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PESQUISA DA INTERAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DO
EGFR E DA COX-2 NOS TUMORES DE MAMA DA
CADELA
MARIA JOÃO GONÇALVES GUIMARÃES
Dissertação de Mestrado em Oncologia
2012
PESQUISA DA INTERAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DO EGFR E
DA COX-2 NOS TUMORES DE MAMA DA CADELA
Maria João Gonçalves Guimarães
Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em
Oncologia submetida ao Instituto de Ciências
Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto.
Orientador – Profª Doutora Felisbina Queiroga
Categoria – Professora Auxiliar com Agregação
Afiliação – Departamento Ciências Veterinárias –
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Co-orientador – Prof. Doutor Carlos Lopes
Categoria – Professor Catedrático Jubilado
Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas Abel
Salazar da Universidade do Porto
Co-orientador – Profª Doutora Isabel Pires
Categoria – Professora Auxiliar
Afiliação – Departamento de Ciências Veterinárias –
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
i
Dedicatória
Dedico este trabalho às pessoas que mais amo nesta Vida e que tenho a graça, o
prazer e a enorme felicidade de ter ao meu lado:
Ao Rui, meu marido, meu companheiro, meu melhor amigo, pelo amor e amizade que
me dedica, pela compreensão e paciência que lhe exijo, pela dignidade e integridade que
lhes são marcantes, pela inteligência e cultura que transmite… por ser como é… pois não
o queria diferente.
Aos meus Pais, pela compreensão e auxílio que sempre me deram, por me amarem
incondicionalmente mesmo quando tenho mau feitio, pelo exemplo de Vida que são e
sempre foram para mim. Tenho orgulho em ser vossa filha.
Ao meu filho ou filha, pois ainda não sei se será menino ou menina, mas que me
acompanhou nestas últimas semanas de redação da tese, fazendo a sua parte: não me
dando muitos enjoos e fazendo-me esboçar um sorriso sempre que lembrava que uma
vida crescia dentro de mim. Já é para mim o motivo de maior orgulho e felicidade… deu
sentido à expressão amor incondicional.
Aos meus animais de quatro patas, Mel, Pompeu e Mia que, apesar de não serem
pessoas, enchem o meu coração e a minha casa. Pela amizade e momentos de
felicidade que me proporcionam.
ii
Agradecimentos
Ao longo da realização deste trabalho muitas foram as pessoas que contribuíram com
a sua sabedoria, compreensão, disponibilidade, amizade e paciência. A todas deixo aqui
um obrigado, profundamente sentido e sincero:
À Professora Doutora Felisbina Luísa Queiroga, por ter aceite a árdua tarefa de me
orientar e guiar nesta importante etapa da minha vida. Agradeço a sabedoria, o tempo e a
simpatia investidos. Agradeço a energia e motivação transmitidas e que me fizeram ter
maior interesse e garra pela investigação científica e pela vida em geral.
Ao Professor Doutor Carlos Lopes, por me ter orientado na realização desta tese, pela
gentileza que o carateriza e pelos sábios conselhos e conhecimentos que me facultou.
À Professora Doutora Isabel Pires, minha co-orientadora, pela mestria, amizade,
simpatia e humildade com que sempre me auxiliou. A sua boa disposição, disponibilidade
e carinho em cada gesto, marcaram muito o desenrolar deste trabalho.
À Drª Maria Isabel Carvalho, minha querida colega neste trabalho, por toda a entrega,
boa disposição, disponibilidade, incentivo, conhecimentos, inteligência e experiência
transmitidos. Foi fundamental para a realização deste trabalho… e foi um prazer trabalhar
com ela.
Às Senhoras Lígia Lourenço, Ana e Glória por toda a ajuda dada no trabalho de
laboratório e pela gentileza demonstrada.
À minha companheira de sempre, Ana Paula, amiga de todas as horas, pelo exemplo
de pessoa que é, pela inteligência, persistência, garra e emoção com que defronta a
Vida… é um modelo para mim.
Aos meus colegas de trabalho, por toda a compreensão, preocupação e
disponibilidade demonstradas durante todo o período de realização deste mestrado.
À minha família, por ser a melhor do Mundo, por me fazer sentir a felicidade plena
quando estamos juntos, pela amizade e amor que nos une a todos.
À minha prima Vanda, por ser uma verdadeira irmã, por estar sempre presente, pela
amizade e pela imprescindível ajuda na realização deste trabalho. Sem ti ia ser mais
difícil levar este barco a bom porto.
iii
Resumo
A neoplasia mamária assume-se como a entidade tumoral que mais frequentemente
assola os canídeos do género feminino. Apesar dos reconhecidos progressos médico-
científicos, urge a necessidade de descoberta de modalidades terapêuticas mais
direccionadas e, consequentemente, mais eficazes.
Assim, a pesquisa de marcadores moleculares com potencial como alvo terapêutico
assume um crescente interesse no seio da comunidade científica. Nesse sentido, à
semelhança do descrito em vários tumores humanos e dada a escassez de informação
em tumores mamários de cadela, os objetivos do nosso trabalho consistiram na
determinação da interacção entre as expressões de Cox-2 e EGFR em 43 tumores
mamários malignos de cadela, pelo método da imunohistoquímica, e a sua associação
com características clínico-patológicas.
Os nossos resultados vieram demonstrar a já conhecida associação entre a expressão
de Cox-2 com características de malignidade tumoral, revelando também uma
associação estatisticamente significativa entre a expressão de EGFR e a metastização
nos linfonodos. Foi estabelecida uma correlação positiva e estatisticamente significativa
entre as expressões de Cox-2 e de EGFR. Constatou-se também que tumores com
elevadas expressões de Cox-2 e EGFR apresentavam correlação com características de
malignidade tumoral, nomeadamente grau nuclear (p=0,049), grau histológico de
malignidade (p=0,031) e metastização nos linfonodos (p=0,025).
Os resultados alcançados pelo nosso estudo abrem perspetivas para uma possível
utilização de inibidores seletivos de Cox-2 e de EGFR, no contexto dos tumores de mama
de cadelas.
Palavras-chave: tumores de mama, EGFR, COX-2, imunohistoquímica, alvo terapêutico.
iv
Abstract
The mammary tumor is assumed as the oncological entity that most often plagues
female dog. Despite the recognized scientific medical progress, there is an urgent need
for discovery of therapeutic modalities more targeted and therefore more effective.
Thus, the research of molecular markers with potential as a therapeutic target assumes
a growing interest within the scientific community. Accordingly, as described in a number
of human tumors and given the lack of information on canine mammary tumors, the
objectives of our work consisted in determining the interaction between the expressions of
Cox-2 and EGFR, in 43 malignant mammary tumors of bitch by the method of
immunohistochemistry, and its association with clinicopathological characteristics.
Our results showed the already known association between the expression of Cox-2
with characteristics of malignancy, revealing also a statistically significant association
between EGFR expression and presence of metastasis in lymph node. We established a
positive and statistically significant correlation between the expression of Cox-2 and
EGFR. It was also found that tumors with high expression of Cox-2 and EGFR were
correlated with characteristics of malignancy, such nuclear grade (p=0,049), histologic
grade of malignancy (=0,031) and metastasis in lymph nodes (p=0,025).
The results achieved by our study open perspectives for a possible use of selective
inhibitors of COX-2 and EGFR, in the context of mammary tumors in female dogs.
Keywords: mammary tumors, EGFR, COX-2, immunohistochemistry, therapeutic target.
v
Índice Geral
INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 1
1.1- Anatomia da glândula mamária .......................................................................... 2
1.2- Etiopatogenia ...................................................................................................... 3
1.3- Etiologia Hormonal ............................................................................................. 5
1.3.1- Receptores de estrogénio ........................................................................................................ 5
1.3.2- Receptores de progesterona.................................................................................................... 6
1.3.3- Hormona do crescimento (GH) e factor I de crescimento tipo insulina (IGF-I) ....................... 6
1.3.4- Prolactina ................................................................................................................................. 7
1.4- Factores de prognóstico clínicos e histopatológicos ........................................... 7
1.5- Marcadores Moleculares..................................................................................... 9
1.5.1- Cox-2 ...................................................................................................................................... 10
1.5.2- EGFR ....................................................................................................................................... 12
1.5.3- Cox-2 e EGFR .......................................................................................................................... 14
1.6- Breve abordagem de modalidades de tratamento .............................................15
OBJECTIVOS DO TRABALHO EXPERIMENTAL ................................................................................... 18
MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................................... 19
3.1- Descrição do material utilizado e sua proveniência ...............................................19
3.2- Métodos ................................................................................................................19
3.2.1- Avaliação clínico-patológica ................................................................................................... 19
3.2.2- Avaliação histopatológica ...................................................................................................... 19
3.2.3- Avaliação imunohistoquímica ............................................................................................... 21
3.2.3.1- Procedimento ...................................................................................................................... 22
3.2.3.2 - Métodos de avaliação e quantificação da imunorreactividade ......................................... 23
3.2.4 - Análise estatística .................................................................................................................. 25
RESULTADOS .................................................................................................................................... 26
4.1- Análise descritiva da amostra em estudo ..............................................................26
4.1.1. Variáveis clínico-patológicas .................................................................................................. 26
4.1.2- Imunoexpressão da Cox-2 e do EGFR nos tumores mamários caninos ................................. 28
4.1.3- Associação da Cox-2 e do EGFR com as variáveis clínico-patológicas ................................... 37
4.1.4- Relação entre a expressão de Cox-2 e de EGFR (associação e correlação) ........................... 39
4.1.5- Associação entre a imunoexpressão de Cox-2 e EGFR com as variáveis clínico-patológicas 40
vi
DISCUSSÃO ....................................................................................................................................... 43
CONCLUSÃO ..................................................................................................................................... 51
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................... 52
vii
Índice de Figuras
Figura 1: Anatomia das glândulas mamárias.……………………………….…………………2
Figura 2: Imunorreactividade para EGFR, em carcinoma tubulopapilar, com localização
predominantemente membranar……………………………………………...........................28
Figura 3: Pormenor da imagem anterior…………………………………………………........29
Figura 4: Imunorreactividade para EGFR em carcinoma tubulopapilar……………………29
Figura 5: Pormenor da imagem anterior………………………………………………….……30
Figura 6: Imunorreactividade para Cox-2, em carcinoma sólido……………………………32
Figura 7: Imunorreactividade para Cox-2,em carcinoma sólido com invasão
vascular…………………………………………………………………………………………...33
Figura 8: Imunorreactividade para a Cox-2 nas células tumorais, que se dispõem em
estruturas tubulares……………………………………………………………………………...33
Figura 9: Imunorreactividade para EGFR, em carcinoma sólido……………………………34
Figura 10: Imunorreactividade para EGFR, em carcinoma sólido com invasão
vascular……………………………………………………………………………………………35
Figura 11: Imunorreactividade para EGFR, de forma difusa e intensa, em carcinoma
tubulopapilar………………………………………………………………………………….…..35
Figura 12: Imunorreactividade para EGFR em carcinoma tubulopapilar………….…….…36
viii
Índice de Quadros
Quadro 1: Atribuição do índice mitótico, segundo o número de mitoses, contado num campo de grande ampliação (400x) com diâmetro de 0,53mm……………………….……20
Quadro 2: Critérios de avaliação do grau histológico de malignidade, segundo Goldshmidt
et al (2011)……………………………………………………………………………………..…21
Quadro 3: Avaliação da imunorreactividade da Cox-2 e do EGFR………………………...24
Quadro 4: Síntese das características da amostra em estudo e respetivas frequências
absolutase relativas…………………………………………………………………………...…27
……………………………………………………………………………………………………..28
Quadro 5: Avaliação da imunoexpressão de Cox-2 e EGFR nos tumores mamários …..31
Quadro 6: Associação entre imunoexpressão de Cox-2 e de EGFR e as variáveis clínico-
patológicas pelo teste de x2………………………………………………………………..……37
Quadro 7: Associação da expressão de Cox-2 com a expressão de EGFR em TMC
malignos…………………………………………………………………………………………..39
Quadro 8: Correlação entre Cox-2-EGFR ………………………………………………….…40
Quadro 9: Relação entre os grupos Cox-2/EGFR e as variáveis clínico-
patológicas…………………………………………………………….………………………….41
Lista de Abreviaturas e Siglas
ix
% - Percentagem
ºC - Graus Celsius
μm - Microlitro
μm - Micrómetro
ANOVA - Análise de variância
cm - Centímetros
DAB - Tetra-hidrocloreto de 3,3’-Diaminobenzidina
dm3 - Decímetro cúbico
EGF - Epidermal growth factor (fator de crescimento da epiderme).
EGFR - Epidermal growth factor receptor (receptor do fator de crescimento epidérmico)
5-FU - 5-Fluorocil
GH - Growth hormone (Hormona do crescimento)
GD - Grau de diferenciação tubular
GHM - Grau histológico de malignidade
GN - Grau nuclear
g - Gramas
HE - Hematoxilina-eosina
HER2/neu - Human Epidermal growth factor Receptor 2
HRP - Sistema de detecção Ultravision de volume Anti-Polivalente
HVUTAD - Hospital Veterinário da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
IGF-I - Insuline-like growth factor-I (Fator I de crescimento tipo insulina)
IgG - Imunoglobulina G
IL - Interleucina
IM - Índice Mitótico
IP- Índice de Proliferação
MAPK - Mitogen-activated protein kinase (proteina cinase activada por mitogéneos)
min - Minutos
mL- Mililitro
MMP - Metaloproteinase de matriz
mRNA - Ácido ribonucleico mensageiro
n - Número de amostras
NSCLC - Non-small cell lung cancer
OMS - Organização Mundial de Saúde
OVH - Ovariohisterectomia
p – Nível de significância estatística
x
PBS - Tampão fosfato salino
PCNA - Proliferating cell nuclear antigen (antigénio nuclear de células em proliferação)
PCR - Polymerase chain reaction
PG - Prostaglandinas
PRL- Prolactina
PGE2 - Prostaglandina E2
PGH2 - Prostaglandina H2
r – Coeficiente de correlação
® - Marca registada
RE - Recetores de Estrogénio
RP - Recetores de Progesterona
seg.- Segundo
SPSS - Statistical Pachage for the Social Sciences
SRD - Sem Raça Determinada
TGFβ - Factor de crescimento tumoral beta
T - Tamanho tumoral
TMC - Tumores mamários caninos
TNF-α - Factor de necrose tumoral alfa
TX - Tromboxanos
UTAD - Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
VEGF - Vascular endothelial growth factor (factor de crescimento do endotélio vascular)
x - Vezes
χ2 - Teste de Qui-quadrado
W - Watts
1
CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO
A incidência de neoplasias nos pequenos animais tem vindo a crescer nos últimos
anos graças a um aumento da esperança média de vida, à semelhança do que ocorre
nos seres humanos (Thuróczy et al., 2007).
A recente sequenciação do genoma canino e a evidência da sua similitude com o
genoma humano, deu ênfase ao cão como um atractivo modelo alternativo para a
investigação do cancro (Lindblad-Toh et al, 2005, Joy et al., 2006). Para isso também
contribuiu o facto de os cães terem um tamanho corporal considerável, uma variabilidade
genética semelhante aos humanos e desenvolverem tumores espontâneos num contexto
de um sistema imunitário natural. Além disso, ao contrário dos animais de laboratório,
estas espécies partilham o mesmo ambiente e estão expostas aos mesmos
carcinogénios, desenvolvendo contudo tumores em menor período de tempo, fruto da sua
menor longevidade comparativamente com as pessoas (Owen et al., 1979; Alenza et al.,
2000; Lee et al., 2004; Uva et al., 2009; Tahmm et al., 2010; Singer et al., 2012).
O desenvolvimento de tumores espontâneos em canídeos e humanos é, portanto, um
fenómeno altamente incidente, partilhando imensas características: aparência histológica,
genética tumoral, alvos moleculares, comportamento biológico, resposta à terapia
convencional (Kumaraguruparan et al., 2006; Paoloni et al., 2008; Uva et al., 2009).
A neoplasia mamária assume-se como o segundo tumor mais frequente em cães,
embora seja o mais frequente em canídeos do género feminino (Stratmann et al.,2008;
Andrade et al., 2010). Considerando ambos os géneros, os tumores mais frequentes são
os de pele (Solano-Gallego, 2010; Sangha, et al., 2011). Os tumores da glândula
mamária raramente ocorrem em cães machos, sendo a sua incidência inferior a 1%, e
parecem estar associados a alterações hormonais, tais como as que ocorrem nos
tumores das células de Sertoli, onde se verifica a secreção de estrogénios (Misdorp,
2002; Rutteman et al.,2001; Henson, 2003). Assim, os tumores mamários constituem a
lesão neoplásica mais comum nas fêmeas da espécie canina, sendo a proporção de
tumores malignos de aproximadamente 41 a 53% (Andrade et al., 2010). Apresentam
uma distribuição multicêntrica e um único animal pode apresentar mais do que um tipo de
neoplasia (Allen et al., 1986). Os tumores mamários em cadelas têm uma incidência três
vezes superior aos tumores da mama nas mulheres (Misdorp, 2002, Cassali et al., 2007)
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
2
1.1- Anatomia da glândula mamária
Normalmente os canídeos têm cinco pares de glândulas mamárias, observando-se
distinta separação na linha média entre as cadeias mamárias direita e esquerda. As
glândulas mamárias estendem-se desde a parte ventral do tórax até à região inguinal
(Evans,1979; Peleteiro, 1994; Tyler, 2002; Ettinger et al.,2010).
A irrigação sanguínea das glândulas mamárias em canídeos provém dos ramos
esternais das artérias torácica interna, intercostal e torácica lateral, da artéria epigástrica
superficial cranial e das artérias epigástrica superficial caudal, epigástrica profunda
cranial, abdominal segmentada, labial, e ilíaca circunflexa profunda. A drenagem venosa
das glândulas é semelhante à irrigação arterial, embora pequenas veias podem cruzar a
linha média entre as glândulas mamárias direita e esquerda. Também os vasos linfáticos
podem cruzar a linha média e assim penetrar nas paredes abdominal e torácica. O
linfonodo axilar recebe a drenagem linfática das glândulas torácicas (cranial e caudal),
enquanto o linfonodo inguinal superficial recebe a drenagem das glândulas abdominais
(craniais e caudais). Os vasos linfáticos da terceira glândula mamária normalmente
drenam através do linfonodo axilar, mas podem fazê-lo por caudalmente (Evans,1979;
Slatter, 1998).
A drenagem pode fazer-se para a veia jugular comum ou formar conexões com os
troncos traqueais e ducto torácico. A mama torácica cranial drena somente para o
linfonodo axilar, através de um canal linfático isolado (Getty, 1986; Sautet et al., 1992;
Rahal et al.,1995). A mama torácica caudal pode drenar apenas para o linfonodo axilar
Figura 1: Anatomia das glândulas mamárias
A - Drenagem linfática das glândulas mamárias: 1 – linfonodos axilares 2 – linfonodo inguinal superficial B - Principal irrigação sanguínea das glândulas mamárias: 3 – ramos esternais da artéria torácica interna 4 – artéria torácica lateral 5 – artéria epigástrica superficial cranial 6 - artéria epigástrica superficial caudal 7 – artéria pudenda externa Fonte: SLATTER (1998)
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
3
(Rahal et al., 1995) ou para o axilar e/ou inguinal (Sautet et al., 1992). A mama abdominal
cranial pode drenar para o linfonodo axilar, inguinal ou ambos (Sautet et al., 1992; Rahal
et al., 1995). A mama abdominal caudal drena apenas para o linfonodo inguinal (Rahal et
al., 1995) ou para o axilar e/ou inguinal (Sautet et al., 1992). A mama inguinal drena
apenas para o linfonodo inguinal (Sautet et al., 1992; Rahal et al., 1995). São evidentes
conexões linfáticas plexiformes entre as mamas torácica caudal e as abdominais, o que
justifica a drenagem da mama torácica caudal para o linfonodo inguinal e da mama
abdominal caudal para o linfonodo axilar (Sautet et al., 1992). As duas mamas torácicas e
a abdominal cranial podem drenar ainda para os linfonodos esternais craniais. Dada a
sua inacessibilidade no contexto cirúrgico, o conhecimento relativo aos linfonodos
esternais craniais é ainda escasso (Sautet et al., 1992). Não se verificam comunicações
linfáticas entre as cadeias mamárias direita e esquerda (Sautet et al., 1992, Rahal et al.,
1995).
Uma grande percentagem de tumores (aproximadamente 75%) ocorre nas glândulas
mamárias inguinais, provavelmente, por terem um maior volume de tecido glandular
(Lana et al., 2007).
1.2- Etiopatogenia
A incidência de neoplasias mamárias aumentou na última década, fenómeno
explicado, entre outras razões, pelo aumento da esperança média de vida dos animais
domésticos (Thuróczy et al., 2007), o que reflete um aumento da eficácia no diagnóstico,
nos tratamentos, bem como uma preocupação crescente dos proprietários pelos seus
animais de companhia (Queiroga et al., 2011).
Segundo Lana et al. (2007), a idade do animal e a probabilidade de desenvolvimento
de tumores mamários variam numa razão directa, sendo que a idade média de
manifestação tumoral, nas cadelas, está entre os 10 e os 11 anos, sendo rara em idades
inferiores a 4 anos.
A predisposição racial não é evidente, embora se tenha verificado uma maior
apresentação destas neoplasias em várias raças Spaniel e, em alguns estudos, também
no Caniche e Dachshund (Rutteman et al., 2001). Outros autores apontam para uma
maior incidência no Caniche, Spaniel inglês, Setter inglês, Pointer, Cocker Spaniel, Fox
Terrier e Terrier de Boston (Cohen et al., 1974; Mitchell et al., 1974; Rutteman et al.,
2001). Curiosamente, os animais das raças Boxer e Beagle são referidos como aqueles
que apresentam menor risco de desenvolverem tumores de mama (Queiroga & Lopes,
2002). O que é evidente é que a incidência de tumores mamários é variável consoante a
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
4
localização geográfica, influenciando a população em causa, em cada estudo (Egenvall et
al., 2005).
Em cães, vários estudos sugerem um maior risco de desenvolvimento de tumores
mamários associado à obesidade, principalmente juvenil (Pérez-Alenza et al., 1998;
Lana et al., 2009; Cleary et al., 2010). Assim, um animal com condição corporal 2,
considerado magro, entre os 9 e os 12 meses de idade, pode ver diminuído o risco de
desenvolvimento deste tipo de tumores na idade adulta (Sonnenschein et al., 1991;
Queiroga & Lopes, 2002). O papel da obesidade no desenvolvimento destas neoplasias
parece resultar das acções levadas a cabo pelos estrogénios, leptina e adiponectina
(Cleary et al., 2010). Graças à actividade da aromatase presente no tecido adiposo, que
promove a conversão dos androgénios em estroma, este tecido assume-se como uma
importante fonte de estrogénio, nomeadamente o 17β-estradiol. Assim sendo, um
aumento do tecido adiposo pode ter como consequência uma maior exposição das
glândulas mamárias ao estrogénio (Simpson & Zhao, 1996). Descobertas recentes em
Medicina Humana vêm atribuir um papel de relevo à adiponectina e leptina, substâncias
adipocitoquinas produzidas no tecido adiposo e cujas concentrações se alteram mediante
o peso corporal, influenciando o desenvolvimento e progressão destas neoplasias (Rose
et al., 2004; Barb et al., 2006; Hou et al., 2007). Desta feita, quando o peso e o índice de
massa corporais aumentam, os níveis séricos de leptina aumentam e de adiponectina
diminuem (Schindler et al.,2006; Behre et al., 2007). De esclarecer que a leptina inibe a
apoptose e estimula a proliferação celular (Artwohl et al.,2002; Fujita et al., 2002),
enquanto a adiponectina reduz a proliferação celular e promove a apoptose, actuando de
forma inversa à primeira (Dieudonne et al., 2006; Arditi et al., 2007).
A dieta caseira, com proporções elevadas de carnes vermelhas, está associada a um
maior risco de desenvolvimento de tumores mamários, bem como displasias (Pérez-
Alenza et al., 1998). Estudos epidemiológicos em humanos demonstram que uma dieta
rica em gordura e uma condição corporal obesa aumentam o risco de tumores mamários
(Lana et al., 2009). As mulheres que tenham mutações nos genes BRCA1 ou BRCA2,
que percam peso entre os 18 e os 30 anos, têm uma redução de 34% no risco de
desenvolvimento de cancro da mama (Kotsopoulos et al., 2005).
Contrariamente ao que acontece na mulher, na cadela não se consegue estabelecer
nenhuma relação entre a gravidez em idades mais prematuras e a diminuição do risco de
desenvolvimento tumoral (Rutteman et al., 2001). Também não se descortinou nenhuma
associação entre as irregularidades do ciclo éstrico e o aparecimento de neoplasias e não
há consenso, entre os diferentes autores, no que diz respeito ao efeito da lactação no
desenvolvimento destes tumores (Hellmén et al.,1993; Misdorp, 2002).
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
5
1.3- Etiologia Hormonal
Considera-se que a etiologia dos tumores mamários da cadela (TMC) é multifactorial,
envolvendo agentes exógenos e agentes endógenos. Destes últimos destacam-se, pela
evidência dos resultados obtidos, o papel das hormonas na tumorigénese (Pérez-Alenza
et al., 2000).
A etiologia hormonal está bem definida nos tumores de mama canina, tendo em conta
que fêmeas inteiras têm um risco 4 vezes superior de desenvolverem tumores,
comparativamente com fêmeas ovariohisterectomizadas antes dos dois anos de idade,
para além do facto dos cães machos raramente serem acometidos por esta neoplasia. A
ovariohisterectomia (OVH) realizada antes do primeiro estro reduz o risco de
desenvolvimento da neoplasia mamária para 0,5%; este risco aumenta significativamente
nas fêmeas esterilizadas após o primeiro ciclo éstrico (8,0%) e o segundo (26%). A
protecção conferida pela OVH desaparece após os dois anos e meio de idade, quando
nenhum efeito é obtido (Schneider, 1970; Fonseca & Daleck, 2000; Egenvall et al., 2005;
Munson e Moresco, 2007).
Os avanços da imunohistoquímica vieram dar ênfase a isto mesmo, na medida em que
permitiram identificar e caracterizar receptores de estrogénio (RE) e de progesterona
(RP) em lesões mamárias benignas e malignas. (Rutteman et al., 1988; Soremno, 2003;
Martin de las Mulas et al., 2004)
1.3.1- Recetores de estrogénio
Segundo Sorenmo (2003), a maioria dos TMC, benignos e malignos, apresenta RE,
existindo uma relação inversa entre a expressão destes receptores e o grau de
diferenciação histológica, à semelhança do que ocorre em seres humanos.
Tumores epiteliais benignos e carcinomas bem diferenciados apresentam
frequentemente positividade para RE, enquanto tumores pouco diferenciados ou
anaplásicos tendem a ser negativos para este recetor hormonal (Soremno, 2003; De las
Mulas et al., 2005).
Estão descritas duas isoformas de RE: REα e REβ. Uma reduzida expressão de REα
nos tumores de mama de cadela parece estar relacionada com um pior prognóstico, em
tumores de grande tamanho e com ulceração. Por sua vez, tumores positivos a REβ são
mais frequentemente benignos do que malignos. A elevada expressão de REβ em
tumores malignos com baixo grau de malignidade sugere que este parâmetro pode ser
um factor de bom prognóstico (De las Mulas et al., 2005; Saji et al., 2005).
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
6
1.3.2- Recetores de progesterona
A progesterona participa activamente no desenvolvimento da mama, promovendo a
expansão das unidades terminais ductais lobulares, quer durante a puberdade quer na
gestação (Anderson, 2002).
Nos canídeos, o tecido mamário normal, lesões hiperplásicas e lesões benignas é
comum expressarem RE e RP. No geral, na presença de tumores benignos o mais
comum é encontrar-se positividade para ambos os recetores: REα+/RP+, enquanto que
em tumores malignos, é mais frequente o seguinte status: REα-/RP+. (Chang et al., 2009)
À medida que a doença progride com subsequente metastização, os tumores malignos
tendem a perder a sua dependência hormonal, pelo são frequentemente negativos para
os RE e os RP. À semelhança do verificado nas mulheres, um perfil RE-/RP- encontra-se
associado a um pior prognóstico (Knight et al., 1977; Rutteman et al., 1988; De las Mulas,
2005).
1.3.3- Hormona do crescimento (GH) e factor I de crescimento tipo insulina (IGF-I)
A GH é uma hormona que actua de forma autócrina e parácrina na glândula mamária,
funcionando como um factor de crescimento local, contribuindo para a proliferação e
diferenciação desta glândula na fase lútea do ciclo éstrico e no contexto de uma
gestação. Um aumento da multiplicação celular por atuação desta hormona pode ser
responsável por uma maior susceptibilidade mamária à transformação neoplásica
(Leeuwen et al., 2000; Kleinberg et al., 2009). Na espécie canina, foi observado que a
produção local de GH pela glândula mamária é induzida pela estimulação com
progesterona. Lantinga-van Leeuwen et al. (2000), pelo método da imunohistoquímica,
demonstrou existir uma co-localização de RP e GH nas amostras tecidulares de glândula
mamária normal, indicando que a existência de RP pode ser uma condição prévia para a
expressão do gene que codifica para a GH. Esse mesmo estudo confirmou que os RP
podem estimular a expressão de GH de forma indirecta, fazendo com que o promotor do
gene GH se torne disponível para a ligação com outros factores de transcrição, e de
forma directa, activando este promotor. Para além disso, denotaram a ausência de
marcação para RP em alguns tumores GH positivos, uma vez que, em estados mais
avançados de doença neoplásica, a expressão do gene que codifica para estes
receptores tende a perder-se.
O IGF-I parece estar envolvido no desenvolvimento normal da glândula mamária,
servindo de mediador das acções da hormona de crescimento (Laban et al., 2003). O
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
7
IGF-1 induzido pela GH é necessário para permitir a acção dos estrogénios e da
progesterona na glândula mamária.
O eixo GH/IGF-1 parece desempenhar um papel distinto nos TMC, bem como um
papel prognóstico neste tipo de neoplasia. Este último dado é baseado na constatação
que níveis séricos de GH e IGF-1, bem como a sua concentração nos tecidos malignos,
avaliados num período pré-cirúrgico, estão relacionados com uma redução da
sobrevivência pós-cirúrgica. Os níveis séricos de IGF-1, em cadelas com tumores
malignos, eram substancialmente mais elevados do que em cadelas sem neoplasia
(Queiroga et al., 2010).
1.3.4- Prolactina
Nos canídeos, as hormonas esteróides e a prolactina atuam como factores de
crescimento local nos tumores mamários malignos, estimulando a proliferação celular. É
provável que esta hormona seja, em parte, produzida localmente pelas células que
sofreram transformação neoplásica, actuando de forma autócrina e parácrina nesta
glândula (Queiroga et al., 2005).
1.4- Factores de prognóstico clínicos e histopatológicos
No contexto dos TMC estão descritos diversos factores reconhecidos pelo seu valor
prognóstico, nomeadamente: tamanho tumoral, metastização nos linfonodos regionais,
metastização à distância, crescimento rápido e recente, presença de ulceração, grau
histológico de malignidade, grau de diferenciação nuclear, índice mitótico e grau de
invasão.
O tamanho tumoral é considerado um factor prognóstico independente nos TMC.
Assim, tumores inferiores a 3 cm estão significativamente correlacionados com um
melhor prognóstico, comparativamente com tumores maiores que 3 cm (Pena et al.,
1998; Misdorp, 2002; Soremno, 2003). Ferreira et al. (2009) demonstrou que a dimensão
é importante na avaliação do comportamento biológico tumoral, tendo sido estabelecida
uma associação entre o grau de diferenciação e a dimensão das massas tumorais.
No que diz respeito à metastização nos linfonodos regionais, quando ocorrem
metástases a este nível há uma significativa queda na expectativa de sobrevida
relativamente aos animais sem metastização regional (Misdorp, 2002; Soremno, 2003;
Karayannopoulou et al.,2005).
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
8
Quanto à presença de metástases à distância, tal situação torna pior o prognóstico,
em relação às cadelas que apresentam disseminação apenas nos linfonodos regionais.
Também o facto de o tumor ter tido um aparecimento recente e se caracterizar por um
crescimento rápido, reflectindo um elevado índice mitótico, está associado a um
prognóstico desfavorável (Pérez-Alenza et al., 1997; Pena et al., 1998; Soremno, 2003).
Um tumor que apresente ulceração na sua superfície é indicador de um pior
prognóstico, na medida em que esta característica está comprovadamente relacionada
com uma maior malignidade tumoral, bem como com uma menor sobrevivência
(Queiroga e Lopes, 2002).
Segundo Misdorp & Hart (1976), o tipo histológico de um tumor assume-se uma
variável independente como factor prognóstico na sobrevida. Contudo, a maior
dificuldade em definir a sua importância em termos prognósticos prende-se com a
existência de uma variedade de sistemas de gradação. Destacam-se entre os mais
utilizados Misdorp et al. (1999) e Gilbertson et al. (1983) ambos baseados na combinação
entre características celulares e nucleares. Num estudo levado a cabo por
Karayannopoulou et al. (2005), cadelas que apresentavam tumores classificados como
grau III apresentavam um risco de morte 21 vezes maior em relação às cadelas com
tumores classificados como grau I ou II. Os carcinomas grau III apresentam aumento do
risco de morte de sete vezes, em relação aos carcinomas grau II. Considerando apenas o
tipo histológico, outros estudos revelaram a existência de um aumento de malignidade
desde os carcinomas complexos até aos carcinomas simples, assumindo-se os sarcomas
como os mais malignos (Parodi et al., 1983; Hellmén et al.,1993; Misdorp et al., 1999,
WHO; Misdorp, 2002; Pérez-Alenza et al., 2000).
Tendo em conta o grau de diferenciação nuclear como indicador de prognóstico,
Lana et al., 2009 demonstrou que o risco de recorrência tumoral ou metastização em
menos de 2 anos, após a mastectomia, foi de 90% em cadelas com tumores pouco
diferenciados, 68% para moderadamente diferenciados e de 24% em tumores bem
diferenciados (Lana et al., 2009).
No que diz respeito ao grau de invasão de um tumor, quanto maior for o grau de
invasão de um tumor, menor é o tempo de sobrevida dos animais acometidos, logo pior é
o prognóstico (Misdorp & Hart, 1976; Pérez-Alenza et al., 1997; Pena et al., 1998).
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
9
1.5- Marcadores Moleculares
Apesar de no contexto dos TMC já ter sido identificada uma panóplia de factores de
natureza clínica e patológica com evidente valor prognóstico, é evidente que a
interpretação do comportamento tumoral ainda parece longe do completo entendimento.
Com a busca incessante da compreensão deste fenómeno, altamente incidente e
dramaticamente complexo, diariamente a comunidade científica se debruça sobre a
temática na tentativa de descortinar como os processos tumorais se desenrolam a nível
molecular. A identificação de marcadores moleculares tem permitido a identificação de
novos alvos terapêuticos.
Actualmente, no contexto dos TMC, estão identificados alguns marcadores
moleculares, de natureza diversa e interesse sustentado, dos quais destacamos: Ki67 e
PCNA, p53, p63, HER-2/neu, genes BRCA, Cox-2 e EGFR.
O Ki67 e o PCNA assumem-se como marcadores de proliferação e estão
correlacionados com o grau histológico tumoral, o grau nuclear, a presença de
metástases, a morte pela neoplasia e o menor tempo livre de doença, após a cirurgia
(Peña et al.,1998; Kadthur et al., 2011).
A imunoexpressão da proteína p53 nuclear, resultante da mutação do gene p53,
apresenta nos TMC um valor prognóstico, correlacionado com menor tempo de sobrevida
e aumento de recorrência tumoral (Veldhoen et al., 1999; Lee et al., 2004; Lana et al;
2009).
Nos tecidos mamários de canídeos, o p63 assume-se como um potencial marcador
celular mioepitelial, revelando-se útil na distinção de células basais ou mioepiteliais
relativamente aos miofibroblastos do estroma. A sobre-expressão do p63 sugere a
possibilidade da existência de uma relação estreita entre células mioepiteliais e
estaminais (Gama et al., 2003).
Vários estudos demostraram que a amplificação do gene HER-2, bem como a sobre-
expressão da proteína HER-2 podem estar presentes em TMC (Ahern et al., 1996; de Las
Mulas, 2003). Foi ainda constatada uma relação significativa entre a sobre-expressão da
proteína HER-2 e o maior grau histológico e maior número de mitoses nas células
tumorais. Gama et al., 2008ª, obtiveram resultados revelando um prognóstico favorável
num grupo de tumores mamários caninos com sobre-expressão da proteína HER-2 e,
como tal, consideraram que o significado prognóstico desta característica fenotípica ainda
permanece controverso na literatura.
No que concerne aos genes BRCA1, BRCA2 e RAD51, nos TMC a escassez de
estudos a este nível está bem patente. Contudo, constatou-se que a existência de
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
10
metastização ao nível dos gânglios linfáticos, no caso de adenocarcinomas, está
associada a uma sobre-expressão do mRNA Rad51. O gene BRCA2, por sua vez, está
expresso apenas em cerca de 50% dos casos. A expressão do Rad51 parece estar
relacionada com tumores fenotipicamente mais agressivos (Klopfleisch & Gruber, 2009).
Um estudo revelou que a proteína BRCA1 apresenta uma diminuição significativa da sua
expressão nuclear nos tumores mamários benignos e na maioria dos malignos e, em
contrapartida, uma sobre-expressão ao nível citoplasmático. Tal evidência foi maior nos
tumores que possuíam níveis elevados de Ki-67 e que eram negativos para RE-α. A
perda da expressão da proteína BRCA1 e a sua peculiar distribuição celular parecem
reflectir uma relação com características de malignidade (Nieto et al., 2003).
Como o nosso estudo incide no estudo da expressão da Cox-2 e do EGFR, estes
marcadores serão alvo de uma abordagem mais exaustiva.
1.5.1- Cox-2
A Cox-2 é um membro da família das enzimas ciclooxigenase que catalizam a
conversão do ácido araquidónico em percursores das prostaglandinas (PG) e em
tromboxanos (TX), essenciais na manutenção da homeostasia celular (Smith et al., 2000
No estado patológico, as PG e os TX promovem a inflamação. Em células
inflamatórias, como macrófagos e sinoviócitos, tem sido detectada a expressão de COX-2
e, consequentemente, o aumento das concentrações de PG e TX como parte da cascata
inflamatória. Determinadas condições celulares, tais como hipóxia, citoquinas (IL-1, IL-6),
TNF-1, oncogenes (ras e src) e o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF),
despoletam um aumento da expressão da COX-2. Ao nível celular, uma elevada
actividade da Cox-2 ajuda a promover a invasão tumoral que é mediada através do
aumento da actividade das MMP-2 e MMP-9. Além disso, a Cox-2 promove a expressão
da proteína anti-apoptótica bcl-2, inibindo assim a senescência celular (Taketo, 1998;
Tamura et al., 2001; Smith et al., 2000; Heller et al., 2005; Lavalle et al., 2009).
Em seres humanos, vários estudos reportam elevados níveis de Cox-2 em cerca de 40
a 50% dos carcinomas de mama invasivos. Esta sobre-expressão aparece
particularmente em carcinomas ductais in situ, lesões consideradas percursoras dos
tumores de mama invasivos. A sua expressão também se encontra relacionada com a
sobre-expressão do HER-2 (Vadlamudi et al., 1999, Half et al., 2002; Subbaramaiah et
al., 2002). A expressão de Cox-2, nos tumores de mama humanos, parece estar
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
11
correlacionada com um menor tempo de sobrevida livre de doença e pior prognóstico
(Hwang et al., 1998; Costa et al., 2002; Arun et al., 2004).
Um estudo protagonizado por Doré et al. (2003) demonstrou que a Cox-2 se
encontrava expressa em 24% de adenomas e em 56% dos adenocarcinomas, com uma
intensidade de reacção maior nos adenocarcinomas do que nos adenomas. Outros
estudos obtiveram resultados inferiores (42%), similares (56%) e superiores (62-100%)
no respeitante à percentagem de tumores malignos com positividade para Cox-2
(Mohammed et al., 2004; Heller et al., 2005; Millanta et al., 2006; Queiroga et al., 2007;
Dias Pereira et al., 2009; Lavalle et al., 2009; Além disso, outros trabalhos revelaram que
a glândula mamária normal não expressa Cox-2, ou expressa-a mas em níveis muito
reduzidos (Doré et al., 2003; Mohammed et al., 2004; Queiroga et al., 2007). Contudo,
numa investigação recente concluiu-se que, na glândula mamária normal, a Cox-2 tem
uma localização membranar apical, enquanto que nas células tumorais a sua distribuição
é citoplasmática (Dias Pereira et al., 2009).
Tipos específicos de carcinomas mamários caninos estão associados à expressão de
níveis elevados de Cox-2, incluindo carcinomas anaplásicos, tubulopapilares,
inflamatórios e de células escamosas, bem como carcinosarcomas (Heller et al., 2005;
Queiroga et al., 2005b; Queiroga et al., 2007; Dias Pereira et al., 2009). Os locais de
metastização também estão identificados como locais de elevada intensidade na
expressão de Cox-2, semelhante ou superior ao observado nos tumores primários (Dias
Pereira et al., 2009). Tal como reportado para humanos, também foi possível estabelecer
uma relação entre a Cox-2 e a sobre-expressão de HER-2/neu no contexto dos TMC
(Millanta et al., 2006)
Millanta et al. (2006), levaram a cabo um estudo cujos resultados revelaram que 100%
dos carcinomas mamários caninos expressavam Cox-2, dos quais 79% com uma
expressão elevada. Além disso, concluíram que a Cox-2 estava relacionada com um pior
prognóstico.
Num outro estudo, protagonizado por Queiroga et al. (2005), os níveis de Cox-2 foram
avaliados por “enzyme immunoassay” e vieram revelar uma associação entre níveis
elevados de Cox-2 e pior prognóstico.
Em dois estudos mais recentes foi também encontrada uma associação
estatisticamente significativa entre expressões elevadas de Cox-2 e angiogénese,
desenvolvimento de metástases à distância, pior prognóstico e menor sobrevida (Lavalle
et al., 2009; Queiroga et al., 2010).
Inibidores seletivos de Cox-2 mostraram reduzir significativamente tumores mamários
de ratinhos induzidos por carcinogénios e ter um papel na quimioprevenção (Arun et al.,
2004). Em Medicina Humana, um estudo indicou que a utilização de aspirina pode reduzir
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
12
o risco de cancro da mama em cerca de 20% (Kudher et al., 2001). Vários trabalhos
apontam para que o uso de inibidores seletivos de Cox-2, em combinação com a
quimioterapia convencional, possa resultar em melhores resultados clínicos, com
menores efeitos nefastos (Chow et al., 2003; Toi et al., 2003).
Em Medicina Veterinária, à semelhança dos humanos, a Cox-2 é alvo de incessante
interesse no sentido de se avaliar o seu papel como factor prognóstico, bem como
potencial alvo terapêutico. Num estudo desenvolvido por Souza et al. (2009), em que 12
cães com carcinoma inflamatório foram tratados com piroxicam, demonstrou-se uma
melhoria do seu estado clínico comparativamente com animais tratados com
doxorrubicina.
Urge a necessidade de desenvolvimento de mais estudos que testem a verdadeira
utilidade de inibidores selectivos de Cox-2, em TMC.
1.5.2- EGFR
A família HER inclui quatro receptores tirosina-quinase: EGF-R ou erbB1, HER-2/neu
ou erbB2, HER-3 ou erbB3 e HER-4 ou erbB4 (Hynes & Lane, 2005; Park et al., 2007;
Sassen et al., 2008).
O receptor EGFR é, portanto, um membro da família HER, sendo constituído por um
domínio extracelular, ao qual se encontra ligado o EGF ou o TGF-α, e pelos domínios
transmembranário e intracelular (Sueoka et al., 2007; Yin et al., 2010).
Ao nível do domínio extra-celular, quando os dois ligandos activam o EGFR (EGF e
TGF-α), tal ligação resulta na homo ou heterodimerização do receptor, seguida da
autofosforilação do domínio da tirosina quinase. Os resíduos fosforilados funcionam como
locais de ligação para o recrutamento de transdutores de sinal e activadores de
substratos intracelulares. As vias Ras-Raf mitogénio-activada proteína quinase, fosfatidil
inositol 3 quinase e Akt constituem as maiores vias de sinalização do EGFR (Alroy et al.,
1997; Muthuswamy et al., 1999;). O domínio intracelular encontra-se associado à acção
desempenhada pela tirosina-quinase (Carpenter & Cohen, 1979).
O EGFR foi o primeiro receptor transmembranário tirosina-quinase a estar
directamente ligado às neoplasias da espécie humana (Hynes & Lane, 2005),
participando nos processos de proliferação e crescimento celulares, angiogénese e
metastização e, por isso, encontra-se envolvido na sobrevivência e crescimento tumorais
(Shien et al., 2005). Existem vários estudos sobre a expressão do EGFR em tumores de
mama humanos, com resultados algo contraditórios. A sobre-expressão de EGFR foi
identificada em cerca de 16 a 36% de tumores de mama contudo, estudos sistemáticos
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
13
avaliando a amplificação génica, expressões do mRNA e de proteínas, nos mesmos
casos, são escassas (Harris et al.,1989; Walker et al, 1999; Tsutsui et al.,2002). Outros
estudos mais recentes revelam que a amplificação do gene EGFR é um evento pouco
frequente no cancro da mama, ocorrendo em cerca de 6 % dos tumores segundo Rohit B
et al., 2005, ou em 0,8 a 14% dos casos segundo outros autores (Al Kuraya K et al.,
2004; Ro J et al., 1988). Apesar de pouco frequente, existirá uma minoria de pacientes
que poderão usufruir de uma terapêutica dirigida ao EGFR, com todas as vantagens que
esta acarreta. Assim, os inibidores da tirosina-quinase assumem-se altamente
promissores como terapia alvo de tumores com expressão de EGFR. Agentes como o
Gefitinib (ZD1839) e Erlotinib são exemplo deste tipo de inibidores, que actuam no
domínio da tirosina-quinase bloqueando as vias de transdução de sinal que promovem o
crescimento das células tumorais (Wakeling et al., 2002).
Em TMC, estudos de avaliação da expressão do EGFR são ainda escassos. Num
estudo imunohistoquímico realizado por Gama et al. (2009), foi avaliada a expressão do
EGFR em 136 tumores mamários caninos (46 benignos e 90 malignos). Nos tecidos
tumorais, a sobre-expressão do EGFR foi detectada em 9 lesões benignas (19,6%) e 38
malignas (42,2%), com a positividade do EGFR significativamente correlacionada com a
malignidade. Além da idade do animal e do tamanho tumoral, não foram comprovadas
associações significativas com outros parâmetros clínico-patológicos. Além disso, neste
mesmo estudo, verificou-se a existência de EGFR ao nível das células mioepiteliais de
tecido mamário normal, hiperplásico e neoplásico benigno. As células epiteliais luminais
apresentavam-se negativas para a presença deste marcador. Desta feita, a marcação
imunohistoquímica deste receptor parece ter uma aplicabilidade diagnóstica na
identificação de células mioepiteliais da glândula mamária (Gama et al., 2003; Gama et
al., 2004).
Num estudo recente realizado por Singer et al., 2012, os autores compararam a
homologia funcional biológica e a estrutura molecular do EGFR e HER-2 associados aos
tumores humanos e caninos, bem como a possibilidade de poderem servir como alvos
para os anticorpos anti-EGFR (cetuximab) e anti-HER-2 (trastuzumab). Pela análise
imunohistoquímica dos TMC, detectaram sobre-expressão do EGFR em 3/10 pacientes e
do HER-2 em 4/10. Constataram 91% de homologia nos aminoácidos do EGFR e 92% do
HER-2, entre as moléculas canina e humana. Além disso, o epitopo do cetuximab apenas
difere em 4 aminoácidos: Lys443 é substituída pela Arg, Ser468 pela Asn, Gly471 pela
Asp e a Asn473 pela Lys, nos canídeos. O local de ligação do trastuzumab é idêntico em
humanos e caninos, diferindo apenas num aminoácido: Pro557 pela Ser. Desta feita,
estes resultados indiciam uma franca homologia entre os antigénios Erb-1 e 2 associados
aos tumores, de canídeos e humanos. O facto dos homólogos caninos expressarem
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
14
semelhantes epitopos para o cetuximab e trastuzumab poderá promover a imunoterapia
baseada em anticorpos em cães. Mais do que isso, a constatação de tal homologia
poderá abrir portas para estratégias comparativas de desenvolvimento de alvos
terapêuticos.
De referir também que, num outro estudo recente levado a cabo por da Costa A et al.
(2011), os autores tentaram identificar por PCR alguns marcadores moleculares no
sangue periférico de canídeos, com o intuito de detectar células tumorais. Entre os
marcadores testados estava o EGFR que se revelou, conjuntamente com os demais
estudados (CK19, ERBB2, CLDN7 e ELF3), um candidato útil a marcador tumoral nos
TMC, bem como um possível factor de prognóstico para comportamentos metastáticos.
1.5.3- Cox-2 e EGFR
Em Medicina Veterinária, que seja do nosso conhecimento, não existem trabalhos
desenvolvidos no sentido de avaliarem simultaneamente as expressões de Cox-2 e
EGFR, no contexto dos TMC. Em Medicina Humana, já existem diversos estudos que se
debruçaram sobre a temática.
EGFR e Cox-2 são moléculas alvo que demonstraram importância em vários tipos de
tumor, com estudos anteriores a relacionar as suas expressões com pior prognóstico e
redução da sobrevivência, embora com conclusões não consistentes entre os diferentes
estudos (Dannenberg et al., 2005; Brown et al., 2005; Soo et al., 2005; Che et al., 2005;
Chua et al., 2004; Putti et al., 2002; Tan et al., 2005). As moléculas Cox-2 e EGFR
demonstraram partilhar funções em várias etapas da carcinogénese, mediando
processos carcinogénicos pleiotrópicos, incluíndo sobrevivência celular, proliferação,
angiogénese e invasão. (Dannenberg et al., 2005).
Vários estudos in vitro revelaram uma ligação entre a activação do EGFR e
subsequente sobre-regulação da Cox-2. A activação do EGFR pode induzir a expressão
da Cox-2 pela via ras/raf MAPK (McKay et al., 2007), bem como a Cox-2 pode induzir a
expressão do EGFR dado que as PG podem activar a sinalização do EGFR, estimulando
assim a proliferação celular. Estudos anteriores descortinaram que as PGE2 derivadas da
Cox-2 podem transactivar o EGFR no cancro colorectal (Pai et al., 2002; Buchanan et al.,
2003) e no colangiocarcinoma (Han et al., 2005). Por outro lado, a activação do EGFR
conduz a um aumento da expressão de Cox-2 e da produção de PGE2 no carcinoma de
células escamosas e nas células de cancro do cólon. Foi demonstrado que a inibição da
tirosina-quinase do EGFR, no carcinoma de células escamosas, reduz a expressão de
Cox-2 (Matsuura et al., 1999).
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
15
A lacuna de informação respeitante à relação da expressão de EGFR e de Cox-2 nos
tumores de mama de cadela, aliado ao conhecimento prévio existente sobre cada um
deles resumidamente descrita nos parágrafos anteriores, serve como base de interesse à
realização desta tese, mais propriamente ao trabalho prático que, mais à frente, será
descrito e apresentado. Anseia-se humildemente que os resultados obtidos se revelem
verdadeiramente úteis na compreensão do teatro tumoral e, principalmente, no
descortinar de novos factores de prognóstico e possíveis alvos terapêuticos, com vista ao
benefício conjunto e partilhado das espécies em causa.
1.6- Breve abordagem de modalidades de tratamento
A Cirurgia assume-se como a abordagem de eleição para o tratamento de tumores
mamários em canídeos, muito embora seja de considerar a sua não realização na
presença de metástases à distância ou na presença de um tipo de tumor designado
“carcinoma inflamatório” (Pérez-Alenza et al.,2001; Lana et al.,2009). O tipo de cirurgia a
realizar é avaliado caso a caso, estando directamente relacionado com o tamanho
tumoral, número de tumores, localização na glândula mamária (que se relaciona com a
drenagem linfática), estado geral do paciente e experiência do cirurgião (Hedlund, 2008).
Das várias técnicas disponíveis – nodulectomia, mastectomia simples, mastectomia
regional, mastectomia unilateral e mastectomia bilateral – o objectivo major consistirá em
atingir a cura, mas também permitir a realização do exame histológico, melhorar a
qualidade de vida do animal acometido pela doença e fazer face ou impedir a progressão
neoplásica. Na escolha entre uma cirurgia mais ou menos invasiva, pesam factores como
a diminuição do risco efectivo de recidivas, para a primeira opção, mas uma menor
morbilidade e custo económico para a segunda. De frisar, que o desenvolvimento de
metástases à distância não parece ser directamente influenciado por abordagens
cirúrgicas mais agressivas (Lana et al., 2009).
No que diz respeito à Quimioterapia, a sua utilização como modalidade terapêutica
pode ainda considerar-se diminuta no contexto dos TMC, facto que advém do menor
número de estudos existentes, de resultados menos satisfatórios, do elevado custo
associado e da evidência de grande heterogeneidade nestes tumores e que dificulta a
caracterização da quimiossensibilidade dos diferentes tipos histológicos,
comparativamente com os seres humanos (Pérez-Alenza, 2001; Lana et al. 2007, Lana et
al., 2009). Ainda assim, os principais quimioterápicos utilizados em neoplasias mamárias
são a Ciclofosfamida, a Doxorrubicina e o 5-Fluouracil (5-FU). Para além destes existem
outros, menos utilizados, como a Vincristina que pode ser associada à Doxorrubicina e à
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
16
Ciclofosfamida; Mitoxantrona, em substituição da Doxorrubicina devido à
cardiotoxicidade; Metotrexato, associado à Ciclofosfamida e ao 5-Fluouracil (Cirillo,
2008). Foram também realizados ensaios com outros fármacos de utilidade em medicina
humana, nomeadamente o Paclitaxel e a Gemcitabina, mas sem produção de resultados
satisfatórios (Cirillo, 2008; Marconato et al., 2008).
A Desmopressina é um derivado sintético da hormona anti-diurética, com propriedades
hemostáticas. A administração desta substância numa solução salina, 30 minutos antes e
24 horas após a remoção cirúrgica dos tumores, diminui a recorrência local e minimiza a
disseminação e sobrevivência de células tumorais residuais, prolongando o período livre
de doença e o período de sobrevivência (Hermo et al., 2008). Mais estudos serão
necessários para melhor compreender o mecanismo de acção e comprovação de
resultados deste fármaco.
Os inibidores da Cox-2 têm sido indicados por alguns autores no tratamento de
carcinomas inflamatórios de mama (Souza et al., 2009). Serão cruciais mais estudos para
averiguar o seu papel nos TMC.
No que concerne à Radioterapia, da escassez de estudos realizados resultaram
efeitos pouco atractivos e que têm condenado à utopia esta modalidade terapêutica nos
TMC (Lana et al., 2009).
A Hormonoterapia, embora não praticada na verdadeira ascensão da palavra, é uma
prática ancestral no tratamento dos TMC, como oportunamente já foi explicado, e em que
se destacou o papel protector da OVH, em idades precoces, no desenvolvimento deste
tipo de tumores (Fonseca & Daleck, 2000).
O tratamento hormonal exógeno está indicado em tumores que exibam receptores de
estrogénio, progesterona ou prolactina (VSSO, 2008a). Em Medicina Humana, o recurso
à manipulação hormonal é prática corrente, nomeadamente pela utilização do Citrato de
Tamoxifeno que é um inibidor selectivo dos receptores de estrogénio ao nível da glândula
mamária (Tavares et al., 2010).
Nos canídeos, devido ao elevado risco de desenvolvimento de piómetras, aconselha-
se que a administração de Tamoxifeno se restrinja a cadelas esterilizadas. Além disso,
visto não haver diferença entre a dose mais alta e a mais baixa, a nível de demais efeitos
secundários, deve optar-se pela administração da dose mais alta deste fármaco,
aumentando assim as hipóteses de sucesso terapêutico (Tavares et al., 2010).
Uma substância promissora como modalidade terapêutica é a Goserilina, um análogo
das hormonas hipofisárias e hipotalâmicas, com capacidade para reduzir os níveis
circulantes de estradiol e progesterona. Revelou a capacidade de diminuir a actividade
tumoral em 53% dos canídeos com patologia mamária, desde que na presença de RE
(VSSO, 2008a).
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
17
Como modalidade terapêutica de vanguarda no combate aos TMC surge a
Imunoterapia. Interessantes estudos têm produzido resultados não menos interessantes
neste contexto, dos quais destaco, entre outros, um ensaio com utilização de um vírus
vacinal oncolítico (GLV-1h68) no tratamento de tumores mamários caninos, vírus este
que infectou e destruiu com sucesso linhas celulares de adenoma mamário canino in
vitro, inibiu a proliferação tumoral, diminuiu o tamanho da neoplasia e replicou-se em
xenotransplante (Gentschev et al.,2009).
Num outro estudo, avaliou-se a administração conjunta do factor de necrose tumoral-α
(TNF) associado a polietilenoglicol (PEG). Apesar de ser necessário estabelecer uma
dose muito restrita de TNF-α, devido à elevada toxicidade verificada, a administração
conjunta com PEG melhora a bioactividade e aumenta a semi-vida (Thamm et al., 2010).
Como tal, os resultados deste estudo justificam a avaliação clínica da utilização destas
substâncias em tumores da espécie humana (Thamm et al., 2010). A aplicação de uma
vacina autóloga de fusão de células dendríticas-células tumorais mamárias, em cães,
também foi avaliada por um grupo de investigadores (Bird et al., 2011). A sua
administração em gânglios poplíteos de canídeos saudáveis conduziu a uma produção
significativa de IgG, imunoglobulinas estas que revelaram reconhecer antigénios de
células tumorais em cultura (Bird et al, 2011). Não se registaram quaisquer efeitos
secundários.
Dada a complexidade envolta no desenvolvimento de um processo tumoral, as
modalidades terapêuticas disponíveis terão de ser alvo de constante actualização e
tendencialmente dever-se-ão preconizar tratamentos combinados e personalizados.
18
CAPÍTULO 2
OBJECTIVOS DO TRABALHO EXPERIMENTAL
Avaliar a expressão de Cox-2 e EGFR em 43 tumores mamários malignos de
cadela, utilizando uma abordagem cega na selecção dos casos no que concerne
à sua classificação histológica, bem como demais dados do historial clínico.
Relacionar as expressões de Cox-2 e EGFR, individualmente, com as
características clínico-patológicas dos animais abrangidos pela amostragem.
Averiguar a associação existente entre os dois parâmetros analisados: Cox-2 e
EGFR e interpretar em termos clínico-patológicos quais os reflexos de tal
associação.
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
19
CAPÍTULO 3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1- Descrição do material utilizado e sua proveniência
Na realização deste trabalho foram incluídas 43 amostras de tumores malignos de
mama de cadela, processadas no Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), provindos do Hospital Veterinário
do UTAD e de diversas clínicas privadas.
3.2- Métodos
3.2.1- Avaliação clínico-patológica
Em todos os casos, procedeu-se à recolha de informação respeitante à identificação
dos animais incluídos na amostra, nomeadamente: idade, sexo, raça, tamanho da lesão,
presença de ulceração, presença de necrose, invasão dos linfonodos regionais,
metástases para órgãos distantes.
No que concerne ao tamanho tumoral, considerou-se o parâmetro T como diâmetro
máximo do tumor primário, tendo sido agrupados em T1- menor que 3 cm; T2-
compreendido entre 3 e 5 cm; T3- superior a 5 cm.
No parâmetro invasão dos linfonodos regionais, considerou-se N0 para a ausência de
metástases e N1 para a presença de metástases ganglionares, com confirmação
histológica.
3.2.2- Avaliação histopatológica
Todo o material recolhido foi fixado em formol a 10%, incluído em parafina sintética
Histoplast ®- Shandon ®, seguindo a metodologia habitual. Após inclusão, foram
realizados cortes de cada um dos tumores com 3 µm de espessura num micrótomo
automático Leica® RM 2255. Em seguida, os cortes foram colocados em lâminas e
efectuou-se secagem na estufa, à temperatura de 37º. Após secagem, foram
desparafinados em xilol, hidratados por passagem consecutiva em álcoois de
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
20
concentrações decrescentes, procedendo-se à coloração convencional com hematoxilina-
eosina (H-E) para posterior diagnóstico histopatológico.
O diagnóstico histopatológico foi realizado em conformidade com os critérios da OMS
(Misdorp, 1999), por dois patologistas independentes e segundo os mesmos critérios,
num microscópio Olympus® BH-2.
Os critérios que foram avaliados constam de: tipo histológico, comportamento tumoral,
e entre tumores malignos: invasão metastática dos linfonodos, grau de pleomorfismo
nuclear, grau de diferenciação tubular e índice mitótico (IM).
O índice mitótico foi avaliado de acordo com a metodologia descrita por (Elston and
Ellis, 1991) para classificação do grau histológico. Efectuaram-se contagens de mitoses
em dez campos de grande ampliação (400x), num microscópio Nikon Optiphot-2®, nas
áreas mais proliferativas, designadas de hot spots. Sempre que era observada grande
variação no número de mitoses em áreas diferentes, eram contados dez campos de
grande ampliação em cada uma delas, de modo a apurar a contagem mais correcta. De
acordo com a área do campo, definida pelo fabricante do microscópio, atribuiu-se o
respectivo índice 1, 2 ou 3 à contagem de mitoses conforme indicado no método de
Elston e Ellis (Elston and Ellis, 1998).
Quadro 1: Atribuição do índice mitótico, segundo o número de mitoses, contado num campo de
grande ampliação (400x) com diâmetro de 0,53mm.
Número de mitoses Índice mitótico
≤ 7 1
8-16 2
≥17 3
Na avaliação do grau histológico de malignidade, foram tidos em conta os parâmetros
relativos a três aspectos: formação tubular, pleomorfismo nuclear, índice mitótico e
hipercromasia, segundo as mais recentes recomendações (Goldschmidt et al., 2011).
(Quadro 2)
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
21
Quadro 2: Critérios de avaliação do grau histológico de malignidade, segundo Goldshmidt et al.,
(2011).
Pontos Formação tubular Pleomorfismo nuclear Índice Mitótico e Hipercromasia
1
Formação de túbulos em mais de 75% da preparação, bem
diferenciados
Núcleos uniformes, de pequeno tamanho. Nucléolos
ocasionais. Ligeiro pleomorfismo e coloração.
0-9 mitoses/ 10 CGA Ocasionais núcleos
hipercromáticos/CGA
2
Moderada formação de túbulos, em 10-75% da
preparação, com áreas de crescimento tumoral sólido
Moderado pleomorfismo nuclear, núcleos
hipercromáticos e presença de nucléolos, alguns dos
quais proeminentes
10-19 mitoses/ 10 CGA 2-3 núcleos hipercromáticos
/CGA
3 Formação de túbulos
mínima ou inexistente (< 10% da preparação)
Marcado pleomorfismo nuclear, frequentemente com
um ou mais nucléolos proeminentes.
Marcada hipercromasia.
20 mitoses/ 10 CGA 2-3 núcleos hipercromáticos/
CGA
Pontuação total Grau histológico de malignidade 3-5 6-7 8-9
I – Baixo Grau, tumor bem diferenciado II – Grau intermédio, moderadamente diferenciado
III – Alto Grau, fracamente diferenciado
3.2.3- Avaliação imunohistoquímica
Para a análise imunohistoquímica foram utilizadas amostras preservadas em formol a
10%, incluídas em parafina. No micrótomo foram realizados cortes seriados de cada um
dos tumores com 3 µm de espessura, que foram colocados em lâminas revestidas com
solução de Silane (3-Aminopropyltriethoxysilane, Sigma ®), de acordo com a metodologia
convencional. Antes de estarem preparados para a realização da técnica de
imunohistoquímica, os cortes permaneceram por 48 horas na estufa a 37ºC, para
secagem e melhor aderência às lâminas.
A expressão das proteínas em estudo foi avaliada pelo método indirecto da
esterptavidina biotina-peroxidase, utilizando a solução de 3,3-diaminobenzidina
tetrahidrocloreto (DAB) como agente cromogéneo.
No apuramento da técnica foram inicialmente efectuados estudos preliminares, para
adequar concentrações dos anticorpos primários, método de recuperação antigénica e
diferentes tempos de incubação, de forma a optimizar os resultados.
Neste estudo, a mácula densa de rim de cão jovem foi utilizada como controlo positivo.
Para controlo positivo do anticorpo EGFR foi utilizada a epiderme. Nos cortes usados
como controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído por tampão fosfato salino
(PBS) com pH=7,4. Todas as incubações foram realizadas em câmara húmida horizontal,
Bio Optica ®.
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
22
3.2.3.1- Procedimento
A expressão imunohistoquímica dos anticorpos foi obtida pelo método indirecto com
uso de um complexo estreptavidina-biotina peroxidase, utilizando o kit Ultravision
Detection System, Labvision Corporation®, Fremont, CA, USA, para a Cox-2, e o kit
Novolink Polymer Detection Sistem, Novocastra®, Newcastle, UK, para o EGFR.
Os cortes foram desparafinados em xilol durante 30 minutos e hidratados com uma
série de álcoois de concentração decrescente (100%, 90%, 80% e 70%) para obter nos
tecidos uma fase aquosa miscível com reagentes a aplicar nos passos seguintes.
Como método de recuperação antigénica, procedeu-se do seguinte modo:
- Cox-2: 20 minutos no microondas, na potência de 750 Watts, com as lâminas imersas
em solução de extran a 0,05%. Por precaução, para manter as lâminas cobertas de
solução de modo a evitar a dessecação dos tecidos, foi adicionada mais solução de
extran a intervalos de 3 minutos.
- EGFR: digestão enzimática com uma solução de 0,4% de pepsina em HCL 0,01N
(pH=2), durante 30 minutos a 37ºC.
Após recuperação antigénica foram deixados a arrefecer, à temperatura ambiente, por
cerca de 30 minutos.
A inibição das peroxidases endógenas foi conseguida com peróxido de hidrogénio a
3%, durante 30 minutos, sendo o seu excesso removido com PBS, numa lavagem
durante 5 minutos. O objectivo deste passo é evitar que haja uma reacção inespecífica do
agente cromogéneo, DAB, com outras peroxidases além daquelas presentes no
complexo estreptavidina-biotina peroxidase.
No que diz respeito à Cox-2, os cortes foram então incubados à temperatura ambiente
durante 10 minutos com Ultra V Block ® para reduzir a reacção inespecífica do anticorpo
primário com a avidina e biotina endógenas dos tecidos. Em seguida, procedeu-se à
incubação com o anticorpo monoclonal anti-Cox-2 (Clone 33, Transduction
Laboratories®, Lexington, KY, USA), na diluição de 1:40 em PBS com pH=7,4, por um
período de 24 horas, no frigorífico a 4ºC, permanecendo em câmara húmida horizontal,
Bio Optica®.
No caso do EGFR, os cortes foram incubados durante 5 minutos à temperatura
ambiente com Protein Block®, seguindo-se 2 lavagens de 5 minutos com PBS.
Posteriormente as lâminas foram incubadas com o anticorpo monoclonal anti- EGFR
(clone 31G7, Invitrogen®, Paisley,UK), na diluição de 1:100 em PBS com pH=7,4,
durante 45 minutos à temperatura ambiente, permanecendo as lâminas em câmara
húmida horizontal Bio Optica®.
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
23
Após o referido período de incubação, os anticorpos primários foram removidos com
três lavagens em tampão PBS e os cortes foram incubados da seguinte forma:
- Cox-2: 10 minutos com Biotinylated Goat Polivalent ® à temperatura ambiente,
seguidos de duas lavagens com PBS e nova incubação de 10 minutos com Streptavidin
Peroxidase®, igualmente à temperatura ambiente, à qual se seguiu nova lavagem por 5
minutos em tampão PBS.
- EGFR: 30 minutos à temperatura ambiente com o Post Primary Block®, seguido de 2
lavagens com tampão PBS e nova incubação por um período de 30 minutos com
Novolink Polymer®. Seguiram-se 2 novas lavagens com tampão PBS.
A revelação das lâminas foi efectuada com uma incubação de pelo menos 5 minutos
em solução de tetra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) SIGMA® diluído em
PBS, à qual se adicionou 0,8 µl de H2O2 (a 30%) por cada mililitro (ml) de solução. O
tempo de reacção foi controlado por visualização ao microscópio óptico, de forma a evitar
que surgisse uma coloração de fundo que poderia prejudicar a avaliação da
imunorreactividade. No final deste tempo procedeu-se à lavagem em água corrente
morna por dez minutos.
Posteriormente, para a realização do contraste nuclear ou contra-coloração, as
lâminas foram imersas numa solução de Hematoxilina de Gill, durante 1 minuto. A
Hematoxilina é um corante nuclear básico que confere aos núcleos das células uma
tonalidade azul, permitindo assim evidenciar a tonalidade castanha da marcação
imunohistoquímica. Finalmente, as lâminas foram desidratadas, com passagens por
álcoois de concentração crescente, por 5 minutos cada (95%,100%), diafanizadas em
xilol e montadas, utilizando a resina sintética Entellan (Merck®).
3.2.3.2 - Métodos de avaliação e quantificação da imunorreactividade
A imunorreactividade foi avaliada por dois observadores independentes, sem
conhecimento prévio do respectivo diagnóstico. A positividade foi indicada pela presença
de distinta marcação castanha citoplasmática ou membranar. Foi utilizado o mesmo
método de quantificação de imunorreactividade para a Cox-2 e para o EGFR.
Na avaliação das expressões dos marcadores foram considerados dois parâmetros
distintos, sendo eles a percentagem de células imunorreactivas (Extensão) e a
Intensidade da Marcação (Intensidade). Uma gradação semi-quantitativa foi realizada na
percentagem de células imunorreactivas, enquanto na intensidade de marcação foi
efectuada uma avaliação subjectiva.
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24
Quadro 3: Avaliação da imunorreactividade da Cox-2 e do EGFR.
Extensão Intensidade
Extensão 1
1-10% de células imunorreactivas
Zero (0)
Intensidade negativa
Extensão 2
11-50% de células imunorreactivas
Um (+)
Intensidade fraca
Extensão 3
51-80% de células imunorreactivas
Dois (++)
Intensidade moderada
Extensão 4
> 80% de células imunorreactivas
Três (+++)
Intensidade forte
Tendo em consideração o exposto no quadro anterior, e avaliados todos os casos
quanto às características em causa, procedeu-se subsequentemente ao cálculo de um
score que resultou do somatório das duas variáveis (adaptado de Ceccarelli et al., 2005).
Desta feita, pela soma dos valores de extensão (1,2,3 ou 4) com os de intensidade (0,1,2
ou 3), obtivemos valores que classificámos:
1 - 2 - negativo
3 - 5 - baixo
6 - 7 - alto
Relativamente ao EGFR, a localização da marcação foi alvo de análise, tendo sido
possível distinguir em todas as amostras marcação com localização citoplasmática,
membranar ou mista.
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
25
3.2.4 - Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas recorrendo ao sistema SPSS®
(Statistical Package for the Social Sciences, Chicago, IL, EUA), versão 19.0. Os valores
obtidos foram considerados significativos para um valor de p <0,05.
Os resultados foram expressos em frequências absolutas e relativas. Para as diversas
variáveis incluídas foi efectuada uma análise estatística descritiva, com o cálculo da
média, desvio padrão, erro padrão, mediana, máximo, mínimo e frequências relativas.
O teste de correlação de Spearman’s foi efectuado, de modo a verificar a presença de
associação entre valores de Cox-2 e de EGFR.
26
CAPÍTULO 4 RESULTADOS
4.1- Análise descritiva da amostra em estudo
4.1.1. Variáveis clínico-patológicas
Os tumores em estudo pertenciam a animais com idades compreendidas entre os 6 e
os 16 anos, sendo a média de idades 10,6 ± 2,6.
As características epidemiológicas e clínico-patológicas relevantes, na caracterização
da amostra de tumores, encontram-se sumariadas no quadro 4.
Dos 43 tumores mamários em estudo, a maioria (23) foi classificada como carcinoma
tubulopapilar (53,5%), 11 como carcinoma complexo (25,6%), 4 representam carcinomas
sólidos (9,3%), 3 carcinomas anaplásicos (7%) e os carcinossarcomas estão
representados em apenas 2 tumores (4,7%).
Entre outras características, de frisar que a maioria dos tumores não apresenta
ulceração (90,7%), nem metastização nos linfonodos regionais (86,0%).
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27
Quadro 4: Síntese das características da amostra em estudo e respectivas frequências absolutas
e relativas.
Variáveis N %
Raça(n=43)
SRD 30 69,8
Caniche 2 4,7
Cão d´Água 1 2,3
Cocker 2 4,7
Doberman 1 2,3
Epagneul 1 2,3
Labrador 2 4,7
Lhasa Apso 1 2,3
Pincher 1 2,3
Scotish Terrier 1 2,3
Sharpei
1 2,3
Tamanho (n=43) T1 (<3cm) T2 (3-5cm) T3 (>5cm)
17 39,5
15 34,9
11 25,6
Ulceração (n=43) Presente Ausente
4 9,3
39 90,7
Diagnóstico histológico (n=43) Carcinoma tubulopapilar Carcinoma complexo Carcinoma anaplásico Carcinoma sólido Carcinossarcoma
23 53,5
11 25,2
3 7,0
4 9,3
2 4,7
Necrose (n=43) Presente Ausente
11 25,6
32 74,4
Índice mitótico (n=43) 1 (≤ 7) 2 (8-16) 3 (≥17)
22 51,2
12 27,9
9 20,9
Grau nuclear (n=43) 2 3
21 48,8
22 51,2
Grau de diferenciação (n=43) 1 2 3
9 20,9
17 39,5
17 39,5
Grau histológico de malignidade (n=43) I II III
17 39,5
13 30,2
13 30,2
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28
4.1.2- Imunoexpressão da Cox-2 e do EGFR nos tumores mamários caninos
A imunorreactividade para a Cox-2 foi observada no citoplasma, membrana nuclear e
membrana citoplasmática, de forma difusa e homogénea.
A imunorreactividade para o EGFR foi observada na membrana citoplasmática e no
citoplasma das células neoplásicas, de forma difusa (Figuras 2 e 3). A marcação não foi
homogénea em toda a preparação histológica, pelo que foi avaliada a marcação
predominante. Numa mesma área observou-se, em alguns tumores, marcação evidente
em células basais, enquanto noutros, em células luminais (Figuras 3 e 4).
Figura 2 - Imunorreactividade para o EGFR, em carcinoma tubulopapilar, com localização
predominantemente membranar. Estalão = 60 μm.
Invasão de linfonodos regionais (n=43) N0 N1
37 86
6 14
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29
Figura 3 - Imunorreactividade para o EGFR com localização predominantemente membranar
(pormenor da imagem anterior). Estalão = 30 μm.
Figura 4 - Imunorreactividade para o EGFR em carcinoma tubulopapilar. De notar a intensa
marcação nas células luminais. Estalão=60 μm.
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30
Figura 5 - Pormenor da imagem anterior. Estalão=30 μm.
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
31
No quadro 5 observamos a imunorreactividade para a Cox-2 e para o EGFR nas
diferentes amostras estudadas.
Quadro 5: Avaliação da imunoexpressão de Cox-2 e EGFR nos tumores mamários caninos.
Amostra Diagnóstico Cox-2 EGFR
Extensão Intensidade Extensão Intensidade
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
c.complexo c.tubpap c.solido
c.tubpap c.complexo c.complexo
c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap
carcinossarcoma c.tubpap c.tubpap
c.complexo c.complexo
c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap
c.complexo c.tubpap c.tubpap
c.complexo c.tubpap c.solido c.anapl c.anapl c.anapl
c.complexo c.complexo c.complexo c.complexo
carcinossarcoma c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.solido c.solido
c.tubpap
3 2 4 4 3 3 2 3 2 4 2 2 2 2 3 3 3 3 2 2 2 3 2 3 2 3 2 3 4 4 2 3 3 1 4 4 4 4 4 4 2 3 2
2 2 2 3 2 2 3 2 1 1 1 3 3 3 2 2 2 1 1 3 3 3 2 2 1 2 3 3 3 3 3 3 2 2 2 1 3 2 1 3 3 2 2
3 2 4 4 2 4 2 3 2 2 2 2 2 3 3 4 4 2 3 3 4 4 4 3 2 4 3 4 4 4 2 3 3 1 4 4 4 4 4 4 2 4 2
2 3 2 3 3 3 3 2 2 3 2 3 3 3 3 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 3 3 3 3 3 2 3
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32
Assim, neste estudo não obtivemos qualquer amostra cuja imunorreactividade, quer
para a Cox-2 quer para o EGFR, fosse considerada negativa (score 1-2). Por
conseguinte, todas as amostras tiveram imunorreactividade positiva, incluíndo-se nos
scores 3-5, considerado de baixa imunorreactividade, ou 6-7, considerado de alta
imunorreactividade.
Tendo por base os resultados evidenciados no quadro 5, e no que concerne à Cox-2,
pela avaliação da extensão da marcação das lâminas em estudo denotou-se que a
maioria das amostras manifestou extensões 2 (37,2%) e 3 (34,9%). Apenas 2,3% (1) dos
casos apresentaram extensão 1, enquanto 25,6% (11) das amostras revelaram extensão
máxima. Quanto à intensidade da marcação, observou-se que o maior número de
amostras se incluía nas intensidades 2 (41,9%) e 3 (39,5%), tendo sido a intensidade 1
verificada em apenas 8 casos (18,6%). (Figuras 6, 7 e 8)
Figura 6- Imunorreactividade para a Cox-2, em carcinoma sólido. Estalão = 60 μm.
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33
Figura 7- Imunorreactividade para a Cox-2, em carcinoma sólido com invasão vascular. Estalão =
30 μm.
Figura 8- Imunorreactividade para a Cox-2 nas células tumorais, que se dispôem em estruturas
tubulares. Estalão = 60 μm.
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
34
Na avaliação da extensão da marcação do EGFR, sobressai o facto do maior número
de casos apresentar extensão 4 (19 amostras / 44,2%). Em contrapartida apenas 1 caso
se caracterizou por extensão 1 (2,3%). As restantes amostras distribuíram-se nas
extensões 2 (13 amostras / 32,2%) e 3 (10 amostras / 23,3%). A intensidade da
marcação para este receptor caracterizou-se por uma forte predominância de casos com
intensidade 3 (31 amostras / 72,1%). Somente 12 amostras (27,9%) manifestaram
intensidade 2. Não houve quaisquer amostras com intensidade 1.
As figuras seguintes (9-12) ilustram a imunorreactividade para o EGFR em diferentes
casos.
Figura 9 - Imunorreactividade para o EGFR, em carcinoma sólido. De notar as imagens
sugestivas de invasão vascular. Estalão = 120 μm
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35
Figura 10 - Imunorreactividade para o EGFR, em carcinoma sólido com invasão vascular.
Estalão=60 μm.
Figura 11 - Imunorreactividade para o EGFR, de forma difusa e intensa, em carcinoma
tubulopapilar. Estalão=300 μm.
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36
Figura 12 - Imunorreactividade para o EGFR em carcinoma tubulopapilar. Estalão = 120 μm.
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37
4.1.3- Associação da Cox-2 e do EGFR com as variáveis clínico-patológicas
Após termos determinado as expressões de Cox-2 e EGFR nas várias amostras em
estudo, procedemos à avaliação da sua possível relação com os diferentes parâmetros
clínico-patológicos. As associações obtidas estão patentes no quadro 6.
Quadro 6: Associação entre a imunoexpressão de Cox-2 e de EGFR e as variáveis clínico-
patológicas pelo teste de χ2.
Variáveis Cox-2
P EGFR
p Alta Baixa Alta Baixa
Tamanho (n=43) 1 (<3cm) 2 (3-5cm) 3 (>5cm)
0,033
0,191 2 15 10 7
3 12 7 8
6 5 9 2
Ulceração (n=43) Presente Ausente
0,267
0,479 2 2 3 1
9 30 23 16
Tipo histológico (n=43) Carcinoma sólido
Carcinoma tubulo-papilar
Carcinoma complexo
Carcinossarcoma
Carcinoma Anaplásico
0,179
0,732
2 2 3 1
5 18 13 10
1 10 6 5
1 1 2 0
2 1 2 1
Necrose (n=43) Presente Ausente
0,091
0,276 5 6 8 3
6 26 18 14
Índice mitótico (n=43) 1 2 3
0,040
0,331 2 20 11 11
5 7 9 3
4 5 6 3
Grau nuclear (n=43) 2 3
0,021
0,085 2 19 10 11
9 13 16 6
Grau de diferenciação (n=43) 1 2 3
0,140
0,424 2 7 4 5
2 15 10 7
7 10 12 5
Grau histológico de malignidade (n=43) I II III
0,020
0,103 2 15 7 10
2 11 9 4
7 6 10 3
Invasão dos linfonodos (n=43) Presente Ausente
0,029
0,038 4 2 6 0
7 30 20 17
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38
Como podemos constatar pela análise do quadro anterior, a Cox-2 apresentou
associação estatisticamente significativa com o tamanho tumoral (p=0,033), índice
mitótico (p=0,040), grau nuclear (p=0,021), grau histológico de malignidade (p=0,020) e
com a metastização nos linfonodos (p=0,029).
Neste estudo foi evidente um aumento do número de casos com alta expressão de
Cox-2 à medida que o tamanho tumoral aumentou. Tendo em conta o índice mitótico
(IM), constatou-se que os tumores com IM=1 têm maioritariamente baixa expressão de
Cox-2, com registo de apenas 2 casos com alta expressão. Pelo contrário nos tumores
com IM=3 (n=9), contabilizaram-se 4 com alta expressão de Cox-2 e 5 com baixa
expressão desta molécula. Denotou-se uma tendência para um aumento da
imunorreactividade para a Cox-2 à medida que o IM aumentou embora, em todos os
grupos, o número de tumores com baixa imunorreactividade foi superior aos de elevada
imunoreactividade.
No que diz respeito ao grau nuclear (GN), nos tumores com GN= 2 (n=22), existe
claramente um maior número de amostras com baixa expressão de Cox-2 (n=20 casos),
observando-se apenas 2 casos com elevada imunorreactividade. Nos tumores com GN=3
(n=22), existe um aumento substancial de casos com elevada imunoexpressão de Cox-2
(n=9), embora ainda existam 13 tumores com baixa expressão.
Finalmente, a existência de associação estatisticamente significativa entre a
expressão de Cox-2 e o grau histológico de malignidade (GHM) vem demonstrar, à luz
dos nossos resultados, que a maioria dos tumores com GHM=III tem altas expressões de
Cox-2 (n=7), sendo que 6 tumores apresentaram baixa imunorreactividade. Nos tumores
com GHM I e II, a maioria apresenta imunoexpressão de Cox-2 baixa contudo, denota-se
uma tendência para uma diminuição dos casos com baixa imunorreactividade, à medida
que o grau de malignidade aumenta.
Nos casos em que se verifica metastização nos linfonodos, a maioria dos tumores
revela alta imunorreactividade para a Cox-2 (4 em 6 casos). Em contrapartida, nas
amostras em que não existe metastização, a baixa expressão de Cox-2 é claramente
mais frequente (n=30) do que a alta expressão (n=7).
No que concerne à expressão de EGFR, evidenciou-se a existência de associação
estatisticamente significativa entre a expressão desta molécula e um parâmetro de
natureza clínico-patológica: metastização dos linfonodos (p=0,038)
Ficou patente pela análise do quadro 6, que todos os tumores em que se verificou
metastização ao nível dos linfonodos revelaram alta imunorreactividade ao EGFR (6
casos ). Na ausência de metastização, a maioria dos tumores revelou elevada expressão
de EGFR (20 de 37 casos).
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
39
As demais variáveis clínico-patológicas que figuram no quadro 6, não revelaram
associações estatisticamente significativas com a Cox-2 ou com o EGFR (p˃0,05).
4.1.4- Relação entre a expressão de Cox-2 e de EGFR (associação e correlação)
Pela evidência de partilha de funções nas diversas etapas da carcinogénese por parte
da enzima Cox-2 e do receptor EGFR, foi realizado o teste de Spearman˃s de modo a
verificar a existência de uma correlação entre os marcadores em estudo. Ambas as
variáveis foram utilizadas de modo categorizado, segundo os valores de cut-off usados
previamente. A correlação obtida é positiva e significativa (r=0,474, p=0,001) para os
tumores incluídos neste estudo. (Quadros 7 e 8)
Quadro 7: Associação da expressão de COX-2 com a expressão de EGFR em TMC malignos.
Pela análise do quadro anterior pode-se constatar que, dos tumores que constituem a
amostra deste estudo, 39,5% (n=17) revelam baixa imunorreactividade para os
marcadores em análise. Contudo, um número significativo de tumores (n=15),
representando 34,9% dos casos, apresenta elevada imunoexpressão de EGFR e
reduzida expressão de Cox-2. Além disso, 11 tumores apresentam simultaneamente alta
imunorreactividade para Cox-2 e EGFR (25,6% da amostra). De realçar que nenhum
tumor apresenta elevada expressão de Cox-2 e reduzida expressão de EGFR.
A associação entre a Cox-2 e o EGFR é estatisticamente significativa (p=0,001).
Expressão COX-2 n
%
Expressão EGFR n % Total P
Baixa Alta
Baixa 39,5% 34,9% 74,4%
0,001 Alta 0,0% 25,6% 25,6%
Total 39,5% 60,5% 100%
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
40
Quadro 8: Correlação entre Cox-2 e EGFR
No quadro 8 está patente que a correlação obtida entre os marcadores em estudo é
positiva e significativa (r=0,474, p=0,001).
4.1.5- Associação entre a imunoexpressão de Cox-2 e EGFR com as variáveis clínico-patológicas
Os tumores mamários incluídos neste estudo foram distribuídos por 3 grupos: o grupo
com baixa expressão de Cox-2 ou EGFR foi denominado grupo A; o grupo com elevada
imunorreatividade à Cox-2 e baixa ao EGFR, ou alta expressão de EGFR e baixa de Cox-
2, forma o grupo B; o grupo com elevada imunorreatividade a ambos foi designado grupo
C (adaptado de Ceccarelli et al., 2005). De frisar, que todos os tumores da amostra
revelaram imunorreatividade para os marcadores em análise. No quadro 9 estão
expressas as relações encontradas entre cada um dos grupos e as variáveis clínico-
patológicas analisadas.
EGFR
Cox-2 n= 43
r=0,474 p=0,001
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
41
Quadro 9: Relação entre os grupos Cox-2/EGFR e as variáveis clínico-patológicas.
Variáveis
baixoCOX-2/baixo EGFR
baixoCOX-2/altoEGFR
altoCOX-
2/altoEGFR p
n n n
Tamanho (n=43) 1 (<3cm)
2 (3-5cm)
3 (>5cm)
0,083
7 8 2
8 4 3
2 3 6
Ulceração (n=43) Presente Ausente
0,500 1 1 2
16 14 9
Tipo histológico (n=43) Carcinoma sólido Carcinoma tubulo-papilar Carcinoma complexo Carcinossarcoma Carcinoma anaplásico
0,479
1 1 2
10 8 5
5 5 1
0 1 1
1 0 2
Necrose (n=43) Presente Ausente
0,213 3 3 5
14 12 6
Índice mitótico (n=43) 1 2 3
0,147 11 9 2
3 4 5
3 2 4
Grau nuclear (n=43) 2 3
0,049 11 8 2
6 7 9
Grau de diferenciação (n=43) 1 2 3
0,263 5 2 2
7 8 2
5 5 7
Grau histológico de malignidade (n=43) I II III
0,031 10 5 2
4 7 2
3 3 7
Metastização dos linfonodos (n=43) Presente Ausente
0,025 0 2 4
17 13 7
Pela observação do quadro 9, podemos constatar que foi possível determinar
associações estatisticamente significativas entre os grupos Cox-2/EGFR e as seguintes
variáveis clínico-patológicas: grau nuclear (p=0,049), grau histológico de malignidade
(p=0,031) e metastização dos linfonodos (p=0,025).
No que concerne ao grau nuclear (GN), observando o quadro 9 podemos constatar
nos tumores identificados como tendo GN=3, 6 de 22 casos revelaram baixa
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
42
imunorreatividade para os dois marcadores, 7 de 22 casos, apresentaram
imunoexpressão alta para o EGFR e baixa para a Cox-2 e 9 de 22 casos, caracterizaram-
se por uma imunoexpressão alta para ambos os marcadores.
No que respeita ao grau histológico de malignidade (GHM), constatou-se que a
maioria dos tumores com GHM=I apresentou baixa imunoexpressão quer de Cox-2, quer
de EGFR (10 de 17 casos). A maioria dos tumores com GHM=2 revelou alta
imunorreatividade para o EGFR e baixa para a Cox-2 (7 de 13 casos). Nos tumores de
GHM=3, denotou-se que a maioria dos casos apresentou alta imunorreatividade para
Cox-2 e EGFR, com o registo de 7 de 13 casos.
No que diz respeito ao parâmetro metastização nos linfonodos, dos 6 casos com
linfonodos metastizados, 4 apresentam em simultâneo elevada imunoreatividade para a
Cox-2 e para o EGFR. Os outros 2 casos pertencem ao grupo com baixa
imunoreatividade para a Cox-2 e elevada para o EGFR. Dos tumores com ausência de
metastização nos linfonodos (n=37), 17 apresentaram baixa imunorreatividade à Cox-2 e
ao EGFR, 13 demonstraram baixa immunoreatividade para a Cox-2 e elevada para o
EGFR e 7 elevada imunoreatividade aos dois marcadores.
43
CAPÍTULO 5 DISCUSSÃO
Os tumores mamários assumem-se como a entidade tumoral mais frequente em
canídeos do género feminino (Sorenmo, 2003).
Apesar de, nas últimas décadas, uma imensidão de trabalhos científicos terem incidido
no complexo fenómeno oncológico na tentativa de descortinar qual a etiologia, factores
de risco, processos moleculares, contributo genético, factores de prognóstico e
modalidades de tratamento, será correcto afirmar que muitos mistérios continuam por
desvendar. Reconhecem-se várias batalhas ganhas nesta luta contra o Cancro, fruto de
novas modalidades de diagnóstico e tratamento, mas a guerra ainda pende para o lado
inimigo, com inúmeras mortes registadas todos os anos, não só na espécie humana mas
também na canina.
A pesquisa de marcadores moleculares com potencial como alvo terapêutico é, desta
feita, de importância fulcral para a comunidade científica, cujo objectivo é atingir a doença
no seu cerne, com a maior especificidade possível e o menor número de efeitos nefastos.
Reconhece-se, porém, que este tipo de modalidade terapêutica poderá ter mais utilidade
associada à terapia convencional, e não como tratamento isolado.
Em Medicina Humana, vários são já os trabalhos desenvolvidos tendo como base a
pesquisa dos marcadores Cox-2 e EGFR, quer isoladamente, quer associados, não só
em tumores de mama, mas em vários outros tipo de tumor: adenocarcinoma pulmonar,
carcinoma pulmonar de não pequenas células, cancro colo-rectal, carcinoma
nasofaríngeo, adenocarcinoma esofágico, entre outros (Bhargava et al., 2005; Ceccarelli
et al., 2005; Li et al., 2006; Van Dyke et al., 2008; Huang et al., 2010; Li et al., 2011)
Em Medicina Veterinária existem alguns estudos que avaliaram a expressão de Cox-2
nos diferentes tumores caninos, embora para o EGFR tal número é notoriamente mais
escasso (Doré et al., 2003; Mohammed et al., 2004; Heller et al., 2005; Millanta et al.,
2006; Queiroga et al., 2007; Dias Pereira et al., 2009; Gama et al. 2009; Lavalle et
al.,2009). Que seja do nosso conhecimento, não existe actualmente nenhum trabalho
científico em tumores de mama de cadela que tenha avaliado a expressão de Cox-2 e de
EGFR, simultaneamente e no mesmo grupo de tumores, nem, consequentemente, a
correlação entre estas duas moléculas. Tal facto serviu de mote para o desenvolvimento
deste trabalho, cujos objectivos recaem na avaliação da expressão destas moléculas em
43 tumores mamários de cadela, pelo método da imunohistoquímica, na relação desta
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
44
expressão com características clínico-patológicas e na relação da Cox-2 e do EGFR
entre si. A análise da expressão das moléculas em causa com a sobrevida foi um
parâmetro não analisado, resultante do facto dos casos serem recentes e não ter
decorrido tempo suficiente para o efeito.
Segundo o nosso trabalho, pela avaliação da expressão da Cox-2 nos tumores
mamários incluídos na nossa amostra, foi possível estabelecer associações
estatisticamente significativas entre esta molécula e diversas características clínico-
patológicas. Assim, os nossos resultados demonstraram que a expressão de Cox-2 tinha
associação estatisticamente significativa com o tamanho tumoral (p=0,033), índice
mitótico (n=0,040), grau nuclear (0,021), grau histológico de malignidade (p=0,020) e
metastização nos linfonodos (p=0,029). As associações constatadas traduzem uma
relação entre a expressão de Cox-2 e fenótipos tumorais mais agressivos, tal como
relatado em estudos anteriores (Doré et al., 2003; Heller et al., 2005; Queiroga et al.,
2007; Dias Pereira et al., 2009; Queiroga et al., 2010).
À semelhança dos resultados obtidos no nosso trabalho, Queiroga et al. (2005),
analisando a expressão de Cox-2 em 129 tumores mamários de cadela por “enzyme-
immunoassay” (ElA) concluiu que, nos tumores malignos não inflamatórios, a detecção
de Cox-2 era maior nos tumores de maior tamanho e de tipo histológico mais agressivo.
Num trabalho desenvolvido pela mesma autora, em 2010, em 27 TMC de carácter
maligno, em que 100% revelaram imunorreactividade para a Cox-2, concluiu-se que a
expressão de Cox-2 apresentava associação estatisticamente significativa com a
metastização nos linfonodos regionais (p=0,038), associação também evidente no nosso
estudo. Num estudo recente, concluiu-se que a expressão de Cox-2 estava presente em
76,2% dos tumores malignos analisados e evidenciava associação estatisticamente
significativa com o tipo histológico (p=0,034), crescimento infiltrativo (p=0,010), grau
nuclear (P=0,049) e índice mitótico (p=0,006) (Queiroga et al., 2011). Como se pode
constatar, existe uma similitude entre estes resultados e os do nosso trabalho,
relativamente ao índice mitótico e ao grau nuclear.
Os nossos resultados não evidenciaram uma associação estatisticamente significativa
entre a expressão de Cox-2 e o tipo histológico, ao contrário do demonstrado no estudo
anterior e noutros de Medicina Veterinária (Heller et al., 2005) e Humana (Ristimaki et al.,
2002). De referir que esta discrepância de resultados poderá resultar do facto da nossa
amostra se caracterizar por um reduzido número de tumores em cada tipo histológico e,
portanto, não haver suficiente representatividade. Para além disso, diferenças na técnica
da imunohistoquímica, na avaliação da imunorreactividade e nos anticorpos utilizados
poderão contribuir para as discrepâncias verificadas nalguns estudos.
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
45
Assim sendo, podemos depreender que as conclusões da nossa investigação
traduzem uma relação entre a expressão de Cox-2 nos TMC e diversos parâmetros
clínicos de malignidade e agressividade tumoral. Estes resultados estão em consonância
com diversos estudos anteriores, no contexto dos tumores de mama (Doré et al., 2003;
Heller et al., 2005; Millanta et al., 2006a; Queiroga et al., 2007; Dias Pereira et al., 2009),
bem como em outros tipos de tumor de canídeos, nomeadamente, mastocitomas (Justina
et al., 2011) e melanomas (Pires et al., 2010).
No que diz respeito ao EGFR, os nossos trabalhos vieram revelar que a expressão
deste receptor apresentava associação estatisticamente significativa com um parâmetro
clínico: metastização nos linfonodos (p=0,038).
Seis tumores revelaram metastização ao nível dos linfonodos regionais e todos
expressaram EGFR (100%).
Num estudo desenvolvido por Gama et al., 2009, em que procedeu à análise de 136
TMC por imunohistoquímica, constatou-se que a expressão de EGFR apresentava
associação estatisticamente significativa com a malignidade tumoral, a idade do animal e
o tamanho tumoral. Assim, segundo esse trabalho, a expressão de EGFR era superior
nos animais com idade superior a 9 anos, nos tumores malignos e nos tumores de maior
tamanho. Não se obtiveram associações significativas com os demais parâmetros clínico-
patológicos, nem com a sobrevivência, embora se denote uma tendência para menores
períodos livres de doença e de sobrevivência global nos tumores com expressão de
EGFR. Apesar dos nossos resultados apenas revelarem uma associação
estatisticamente significativa entre a expressão do EGFR e a invasão dos linfonodos, tal
traduz uma relação entre a expressão do marcador em causa e a malignidade tumoral, tal
como verificado no estudo de Gama et al. (2009), denotando-se simultaneamente um
possível papel do EGFR na progressão tumoral.
Rutteman et al., (1994) realizaram um estudo no sentido de avaliarem a expressão de
EGFR em tecidos mamários normais, tumores benignos, tumores malignos e metástases,
concluíndo que a expressão de EGFR não diferia muito entre estes tecidos. Segundo os
seus resultados, na glândula mamária de canídeos, a expressão de EGFR não se
relacionava com a agressividade biológica do comportamento tumoral. Resultados
semelhantes foram alcançados por Nerurkar et al. (1987) e Donnayet al. (1996). A
disparidade verificada entre os resultados apresentados por estes autores e os obtidos no
nosso trabalho e de Gama et al. (2009), poderá estar relacionada com o contexto
temporal em que se desenvolveram e, consequentemente, pela adopção de diferentes
técnicas. Tal facto impossibilita, a nosso ver, o exercício de comparações legítimas.
A escassez de estudos de expressão de EGFR em TMC é deveras notória, o que
impossibilita uma confrontação de resultados mais produtiva. De referir que a expressão
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
46
de EGFR tem sido alvo de estudo noutros tumores caninos, nomeadamente em tumores
nasais (Shiomitsu et al., 2009), gliomas (Higgins et al., 2010) e osteossarcomas
(Selvarajah et al., 2012), entre outros, e relacionada com a malignidade tumoral, tal como
verificado nos TMC. Tais constatações despoletam um interesse cada vez maior para a
utilização de terapia dirigida.
Em Medicina Humana, no contexto do cancro da mama, o EGFR é um marcador
molecular cujo valor prognóstico tem sido alvo de inúmeros estudos, cujos resultados
permanecem bastante controversos (Fox et al., 1994; Toi et al., 1994; Pirinen et al.,1995;
Reis-Filho et al., 2006a, b). Assim, enquanto alguns trabalhos concluem que a expressão
positiva de EGFR está relacionada com menor tempo livre de doença e menor
sobrevivência (Tsutsui et al., 2002), outros há que não denotam qualquer correlação
(Ciardiello et al., 2003).
Como anteriormente referido, não existem à data, segundo o nosso conhecimento,
quaisquer estudos realizados em TMC que avaliem a expressão de Cox-2 e EGFR, bem
como a sua correlação. Segundo os nossos resultados, dos 43 tumores de mama
malignos analisados, 25,6% apresentaram simultaneamente altas expressões de Cox-2 e
EGFR. Além disso, 34,9% revelaram alta imunorreatividade para o EGFR e baixa para a
Cox-2, sobressaindo o facto de não existir qualquer tumor com alta expressão de Cox-2
sem alta expressão de EGFR. Apenas 17 casos (39,5%) demonstraram baixa
imunorreactividade para os dois marcadores em análise.
As expressões de Cox-2 e EGFR apresentaram correlação positiva (r=0,474) e
estatisticamente significativa (p=0,001), entre si.
Na relação da imunoexpressão dos grupos Cox-2/EGFR com as variáveis clínico-
patológicas foi possível estabelecer associações estatisticamente significativas entre
estes grupos e o grau nuclear (p=0,049), o grau histológico de malignidade (p=0,031) e a
metastização nos linfonodos (p=0,025).
Assim, em linhas gerais, denotou-se que os tumores com alta imunoexpressão de
Cox-2 e EGFR eram tumores com características de maior agressividade. A maioria dos
tumores com GN=3, GHM=3 e com invasão dos linfonodos regionais revelaram alta
imunorreactividade para ambos os marcadores.
Face ao exposto, o nosso trabalho vem constatar uma correlação entre as expressões
COX-2 e EGFR nos TMC, além de ter demonstrado a existência de associações
estatisticamente significativas com determinadas características clínico-patológicas
relacionadas com fenótipos tumorais mais agressivos. Estes resultados entram em
acordo com o verificado individualmente para cada marcador analisado, como
anteriormente discutido.
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
47
O EGFR encontra-se frequentemente sobre-expresso no cancro colo-rectal humano,
cuja aberrante expressão promove a proliferação e a resistência à apoptose e,
consequentemente, a transformação, progressão e metastização (Radinsky et al., 1995;
Tong et al., 1998; Robert set al., 2002). Tais fatos são concordantes com os nossos
resultados, dado que se verificou uma associação estatisticamente significativa entre o
EGFR e a invasão dos linfonodos regionais, sobressaindo o papel deste marcador na
progressão tumoral. A Cox-2 também se encontra anormalmente expressa na maioria
destes tumores e encontra-se envolvida na tumorigénese promovendo também a
proliferação celular e a inibição da apoptose, além da angiogénese (Kutchera et al., 1996;
Gupta et al., 2001; Pai et al., 2003). As acções desenvolvidas pela Cox-2 nas várias
etapas da carcinogénese, anteriormente explícitas, conduzem a fenótipos tumorais mais
agressivos, sendo esta conclusão semelhante às formuladas no decorrer no nosso
estudo.
Num estudo levado a cabo por Ceccarelli et al. (2005) avaliou-se por IHQ as
expressões de EGFR, Cox-2 e marcadores proliferação, numa série de 205 tumores
colorectais e as suas associações com parâmetros clínico-patológicos. Os seus
resultados não evidenciaram associações estatisticamente significativas entre EGFR e
Cox-2 com a idade, localização tumoral ou estadio. A expressão de EGFR apresentou
relação directa com o Ki-67 e as ciclinas D1 e E, o que confirmou ser um dos factores
envolvidos na proliferação, como anteriormente já referido (Knauer et al., 1984, Li net al.,
2001) dando ainda mais solidez aos resultados por nós alcançados relativamente ao
EGFR nos TMC. Por outro lado, os casos com elevada expressão de Cox-2
demonstraram uma clara promoção da proliferação do EGFR, o mesmo não se
verificando nos de baixa expressão, tal como constatado pelo nosso estudo cuja
correlação entre estas duas moléculas se revelou positiva e significativa, além de que
não se registaram quaisquer casos de alta expressão de Cox-2 com baixa expressão de
EGFR. Ceccarelli et al. (2005) concluíram que as duas proteínas são alvos
farmacológicos de enorme interesse no contexto do Cancro Colo-rectal, quer para
terapia, quer para quimioprevenção. O grupo de casos com elevada expressão de Cox-2
parece ser o candidato ideal para uma terapia combinada anti-Cox-2/EGFR. Uma vez
que, na nossa amostra, 25,6% dos tumores revelaram elevada imunorreactividade para
os dois marcadores, fará todo o sentido, futuramente, o desenvolvimento de estudos
sobre a utilização de modalidades terapêuticas combinadas anti-Cox-2/EGFR nos TMC.
Li et al. (2006) analisaram e compararam pacientes com tecido esofágico normal,
esofagite de Barret e adenocarcinoma esofágico, revelando um aumento de expressão
de Cox-2 e EGFR do tecido normal para a esofagite normal, e deste para o
adenocarcinoma. O fato das expressões de Cox-2 e EGFR aumentarem em tecidos
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
48
tumorais, comparativamente com não cancerígenos, entra em concordância com os
nossos resultados pois, tendo em consideração que só analisámos tumores malignos,
obtivemos imunoexpressões (baixas ou altas) de Cox-2 e EGFR em todos os casos.
Além disso, houve uma clara relação da expressão destes marcadores com
características de maior malignidade tumoral.
Kim et al. (2004), constataram que pacientes padecendo de carcinoma de células
escamosas no cérvix uterino, com imunopositividade para Cox-2 e EGFR, apresentavam
piores resultados de sobrevivência livre de doença aos 5 anos e maior probabilidade de
recorrência loco-regional comparativamente com doentes com +Cox-2/-EGFR, -Cox-
2/+EGFR ou –Cox-2/-EGFR. Os nossos resultados também evidenciaram relações entre
o grupo +Cox-2/+EGFR com o GHM e a metastização nos linfonodos, características de
maior agressividade tumoral. Por analogia é de esperar que os TMC com alta
imunorreactividade a Cox-2 e EGFR tivessem menor sobrevida e maior recorrência loco-
regional.
Van Dyke et al. (2008), num estudo analisando adenocarcinomas de pulmão em
mulheres, demonstrou que tumores com expressão -Cox-2/+EGFR, mas não +Cox-
2/+EGFR, apresentaram-se associados a sobrevivência. Por outro lado, pacientes com
positividade à Cox-2 tendiam a ter pior prognóstico do que pacientes sem expressão do
marcador. Estes resultados vêm uma vez mais reforçar as nossas conclusões, dado que
também verificámos que os grupos +Cox-2/+EGFR apresentavam relações com
características de maior agressividade tumoral, do que nos restantes grupos, pelo que se
esperaria que, nestes últimos, a sobrevivência fosse menor. Também constatámos que
tumores com elevada imunorreatividade para Cox-2 estavam associados a características
clínico-patológicas de maior agressividade, consequentemente, pior prognóstico. No
entanto serão necessários estudos de seguimento clinico, a fim de clarificar os presentes
resultados.
Num estudo recente desenvolvido por Fenge et al. (2011), foi avaliada a expressão de
EGFR e Cox-2 em tumores pulmonares de não pequenas células (NSCLC), com o intuito
de relacionar tais expressões com características clínico-patológicas e estabelecer os
seus valores prognósticos. A imunoexpressão de EGFR demonstrou associação
estatisticamente significativa com o parâmetro metastização nos linfonodos (p=0,040), em
concordância com os nossos resultados, e sobrevivência (p=0,038), sendo que elevadas
expressões de EGFR se relacionaram com menor período de sobrevivência. Além disso,
demonstraram que a expressão de EGFR está associada a uma maior resistência dos
tumores à radioterapia e menor efectividade da técnica. Relativamente à Cox-2, esta
apresentou-se relacionada com a malignidade tumoral, à semelhança do nosso estudo,
mas não evidenciou correlação com a sobrevivência. Apesar de se ter constatado sobre-
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
49
expressão de Cox-2 e EGFR nos NSCLC, as suas expressões não demonstraram
correlação entre si. Segundo os autores esta falta de correlação poderá implicar que a
expressão destas duas proteínas poderá ser controlada por mecanismos independentes.
Num estudo protagonizado por Lanza-Jacoby et al.(2006), os autores demonstraram
os efeitos da combinação do inibidor da tirosina-quinase do EGFR, ZD1839, e o inibidor
da Cox-2, celecoxib, na sobrevivência celular, progressão do ciclo celular e apoptose,
numa linha celular de tumores de mama de ratinhos, NMF11.2. Os resultados deste
trabalho revelaram que a combinação dos dois fármacos conduziu a um efeito supra-
apoptótico adicional em células tumorais com simultânea expressão de HER-2. A
eficácia do tratamento combinado também demonstrou estar associado com uma
considerável inibição do EGFR EGF- activado e do sinal extracelular regulado pela
quinase (via ERK-1/2), comparativamente com os tratamentos preconizados com apenas
um dos agentes. A evidência de que 25,6% dos tumores abrangidos pela nossa amostra
revelaram altas expressões de Cox-2 e EGFR, dá ênfase à possível utilidade destes
fármacos no combate aos TMC.
Por outro lado, num ensaio de fase I em doentes com cancro de pulmão de não
pequenas células, observou-se que a terapia combinada era segura e obtinha respostas
parciais em 33% dos pacientes e conduzia a estabilização em cerca de 24% (Reckamp et
al., 2006). Contudo, noutros ensaios clínicos mais recentes (utilizando um inibidor de
Cox-2 e inibidores do EGFR, gefitinib ou erlotinib, não evidenciaram qualquer benefício
adicional do tratamento combinado em pacientes sem resposta ao tratamento com
platinum ou pacientes naíve à quimioterapia, comparativamente com estudos anteriores
preconizados com o recurso ao gefitinib ou erlotinib sozinhos (O, Byrne et al.,2007;
Gadgeel et al., 2007; Argwala et al., Fidler et al., 2006). Estes resultados entram em
discordância com os verificados em linhas celulares in vitro, havendo autores que
sugiram que o benefício da terapia combinada poderá estar associada a tumores com
mutações de EGFR (Gadgeel et al., 2007). Apesar dos nossos resultados evidenciarem
um número considerável de tumores com expressão simultânea de Cox-2 e EGFR,
estudos específicos com inibidores selectivos destas moléculas são necessários, no
contexto dos TMC, para constatação da sua real efectividade.
Em suma, o nosso trabalho de investigação, que seja do nosso conhecimento,
debruçou-se pela primeira vez, na esfera da Medicina Veterinária, na avaliação conjunta
das imunoexpressões dos marcadores EGFR e COX-2, desta feita em TMC. Os
resultados produzidos evidenciaram relações significativas entre estas expressões e
características de malignidade/agressividade tumoral, à semelhança do relatado em
inúmeros estudos realizados em tumores de Medicina Humana, como anteriormente
Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS
50
descrito. Além disso, foi possível estabelecer uma correlação entre a expressão das
proteínas entre si.
51
CAPÍTULO 6
CONCLUSÃO
Em Medicina Humana, apesar da panóplia de estudos incidindo sobre as expressões
de Cox-2 e EGFR, os resultados relacionados com o valor prognóstico e a utilidade da
utilização de terapia combinada dirigida a estas moléculas-alvo, ainda permanece
controverso. Evidente parece ser que cada situação tumoral está envolta de processos
ímpares, de interacções moleculares próprias e passíveis de adaptações temporais,
levando-nos a crer que o valor prognóstico de cada molécula e a utilização de terapia-
dirigida carece de uma minuciosa avaliação individual.
Em Medicina Veterinária urge a necessidade de desenvolvimento de um maior número
de estudos no sentido de se avaliarem as expressões de Cox-2 e EGFR em amostras
maiores de TMC e noutros tipos de tumor, na tentativa de discernir qual o seu papel
prognóstico, bem como a possibilidade de usufruir de terapia combinada.
Os nossos resultados revelaram-se bastante promissores no sentido em que
demostraram a existência de imunoexpressão de Cox-2 e EGFR nos TMC, conseguiram
estabelecer relações entre estes marcadores e características relacionadas com
agressividade tumoral, à semelhança de alguns tumores humanos, e evidenciaram
correlação entre as expressões de Cox-2 e EGFR. Estas constatações abrem portas para
investigações respeitantes à utilização de terapia dirigida, em modalidade isolada ou
combinada, nos tumores mamários de cadela. A utilização destas abordagens
terapêuticas trará esclarecimentos para o entendimento da tumorigénese mamária de
canídeos e, adicionalmente, para os tumores de mama da mulher, tendo em conta que,
actualmente, a cadela se assume como um reconhecido modelo de carcinogénese para
os tumores humanos.
52
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