RODRIGO ROCHA LATADO. Tópicos IntroduçãoIntrodução Principais característicasPrincipais...

RODRIGO ROCHA LATADORODRIGO ROCHA LATADO

TópicosTópicos• IntroduçãoIntrodução

• Principais característicasPrincipais características

• Sistemas de cultivo Sistemas de cultivo in vitroin vitro de células e de células e tecidostecidos

• Aplicações das técnicas de cultura de Aplicações das técnicas de cultura de tecidos vegetaistecidos vegetais

BIOTECNOLOGIA VEGETAL: Cultura de Tecidos

Manipulação Genética

Biologia Molecular

Cultura de tecidos vegetais

- Nome genérico que se dá aos vários procedimentos de cultivo in vitro de células, tecidos e órgãos vegetais em um meio nutritivo e em condições assépticas. Extraído de Glossário de Biotecnologia (2005)

INTRODUÇÃO

Principais Características

• in vitro = cultivo em frascos de vidro ou de plástico; • ambiente artificial (físico e nutricional);

• ocupa menor espaço físico;

• diferentes tipos de células, tecidos e órgãos; • ambiente asséptico = ausência de microorganismos e insetos;

Cultivo Cultivo in vitroin vitro de banana (micropropagação) de banana (micropropagação)

Cultivo Cultivo in vitroin vitro de banana de banana

aclimatizaçãoPlantio

Cultura Cultura in vitroin vitro de banana de banana

Fotos: Tulmann Neto

Cultivo Cultivo in vitroin vitro de banana de banana

Foto: P.H. Viégas

HISTÓRICO

TOTIPOTÊNCIA

- 1o dos primeiros fundamentos da cultura de tecidos vegetais

"...cell is capable of autonomy and even that is totipotent..." (Schleiden, 1838; Schwann, 1839)

”...célula é autônoma, portanto, contém o potencial necessário para originar uma planta...”

Entretanto,

a totipotência somente é expressa sob condições especiais de estímulos.

HISTÓRICO

Gottliet Haberlandt (1854-1946)

CULTURA DE TECIDOS

Fisiólogo vegetal austro-húngaro (G. Haberlandt, 1902) foi o 1o a tentar cultivar plantas “in vitro”, entretanto, devido a limitações técnicas da época, não obteve sucesso.

"Haberlandt’s vision was of achieving continued cell division in explanted tissues on nutrient media – that is, of establishing true, potentially perpetual, tissue cultures."

"Harbelandt originated the conceptual and was the first to attempt to cultivate isolated plant cells "in vitro" on an artificial medium." (Dodds & Roberts, 1995)

HISTÓRICO

1900: Idéias sobre totipotência (Morgan, 1901) (Haberlandt, 1902) primeiro a tentar o cultivo de células vegetais (folha);

1930 - 1940: Trabalhos básicos sobre assepsia, formulação de meios nutritivos, descoberta de auxinas;

Indução e cultivo de calos;

HISTÓRICO

1934 - primeiro trabalho de cultura de tecidos - ápices radiculares de tomate por tempo indefinido (White);

1934 - identificação da auxina AIA (Kogh et al.);

1937 - importância da tiamina (vitamina) para o crescimento de raízes in vitro e elaborou uma ‘mistura orgânica’, utilizada até hoje (White);

1939 - obtenção e manutenção por tempo indefinido de calo de cenoura (Gautheret; Nobércour);

1939 - White: obtenção de calo de fumo;

HISTÓRICO

1940 – 1970: Formulação de meios nutritivos, cultura de ápices meristemáticos, células em suspensão, embriogênese somática, isolamento de protoplastos e regeneração de plantas;

1970 – 1990: Primeiros trabalhos sobre manipulação genética, fusão de protoplastos e plantas transgênicas;

HISTÓRICO

1941 - adição de água de coco aos meios de cultura (Van Overbeek et al.);

1946 - 1a regeneração de plantas a partir de ápices meristemáticos de Lupinus (Ball);

1952 - uso prático - obtenção de plantas de dália, livres de vírus (Morel & Martin);

1960 – mesmo para orquídeas (Morel);

HISTÓRICO

1955 e 1956 - (Miller et al.)- descoberta da cinetina - regeneração de parte aérea/raiz de tabaco

depende do balanço auxina/citocinina

1958 – (Steward et al.) e 1959 - (Reinert) - formação de embriões somáticos de cenoura

1960 - isolamento de protoplastos tomate (Cocking)

1962 – formulação do meio de cultura MS (Murashige & Skoog);

HISTÓRICO

1966 – plantas haplóides a partir de cultura de anteras de Datura (Guha & Maheshwari);

1971 – regeneração de plantas a partir de protoplastos (Takebe et al.);

1972 - fusão de protoplastos de Nicotiana glauca e N. langsdorfii (Carlson et al.);

1978 – obtenção de híbridos somáticos entre tomate e batata (Melchers et al.);

HISTÓRICO

1974 – descobriram que o plasmídeo-Ti era o princípio indutor da A. tumefaciens, possibilitando a transformação de plantas (Zaenen et al.; Van Larebeke et al.);

1977 – integração de DNA plasmidial, em células de tabaco (transformação genética) (Chilton et al.);

1979 – desenvolveram a técnica de co-cultivo (Marton et al.);

1985 - obtiveram plantas transformadas de tabaco (Horsch et al.);

HISTÓRICO

1994 – Lançamento comercial da 1a planta transgênica;

Tamate Flavr Savr (Calgene)

HISTÓRICO

1990 – hoje: desenvolvimento de protocolos mais eficientes de cultura de tecidos;

Universidades e Centros de Pesquisa

- estudos básicos: fisiologia e bioquímica - desenvolvimento de protocolos:

Organogênese e Embriogênese somáticaCultura de células haplóides, protoplastos,

etc…Seleção in vitroProdução de sementes sintéticasTransformação genética

CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

EXPLANTE- qualquer segmento de tecido oriundo de uma planta para iniciar uma cultura in vitro, geralmente com vistas a estabelecerum protocolo de plantas de genótipo superior.

meristemas pré-existentes - exemplos: ápice caulinar, meristema, segmento nodal e sementes

não meristemáticos - exemplos: disco de folha, segmentos de raiz, segmentos de folha

EXPLANTES

ápices caulinares

EstruturasArroz

EXPLANTES

Meristema

EXPLANTES

Segmento Nodal

EXPLANTES

Discos de folha Segmentos de raiz

SISTEMAS DE CULTURA IN VITRODE CÉLULAS E TECIDOS

Cultura de Embrião: Embrião zigótico imaturo ou maduro;

Cultura de Órgãos: meristema, raiz, gemas, outros.

Cultura de Calos: cultivo de uma massa não-diferenciada de células.

Cultura de Células em Suspensão: cultura de células isoladas e/ou em pequenos agregados, incubada sob agitação.

Embriogênese Somática: produção de embrião morfologicamente semelhante a um embrião zigótico que é diferenciado a partir de células somáticas.

Cultura de Células Haplóides: cultura de anteras, grãos de pólen e óvulos, com o objetivo de se obter plantas haplóides.

Cultura de Protoplastos: isolamento e cultivo de células sem parede celular.

Cultura de embriões

Mamão

Fonte: Cid (2003)

Cultura de órgãos (gema axilar)

Micropropagação de Café

Fonte: Cid (2003)

Cultura de órgãos (gema caulinar)

Abacaxi

Fonte: Cid (2003)

Cultura de órgãos (segmento epicótilo)

Citros

Fonte: Almeida (2002)

Cultura de calos

Eucalipto

Fonte: Cid (2003)

Cultura de células em suspensão

CaféFonte: Koehler (2006)

Fonte de explantes

Cultura de células em suspensão

Citros

Cultura de embriões somáticos

Café

Fonte: Cid (2003)

Cultura de protoplastos

BananaFonte: Assani et al. (2006)

APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

Pesquisa Básica: fisiologia e bioquímica vegetal

Micropropagação: mudas de alta qualidade e em grande quantidade

Limpeza de Vírus: vírus sistêmicos em espécies de propagação vegetativa

Cultivo de Embrião: dormência de sementes ou embriões obtidos de cruzamentos entre parentais distantes

Embriogênese Somática: produção de sementes sintéticas

Plantas Haplóides ou duplo-haplóides: obtenção de linhagens homozigotas

Conservação de Germoplasma in vitro

Manipulação Genética: hibridação somática, transformação genética, seleção in vitro, indução de mutações

Pesquisa Básica: fisiologia e bioquímica vegetal

Como é possível se obter:

- linhagens celulares homogêneas, sem clorofila e com ciclo sincronizado;- células isoladas (protoplastos);- grande número de células e plantas num pequeno espaço e sob condições artificiais;

APLICAÇÕES

bioquímica: - nutrição celular e de plantas;- cadeia de transporte em

membranas;- toxidez e detoxificação celular;

- metabólitos secundários;

fisiologia: - ciclo celular;- fatores de crescimento;- senescência;- vias de regeneração

(embriogênese somática);- fatores que afetam a fotossíntese;

Micropropagação clonal

- Produção de mudas em larga escala (plantas idênticas); - Maior utilização comercial da cultura de tecidos;- Necessidade de se ajustar os protocolos para cada espécie, variedade ou clone;

Espécies que mais têm sido utilizadas para a microprapagação comercial (cana-de-açúcar, Pinus, eucalipto, banana, abacaxi, morango, batata e ornamentais).

Cuidados para se evitar a variação somaclonal !!!!!

Variação Somaclonal: variação detectada em plantas regeneradas por cultura de tecidos (Larkin & Scowcroft, 1981);

Micropropagação de baunilha Micropropagação de mandioca

Fonte: Santos (2001)

Limpeza de vírus

Principais culturas: Cana-de-açúcar, Mandioca, Morango, Batata,

Plantas ornamentais

Limpeza de vírus

termoterapia + cultura do ápice meristemático

ex: vírus do mosaico da cana-de açúcarcultura de meristema: explante 0,3 mmcultura ápice meristemático (1 – 2,5 cm) +

termoterapia (45oC / 8 horas)

• quimioterapia + cultura do ápice meristemáticoincorporação de antivirais no meio de cultura

• Indexação: avaliação da presença do vírusensaios biológicosmicroscopia eletrônicaserologia (ELISA)hibridação com ácidos nucléicos

Cultivo de embrião

Cultivo de embriões zigóticos imaturos ou maduros

Objetivos:

-Superar a dormência de sementes (devido a imaturidade ou pela presença de inibidores no endosperma);

- Recuperar híbridos raros de cruzamentos incompatíveis;

Embriogênese somática

Cultivo de embriões somáticos

- Constitui-se numa importante ferramenta para os estudos básicos relacionados com a fisiologia e gênese do desenvolvimento do embrião;

- Método para propagação de plantas elite com uso de biorreatores e produção de sementes sintéticas;

- Produção de plantas transgênicas;

Embriogênese somática e sementes sintéticas

O conjunto de técnicas que visa o emprego de embriões somáticos é chamado de tecnologia de sementes sintéticas ou artificiais.

Cultura de células haplóides ou duplo-haplóides

Cultivo de células haplóides (grãos de pólen, anteras e óvulos);

Objetivos

- Obtenção de plantas haplóides;

- Obtenção de plantas duplo-haplóides (plantas completamente homozigotas) em apenas um ciclo e sem a necessidade de realizar cruzamentos;

-Vantagem: tempo

Cultura de anteras e pólen

Anteras Micrósporogerminando

Embriogênesesomática

Embriões somáticos

Gramínea

Cultura de óvulos

Flor - Ovário Óvulos Calos

Organogênesesomática

Obtenção de plantasMultiplicação

Tabaco

Conservação do germoplasma in vitro

- Conservação do germoplasma em pequeno espaço, a baixo custo e mantendo a integridade genética do acesso;

- Maior interesse para espécies de propagação vegetativa, tais como: alho, mandioca , batata, batata doce e outras;

- Evitar a variação somaclonal !!!

- Possibilidade de troca de germoplasma sadio (sem risco de novas doenças e pragas);

Manipulação Genética

- Ampliação da variabilidade: indução de variação somaclonal;

-Obtenção de novos materiais: hibridação somática, hibridação assimétrica, cibridização;

- Servir como apoio para outras técnicas: Indução de mutações, poliploidização com uso de colchicina, transformação genética e outras;

- Seleção in vitro de linhagens celulares e plantas;

Bibliografia consultada:

Borém, A.; Veira, M.L.C. Glossário de Biotecnologia, Viçosa, Editora Folha de Viçosa, 2005.

Roca, W.M. Mroginski, L.A.; Cultivo de tejidos em la agricultura fundamentos y aplicaciones. Colômbia, CIAT, 1991, 970p.

Torres A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília, EMBRAPA-SPI v.1, 1998, 864p.

Torres A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília, EMBRAPA-SPI v.2, 1999, 354p.

Revista BIOTECNOLOGIA Ciência e Desenvolvimento. KL3 Publicações: Brasília, 2001.