Prof. Odir A. Dellagostin Biblioteca Genômica e de cDNA

Prof. Odir A. Dellagostin

Biblioteca Genômica e de Biblioteca Genômica e de cDNAcDNA

Biblioteca GenômicaBiblioteca Genômica

É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um determinado organismo

Características das Bibliotecas Características das Bibliotecas de DNAde DNASão usadas para principalmente para

procariotosEm eucariotos usa-se biblioteca

genômica para estudo de regiões reguladoras

Independe do típo de célula utilizada para a obtenção do DNA

Biblioteca de cDNABiblioteca de cDNA

É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mRNA.

É usada principalmente para células eucarióticas.

Varia de acordo com o tecido utilizado.

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• É a formação de molécula fita dupla, É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens complementares, mas de origens diferentesdiferentes

• Hibridização Renaturação

HIBRIDIZAÇÃO HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOSDOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

• Triagem de Bibliotecas Genômicas

• Diagnóstico molecular

• Tipagem molecular

• Teste de paternidade

• Medicina forense

Aplicações

Triagem de uma biblioteca

Conhecer parte da Conhecer parte da seqüência do geneseqüência do gene

Seqüência Seqüência completa do genecompleta do gene

Sonda de DNASonda de DNA Utilizar sonda de Utilizar sonda de oligonucleotídeos oligonucleotídeos derivado de uma derivado de uma

proteínaproteína

Codon degeneradoCodon degeneradoConhecer cerca de Conhecer cerca de 6 aa contíguos6 aa contíguos

AnticorposAnticorpos

1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos

Marcação da Sonda de DNAMarcação da Sonda de DNA

•Radioativa: Radioativa: 3232P P

•Não radioativa: Não radioativa: peroxidase, fosfatase alcalinaperoxidase, fosfatase alcalina

SONDA de DNASONDA de DNA

- Seqüência de DNA Marcada- Seqüência de DNA Marcada

Marcação da Sonda de DNAMarcação da Sonda de DNA

•Enzimática: Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalinaperoxidase, fosfatase alcalina

Desnaturação DNA

DNA fita simples

Ligação Fraca

(DNA+ Peroxidase)

Sondas Covalentemente marcada com a enzima

+ peroxidase complexada com polimero positivo

+ glutaraldeído

2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização

1

2 3

456

Placas com Colônias

contendo os plasmídeos

Lise das Bactérias – Desnaturação do DNA

SondaFilme de Raio - X

2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização

Caracterização da seqüência encontrada

• Seqüenciamento de DNASeqüenciamento de DNA

• PCRPCR

• Expressão da seqüência codificadoraExpressão da seqüência codificadora

Southern Blot - DNASouthern Blot - DNA

Northern Blot - RNANorthern Blot - RNA

Western Blot - ProteínaWestern Blot - Proteína

• Sonda: seqüência de DNA marcada

Transferência de DNA do gel para a membrana

Southern Blot

NORTHERN BLOT

4. Geração de uma sonda marcada

pGEM-T

dATPdGTPdTTP

dCTP

1. Extração do DNA

2. Eletroforese do RNA

3. Transferência para a menbrana

5. Hibridização

6. Visualização