Embed Size (px)
Citation preview
FFI0750 – BIOLOGIA MOLECULAR ESTRUTURALProf. Dr. Rafael V. C. Guido / Prof. Dr. Glaucius Oliva
AULA PRÁTICA 5
CRISTALIZAÇÃO DE PROTEÍNAS
Nome:
Grupo:
Orientações:
Nos exercícios desta aula vocês utilizarão uma solução concentrada de lisozima para estudar o
fenômeno de cristalização proteínas por difusão de vapor.
As perguntas devem ser respondidas neste mesmo documento.
Cada grupo receberá soluções estoque para preparação das condições de cristalização e a
solução de lisozima.
Ao final da aula enviem um arquivo .pdf com as respostas via e-mail para: [email protected]
Nomeie o arquivo com as respostas da seguinte maneira: BME2015_P5_GX.docx (substituta o
“X” pelo no. do grupo, ou seja, 1, 2, 3, ...)
1
FFI0750 – BIOLOGIA MOLECULAR ESTRUTURALProf. Dr. Rafael V. C. Guido / Prof. Dr. Glaucius Oliva
Cristal de proteína é o arranjo sistemático das moléculas que geram padrões de difração quando irradiadas com raios X. As organizações moleculares dentro de um cristal podem ser classificadas por tipos de empacotamento e de simetrias axiais. A menor estrutura capaz de recuperar a informação estrutural do cristal é denominada célula unitária. As subdivisões de uma célula unitária que possuem relações de rototranslação entre si são denominadas unidades assimétricas (Figura 1). Os principais métodos para a cristalização de proteínas por difusão de vapor são: i. gota pendurada (do inglês, hanging drop – Figura 2A) e ii. gota assentada (sitting drop – Figura 2B).
Figura 1. Esquema representativo de um cristal de proteína e suas subdivisões.
Figura 2. Esquema representativo dos métodos de difusão de vapor em gota suspensa (hanging drop) e gota assentada (sitting drop).
2
FFI0750 – BIOLOGIA MOLECULAR ESTRUTURALProf. Dr. Rafael V. C. Guido / Prof. Dr. Glaucius Oliva
Exercício 1
Um estudo de triagem de condições de cristalização identificou a formação de cristais de lisozima em duas condições (Condição 1 e 2).
Condição 1 Condição 2
PEG 6000 30% m/v, NaCl 1M, Acetato de sódio pH 4,5 50 mM, lisozima 100 mg/mL
PEG 4000 30% m/v, NaCl 1M, Acetato de sódio pH 4,5 50 mM, lisozima 100 mg/mL
1. Avalie as características dos cristais obtidos nas condição 1 e 2 (e.g., quantidade, tamanho, forma, etc)
3
FFI0750 – BIOLOGIA MOLECULAR ESTRUTURALProf. Dr. Rafael V. C. Guido / Prof. Dr. Glaucius Oliva
2. Com base na sua resposta anterior planeje, esquematize e execute um experimento de otimização das condições 1 ou 2 na tabela abaixo com o objetivo de obter cristais adequados para difração de raios X.
Para a condução dos experimentos de cristalização vocês deverão utilizar as soluções estoques fornecidas e indicadas na seção “soluções estoque”:
- distribua 600 L das soluções de cristalização planejadas em cada poço (24 condições) - adicione uma gota de 1 L de solução de lisozima sobre a lamínula (hanging drop) ou anteparo
lateral (sitting drop)- adicione 1 L de solução do poço (solução de cristalização) sobre a gota de solução de lisozima
(diluição 1:1)- vede o sistema de acordo com o método selecionado:
o Hanging drop – verta a lamínula sobre o poço. o Sitting drop – utilize o filme de vedação sobre toda a placa
- Acompanhe, com o auxílio de microscópio, a formação de cristais de lisozima
Experimento de otimização
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
4
FFI0750 – BIOLOGIA MOLECULAR ESTRUTURALProf. Dr. Rafael V. C. Guido / Prof. Dr. Glaucius Oliva
Soluções estoques
Reagente Concentração pHPEG 4000 50% (m/v) -PEG 6000 50% (m/v) -
NaCl 4 M -Acetato de Na 1 M 4,5Acetato de Na 50 mM 4,5
Lisozima 100 mg/mL -
Incluir no espaço abaixo duas fotos dos cristais obtidos em condições distintas no experimento de otimização
Condição:
Condição:
Exercício 25
FFI0750 – BIOLOGIA MOLECULAR ESTRUTURALProf. Dr. Rafael V. C. Guido / Prof. Dr. Glaucius Oliva
Com base nos resultados obtidos no experimento de otimização planeje e esquematize na tabela abaixo novas (diferentes) condições de cristalização. Justifique suas escolhas
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
Exercício 3
Explique qual a função de cada um dos reagentes, indicados na seção “solução estoque”, para a cristalização?
6
