CARACTERIZAÇÃO DE UM HIDROGEL NANOCOMPÓSITO PVA-

PRATA PARA USO POTENCIAL COMO CURATIVO

R. N. Oliveira, R. M. Thiré, G. D. A. SoaresLab. Biomateriais, PEMM, COPPE/UFRJ, CP 68505, Rio de Janeiro, 21941-972, Brasil.

E-mail: nunes@metalmat.ufrj.br

Queimaduras são ferimentos conhecidos por apresentarem diversos tipos de bactérias no local e também por precisarem de ambiente úmido que favoreça a cura. Hidrogéis de PVA têm sido estudados como curativos devido à biocompatibilidade, alta capacidade de intumescimento e baixa adesão celular. Entretanto, esses géis não apresentam efeito bactericida, o que poderia ser resolvido através da incorporação de um antibiótico, como nanopartículas de prata. Prata apresenta característica bactericida e as nanopartículas poderiam ser sintetizadas no interior de hidrogéis de PVA via irradiação, a qual também pode reticulas o polímero. O objetivo deste trabalho foi desenvolver hidrogéis de PVA carregados com 5% AgNO3,expostos a diferentes doses de radiação (1 e 15 kGy), criogelificados ou não. A análise microestrutural foi realizada via DRX e FTIR; os ensaios de intumescimento foram realizados em água destilada e os meios de intumescimento foram estudados por UV-Vis; para análise morfológica utilizou-se MEV. Todas as amostras são porosas; a prata estava conectada às cadeias poliméricas, na forma de quelato (PVA-Ag+). Os filmes intumesceram no mínimo 450%, sendo considerados superabsorventes. As amostras submetidas a alta dose de radiação e não criogelificadas liberaram nanopartículas para o meio após 4 dias de intumescimento. Palavras-chave: PVA, prata, hidrogel.

1. INTRODUÇÃO

Queimadura é uma das formas de trauma das mais devastadoras e mais comuns (Rafla e Tredget, 2011). De acordo com a Sociedade Brasileira de Cirurgia Dermatológica, “As queimaduras estão entre os mais comuns acidentes domésticos” (Palermo, 2011). Associada ao ferimento pode ocorrer infecção da queimadura, dificultando a cura. Queimaduras normalmente são tratadas por etapas. Essas envolvem a retirada de sujidades e de tecido morto; aplicação de agente microbiano, como a prata; uso de curativo primário e/ou secundário; etc.

De acordo com Rossi e colaboradores (Rossi et al., 2010) “a limpeza da ferida constitui um passo essencial para que um protocolo de tratamento de feridas seja eficaz. Deve ser realizada utilizando-se água corrente, ou solução fisiológica, aquecidas para remover sujidades e tecidos desvitalizados soltos no leito da ferida”. Seguida à limpeza, está a aplicação de agente antimicrobiano.

O uso de nitrato de prata em queimaduras foi registrado em 1830 por Rust (Klasen, 2000). Em 1960, Moyer aplicou solução 0,5% AgNO3 em queimaduras e, segundo ele, essa solução não interferia com a proliferação da epiderme e tinha propriedades bactericidas contra Staphyloccocus aureus (S. Aureus), Pseudômonas Aeruginosa (P. Aeruginosa), Escherichia Coli (E. coli) e Estreptococos hemolíticos (Rai et al., 2009; Klasen, 2000).

As formulações que utilizam prata na forma iônica são bem estabelecidas, embora existam poucas informações sobre o efeito da prata metálica. De acordo com o grupo de Rai (Rai et al., 2009), a prata metálica (Ag0) é inerte, mas reage com a umidade da pele e com os exsudatos das feridas se tornando ionizada (Ag+). Prata iônica é altamente reativa, uma vez que essa se liga as proteínas do tecido, acarretando mudanças estruturais na bactéria, levando a morte. Prata também se liga à elementos presentes em componentes da célula, como fósforo e enxofre do DNA, por desnaturação, inibe a replicação da bactéria (Morones et al., 2005).

A última etapa de um tratamento de queimadura que não envolva cirurgia seria a aplicação de um curativo. O curativo ideal deveria “manter o ambiente lesado úmido, absorver o excesso de exsudato, eliminar o espaço vazio, não machucar, promover isolamento térmico e ser barreira a bactérias” (Singh e Pal, 2011; Jones e Vaughan, 2005).

Hidrogéis são redes tridimensionais de polímeros hidrofílicos que incham em contato com soluções aquosas, permanecendo insolúveis devido à presença de reticulação (Jones e Vaughan, 2005; Peppas, 1997; Yoshii et al., 1995; Wu et al., 2001; Endo et al., 2008). Devem, além de absorver o exsudato, garantir cobertura fisiológica temporária, proteger a ferida de traumas mecânicos e promover cura (manter o local úmido, evitar formação de tecido necrótico, etc.), tendo sido utilizados como curativos com sucesso (Stasko et al., 2009).

A reticulação pode ser formada por rota física, via criogelificação por exemplo, em que “as cadeias estão conectadas por forças eletrostáticas, por ligações de hidrogênio, por interações hidrofóbicas ou por enovelamento das cadeias”, ou química, quando há a presença do agente de reticulação que se liga a grupos específicos das cadeias por ligações primárias; ou por irradiação, em que radicais específicos nas cadeias reagem entre si formando uma rede. A irradiação forma o hidrogel e o esteriliza em uma única etapa (Varshney, 2007; Hassan e Peppas, 2000; Rosiak et al., 2002).

A capacidade de manter água retida em sua rede, sua transparência e características mecânicas adequadas torna os hidrogéis produzidos a partir de polímeros biocompatíveis e biodegradáveis uma alternativa interessante para curativos. Dentre os polímeros biocompatíveis hidrofílicos possíveis de ser matéria-prima para hidrogéis, poli(álcool vinílico) – PVA, tem sido uma alternativa viável. PVA é um polímero semicristalino com tendência a apresentar ligações inter e intramoleculares (Ricciardi et al., 2003).

A obtenção de hidrogel de PVA via criogelificação é bem conhecida e o produto apresenta alta resistência mecânica e elasticidade, transparência, mínima adesão celular e de proteínas, além da capacidade de intumescimento adequada para aplicações biomédicas (Hassan e Peppas, 2000; Hassan et al., 2000; Ma e Xiong, 2008; Stasko et al., 2009). Entretanto, para aplicação de hidrogel de PVA criogelificado em área biomédica, é preciso esterilizá-lo, inserindo mais uma etapa à sua produção. Hidrogéis de PVA também podem ser reticulados via radiação gama (Maeda et al., 1973).

Curativos de PVA intumescem e auxiliam a cura, entretanto ao se pensar em curativos, lembra-se que o local ferido pode apresentar microorganismos que dificultam o processo de cura. O desenvolvimento de géis contendo agente antimicrobiano pode ser interessante para tal aplicação. O PVA é solúvel em água, bem como o AgNO3, e reage com os íons prata em solução formando um quelato-metálico (PVA-Ag+). Ao irradiar a solução de PVA-AgNO3, alguns autores encontraram a formação do quelato (Zidan, 1999); enquanto que outros obtiveram nanopartículas de prata (Clémenson et al., 2008).

A ação das nanopartículas de prata pode ser resumida em três etapas: se ligam à superfície da bactéria e alteram seu funcionamento, como permeabilidade e respiração; penetram na bactéria e reagem com compostos contendo S ou P, como DNA; e liberam íons prata, contribuição adicional ao efeito bactericida das nanopartículas (Singh et al., 2008).O presente trabalho teve o intuito de desenvolver e caracterizar hidrogéis de PVA carregados com 5% AgNO3, reticulados sob radiação gama, com ou sem auxilio de criogelificação, para

obtenção de filmes poliméricos contendo agente antimicrobiano. A união de alta capacidade de intumescimento dos géis de PVA com o efeito bactericida da prata poderiam tornar esses géis bons candidatos no tratamento de queimaduras.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

O preparo da solução de PVA foi realizado dissolvendo-se 10 g de PVA (SIGMA-ALDRICH, 98-99% hidrolisado) em 70 ml de água destilada (solução 10% p/v), a 90°C por 1 h e 30 min, sob agitação mecânica. Foi preparada solução aquosa de 0,5g de AgNO3

(VETEC) ao dissolver 0,5g AgNO3 em 20 ml de água destilada, sob agitação magnética, no escuro, por aproximadamente 15 min. A solução polimérica foi misturada à solução de nitrato de prata no escuro e verteu-se em placas de petri, controlando o volume.

Parte das amostras foi submetida à criogelificação, em que os filmes eram submetidos a -20°C por 16h; permanecia por 30 min a temperatura ambiente seguido de 1 h a -20°C sucessivamente, até completar 5 ciclos. Os filmes foram então secos e irradiados via radiação gama. As amostras foram submetidas a diferentes doses de radiação: 1 kGy e 15 kGy. Os limites da dose de radiação gama foram escolhidos de forma a minimizar a degradação do PVA e ainda assim, produzir nanopartículas de prata e reticular o polímero. A ordem dos experimentos e a denominação das amostras estão dispostos na Tabela 1.

Tabela 1 – Condições dos experimentos.Nome 1 2 3 4 5

Material PVA PVA-Ag PVA-Ag PVA-Ag PVA-AgDose (kGy) 0 1 1 15 15

Criogelificação sim não sim não sim

A análise microestrutural foi realizada por difração de raios-X, para detecção de prata ou seus compostos. Varredura de 5° a 60°, passo de 0,02°, usando difratômetro SHIMADZU vertical configuração theta-2theta, modelo XRD 6000, geometria Bragg-Brentano, com raio goniométrico de 185 mm. O alvo utilizado foi de cobre (Radiação Cukα), 30 kV/30mA. A interação da prata com o PVA foi avaliada via análise de espectroscopia no infravermelho (FTIR), equipamento NICOLET 6700, na faixa de comprimentos de onda do infravermelho médio (4000 a 550 cm-1).

A capacidade de intumescimento foi quantificada ao imergir os filmes (triplicata) em água destilada. Após intervalos regulares (15, 30, 60, 120, 180, 240 e 1440 minutos), os filmes eram pesados, sendo a água acumulada na superfície removida com auxílio de papel de filtro.

As amostras permaneceram em água destilada em estufa a 37°C por 4 dias, tempo comum de uso do curativo (hidrogel) de PVA. Após esse tempo, o meio foi analisado por espectroscopia no UV-VIS (espectroscopia na faixa de ultravioleta / visível, equipamento Perkin Elmer, Lambda 25), entre 475 e 250 nm, de forma a avaliar a liberação da prata para o fluido.

A análise morfológica foi realizada por microscopia eletrônica de varredura - MEV, equipamento JEOL JSM 6460-LV, utilizando energia de laser de 15 kV. As amostras foram previamente intumescidas e posteriormente, congeladas e liofilizadas. Camadas de ouro foram depositadas sobre as amostras para observação em MEV.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir dos difratogramas das amostras, Figura 1, é possível observar um pico em 2θ = 19.5°, relativo a formação dos cristalitos do PVA, bem como um pico em 2θ = 8.5°, que não pertence à prata metálica ou ao PVA. Segundo Zidan (1999), deve ser relativo ao “espalhamento atômico de padrões cristalinos do complexo PVA-Ag+”. De acordo com Gautam e colaboradores, a formação de nanopartículas de prata a partir de solução PVA-Ag seria: primeiramente, adsorção do cátion metálico (Ag+) pelos elétrons desemparelhados do grupo OH nas cadeias, formando o quelato PVA-Ag+. Em seguida, há redução da prata metálica próxima ao PVA, deixando o polímero com elétron desemparelhado, o que poderia também gerar um ponto de reticulação.

Figura 1 - Difratogramas das amostras.

A intensidade do pico cristalino do PVA diminui com o aumento da radiação, o que poderia indicar a formação de reticulação e não de cristalitos. Observam-se através dos difratogramas das amostras compósitas os picos do PVA e do quelato. Não foi encontrada prata metálica. A presença do quelato não invalida a formação de nanopartículas, uma vez que ambas as fases poderiam estar presentes. Caso as nanopartículas formadas fossem pequenas a ponto da quantidade de planos coerentes ser insuficiente para gerar sinal detectável, não seriam observadas no DRX.

A interação da prata com o polímero poderia ser documentada por FTIR, Figura 2. Observa-se que algumas bandas, indicadas por (*) aparecem em todas as amostras, tais como as bandas em: 3260 cm-1, relativa ao estiramento dos grupos (-OH); 2925 cm-1, que pode ser atribuída ao estiramento de CH2; banda em torno de 1320 cm-1, atribuída a vibração de C-H; em aproximadamente 1140 cm-1 e 1080 cm-1; relativas à vibração C-O; banda em 930 cm-1, relacionada à “torção” de grupos C-H em seqüência sindiotática do PVA; e banda em 830 cm-

1, atribuída a “torção” de C-H em seqüência atática do polímero (Krkljes et al., 2007; Khanna et al., 2005; Luo et al., 2009; Singh e Pal, 2011).

Na amostra de PVA puro observa-se uma banda em 1420 cm-1, atribuída ao estiramento simétrico dos grupamentos C-O-C presentes devido à reticulação e devido aos grupos acetato não hidrolisados devido ao acetato de vinila, que dá origem ao PVA (Luo et al., 2009). Os filmes de PVA-Ag do presente trabalho apresentaram um provável deslocamento da banda presente nos filmes de PVA em 1420 cm-1, indicada por (#), para 1403 cm-1 e o aparecimento de banda em 1518 cm-1, ambas sinalizadas por (+). É possível afirmar

que o espectro de FTIR dos filmes de PVA-Ag foi consideravelmente diferente do filme de PVA puro, o que sugere que há algum tipo de interação entre Ag e PVA.

Figura 2 - Espectros de FTIR das amostras.

O ensaio de intumescimento revelou que os filmes de PVA-Ag atingiram o equilíbrio de intumescimento após 1h, Figura 3. Os filmes intumesceram no mínimo 400% em água destilada, tornando esses géis candidatos a curativos, uma vez que manteriam o local ferido úmido.

Figura 3 - Razão de Intumescimento dos géis compósitos.

Os géis permaneceram em água por 4 dias, tempo médio de uso de hidrogéis como curativos, de forma a detectar possível liberação de prata para o meio, Figura 4. A presença do metal no fluido poderia ser prejudicial ao organismo caso atingisse níveis de toxicidade.

Observou-se a presença da banda de ressonância plasmônica da prata em 420 nm, característica das nanopartículas de prata, apenas na amostra 4. Essa amostra não foi criogelificada e a dose de radiação foi a mais alta do estudo. Provavelmente a alta dose quebrou cadeias e permitiu que a prata migrasse do interior do gel para o meio. Ao comparar essa amostra com aquela exposta a alta dose e criogelificada, amostra 5, essa não liberou prata, o que sugere que a criogelificação deve ser impedimento físico à movimentação da

prata. As amostras submetidas a baixa dose não liberaram prata. Possivelmente, foi pequena a quebra de cadeias e moléculas maiores apresentam maior enovelamento, dificultando o movimento da prata.

Figura 4 - espectros de UV-Vis do meio de intumescimento dos filmes após 4 dias de imersão.

Ao se pensar em posicionar o curativo e que o fluxo de exsudato carrearia as bactérias para dentro da rede, o efeito bactericida se daria no interior do gel. Uma vez que parte da porosidade dos géis como aqueles na Figura 5, apresenta diâmetro suficiente (aproximadamente 10 µm), por exemplo, para acomodar a E. Coli (3 µm), a prata seria importante presente na rede dos hidrogéis, evitando-se a liberação do metal para o corpo, diminuindo a chance de toxicidade.

Figura 5 - Microscopia eletrônica de varredura mostrando a porosidade das (a) amostra 2 (1kGy, não criogelificada) e (b) amostra 4 (15kGy, não criogelificada).

4. CONCLUSÕES

Os estudos iniciais dos hidrogéis compósitos sugeriram que há interação entre PVA e a prata e que a prata está presente na forma de quelato, embora tal fato não invalide também a formação de nanopartículas. Todos intumesceram ao menos 400% e, por serem porosos, o carreamento de bactérias pelo exsudato para a rede dos géis seria possível. A presença de prata no interior dos filmes possibilita o efeito bactericida, mas a liberação de prata para o meio poderia causar toxicidade ao organismo. Observou-se que baixas doses e a

criogelificação favorecem a permanência da prata na rede dos géis. O teor de prata deve ser investigado de forma a prevenir toxicidade quando em contato com o corpo.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à CAPES, à FAPERJ e ao CNPq pelo suporte.

REFERÊNCIAS

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CHARACTERIZATION OF A PVA-Ag NANOCOMPOSITE HYDROGEL FOR POTENTIAL WOUND HEALING

R. N. Oliveira1, R. M. Thiré1, G. D. A. Soares1

1Biomaterials Lab., PEMM, COPPE/UFRJ, CP 68505, Rio de Janeiro, 21941-972, BrazilE-mail: nunes@metalmat.ufrj.br

Burns are injuries known to have several bacteria on site and also, they require a moist environment for healing. PVA hydrogels have been studied for wound healing as a consequence of their biocompatibility, high swelling capability and low cell adsorption. However, these gels do not present any bactericide effect, which could be solved by the incorporation of an antibiotic, like silver nanoparticles. Silver has bactericide characteristics and the nanoparticles could be synthesized inside PVA hydrogels via gamma radiation, which also crosslink the polymer. The goal of the present work was to develop PVA hydrogels loaded with 5% AgNO3, exposed to different doses of gamma radiation (1 and 15 KGy), freeze-thawed or not. The microstructural analysis was performed via XRD and FTIR; the swelling tests were accomplished in distilled water and the swelling media were analyzed via UV-Vis; and SEM was used for the morphological analysis. All samples were porous. The silver seemed to be attached to polymer chains, in a chelate form (PVA-Ag+). The gels swelled at least 450 %, being considered superabsorbent films. The sample submitted to high radiation dose non freeze-thawed delivered silver nanoparticles to the media after 4 days of swelling.

Palavras-chave: PVA, silver, hydrogel