo sugeriu (NUDO, 2006) que porções vivas de massa encefálica
alteravam suas funções realizando, às vezes, outras e assim contribuindo com a
recuperação do órgão. No entanto, por volta de 1906, é que o termo plasticidade foi
introduzido por um psiquiatra italiano (BERLUCCHI, 2002).
Somente em 1948, a hipótese de plasticidade ganha forma semelhante a atual. A
idéia era que a aplicação de um estímulo proporcionasse dois níveis de mudanças em que
a primeira seria uma alteração funcional relativa às peculiaridades inerentes ao SN,
geração e transmissão de impulsos elétricos e a segunda são alterações permanentes, em
sua função, devido à aplicação de estímulos adequados. A isso chamar-se-ia plasticidade
neural (KANDEL, 2003).
Posteriormente, na década de 60, grandes descobertas relacionadas à plasticidade
neural foram feitas. Pesquisadores postularam que conexões neurais a nível cortical eram
intensificadas e remodeladas pelas experiências (JOHANSSON, 2004; HOLLOWAY,
2003).
22
Na década de 80, a visão dos cientistas sobre a capacidade regenerativa do SNC
de mamíferos adultos começou a sofrer mudanças, com a pesquisa realizada por Albert
Aguayo, que utilizou ratos adultos submetidos à transecção do nervo óptico. Aguayo
relatou duas importantes conclusões: A primeira é que os axônios presentes no SNC são
capazes de regenerar, desde que estejam em contato com o microambiente do SNP, e a
segunda é que o microambiente do SNC não favorece o crescimento regenerativo dos
axônios centrais (LENT, 2004).
Assim, foi somente nas duas últimas décadas que vários relatos de plasticidade
foram demonstrados em modelos experimentais e em humanos, permitindo-nos começar a
traçar os mecanismos implícitos. Os achados sobre neuroplasticidade têm sido observados
em várias formas de análise (NUDO, 2006).
Trabalhos atuais têm relatado a reorganização neural visando uma maneira que
facilite a recuperação da função. Tal fato vem sendo sugerido e, de uma maneira geral,
progressivamente demonstrado, como um objetivo importante da recuperação neural
(NUDO, 2006).
Sendo o SNP composto principalmente por prolongamentos oriundos do SNC torna-
se um alvo mais facilmente passível de lesões, tanto pela quantidade existente, como pela
sua distribuição anatômica. Assim, quando um axônio no SNP é lesado, o neurônio tende à
reparação, aumentando significativamente a síntese de proteínas estruturais, exacerbando
todo o potencial das organelas (SUN, 2010). Um exemplo é o reticulo endoplasmático
rugoso, que com as lesões do respectivo neurônio passa a ter suas cisternas distendidas
com os produtos da síntese proteíca ou os ribossomos aparentando uma desorganização
(SILVERTHORN, 2003).
Concomitantemente com essas ocorrências, o soma apresenta-se edemaciado,
adquirindo a forma arredondada e o núcleo assume uma posição excêntrica. Essas
23 alterações morfológicas refletem o processo citológico ligado ao aumento da síntese de
proteínas (BERNE, 2004).
Apesar de todo o esforço do soma na produção de proteínas estruturais, os
neurônios não são dotados da capacidade de repor apenas as proteínas danificadas
durante a lesão. O que ocorre é uma desintegração de todo o axônio localizado após a
lesão (BOOTH, 1982; SANTOS-JUNIOR, 2010).
Para os axônios mielínicos, não somente o axônio, mas a mielina também sofre
desintegração, chegando ao ponto de uma desenervação do órgão efetor. Contudo, esse
esforço na produção de proteínas, não é em vão; servirá para reconstrução do axônio,
desde o ponto danificado até o órgão efetor, minimizando os danos que poderiam ser
totalmente irreversíveis (GUYTON 2002).
O início da regeneração fica bem caracterizado pelo surgimento de brotamentos no
coto proximal do axônio. Nesse processo, as células de Schwann presentes na porção
degenerada do nervo, não só sobrevivem como se multiplicam, formando um cone de
crescimento que serve de linha guia que indicará qual o caminho original seguido pelo
nervo que antes existia ali. Assim, é possível que, em determinados casos ocorram a re-
inervação e o novo axônio venha a possuir características aproximadamente idênticas as
do axônio previamente existente. (BERNE, 2004). Contudo, a hipótese de plasticidade
neural com suas vias de ação ainda tem muitos pontos a serem esclarecidos.
1.4. Imobilização
Os tecidos do corpo humano estão em constante reorganização, assim, a maioria
dos tecidos sofrem adaptações às novas demandas, seja do próprio organismo, interno ou
do meio externo (BERNE, 2004).
24
É muito comum na prática clínica utilizar técnicas de imobilização como alternativa
para reverter quadros patológicos como fraturas ou entorses. Segundo a literatura
pequenos períodos de imobilização podem ocasionar prejuízos à região imobilizada, sendo
os principais, hipotrofia e/ou atrofia muscular (VASCONCELOS, 2010).
Como resultado da imobilização, temos, inicialmente, a perda da massa muscular
associada à diminuição da força, consequentemente levando a uma redução no tamanho
do músculo (BOOTH, 1982; FALEMPIN e MOUNIER, 1998), sendo mais acentuada nas
primeiras setenta e duas horas, com índices de 14 a 17%. Tendo decorrido
aproximadamente uma semana, o ritmo de perda parece diminuir.
A imobilização causa também transtornos em outras partes do organismo, e esses
transtornos podem interferir inclusive no metabolismo, limitando temporariamente as
atividades cotidianas, diminuindo assim, sua qualidade de vida (SANTOS-JUNIOR, 2010).
Dados histológicos já descrevem diminuição na síntese proteica muscular após 6
horas de imobilização (BOOTH, 1987), aumento intenso no volume de tecido conjuntivo
após 2 dias (WELLIAMS e GOLDSPINK, 1984) e hipotrofia de 35% a 45 % após 7 dias
(APPELL, 1986).
O músculo é o elemento motor do corpo que aciona de forma voluntária ou
involuntária os segmentos do corpo. A musculatura estriada de contração voluntária é
denominada musculatura esquelética (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). O músculo
esquelético é responsável aproximadamente por 45% do peso corporal e é o maior sistema
orgânico do ser humano, sendo um importante tecido na homeostasia bioenergética, tanto
em repouso como em exercício. O músculo esquelético representa também o principal
local de transformação e de armazenamento de energia (SANTOS-JUNIOR, 2010).
Segundo a literatura, o músculo, dentre os tecidos biológicos, é o mais mutável e
responde a demandas com adaptações morfológicas e/ou funcionais. A função do músculo
25 esquelético depende da atividade proprioceptiva intacta, inervação motora, carga mecânica
e mobilidade articular (LIEBER, 1992; SILVEIRA, 1994).
A imobilização provoca mudanças a nível muscular (SANTOS-JUNIOR 2010) e
nervoso (ALVES 2010). Uma das possíveis mudanças decorrentes da imobilização é a
modificação primária do grau da atividade neural sobre o tecido muscular (FALEMPIN e
MOUNIER, 1998). Além do grau de atividade, é possível que haja também modificação
primária (causada simplesmente pela diminuição do uso) da própria estrutura morfológica
neural. Como os casos de imobilização freqüentemente se associam a lesões traumáticas
ou outras patologias, faz-se necessário distinguir o que seja lesão neural primária e
secundária. Visando dar uma contribuição ao aperfeiçoamento da prática clínica
terapêutica em casos de imobilização com dano à função do órgão imobilizado, o presente
trabalho se propõe a averiguar e caracterizar as alterações morfológicas primárias no
nervo isquiático de ratos com o membro correspondente imobilizado.
26
2 Relevância
Atualmente a prática clínica utiliza técnica de imobilização como alternativa na
reversão de quadros patológicos que vão das entorses à fraturas. Logo, pequenos
períodos de imobilização podem gerar prejuízos à região imobilizada, sendo os principais a
hipotrofia e/ou atrofia muscular.
Modelos experimentais vêm dando suporte a pesquisas científicas no intuito de
aprofundar o conhecimento sobre imobilização. Parte da literatura traz modelos tradicionais
que utilizam gesso nas imobilizações. A imobilização pelo gesso tem várias desvantagens,
dentre elas, o edema de pata é a principal e mais grave, também podemos citar a retirada
da imobilização pelo próprio animal, a necessidade de anestesia para o período de
secagem do gesso, entre outros. Para minimizar os problemas da imobilização com o
gesso, desenvolveu-se no Instituto Superior de Ciências Biomédicas - ISCB da UECE um
modelo de imobilização feita com esparadrapo onde preserva-se melhor a integridade do
animal. Essa prática tem demonstrado uma perspectiva bem real com resultados
relevantes.
Contudo, ainda não foi descrito na literatura a análise, do ponto de vista morfológico,
dos nervos de modelos imobilizados com esparadrapo. Assim, esse trabalho, além da sua
relevante contribuição das alterações morfológicas primárias de um nervo periférico pela
imobilização, tem outra contribuição ímpar que é também para o entendimento dos
acontecimentos inerentes a este modelo de imobilização com esparadrapo, contribuindo
para uma possível aplicabilidade em humanos.
27
3 Objetivos
3.1 Objetivo Geral:
- Caracterizar e analisar as alterações morfológicas do nervo isquiático de membro
imobilizado de ratos.
3.2 Objetivos Específicos:
- Apresentar o comportamento morfológico do nervo isquiático, proporcionado pela
imobilização;
- Pesquisar e analisar a distribuição das frequências referente aos diâmetros dos
axônios do nervo isquiático;
- Pesquisar e analisar a área média das fibras do nervo isquiático.
28
4 Materiais e Métodos
4.1 Local da Execução e Tipo de Estudo
O trabalho foi desenvolvido nas dependências do Instituto Superior de Ciências
Biomédicas da Universidades Estadual do Ceará-UECE, Fortaleza-Ceará e na
Universidade de Brasília – UNB Brasília, no período de 01/03/2009 a 30/08/2011. Trata-se
de uma pesquisa longitudinal de cunho experimental.
4.2 Animais
Esse trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais –
Ceua/Uece sob número de protocolo 10244987-2.
Para tal pesquisa foram utilizados ratos Winstar machos (Ratus norvegicus) 180 a
220g com 4 semanas de vida, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do
Ceará (UFC) e mantidos no Centro de Aclimatação do Instituto Superior de Ciências
Biomédicas da Universidade Estadual do Ceará, com ciclo de 12h claro por 12h escuro,
acesso ad libitum a água e ração e temperatura de 24 ± 2ºC.
29
4.3 Amostra
A amostra foi composta por 6 animais divididos em 2 grupos: Grupo Imobilizado n=3
(GI), Grupo Controle n=3 (GC).
4.4 Tratamento
O tratamento de imobilização foi baseada em (SANTOS-JUNIOR, 2010), que utilizou
esparadrapo imobilizando uma pata de cada animal. Essa imobilização manteve a
articulação do joelho em extensão e o tornozelo em flexão plantar por um período de 15
dias. É importante relatar que o acesso à água e ração dos animais imobilizados não foram
prejudicados. O GC não recebeu imobilização na pata.
4.5 Sacrifício
Após 15 dias consecutivos de imobilização os animais foram anestesiados com
Cetamina (60mg/Kg) e Xilasina (8mg/Kg) e perfundidos com solução salina primeiramente
e posteriormente com paraformaldeido (PFA) 4%.
30
4.6 Processamento do Tecido
Após a perfusão o nervo isquiático foi dissecado e retirado, aproximadamente 1cm
de tecido da porção distal, sendo imediatamente imersa na solução Karnovsky modificada,
composta por 2% de PFA, 2,5% de Glutaraldeido em tampão Cacodilato de Sódio (Caco)
0,1M pH 7,4, durante 3h em temperatura ambiente. Posteriormente o material foi lavado,
três vezes, em Caco durante 5 minutos cada lavagem. Na Pós-fixação o tecido foi imerso
em Tetróxido de Ósmio 1% junto com Ferricianeto de K+ClCa 5mM, durante uma hora em
ambiente escuro. Após essa etapa o material foi lavado com dois banhos de Caco 0,1M e
dois banhos de água, cinco minutos cada.
A contrastação foi feita “in bloc”(antes do corte) com Acetato de Uranila no mínimo
duas horas em ambiente escuro. Após a contrastação do material, o mesmo foi lavado três
vezes em água destilada e foi desidratado em banhos de acetona 30%, 50%, 70%, 90%,
trinta minutos em cada e 100% três banhos de dez minutos cada.
Após a desidratação o tecido foi imerso em uma solução contendo acetona e resina
Spurr-s inicialmente em uma proporção de 2 medidas de acetona para 1 de resina, durante
seis horas no mínimo, depois, 1:1, 1:2 e finalmente resina pura com a tampa do ependof
aberta para eliminar qualquer vestígio de acetona, permanecendo somente resina. Durante
o processo para emblocar teve-se o cuidado de posicionar o material para a obtenção de
cortes transversais do nervo, assim o material emblocado permaneceu 72h na estufa a
65°C para a polimerização da resina.
Ocorrendo a polimerização da resina, foi retirado o excesso de resina com gilete
apresentando o formato de pirâmide. O bloco estando piramidado foi encaminhado para o
corte semi-fino (3µm) em navalha de vidro e posterior corte em navalha de diamante com
31 espessura de 70nm, o qual é colocado em telinhas de cobre pré tratadas em ácido
clorídrico (HCl) 1M, H2O e Etanol.
Após a colocação dos cortes nas telinhas, o material foi analisado no Microscópio
Eletrônico de Transmissão JEOL JEM 1011.
4.7 Análise
Em uma primeira fase foi feito uma análise subjetiva através da comparação das
imagens organizadas em pranchetas. Para essa comparação buscou-se organizar as
imagens que apresentassem o mesmo aumento e/ou a mesma barra de calibração.
Posteriormente foi feito uma análise objetiva, escolhendo aleatoriamente 100
axônios mielínicos do GC e 200 axônios mielínicos do GI, onde foi medido o diâmetro e
área. Para essa análise foi utilizado o software Image J.
4.8 Estatística
Na análise estatística foi feito a distribuição de frequência, normalizada pelo
percentual, o diâmetro médio e área média das fibras. Considerou-se o intervalo de
confiança de 95% e o teste utilizado foi o teste t pareado. Para a essa análise utilizamos o
Software Graf Ped Prism 5.0
32
5 Resultados
Foi observado nas fibras nervosas dos animais tratados sinais de degeneração. Na
Fig 1 b notamos fragmentação da mielina (setas) e na Fig 1. c temos associado à
fragmentação uma deformação parcial ou total da fibra (setas). Assim, podemos classificar
em dois tipos: as fibras que apresentaram a mielina fragmentada (Fig 1. b) e as que
apareceram com deformação (Fig 1.c).
Figura 1 (a, b, c)
a
c
b
Figura 1 . Imagens em microscopia eletrônica de transmissão, aumentos de 10000x (a) 15000x (b) e 12000 (c) As figuras acima mostram o GC (a) e GI (b, c). Barra de 2µm
33
A Figura 2 mostra que as fibras com fragmentação representam a maioria, tendo
seu diâmetro entre 6 e 8µm. Já as fibras que apresentaram deformação estão com
diâmetro entre 5 e 6µm. Não apresentando diferença estatisticamente significante entre os
diâmetros das fibras fragmentadas e deformadas.
Figura 2 . Diâmetro médio das fibras que apresentaram algum tipo de alteração morfológica. Média ± erro padrão.
34
Figura 3 (d, e, f)
Nas Figura 3.e e f é possível notar um agrupamento de fibras nervosas de menor
diâmetro próximas uma das outras (setas em verde), formato altamente sugestivo de
“cluster” palavra da língua inglesa utilizada na microscopia eletrônica para designar
agrupameto de células em regeneração.
Figura 3 . Imagens em microscopia eletrônica de transmissão, aumentos de 5000x (d, e) e 3000x (f) As figuras acima mostram o GC (d) e GI (.e, f). Barra de 5µm.
d
f
e
35
Nas figuras 4 e 5 temos a distribuição de frequência do GC e do GI. Na figura 4 o
GC tem uma distribuição similar à normal (Gaussiana), diferente da distribuição do GI. Na
figura 5 observamos um aumento na faixa que vai de 1 a 4,9 de 16% no GI e uma redução
de 17% na faixa de maior diâmetro no GI.
Figura 4 Distribuição de frequência por faixa de diâmetro. Faixa de 1 a 4,9 temos as fibras nervosas de menor calibre, 5 a7,9 médio calibre e 8 a 11 as fibras de grande calibre. Normalizado pelo percentual.
Figura 5 Distribuição de frequência por faixa de diâmetro, comparativo entre faixas, Normalizado pelo percentual.
36
Analisando a área média das fibras podemos observar que os animais que foram
submetidos a tratamento apresentam uma menor área média das fibras. Comparando com
o GC apresenta diferença estatística significante.
Figura 6. Área média das fibras do nervo isquiático. Teste t pareado. Asterisco igual a p ≤ 0,001
37
6 Discussão
A existência do homem até os dias atuais se reporta aos incansáveis processos
adaptativos sofridos desde os nossos ancestrais, onde suas preocupações giravam em
torno do cassar, pescar, coletar e abrigar-se em local seguro, esses eram comportamentos
essenciais para a sobrevivência. Não só proporcionavam a sobrevivência da espécie como
também serviam de estímulos para adaptações orgânicas relevantes na posterioridade
(DARWIN, 1973).
Adaptações como o aumento do diâmetro da fibra muscular ou da densidade óssea
não tiveram tanto destaque como as adaptações do SN. Percebemos isso quando
observamos a filogenia da mente humana: Passando do controle motor com a praxia fina,
para a descoberta, manipulação e utilização de instrumentos como a pedra bruta e pedra
polida, materiais como metais, enfim, todas essas mudanças foram diretamente
estimuladas pela nessecidade de sobrevivência, culminando em processos adaptativos do
SN (RIBAS, 2006).
Hoje, após o nascimento de um humano, seus tecidos sofrem incontáveis processos
adaptativos. Algumas já pré-progamadas em seu material genético e outras oriundas de
estímulos do meio externo (BERNE, 2004). Contudo, a adaptação fica a mercer da
plasticidade do tecido estimulado. Às vezes, as adaptações são precedidas de
degenerações. Degenerações comumente encontradas na porção distal do SNP em casos
de lesões (DIAS, 2000).
A imobilização proporciona adaptações musculares e sinais de degeneração nas
fibras nervosas dos animais tratados caracterizado pela fragmentação total ou parcial da
fibra. As decrições no que diz repeito à fragmentação das fibras nervosas está bem
relatada na literatura (BERNE, 2004; CORRÊA 2005; MURINSON, 2005; IDE, 1996;
38 LUNDBORG, 1993; GUTMANN e HOLUBAR 1950; SUNDDERLAND, 1945; SEDDON,
1972). Logo, em nosso estudo observamos uma degenaração pouco descrita na literatura
não havendo compatibilidade fidedigna com as caracteristicas já bem relatadas. As
principais classificações aceitas baseiam-se principalmente em Sundderland (1945) e
Seddon (1972).
Seddon classifica os diversos tipos de lesão de nervos periféricos como
neurapraxia, axôniotmese e neurotmese. Na neuropraxia há apenas um dano discreto do
nervo com perda transitória da condutividade, nas suas fibras motoras e o prognóstico é
bom. Na axôniotmese tem-se uma lesão em nível axonal, mas não há dano na formação
estrutural do nervo em si. E por fim, a neurotmese está ligada à lesão traumática, os
nervos são seccionados, rompidos ou destruídos, o prognóstico é ruim.
Sundderland, classifica as lesões de nervos periféricos em 5 graus: lesões de
primeiro grau há o bloqueio da condução nervosa por um determinado período de tempo
mantendo a integridade estrutural do nervo; na lesões de segundo grau ocorrem a secção
axonal completa sem a interrupção da lâmina basal. A lesão de terceiro grau, é vista
quando se observa a secção axonal e endoneural. Na lesão de quarto grau, em que ocorre
a secção axonal, endoneural e perineural e a de quinto grau, na qual se tem a secção
axonal completa.
Alves 2010, demostrou condutividade nervosa após periodo de imobilização, logo
não pode ser classificado como neuropraxia. A classificação de axoniotimese tambem não,
porque na axoniotmese tem-se uma lesão a nível axonal sem dano estrutural e no
presente estudo foi observado dano na estrutura como um todo. A neurotmese está ligada
a lesões traumáticas, fato que não faz parte da nossa metodologia. Assim a classificação
de Seddon não se adequa ao nosso estudo.
39
Os 5 graus da classificação de Sundderland fazem referência a classificação de
Seddon, onde o grau I corresponde a neuropraxia, os graus II, III e IV correspondem a
axoniotmese e o grau V corresponde a neurotmese.
A maioria das lesões nervosas, referentes a essas classsificações, são presentes
em estudos onde ocorrem doenças neuro-degenerativas e/ou lesões mecânicas. Assim,
temos um padrão de degeneração carente de estudos. Esse padrão é caracterizado por
fissuras na mielina sem alteração axonal, tal fissura ora é parcial ora é total podendo haver
os dois tipos na mesma fibra. Além das fissuras mielínicas temos em algumas imagens
desintegração total da fibra, onde uma única fibra apresenta-se em pedaços. E como visto
por Alves (2010) a condutividade é presente.
A fragmentação observada em nosso estudo foi dividida em dois grupos, o primeiro
estaria associada a uma deformação parcial (Fig 1 b) e o segundo seria a desintegração
total da fibras (Fig 1 c). Essa degeneração neural foi observada em uma faixa de 5 a 8µm
de diâmetro, sendo, possivelmente, um processo degenerativo em fase inicial, na
respectiva faixa, pois muitos axônios selecionados para serem analisados, não foram, por
conta da morfologia inviável para essa análise (Fig 2 ).
Assim, esses axônios analisados que apresentavam algum grau de degeneração
não estão sendo utilizados para suas funções. Alves (2010) ao analizar, a nível
eletrofisiológico, o nervo isquiático de ratos submetidos a imobilização de pata, relata
algumas mudanças, como a diminuição no padrão de utilização das fibras que formam a
primeira componente do potencial de ação composto estão bem evidentes. Vale ressaltar
que nosso dados estão coerentes com os achados de Alves (2010) e ambos corroboram
com dados disponíveis na literatura. Esses dados da literatura já mostravam que periodos
de imobilização promovem mudanças no complexo nervo-músculo, mas eles mediram e
40 avaliaram parâmetros diferentes da função neural (APPELL 1990, COUTINHO 2004,
FERREIRA 2004, BOOTH 1982).
A hipótese de lesão nervosa, ao invés da hipótese de adaptação, poderia ser
cogitada nessas circustâncias, no entanto, essa hipótese é anulada pelo surgimento de
“clusters”, em concomitância com a desintegração (Fig. 3 e) (setas vermelhas). Sendo
assim, a degeneração se justifica pela necessidade de novo padrão funcional do membro
imobilizado e não por uma lesão ocorrida durante o processo físico de imobilização. O
novo padrão funcional supra citado, refere-se principalmente as inúmeras alterações
ocorridas na musculatura esquelética (APPELL 1990).
A distribuição Gaussiana apresentada na Fig. 4 GC já era esperado para o GC e
Mazzerm (2006) confirma que os animais que não são submetidos a tratamento tendem a
manter uma distribuição normal das fibras nervosas, diferentemente dos tratados.
Já no GI Fig. 5 fica claro uma redistribuição dos diâmetros das fibras no GI onde
apresentou uma redução de 17% na faixa de maior diâmetro. Ao se comparar o traçado
eletrofisiológico dos animais submetidos a imobilização (Fig. B de ALVES 2010) com a
distribuição de frequência apenas no GI (Fig 5.1 desta dissertação), observamos uma
compatibilidade. A primeira componente, dotada principalmente de fibras com maior
diâmetro apresentou diminuição. E em nossos achados, observamos redução nas fibras
com essas características.
41
encial de ação composto de ALVES, 2010.
Figura 5.1 Distribuição de frequência apenas do GI, por faixa de diâmetro. Faixa de 1 a 4,9 temos as fibras nervosas de menor calibre, 5 a7,9 médio calibre e 8 a 11 as fibras de grande calibre. Normalizado pelo percentual.
B
Figura B Traçado eletrofisiológico do potencial de ação composto do nervo isquiático do GI.(B). Essa figura foi retirada do trabalho de ALVES 2010.
A
Figura A Traçado eletrofisiológico do potencial de ação composto do nervo isquiático do GC.(A). Essa figura foi retirada do trabalho de ALVES 2010.
42
Ainda no comparativo entre a Fig. B (ALVES, 2010) com a Fig. 5.1 . percebemos
também uma corroboração dos resultados da segunda componente da Fig. B (ALVES,
2010) com o aumento de 16% na faixa de menor diâmetro da Fig. 5.1 . para esses
resultados três fatores foram fundamentais: o primeiro está no surgimento de “clusters” os
quais provocam um aumento na quantidade de fibras que compõem a segunda
componente. O segundo fator é a possível redução da bainha de mielina proporcionando
uma mudança na faixa de distribuição. E por fim, diminuição da área média das fibras dos
animais tratados, que apresentou resultado estatisticamente menor que o GC. A segunda
componente do potencial de ação composto, é dotada principalmente de fibras sensitivas
(BERNE, 2004). Assim, observamos um aumento da quantidade de fibras sensitivas e uma
possível redução do limiar dessas fibras, caracterizando assim mudanças eletrofisiológicas
(ALVES, 2010) e morfológicas em busca de um novo ponto de homeostase.
Todas essas alterações nervosas mantém uma relação direta com a musculatura
esquelética. Segundo Falempin (1998) um provável gatilho inicial para as mudanças
posterior à imobilização é a alteração do grau da atividade neural sobre o tecido muscular.
Para Seki (2001a, 2001b) a mudança na estrutura proteíca da musculatura esquelética
analizada após três semanas de imobilização articular, têm estreita relação com as
modificações na modulação do limiar dos motoneurônios do referido músculo. Sugere-se
ainda que estas alterações nos motoneurônios devam ter início muito antes do final de três
semanas de imobilização.
Lima (2007) observou que apenas sete dias de imobilização foi o suficiente para
promover importantes adaptações de sarcômero e alterações na morfometria e mecânica
da musculatura esquelética de ratos. E na mesma linha de curtos períodos de imobilização
Chingui (2008), estudando alterações químicas e metabólicas, mostrou que ocorrem
mudanças a nível muscular como o conteúdo de glicogênio, o percentual de hidratação do
43 músculo, a concentração de DNA, a concentração de proteínas totais e o peso muscular.
Essas mudanças foram observadas até o terceiro dia de imobilização ficando evidente que
apenas um dia é possível observar alterações metebólicas.
Tendo em vista que houve degeneração e regeneração em resposta à mera
imobilização, sem acometimento simultâneo de outra patologia, e dada a rapidez das
alterações musculares na ausência de movimentação, acredita-se que a imobilização, ao
provocar adaptações no tecido muscular esquelético gera novas demandas nervosa.
Assim, de forma aferente, a plasticidade neural possivelmente provocou modificações
morfológicas nas fibras do nervo isquiático, atendendo a nova demanda.
Assim temos duas linhas de processos que foram evidenciadas nesse trabalho. A
primeira está intimamente ligada à degeneração e a outra se reporta à regeneração.
Sugere-se que a junção dessas duas linhas culminou na adaptação. Como adaptação é
definida literalmente como “Processo que permite torna-se mais apto a sobreviver no
ambiente” (AURÉLIO, 2008), no presente caso resta demonstrar os componentes
adaptativos do processo.
Assim, os achados supracitados são sugestivos de plasticidade neural com
brotamento colateral, uma adaptação neural ao novo padrão funcional.
44
7 CONCLUSÃO
Com esse trabalho foi possível concluir que a imobilização foi suficiente para que o
tecido nervoso periférico sofresse alterações.
Concluiu-se também que, como houve, em resposta à imobilização, degeneração e
regeneração com característica de “cluster” axonal, um processo de reparação, o processo
como um todo pode ser caracterizado como um processo adaptivo, de plasticidade
neuronal, portanto.
Concluiu-se ainda que o período de imobilização relativamente curto ao qual os
animais foram submetidos foi o suficiente para que o tecido nervoso periférico sofresse
adaptações, diminuindo a quantidade de fibras com maior diâmetro e aumentando as fibras
com menor diâmetro.
45
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50
ANEXO
ANEXO A-
Limb immobilization alters functional electrophysiological
parameters of sciatic nerve J.S.M. Alves1, J.H. Leal-Cardoso1, P.S. Carlos1, C. M. Lucci, S. N. Báo 3, V.M. Ceccato1and R. Barbosa2 1Instituto Superior de Ciências Biomédicas, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brasil 2Mestrado em Bioprospecção Molecular, Universidade Regional do Cariri, Crato, CE, Brasil
3 Instituto de ciências Biológicas, Universidade de Brasília, Brasília, DF, Brasil
Key words: Immobilization; Sciatic nerve; Compound action potential; Conduction velocity;
Rheobase; Chronaxy.
Acknowledgments We are thankful to Doctor Daniel Weinreich for the orthographic revision. Research supported by CNPq, CAPES and FUNCAP. Address for correspondence: J.H. Leal-Cardoso Instituto Superior de Ciências Biomédicas Universidade Estadual do Ceará Av. Paranjana, 1700 Campus Itaperi 60740-000 Fortaleza, CE, Brasil Tel: +55-85-3101-9810 E-mail: lealcard@yahoo.com
51 Abstract
Immobilization used in clinical practice to treat orthopedic and traumatological problems,
cause changes in muscle but it is not known whether changes also occur in nerve. We
therefore investigated the effects of immobilization on excitability and compound action
potential (CAP) of the rat sciatic nerve. Fourteen days after immobilizations of the right leg
of adult Wistar rats, rats were euthanized and right sciatic nerves were dissected, mounted
in a moist chamber. Nerves were stimulated at a baseline frequency of 0.2 Hz and, tested
for 2 min periods with at 20, 50 and 100 Hz. Immobilization significantly altered nerve
excitability: rheobase and chronaxy changed from 3.13 ± 0.05 V and 52.31 ± 1.95 µs (N =
15), respectively, (controls) to 2.84 ± 0.06 V and 59.71 ± 2.79 µs (N = 13). Immobilization
decreased the amplitude of first CAP wave (from 7.03 ± 0.50 mV (control) to 4.92 ± 0.49
mV) but increased second CAP wave (from 3.15 ± 0.52 mV (control) to 4.87 ± 0.51 mV (N =
15)). Immobilization also changed the conduction velocity of the first CAP wave (from 93.63
± 7.49 m/s (control) to 79.14 ± 5.59 m/s) but not the conduction velocity of the second CAP
wave. Increases in frequency of stimulation caused a decrease in CAP amplitudes but
immobilization did not change the frequency-induced amplitude depression for the first and
second wave. At the electron microscopy inspection, the morphological structure of sciatic
nerves of immobilized limbs showed an axonal degeneration. This alteration was
predominantly a defragmentation of the myelin sheet and loss of integrity of the respective
axon. In conclusion, here we have demonstrated that long-lasting leg immobilizations can
induce alterations in nerve function.
Key words: Immobilization; Sciatic nerve; Compound action potential; Conduction velocity;
Rheobase; Chronaxy.
52
Introduction
Peripheral nerves are frequent targets of traumatic injuries, such as crushing,
compression, stretching, avulsion and partial or full section, resulting in impaired nerve
impulse transmission and reduction or loss of sensation and motor function in the
innervated area. The magnitude of changes to the nerve function depends upon the nature
of the injury, timing, type and diameter of the affected nerve fibers (1,2). Traumatic injuries
lead to partial or total disability of memberlimb that removes the patient from their usual
activities for long periods of time (3). As a part of the healing process neuromuscular
plasticity develops. As an important component of the neural basis of control of movement,
plasticity also occurs as a result of alterations of functional use of neuromuscular body
components, within the normal range of function (3).
Traumatic injuries and their treatments can frequently lead to long lasting limb
immobilization. Since the control of movement and associated neuromuscular plasticity
depends on the continued response of the nervous system activity, neuromuscular plasticity
is expected to occur with simple immobilization. Indeed, it is already documented that long
lasting body immobilization causes skeletal muscle atrophy (4,5) and it would be predicted
that functional alterations to nerve are likely to occur. It is also known that innervations is
critical for the functional and structural integrity of muscle (6,7), with nerve function
degeneration causing loss of muscle weight and ability to generate muscle force (8,9).
Thus, since simple immobilization may cause a negative plasticity in nerve, it is important to
elucidate whether functional alterations occur in nerve as a result of simple immobilization.
If they do occur, it is important to elucidate the underlying mechanism in order to
understand the contribution of negative plasticity on nerve due to immobilization in
traumatic injury healing process.
53
Few studies exist in the literature that assesses immobilization-induced alteration of
physiological and morphological parameters of the sciatic nerve. Since long lasting limb
immobilization is frequent in clinical practice, the objective of the present study was to
elucidate whether immobilization induces alterations of electrophysiological parameters
related to excitability of peripheral nerves and the mechanism. In the present work, we
examined whether immobilization of the right hind paw of the rat for 14 days would alter
electrophysiological and morphological properties of the sciatic nerve. We found that this
experimental condition alters the excitability of this nerve as demonstrated by modifications
of rheobase, chronaxie and various parameters of the compound nerve action potential and
induces axonal and myelin sheet degeneration (CAP).
Materials and methods
Dissection, tissue preparation and immobilization p rotocol
Male Wistar rats (Rattusnorvegicus, 180-200g) were used. All animals were in
compliance with the Guide for Care and Use of Laboratory Animals, published by U.S.
National Institutes of Health (NIH publication 27-89, revised 1996; http://www.nap.edu) to
minimize the suffering. All procedures described here were analyzed, and received the
approval of the Ethics Committee for Animal Use at the State University of Ceara, project
number nº 08351783-9.
Immobilization was performed using the method described by Santos-Junior et al.,
2010 (10). Briefly, the rats were first anesthetized with ketamine 60 mg/kg and xylazine 8
mg/kg of body weight intraperitoneally. A control group received no immobilization and
another group underwent immobilization of right hind leg (immobilized group) using
54 waterproof tap wrapped around the pelvis, hip, knee and ankle in order to achieve full leg
immobilization.
At the end of treatment (14 days immobilization), the rats were sacrificed by cerebral
concussion and the right sciatic nerve (SN) was dissected. The tissues were then
immediately placed in Petri dishes containing refrigerated Locke solution. Afterwards,
nerves were mounted in a moist chamber and used the same day of dissection for
recording of compound action potential. Petri dish and moist chamber contained modified
Locke’s solution, whose composition was (in mM): NaCl 140, KCl 5.6, MgCl2 1.2, CaCl 2.2,
Tris (hydroxymethyl-aminomethane) 10 and glucose 10. The pH of the Locke solution was
7.4. The experiments were performed at room temperature (18-22 °C), and all salts were
purchased from the Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA) or Reagen (Rio de Janeiro,
Brazil) and were of analytical grade.
Electrophysiological recording
The sciatic nerve (SN) was stimulated and evoked CAP was recorded as described
by Lima-Accioly et al. (2006) (11). Briefly, the SN was mounted in a moist chamber and one
of its ends was stimulated with electrical pulses at a frequency of 0.2 Hz (baseline
frequency). A 100 µs, 40 V pulse was delivered by a stimulus isolation unit (Model
SIU4678, Grass Instruments Co., Quincy, MA, USA) connected to a stimulator (Model S48,
Grass Instruments Co., Quincy, MA, EUA). Evoked CAPs were recorded with platinum
electrodes placed 4-5 cm from the stimulation electrodes. The recording electrodes were
connected to an oscilloscope (Model 547, Tektronix, Inc., Portland , OR, USA) through a
high input impedance amplifier (model AM 01/UECE) specially configured and produced in
the laboratory to meet the needs of the research. Digidata 1200 acquisition of computer
hardware (Axon Instruments, Inc., Union City, USA) and AxoScope software (Axon) were
55 used for data capture and analysis. In order to measure conduction velocity of a given CAP
wave we divided the distance between the stimulating and recording electrodes by the time
elapsed between the initiation of the stimulus and the time when the positive peak of that
wave was reached. Strength-duration curves with constant-voltage square waves were
used to determine rheobase and chronaxy (12). Rheobase was measured as the threshold
stimulus voltage for an active response with a long-duration pulse (1000 µs) and chronaxy
as the pulse-width corresponding to twice the rheobase.
Nerves were first stimulated at 0.2 Hz for 120 min, a time period sufficient achieve
stable recording, then the measurements of CAP parameters were done. Nerves that
showed no change in CAP amplitude during the last 30 min were included in the study.
Subsequently, we recorded CAPs evoked at 20, 50 and 100 Hz. Each stimulation period
lasted two min; with 5 min intervals of 0.2 Hz stimulation.
Methodology Preparation for TEM
The animal was anesthetized and perfused with 4% paraformaldehyde. After
perfusion the distal sciatic nerve was dissected and fixed in Karnovsky for 3h, at room
temperature. Post-fixation was done with osmium tetroxide 1% during one hour in the
dark.The contrast was made "in bloc" and the tissue was dehydrated in bathwith increasing
acetone concentration. After dehydration the tissue was embedded in Spurr-s resin. Inorder
to cut tissue slices 70nmthick, a diamond knife was used and imager visualization and
analysis was done in TEM JEOL JEM 1011.
Statistics
Results are presented as the mean +s.e. of mean, with (n) indicating the number of
experiments. Values were analysed using Student’s t test, or ANOVA followed by a contrast
56
test, or a non-parametric test, as appropriate. Results were considered significant at
p < 0.05.
RESULTS
Electrophysiological alterations
The 14 days immobilization of right hind leg affected body weight and the mass of
the right soleus and gasctrocnemius muscles. The body weight for control and immobilized
groups were 370.3 ± 7.20 g and 297.3 ± 14.55 g, respectively. The soleus of control and
immobilized groups were 0.18 ± 0.004 g and 0.11 ± 0.006 g, respectively. The
gastrocnemius of control and immobilized groups were 2.24 ± 0.133 g and 1.60 ±0.100 g,
respectively. All these alterations were statistically significant (P < 0.05, for each group,
unpaired Student’s t test, N = 15).
Immobilization significantly (P < 0.05, for each group, unpaired Student’s t test, N =
15) increased nerve chronaxy and decreased rheobase, the electrophysiological
parameters more directly related to excitability, from the control values, 52.31 ± 1.95 µs
(Figure 1C) and 3.13 ± 0.05 V (Figure 1D), respectively, to 59.71 ± 2.79 µs and 2.84 ± 0.06
V.
Since excitability was altered by immobilization, we examined whether immobilization
affected the CAP. Typically, under our stimulation and recording conditions, CAPs
consisted of two distinct components or waves (Figure 1A). A 3rd component wave was
frequently observed at the end of the stabilization period, but often it diminished in
amplitude progressively becoming indistinguishable from baseline noise during this period
(Leal-Cardoso et al., 2010). In the present study, we only analyzed the first two waves of
the CAP.
57
We analyzed the effect of immobilization on CAP conduction velocities and
amplitudes in preparations stimulated at a baseline frequency and with higher frequencies.
Immobilization significantly (P<0.05) decreased the conduction velocity of the first wave
(Fig. 1E, ANOVA) but had no significant affect on the conduction velocity of the second
wave (Fig. 1F, ANOVA). The amplitude of the CAP waves were differentially affected by
immobilization: the first component was significantly (P < 0.05, ANOVA) decreased (Fig 1G)
while the amplitude of the second component was significantly enhanced (Fig 1H, ANOVA).
The amplitudes and the conduction velocities of the first and second CAP waves
were also analyzed for the effect of frequency (0.2 – 100 Hz) on the parameter value.
Concerning both waves, under the same experimental condition (immobilized, for example),
a tendency (without reaching statistical significance, ANOVA) to decreases in conduction
velocity (Fig 1E and 1F) and amplitude (Fig 1G and 1H) with increasing frequency was
observed.
The size of the decreases in amplitude s and velocity of the first and second CAP
components with increasing frequency (0.2 – 100 Hz) in control and in immobilized animals
were also analyzed and depicted in Table 1. Comparing the size of the decrease in velocity
with that in amplitude, for the first and second components, proportionally, with increase in
frequency the size of the decrease was larger for the amplitude than for the frequency (95
% confidence interval), independent of the condition. Comparing the size of the decrease
inside a given parameter for different conditions, the decrease in amplitude and conduction
velocity for the first component were proportionately larger (without reaching statistical
significance, however) in animals with a limb immobilized as compared to controls (Table
1). Concerning the second component, the alteration of conduction velocity with increase in
frequency was proportionally the same in control and in immobilized condition; for the
58 alterations of amplitudes, the decrease in amplitudes with increase in frequency was
smaller in immobilized than in controls (Table 1).
Morphological alterations
At the electron microscopy inspection, the morphological structure of sciatic nerves
of immobilized limbs showed an axonal degeneration. This alteration was predominantly a
defragmentation of the myelin sheet and loss of integrity of the respective axon. This
degeneration inflicted predominantly the axons with the largest diameter (Fig 2). An
increase in the number of small and medium size diameter axons was observed (Fig 3). A
large number of these small and medium size diameter axons showed a cluster
organization suggestive of regenerative process (Fig 4).
Discussion
The major discovery of the present study is that immobilization causes alterations of
the excitability and of the morphological structure of a peripheral nerve of the non mobilized
limb. It is already reported that long last immobilization causes decrease of functional
performance and atrophy of muscles of the non mobilized limb (4,5,10), but no studies were
available to functional and morphological nerve parameters. Surprisingly and contradictorily
to what is expected based on analogy with skeletal muscle, an stimulatory effect on a basic
parameter to measure excitability, the rheobase, was found. This adds relevance to the
data here presented. Not less surprising was the pattern of the axonal and myelinic
degeneration, affecting predominantly the axons with the largest diameters, and of the
regeneration,which was characterized by the appearance of clusters of axons with medium
size diameter. To the best of our knowledge, this is the first time that this is reported.
59
In order to diminish the scars and ulcerations of the non mobilized limb we
developed adaptations of the immobilization procedures (4,5,10). To assure that our
method was able to promote the expected effects on muscles, we weighed the
gastrocnemius and the soleus muscle. Both underwent a significant decrease in muscle
mass. We also measured body weight, which was decreased. These data agree with the
literature (4,5) and assure that the nerve alterations were really obtained in a situation of
appropriate limb immobilization.
Concerning the decrease in rheobase value, which shows an increase in excitability,
it may result from alterations of several factors related to active or passive properties of the
axons. It may result from leakage conductivity and membrane time constant, geometric
factors and voltage-dependent sodium conductance alterations (12). Geometric factors are
believed not to play a role, since all procedures related to the nerve placement and
chamber preparation for recording are the same in control and experimental condition. Little
can be advanced about the contribution of the other factors for this increase in excitability.
One aspect of this decrease in rheobase, however, deserves consideration: it is
simultaneous with an increase in chronaxy. If this rheobase diminution was caused only by
primary alteration of active factors related inward Na current, without membrane time
constant modification, then a decrease in voltage threshold for firing would imply alterations
in rheobase and chronaxy in the same direction, it is to say, decrease for both values in the
present case. This did not occur suggesting that a primary increase in membrane time
constant occurred. It is the membrane resistance or membrane capacitance which
determines the membrane time constant (13,14). Therefore one of these parameters or
both are likely to be altered in immobilization.It is known that axonal myelination decreases
membrane capacitance (12). Electron microscopy data showed that demylination occurred
and gave support to the hypothesis of a primary increase in membrane capacitance.
60
Immobilization had a depressive effect on both the amplitude and the conduction
velocity of the first CAP component, yet on the second component it caused increase in
amplitude and did not affect conduction velocity. It is difficult to analyze the causes of
modifications of first and second component with the data available. This is because
modifications in CAP component waves may result from modifications at the level of
individual axons, like the dV/dt of intracellular axonal action potentials, and from action
potential population parameters, like the synchronization of intracellular axonal action
potentials on the nerve (15, 16). At the first interpretation of electrophysilogical data, it is
tempting to conclude that lack of mobilization acted with different mechanisms in the two
components, so as to promote nearly opposite effects. This hypothesis was supported by
electron microscopy data. The myelin degeneration affected predominantly the axons with
the largest diameter, which explains the decrease in velocity and amplitude of the first wave
of the action potential. The increase in the number of small and medium size diameter
axons partially due cluster organization suggestive of regenerative process (Fig 3) explains
the increase in amplitude of second component without alteration of conduction velocity.
Based on the velocity of conduction and on classifications of mammalian nerve fibers (22),
for the two components rat CAP of sciatic nerve we suggest that the first consists of
contribution of Aα and Aα/β fibers (30–120 m/s) and the second component consists of Aγ
fibers (15–30 m/s) (17, 18 and 19). This would lead to the conclusion that, regarding
myelinated fibers, immobilization affects predominantly and depressively Aα and Aβ fibers.
We cannot exclude the possibility that an alternative mechanism might have
contributed to the increase in second component amplitude. It is the fact that the
contribution of an action potential of a given axon to any component depends on its
conduction velocity. Therefore, with a decrease in conduction velocity proportionally uniform
for all axons, the first component only loses contribution. The second component, however,
61 whilst likely also losing, probably wins the contribution of the axons which previously
contributed to the first component with the lowest velocity of conduction and underwent
further decrease in velocity.
It is documented that stimulations at frequencies ≥ 50 Hz and lasting minutes cause
a decrease in action potential amplitude and conduction velocity. This depressive effect has
been attributed to reversible micro-alterations of the structure of the node of Ranvier (20).
Since we observed degeneration at electron microscopy, we investigated whether
depressive effect on CAP parameters by stimulation at high frequency was amplified. Our
data here, in accordance with the literature, showed a depressive effect on CAP. The
depressive effect on velocity of conduction seemed to be more pronounced on
immobilization, since at 100 Hz velocity of the first and second CAP component decayed
more in this condition than in control (Table 1). To the velocity of conduction, however, the
sizes of the decrease at 100 Hz was larger for the first and smaller for second component.
We have no explanation for that so far.
In conclusion, here we have demonstrated that long lasting immobilizations have
depressive effect on nerve function. The data here presented suggest various facts and
raises several questions with clinical implications. This study shows that not only the
muscles but, at least in rats, the nerve function deteriorates with long lasting
immobilizations. This brings the question whether the same happens in humans and, if it
does, how to stimulate the nerve and not only muscles to achieve good nerve preservation.
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65
TABLE AND FIGURE LEGENDS
Table 1. Comparing amplitude and velocity of the first component for control versus
immobilized in different frequency. Data are reported expressed as absolute values
percentage (%) 0,2 Hz compared whit 100 Hz . With 95% confidence interval for %
decrese and mean of absolute value at 0.2 Hz (n=15 per group).
Figure 1. Effect of immobilization on compound action potential (CAP) parameters. Panels
show: A and B, representative CAP tracings in control (A) and immobilization (B) conditions;
C and D, chronaxy (C) and rheobase (D) in control and immobilized rats. E, F, G and H
panels show: velocity of conduction of first (E) and second (F) components and positive
amplitude of first (G) and second components (G) of CAP at different frequencies in control
and immobilized rats. Data are reported as mean±S.E.M. (n=15 per group). * indicates
P<0.05 ANOVA followed by Bonferroni's post-hoc test.
Figure 2 (frame 2). Immobilization-induced degeneration of myelin sheet of large diameter
axons of
the sciatic nerve. A, control axons; B, axons of nerve of immobilized limb of rat. The arrows
in B show axons with the myelin sheet undergoing degeneration.
Figure 3-Freuquency distribution of fibers diameters. Measurement done one 130 and 120
fibers in control experimental condition respective. D,diameter; C, control; I, immobilized.
66 Figure 4 (frame 5). Regeneration of myelin sheet of axons of the sciatic nerve of
immobilized limb of rat. A, control axons; B, axons of nerve of immobilized limb of rat. The
arrows in B show axons with the myelin sheet undergoing regeneration. Observe the
pattern of cluster for regenerating axons.
67
B
C D
E F
G H
A
Figure 1.
68
fig 2: imagens degeneração
fig 3: gráfico da distribuição de frequência " em anexo PPT" fig:4 imagens regeneração
69
Table 1. Control Group Immobilized Group
Parameter
Mean ± SEM*
of Absolute Value at 0.2 Hz
Decrease observed at
100 Hz (in % of
value at 0.2 Hz)
(CD100)
95% confidence interval for % decrease
Mean ±
SEM* of
Absolute Value
at 0.2 Hz
Decrease observed at
100 Hz (in % of value
at 0.2 Hz) (ID100)
95% confidence interval for % decrease
Diference in decrease from immobilized to
control observed at 100 Hz
(ID100-CD100)
Velocity 1st Component
(m/s) 93.63 ± 7.49 16.94%
12.61 - 21.26
79.14 ± 5.59 22.08%
13.62 - 30.55
5.15
Amplitude 1st Component
(mV) 6.98 ± 0.49 28.79%
23.40 - 34.19
4.60 ± 0.45 35.84%
30.94 - 40.73
7.04
Velocity 2nd Component
(m/s) 32.46 ± 1.55 17.30%
14.63 - 19.97
32.85 ± 2.00 21.64%
18.50 - 24.79
4.35
Amplitude 2nd Component
(mV) 3.25 ± 0.30 37.88%
31.92 - 43.84
4.91 ± 0.69 33.95%
28.76 - 39.15
-3.93
* 13 ≤ N ≤ 15
1
Recommended