zimática

Cinética e Cinética e regulação regulação enzimáticaenzimática

IST – FML2º Semestre 2007/2008

Trabalho realizado por:

Miguel Amador nº58484

Joana Nunes nº58497João Marques nº58513

Cinética EnzimáticaCinética Enzimática

Estrutura Enzimática Constituição em Aminoácidos

Mecanismos de Acção Enzimática

São difíceis de definir quantitativamente

Determinar constantes da reacção catalisada

influenciam

é necessárioPelo que

Cinética EnzimáticaCinética Enzimática

Cinética Enzimática

Estudo da velocidade de uma reacção química que ocorre na presença de um enzima

Permite elucidar sobre:•Os pormenores do mecanismo catalítico das enzimas•O papel das enzimas no metabolismo•Controle da actividade •Mecanismos de inibição

Velocidade vs. ConcentraçãoVelocidade vs. Concentração

A concentração de substrato influencia a velocidade de uma reacção

Estudo da relação entre a concentração e a velocidade:

. No inicio da reacção a quantidade de substrato é constante, já que a quantidade de substrato é muito maior do que a de enzima..Determina-se a velocidade inicial de reacção, Vo ,para uma determinada [S]..Obtêm-se valores para várias concentrações de substrato, mantendo constante a concentração de enzima.

Assim podemos traçar os valores num gráfico, em que exprimimos Vo como função de [S]

Velocidade vs. ConcentraçãoVelocidade vs. Concentração

Dados:•Para [S] baixas, Vo aumenta quase linearmente•Para [S] maiores, Vo aumenta mais gradualmente•Para [S] mais elevadas, atinge-se uma velocidade máxima, Vmáx.

Equação de Michaelis-MentenEquação de Michaelis-Menten

Comportamento é explicado pela formação do complexo enzima-substrato ES

1. O enzima liga-se ao substrato reversivelmente formando o complexo ES

2. O complexo ES dissocia-se em enzima livre e produto da reacção

Reacção rápida

Reacção mais lenta

.A reacção 2, mais lenta, limita a velocidade global da reacção.

.A velocidade é proporcional à concentração do complexo ES.

.A cada momento o enzima existe na forma livre e no complexo ES.

.A velocidade máxima (Vmáx) da reacção ocorre quando todos os enzimas estão associadas a moléculas de substrato.

Dedução da Equação Michaelis-Menten

A curva que representa a relação entre [S] e Vo tem forma idêntica para a maior parte dos enzimas. Esta curva pode ser descrita algebricamente pela equação de

Michaelis-Menten.

Hipótese: o passo limitante da velocidade das reacções enzimáticas é a desassociação do complexo ES

A equação de Michaelis-Menten é

Dedução da Equação Michaelis-Menten

Presuposto: não há transformação de produto em substrato

Reacções de formação e desassociação do complexo ES:

Vo pode ser considerado como a velocidade com que ocorre a quebra da ligação ES

Não é fácil determinar [ES]![ET] - concentração total da enzima

A concentração de enzima livre é, assim, [ET]-[ES]

Dedução da Equação Michaelis-Menten

.Passo 1

Velocidade de formação de ES Velocidade de degradação de ES

.Passo 2

[ES] é constante, ou seja, a velocidade de degradação e formação de ES são iguais.

.Passo 3

Dedução da Equação Michaelis-Menten

.Passo 4Obtemos Vo, substituindo [ES]

A velocidade é máxima quando [ES]=[ET]!

Equação de Michaelis-Menten

Análise da Equação Michaelis-Menten

Km – unidades de concentração

A equação de Michaelis-Menten, que nos dá a relação quantitativa entre a velocidade inicial V0, a velocidade máxima Vmáx e a quantidade inicial de

substrato [S], todas relacionadas pela constante de Michaelis Km

No caso de V0 ser exactamente metade de Vmax:

Km corresponde à concentração de substrato para a qual V0 é metade da velocidade máxima

Análise da Equação Michaelis-Menten

A equação de Michaelis-Menten é muito útil para determinar os valores de Km e Vmáx das reacções.

Os enzimas que exibem uma dependência hiperbólica de V0 em função de [S] diz-se que seguem a cinética de Michaelis-Menten.

Enzimas cujo mecanismo obedeça às duas reacções anteriores podemos dizer que o valor de Km está relacionado com a afinidade do enzima para o substrato, e logo é diferente de substrato

para substrato e de enzima para enzima.

O Vmáx é a velocidade máxima que a reacção pode alcançar, na situação virtual em que todos os enzimas se encontram ligados ao substrato.

Equação de Lineweaver-Burk

Podemos transformar a equação de Michaelis-Menten, invertendo-a:

Esta forma da equação de Michaelis-Menten chama-se equação de Lineweaver-Burk

Equação de Lineweaver-BurkGráfico de 1/[V0] em função de 1/[S]

Obtém-se uma função linear!

.Esta recta tem um declive Km/Vmáx

.A intersecção da recta no eixo 1/V0 corresponde ao valor 1/Vmáx

.A intersecção com o eixo 1/[S] corresponde a -1/Km

Permite uma determinação de Vmáx precisa!

Inibição enzimática

• Reversível

• Irreversível

Competitiva

Anti-Competitiva

Mista

Inibição Reversível Competitiva

• Há competição pelo centro activo do enzima

• O inibidor é estruturalmente semelhante ao substracto

• A inibição pode ser contrariada adicionando mais substracto ao meio

• O Km aumenta e o Vmax não se altera

Inibição Reversível Competitiva

Inibição Reversível Competitiva

Inibição Reversível Competitiva

Inibição Reversível Anti-Competitiva

• O inibidor liga-se a um local específico do enzima (que não o centro activo)

• O inibidor liga-se apenas ao complexo ES, formando o complexo ESI

• O Km diminui e o Vmax diminui

Inibição Reversível Anti-Competitiva

Inibição Reversível Anti-Competitiva

Inibição Reversível Anti-Competitiva

Inibição Reversível Mista

• O inibidor liga-se a um local específico do enzima (que não o centro activo)

• O inibidor liga-se tanto ao enzima livre como ao complexo ES

• Vmax diminui

• Km pode aumentar, diminuir ou manter-se

Inibição Reversível Mista

Inibição Reversível Mista

Inibição Reversível Mista

Inibição Reversível

Quando α = α’, a Inibição Mista tem o nome de Inibição Não Competitiva

Inibição Irreversível

• O inibidor combina-se permanentemente ao enzima de uma das seguintes formas:

Ligação covalente

Destruição de um grupo funcional essencial ao funcionamento do enzima

Ligação não covalente particularmente estável

Hexocinase

• A hexocinase fosforila a glucose para glucose-6-fosfato

• Reacção ocorre com consumo de ATP juntamente com um ião Mg2+

• O Km para a glucose é 0.1mM, e a concentração de glucose na célula é 4mM

• A hexocinase é regulada alostericamente pelo produto da sua própria reacção

Hexocinase

• A hexocinase é uma enzima do tipo indutivo

Hexocinase

• Fosforilação impede a saída de glucose da célula

Hexocinase

• Reacção catalisada pela hexocinase

Hexocinase

• No fígado também existe uma hexocinase, mas com menor afinidade para com a glucose

• Esta só está activa quando a concentração de glucose no sangue é muito elevada

• No fígado, a glucose é convertida em glicogénio

• Quando a concentração de glucose no sangue é baixa, o fígado não compete com outros tecidos

Hexocinase

• A fosforilação da glucose é reversível!

• A conversão da glucose-6-fosfato emglucose ocorre no fígado durante a

gluconeogénese.

Enzimas Reguladores

• Enzimas que aumentam ou diminuem a sua actividade em reacção a determinados factores.

• Fazem normalmente parte de sequências metabólicas.

Permitem regular a actividade de toda a sequência metabólica e possibilitam à célula ajustar-se às suas necessidades energéticas e

biomoléculares.

Tipos de Moduladores

Mecanismos que regulam a actividade enzimática:

•Variação da concentração de substrato

•Variação de pH e temperatura

•Inibição enzimática

•Modulação covalente•Modulação alostérica

Modulação alostérica

Ocorre em enzimas que possuem um local de modulação alostérico

Modulador alostérico

Positivo(activam o enzima)

Negativo(inibe o enzima)

Heterotropismo(o modulador é

diferente do substrato)

Homotropismo(o modulador é

igual ao substrato)

A ligação entre o modulador e o enzima é não-covalente e o local de modulação é especifico para cada modulador, no caso dos enzimas heterotrópicos

Modulação alostérica

Induz:

Modificações conformacionais na estrutura espacial do

enzima

Modifica a afinidade do enzima para com os seus

substratos

Modulação alostérica

Um modelo muito comum de regulação alostérica é a inibição

por retroalimentação, onde o próprio produto da reacção actua como modulador da

enzima que a catalisa.

Cinética

•Não seguem a cinética de Michaelis-Menten

•Comportamento sigmóide

•[S] para a qual V0=Vmáx/2 não corresponde ao Km

O comportamento sigmóide é explicado pela interacção entre as subunidades das proteínas, já que mudanças estruturais numa subunidade são transferidas para as

adjacentes, através de interacções não covalentes entre elas.

Cinética

Enzimas homotrópicas pequenas variações na concentração do modulador podem provocar grande variações na actividade do enzima.

Enzimas heterotrópicasÉ dificil generalizar a forma como se comportam . Apresentam uma grande variabilidade no comportamento.

Cinética

Modulação covalente

•Fosforilação

•Adenilação

•Urinilação

•ADP-ribosilação

•Metilação

Grupos adicionados ou retirados do enzima através de modificações covalentes

Fosforilação

Ligação de um grupo Fosforil a determinados resíduos de aminoácidos

•É catalisada por quinases

•É um processo reversível

•Fosfatase remove os grupos fosforil adicionados

Fosforilação

Influencia a polaridade dos aminoácidos

Permite o estabelecimento de pontes hidrogeniónicas

Importantes para a estrutura e conformação da molécula

O grupo fosforil:

Adenilação

É adicionado um grupo Adenil à tirosina

Uridilação

É adicionado um grupo uridil à tirosina

ADP-Ribosilação

É acresentada uma ADP-Ribose, com incidência nos resíduos Arginina, Glutamina, Cisteína e Histidina alterada (diftamida-a)

Metilação

É adicionado um grupo metil em resíduos de glutamato

Zimogénios

A regulação enzimática pode passar ainda pela existência de um precursor, sem capacidade catalítica, que, no caso das

proteases, são chamados zimogénios.

Zimogénio Clivagem proteolítica Enzima activa