Genômica e proteômica

SEQUENCIAMENTO DE DNA SEQUENCIAMENTO DE DNA (cDNA)(cDNA)

Prof. Adriana DantasProf. Adriana DantasUERGSUERGS

• ObjetivosObjetivos

Determinar a estrutura de uma molécula de DNA, identificando A SEQÜÊNCIA DE nucleotídeos componentes.

É o primeiro passo para a interpretação das informações genéticas codificadas no DNA, as quais determinam as características estruturais e funcionais de cada ser vivo

Projetos GenomasProjetos Genomas EstruturalEstrutural

– Sequenciamento Completo do GenomaSequenciamento Completo do Genoma– Região Gênica e Região IntergênicaRegião Gênica e Região Intergênica

FuncionalFuncional– ESTs – Expressed Sequence TagESTs – Expressed Sequence Tag– Regiões que codificam proteinasRegiões que codificam proteinas– Funçoes celulares, metabólicas, Funçoes celulares, metabólicas,

fisiológicas.fisiológicas.

Evolução dos organismos vivos, Evolução dos organismos vivos, dogmas central e periféricosdogmas central e periféricos

A A Engenharia GenéticaEngenharia Genética atua atua em nível molecular, onde as em nível molecular, onde as

diferenças entre espécies diferenças entre espécies “desaparecem”.“desaparecem”.

DNA RNAm Proteínas (n aa)

Replicação

Transcrição Tradução

núcleocitoplasma

TranscriptaseTranscriptase

Obtenção do DNA genômico

Construção de primers

Amplificação do gene de interesse a ser clonado

Preparação do vetor

Ligação do vetor ao “inserto”

Transformação da bactéria

Seleção dos clones recombinantes

Propagação da colônia recombinante em meio líquido

Extração e purificação de plasmídio recombinante

Digestão e seqüenciamento

Bioinformática

Identificaçao de sequencias

Inserção de DNA exógeno: - Eletroporação; Agrobact.; Biobalistica, etc.

Etapas genômicasEtapas genômicas

gDNA x cDNAgDNA x cDNA

Diferenças moleculares;Diferenças moleculares;Tecidos;Tecidos;

Estratégias;Estratégias;Onde obter e como obter?Onde obter e como obter?

PNAS, vol. 74 No. 2 p. 560-564, 1977

Graduado em química e física em Harvard1960 - biologia molecular

mRNAsíntese proteícaregulação gênicatécnicas de DNA recombinante

Prêmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980

Walter Gilbert (1932 - )Walter Gilbert (1932 - )

Prêmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980

Graduado em Ciências em Cambridge Estudou proteínas – insulina1943 – técnicas de sequenciamento

J. Mol. Biol. v.94, p. 441-448, 1975

Frederick Sanger ( 1918 -)Frederick Sanger ( 1918 -)

aa aa aa aa aa aa aa aa

Proteína

CTC ATT GTG CTT GAA TTT TTG GTG

DNA

GAG UAA CAC GAA CUU AAA AAC CAC

mRNA

Seqüenciamento de DNA - GilbertSeqüenciamento de DNA - Gilbert

-OH nos dNTPS

Não forman ligação fosfodiéster com o próximo dNTPs que chega na cadeia

ddATP32

DNADNA polimerase

A, C, G e TDNA

DNA polimerase

A, C, G e T

ddCTP32

Repetidos ciclos de: desnaturação, anelamento extensão

A C T G

AACGGTTCCAC

Interpretação

DNADNA polimerase

A, C, G e T

ddGTP32

DNADNA polimerase

A, C, G e T

ddTTP32

•

500 bases / segundo

HistóricoHistórico

Gilbert e SangerGilbert e Sanger–70’s: 20 bases em dois anos

Seqüenciamento manual–Géis de poliacrilamida–Radioisótopos

Seqüenciamento automáticoCapilar

Uso da bioinformática na análise genômica

primer polimerase

dNTPs

template

labelled ddNTPs

Seqüenciamento de DNA

TAGAGCATCGATCGATGCTGCAGATGATGCTAGCATCGGCTAGGCGACG

ATCTCGTAGCTA

ATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCTA

ATCTCGTAGCTAGCTA

ATCTCGTAGCTAGATCTCGTAGCTAGCATCTCGTAGCTAGCT

ATCTCGTAGCTAGCTACATCTCGTAGCTAGCTACGATCTCGTAGCTAGCTACGAATCTCGTAGCTAGCTACGACATCTCGTAGCTAGCTACGACGATCTCGTAGCTAGCTACGACGTATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCT

ATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCT

A

G

C

T

A

C

G

A

C

G

T

C

T

A

Seqüenciamento de DNA

Seqüenciamento de DNA

Início

Fim

Receber Processar Anotar Depositar

Bioinformática

PROJETOS GENOMA

COMPARAÇÃO COM BANCOS DE DADOS

VERIFICAÇÃO DE HOMOLOGIACOM GENES PREVIAMENTE SEQUENCIADOS

Seqüências

0

2.000.000

4.000.000

6.000.000

8.000.000

10.000.000

12.000.000

14.000.000

16.000.000

1982

1983

1984

1985

1986

1987

1988

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

Ano

606

15 milhões

Crescimento do GenBank

Europeu Japonês

24h

SeqüencSeqüenciamento iamento parcial deparcial de tra transcritosnscritos

Genes diferencialmente expressos

Biblioteca de frruto suscetívelBiblioteca de fruto resistente

Genes exclusivos de uma forma

Genes comuns

Determinando o perfil de expressão gênica e identificando genes diferencialmente expressos

• Determinação da função de um gene

• Caracterização de um estádio de desenvolvimento ou fisiológico

• Caracterização de elementos regulatórios

Por que?

Técnicas disponíveis

• Seleção diferencial e hibridização subtrativa (Sambrook et al., 1989)

• cDNA-AFLP (Bachem et al.,1996)

• Differential Display Reverse Transcription PCR - (DDRT-PCR) (Liang and Pardee., 1992)

• RFLP-coupled differential display (RC4D) (Fischer et al., 1995)

• Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) (Velculescu et al., 1995)

• Macroarrays (Chen et al., 1998)

• Microarrays (Schena et al., 1995)

ESTs (Expression Sequences Tags)

AAAAAAAAA TTTTTTTTTRT

PCRClonagem

Seqüenciamento

Extração RNAm + Oligo (dT)

cDNA

cDNA “tester“com adaptador 1 R cDNA“tester“com adaptador 2 RcDNA “Driver”

(em excesso)

1ª Hibridização

a

RNA mensageiro

Subtração

Ligação dosadaptadores

cDNA

Digestão comRsaI

a, b, c, d + e

2ª Hibridização: mistura de amostras,

adição de “Driver” desnaturado eanelamento

Preenchimento dos terminais

d

b

c

a

d

b

c

e Adição de “primers”Amplificação por PCR

a e d - nenhuma amplificação

b- b’ - nenhuma amplificação

c - amplificação linear

e - amplificação exponenciale5’

5’

3’

3’

Construção de bibliotecas Subtrativas

TesterRNA tecido A

DriverRNA tecido B

cDNA

Digestão com Dpn II

Ligação ao oligo A Ligação ao oligo B

Hibridização com excesso de Driver

PCR com a utilização de iniciadores complementares ao oligo A

Amplificação seletiva dos cDNAs derivados do Tester

Clonagem em vetores e montagem da biblioteca

cDNA-AFLP

cDNA-AFLP

Vantagens:• Alta reprodutibilidade;• Poucos falso positivos;• Necessita de pequenas quantidades

iniciais de RNA.

Desvantagens:• O cDNA precisa conter o sítio de

restrição da enzima utilizada.

DDRT-PCR (Differential Display Reverse Transcription PCR)

SNPs (Single nucleotide polymorphisms)

5’ leader Coding sequence(exons)

3’ end Poly-A

Seqüênciamento 5’Seqüênciamento 5’Seqüênciamento 3’Seqüênciamento 3’

Polimorfismo de um único nucleotídeo

I.G. Gut, Automation in genotyping single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 17 (2001) 475–492.

detectar a variação de seqüência na janela de um alinhamento de ESTs de um mesmo gene, parcialmente

sobrepostas

SNPs - Princípio

Variações mais frequentes no genoma: 1 substituição a cada 31 pb não codificadora e a cada 124 pb em regiões codificadoras

Detecção e validação de SNPs

(A)200

AUG

Um mRNA & suas ESTsUm mRNA & suas ESTs

(A)200(T)18cDNA (fita -)

AUG(A)18

cDNA (fita +)

cDNA (fita +)

(T)18cDNA (fita -)

(A)18

ATGATCATGACTTACGGGCGCGCGAT

GGCGCGCGATATCCAAATTTATTATCC

3’EST 3’EST

3’EST 3’EST5’EST5’EST

5’EST5’EST

AAATTTATTATCCATCTACG

PCR PCR inespecíficoinespecífico & seu & seu ORESTESORESTES

(A)200

cDNA (fita -)

AUG amplicon (fita +)

Iniciador(60ºC 37ºC)

amplicon (fita -)

amplicon (fita +)

PCR(60ºC)

ORESTEORESTESS

AGATCGATCATGACTTACGGGCGCGCGATATCG

GGGCGCGCGATATCGAAAAATTTATAAGGCTAGCCCCGGCGGCTCGGCCGGGGAGATCGATCATGAC

+ORESTES (outros iniciadores)+ORESTES (outros iniciadores)

montagemmontagem

AGATATGAGAGACACAGAAATTTCCG

GACACAGAAATTTCCGATA

ATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGC

GACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCC

TTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACC

TACCCCAAATACCCTAAGATTA

AAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAG

AGATATGAGAGACACAGAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACCCTAAGATTA

AGATATGAGAGACACAGAAATTTCCG

GACACAGAAATTTCCGATA

ATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGC

GACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCC

TTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACC

TACCCCAAATACCCTAAGATTA

AAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAG

AGATATGAGAGACACAGAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACCCTAAGATTAAGATATGAGAGACACAGAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACCCTAAGATTA

AGATATGAGAGACACAGAAATTTCCG

GACACAGAAATTTCCGATA

ATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGC

GACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCC

TTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACC

TACCCCAAATACCCTAAGATTA

AAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAG

Contig

Análise de transcriptomaAnálise de transcriptoma

EExpressed xpressed SSequence equence TTagsags

Micro arranjos Micro arranjos

SSerial erial AAnalysis of nalysis of GGene ene EExpressionxpression

EExpression xpression SSequences equences TTagsags

AAAAAAAAA TTTTTTTTTRT

PCRClonagem

Seqüenciamento

Redundância entre os transcritosRedundância entre os transcritos

100

150

200

250

Genes diferencialmente expressosGenes diferencialmente expressos

Biblioteca de leveduraBiblioteca de micélio

Genes exclusivos de uma forma

Genes comuns

Genes específicosGenes específicos

Princípio da genotipagem

TTACGCATAACCTATCGAATTCCATCGCATCGA1. PCR amplificação

2. Restrição do produto PCR com a enzima adequada (ex: EcoRI, GAATTC)

TAACCTATCGAATTCCATCG

C

SNP site

TAACCTATCGACTTCCATCG

Se ‘A’ está presente ocorrea restrição

Se ‘C’ está presente, não ocorrea restrição

-

+

N R -

+

N R

Análise Molecular Análise Molecular

Identificação Molecular

Análise de DNA- PCR- Southern Blot - Real Time PCR- Arranjos

Análise de ProteínaBaseadas em imunologia

- ELISA- Western blot- Proteoma

4. Hibridização da membrana com a sonda específica

Retirada da membrana com o DNA

Hibridização da membrana com sonda radioativa

Solução de transferência

Esponja

Gel

Membrana de Nylon

Papel para Absorção

3. Transferência do DNA para a membrana de nylon (Blotting)

2. Eletroforese DNA em Gelde Agarose

5. Revelação do autoradiograma

Retirada das hibridizações

não específicas

1. Digestão do DNA com enzimas de restrição

Southern Blot

Análise Molecular

Digestão com EcoRI e hibridação com sonda específica para

sarcotoxin IA

PCR

Southern blot

Análise do fenótipo

Sintoma aos 25 dias após inoculação (104 CFU/ml)

stx-5Controle

Western blot

Real Time PCR

Resultados após amplificação

Análise da Expressão de Genes

Arranjos de DNA

Aumento do número de genes

chips de DNA

diferentes seqüências para detectar genes expressos ou

introduzidos em plantas

BibliotecaEstoque de bactéria

em glicerol (96 ou 384-well )

Amplificaç ão de PCRDiretamente do estoque Usando iniciadores SP6-T7 em placas 96-well

Mantagem em placas 384-well

Gotas em matrizesSobre lâminas devidro

Impressão do chip DNA

Seqüênciamento de genes expressos:Seqüênciamento de genes expressos: Documentar a existência de Documentar a existência de transcritos gênicos num transcritos gênicos num transcriptomatranscriptoma

EST (Etiqueta de Seqüência EST (Etiqueta de Seqüência Expressa)Expressa) –seqüenciamento único de cada cDNAseqüenciamento único de cada cDNA–extremidades 5’ ou 3’extremidades 5’ ou 3’

ORESTES (ESTs ricas em ORFs)ORESTES (ESTs ricas em ORFs)–seqüenciamento único do amplicon seqüenciamento único do amplicon

derivado de cDNA por PCR derivado de cDNA por PCR inespecíficoinespecífico–prevalece o centro do cDNA (cds)prevalece o centro do cDNA (cds)

Micro-arrayMicro-arrayBaseado na hibridização de sondas de DNA (clones individuais) com cDNA isolado de diferentes formas celulares.

Clones individuais são adsorvidos em uma matriz sólida.

cDNA Microarray Printing

Deposição dos produtos de PCR sobre lâminas de vidro ou membranas de nylon utilizando “Array Spotter Gen. III

Amersham-Biosciences”

hibridizaçãohibridização

Chip de alta densidadeChip de alta densidade

Forno de hibridação

Hibridação e lavagem automática

Hibridações de lâminas é realizada no módulo ASP (automated slyde processor).

A hibridação de mambranas de nylon é realizada em forno de hibridação

Histórico do sequenciamento de genomas

1977- bacteriófago phi-x174 (5386bp) foi 1. organismo sequenciado.

Sanger et al [Nature 246, 687 (1977)].

1982- bacteriophage lambda (48,502bp) Sanger et al [J. Mol. Biol. 162, 729 (1982)]

anos 80 - genoma mitocondrial, 16kb; Epstein Barr virus, 172kb; human

cytomegalovirus, 229kb

1980’s- final: desenvolvimento de sequenciadores automáticos

1991- menos de 2,000 gens de proteinas humanas conhecidos

1995- 1o. genoma de um organismo de vida livre 1995

bactéria Haemophilus influenzae Rd KW20- 1,8 Mbases

2004 – 160 genomas bacterianos completos, de 130 espécies

19 genomas de archae completos

28 genomas de eucariotos, completos, ou alguns cromossomas completos cromossomas completos, incluindo:

• homem

• camundongo (rato sendo sequenciado)

• 3 plantas: Arabidopsis thaliana e 2 variedades de arroz

• 2 peixes

• 6 protozoários

• 3 artrópodos incluindo Drosophila melanogaster

• 6 fungos

• nematódios, alga, cryptomonas

Gen humano típico: 5 ou 6 introns, tamanho médio dos introns: 2100bp (alguns com 100000 bp)

tamanho médio dos exons: 125bp

Exons de gens celulares: 5% genoma humano

Dados sobre composição do genoma: grande extensão de introns x exons

Dados sobre composição do genoma: tamanho e número de gens

Homem: 30.000 gens 2,8 x 109 bp

Arroz (Oryza sativa): 20.000 gens 3,7 x 108 bp

Drosophila melanogaster:13.600 gens 1,8 x 108 bp

Escherichia coli: 5.300 gens 4,6 x 106 bp

Comparando Homem e E. coli tem-se que:

número de gens: 5,7x tamanho do DNA: 610 x

Genômica x ProteômicaGenômica x Proteômica

A Genômica possibilitou o A Genômica possibilitou o sequenciamento de alta performance sequenciamento de alta performance de diferentes gens de diversos de diferentes gens de diversos organismos. Porém não resolveu organismos. Porém não resolveu questões importantes relativo á questões importantes relativo á função de várias proteínas. função de várias proteínas.

““Podemos ver o Genoma como a Podemos ver o Genoma como a descoberta dos hieróglifos que ainda descoberta dos hieróglifos que ainda necessitam ser decifrados”necessitam ser decifrados”

questão 1: 1 transcrito primário podendo corresponder a mais de um mRNA, e portanto mais de uma proteina

questão 2: 1 mRNA não sendo eficientemente traduzido, como ocorre em alguns casos de transferência lateral

questão 3: alguns RNAs ficam longo tempo sem ser traduzidos em células eucarióticas

questão 4: processamento pós-traducional: várias proteinas, com atividade distinta, vindo do mesmo gen

Um gen vários produtos !

Pos-GenômicaPos-Genômica

Genomica FuncionalGenomica Funcional

ProteômicaProteômica

Genomica EstruturalGenomica Estrutural

DNA-MicroarrayDNA-MicroarrayGel Electroforese 2DGel Electroforese 2D

Espectrometria de Massa Espectrometria de Massa Sequenciamento de ProteinaSequenciamento de Proteina

Crystallografia de Crystallografia de X RayX RayNMRNMR

Sequência - Forma - FunçãoSequência - Forma - Função

Rede ProteômicaRede Proteômica

Problemas BiológicosProblemas Biológicos

Gel 2D Cromatografia Gel 2D Gel 2D Gel 2D

Maldi - Tof Maldi - Tof

MS-MS: ESI-Q-Tof MALDI TOF-TOF

Expressão

Cristalização

NMR X- rays

Purificação de Proteína

Bioinformatica

Microarray

Proteoma

Levantamento quantitativo de proteínas/peptídeos em uma amostra para identificar mudanças de interesse

Proteoma GenomaProteínas e peptídeos

Dinâmico

Células e tecido específicos

DNA

Estático

Orgão específico

Abordagens em ProteômicaAbordagens em Proteômica Proteômica de ExpressãoProteômica de Expressão

– Expressão DiferencialExpressão Diferencial

Proteômica FuncionalProteômica Funcional

– Interação Proteina-ProteinaInteração Proteina-Proteina

– Vias de SinalizaçãoVias de Sinalização

– Modificação Pós- traducionalModificação Pós- traducional

Proteômica QuantitativaProteômica Quantitativa

Separação e preparo de amostraSeparação e preparo de amostra

Digestão - tripsina

Peptídeo

Separação

Esquema geral de identificação de proteínas

Aplicações:

- Descoberta de novas drogas, - Estudos em patologia, - Diagnóstico, - Terapias, - Microbiologia,- Bioquímica, - Fisiologia de plantas, - Controle de qualidade.

2D-gel, V. cholerae El Tor N16961 strain

Mapa de referência de Vibrio cholerae El Tor com 94 spots

Main cellular roles Main cellular roles found:found:

spotsspots proteinsproteins

Energy metabolismEnergy metabolism 3636 2828

(TCA cycle)(TCA cycle) (9)(9) (8)(8)

(glycolysis/gluconeogen(glycolysis/gluconeogenesis)esis)

(11)(11) (7)(7)

Transport and binding Transport and binding proteinsproteins

16 16 1313

(Solute-binding protein (Solute-binding protein of ABC transporters)of ABC transporters)

(15)(15) (12)(12)

(other transporters)(other transporters) (1)(1) (1)(1)

Identification of spots by peptide mass fingerprint:

94 spots, corresponding to 80 proteins

94,0-

67,0-

43,0-

30,0-

20.1-

14.4-

kDa 4 7

Spot 258Serine proteinase B.

insularis

Spot 474Vascular endothelial

growth factor

Spot 428Convulxin beta [Crotalus

durissus]

Spot 427, 429 e 467Lectin [Bitis arietans]

Spot 375, 435 e 459Platelet glycoprotein Ib-binding

protein alpha subunit [B. jararaca]

Spots 255, 260, 261, 262 and 268Metalloproteinase (PI) B.insuaris

Spot 412Anticoagulant protein A

[Deinagkistrodon acutus]

Spot 356Metalloproteinase

(Agkistrodon contortrix laticinctus)

Spot 386 and 394Phospholipase A2 B. insularis

433 e 434Agkisacutacin B chain

[Deinagkistrodon acutus]

489BJcuL precursor [B. jararacussu].

Spot 24, 28, 29, 30, 31, 32, 77, 90, 93 and 96Metalloproteinase (PIII) B.insularis

Spot 444Unnamed Protein Product (Mus Musculus)

Análise de Peptídeos: Peptidomics

• A eletrofores bidimensional separa proteínas entre 10 kDa e 200 kDa: Proteínas maiores ou menores não são detectadas;

• Para análise de peptídeos dependendo da amostra podemos analisar diretamente no MALDI-TOF, ou ainda fazer uma separação prévia e analisar frações cromatográficas contendo peptídeos.

B. insularis crude venom MALDI-TOF/MS

1100 1180 1260 1340 1420 1500

Mass (m/z)

1.6E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Inte

nsity

4700 Reflector Spec #1[BP = 1370.7, 16470]

1370.74

82

1196.64

23

1279.77

83

1392.72

62

1218.62

38

1414.70

90

950 1060 1170 1280 1390 1500

Mass (m/z)

3.7E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sity

4700 Reflector Spec #1=>BC=>NF0.7[BP = 1087.6, 36679]

1087

.622

8

1277

.616

1

1373

.722

9

1244

.639

8

1404

.764

0

1037

.544

3

1101

.599

6

1063

.573

6

956.

5493

1370

.700

4

1144

.641

4

1299

.695

2

1395

.700

2

1409

.792

5

Crude venom direct analysis in MALDI-TOF

Lachesis muta MS/MS 1373

610 778 946 1114 1282 1450Mass (m/z)

0102030405060708090

100

% In

tensit

y

4700 MS/MS Precursor 1373.72 Spec #1=>BC=>NF0.7[BP = 1161.5, 46639]

1161

.521

1

1048

.459

4

851.

4226

1133

.560

8

911.

4136

1169

.577

6

1373

.583

5

639.

3297

1258

.647

3

774.

3678

PPI / LHP G

qkpwppghipp Peptídeo potenciador de bradicinina

~16kD ~16kD

6.1 6.16.4 6.4

Spots only visible in logaritmic or stationary cells

(arrows), indicating different protein expression

along growth curve.

Some common spots varied in intensity

with growth phase.