ESPONJAS QUITOSANA:COLÁGENO COMO SUPORTE PARA LIBERAÇÃO DE EXTRATO DE SEMENTE DE UVA.

Danilo A. Locilento1, Virgínia C. A. Martins2, Ana M. G. Plepis1,2

1Programa de Pós-Graduação Interunidades Bioengenharia, USP, São Carlos (SP), Brasil.2Instituto de Química de São Carlos, USP, São Carlos (SP), Brasil.

E-mail: daniloloc@usp.br

Resumo. Polímeros naturais como quitosana e colágeno têm sido estudados como suporte no auxilio do processo de regeneração tecidual. A quitosana possui propriedades de biocompatibilidade e estímulo da proliferação celular. O colágeno tem sido aplicado no revestimento de feridas, reconstituição tecidual e em sistemas de liberação de fármacos. Também se tem buscado a utilização de fitoterápicos como o extrato de semente de uva que contém proantocianidina que atua estimulando o fator de crescimento endotelial vascular e proliferação de fibroblastos. A quitosana foi obtida a partir de gládio de lula e preparada na concentração de 1% (g / g) em ácido acético 1%. O colágeno foi obtido pelo tratamento de tendão bovino e ajustado a 1% com ácido acético. As esponjas foram obtidas por liofilização, das blendas de quitosana: colágeno (1:2, g/g) e quitosana:colágeno:glicerol (1:2:0,25, g/g/g) contendo 0,5, 1,0 e 2,0% de extrato em relação a blenda. Estudos de análise térmica (DSC e TG) foram utilizados para caracterização. Também foram feitas liberações in vitro do extrato em solução de PBS, pH 7,4 a 37°C sob agitação. As concentrações foram determinadas por interpolação em curva de calibração em espectrofotômetro U.V.–Vis em 278,6 nm. Observou-se um aumento na temperatura de desnaturação do colágeno com o aumento da concentração do extrato indicando um efeito de reticulação que é mais pronunciado na presença de glicerol e diminuição da estabilidade térmica. As quantidades de extrato liberado in vitro de todas as amostras aumentam até por volta de 24 h. A maior porcentagem de liberação ocorre para a esponja quitosana:colágeno:extrato 2% (44%), demonstrando um mecanismo de liberação de transporte anômalo (0,5 > n < 1), que se dá quando ocorre simultaneamente o transporte por difusão (Fickiano) e Caso II (não-fickiano). Entretanto, esponjas contendo glicerol, utilizado como plastificante, mostraram um comportamento quase Fickiano (n~0,5) alterando portanto o mecanismo de liberação.

Palavras-chave: Quitosana, Colágeno, Extrato de semente de uva, Liberação de fármacos.

1. INTRODUÇÃO

A pele é o maior órgão do corpo nos vertebrados e desempenha um papel crucial em muitas funções, tais como proteção contra agressões externas, homeostasia de fluidos, regulação da temperatura corpórea e detecção sensorial. Estas funções podem ser prejudicadas na ocorrência de danos ou perda de integridade da pele. Qualquer lesão cutânea, além de causar danos físicos, mecânicos e térmicos, pode também afetar as funções fisiológicas de tecidos internos [VAN DER VEEN et al., 2010]. Dentre as causas mais comuns de lesões cutâneas, encontram-se as queimaduras e úlceras.

As tentativas humanas de intervir no processo de regeneração tecidual remontam à antiguidade, demonstrando que desde então já se reconhecia a importância de proteger as lesões de forma a evitar complicações.

Nas últimas décadas houve uma importante expansão na pesquisa médica para o desenvolvimento de biomateriais visando à reparação tecidual [ZHONG et al., 2010].

Biomateriais possuem características de biocompatibilidade, o que proporciona uma melhor interação entre o material e o tecido.

Biomateriais derivados de polímeros naturais como a quitosana e o colágeno, têm se destacado por aceitar diversas formas de aplicação como: géis, filmes, esponjas e hidrogéis, sendo estas opções utilizadas na obtenção de curativos, auxiliando na cicatrização e regeneração tecidual (ZHONG et al., 2010).

Além de sua aplicação em variadas formas a utilização da quitosana está baseada em inúmeras propriedades, como a biocompatibilidade, bioadesividade, atuação na abertura das junções epiteliais [BERGER et al., 2004], possuindo ainda ação antimicrobiana, capacidade de ativar macrófagos, estimular a proliferação celular, além de orientar a reorganização da histo-arquitetura celular [ALEMDAROGLU et al., 2006]. Uma das características mais promissoras da quitosana no uso como biomaterial é sua excelente habilidade em ser processada em estruturas porosas para uso em transplante de células, curativos e liberação de fármacos [DENKBAS, 2006]. O colágeno é a proteína mais abundante do tecido conjuntivo e é capaz de orientar a formação de tecidos em desenvolvimento [LEE et al., 2001]. Por suas propriedades hemostáticas, ausência de citotoxicidade e baixa antigenicidade, o colágeno tem sido aplicado no auxilio do tratamento de queimaduras, revestimento de feridas, regeneração tecidual e também utilizado em sistemas de liberação de fármacos.

Como forma de potencializar a atividade dos biomateriais, alternativas terapêuticas utilizando fitoterápicos veem sendo estudados e utilizados no processo de regeneração tecidual [PEREIRA et al., 2005; GARROS et al., 2006]. Dentre os fitoterarápicos que possuem atividade na regeneração tecidual, está o extrato de semente de uva, no qual seus efeitos benéficos são provenientes da capacidade de eliminação de radicais livres, sendo esta atividade antioxidante superior a outros antioxidantes conhecidos, como vitamina C, vitamina E e β-caroteno. Alguns dados clínicos demonstram ação antioxidante 20 vezes mais potente que a vitamina C e 50 vezes mais potente que a vitamina E. [CHO et al., 2009]. Como principal componente do extrato de semente de uva, estão as proantocianidinas ou tanino condensado.

As proantocianidinas possuem variadas atividades farmacológicas e biológicas, incluindo: cardioprotetora, antitumoral, bactericida, anti-inflamatória e antioxidante [CHO et al., 2009]. Atuam também como facilitador da cicatrização tecidual devido á estimulação do fator de crescimento endotelial vascular (angiogênese) [KHANNA et al., 2001], proliferação de fibroblastos e aumento da síntese de matriz extracelular, incluindo colágeno e fibronectina [KIM et al., 1997]. Outro atributo importante das proantocianidinas refere-se a sua capacidade de atuação com agente reticulador de colágeno, descrito por [HAN et al., 2003].

O objetivo deste trabalho é estudar a liberação de extrato de semente de uva de esponjas de quitosana:colágeno com e sem glicerol utilizado como plastificante.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Materiais

A quitosana foi obtida a partir de gládio de lula (Loligo sp) e preparada em três etapas: desmineralização, desproteinização e desacetilação [HORN et al., 2009]. Uma solução de quitosana foi preparada na concentração de 1% em ácido acético 1%.

O colágeno foi obtido por hidrólise alcalina de tendão bovino com solução alcalina contendo sulfatos e cloretos de Na+, K+ e Ca2+ por 96 h a 25°C, seguido da estabilização com uma solução aquosa de cloretos e sulfatos dos mesmos cátions. Após isso, os sais foram removidos por lavagens com ácido bórico, EDTA e água deionizada [BATISTA et al., 2009].

O gel foi extraído e homogeneizado em solução de ácido acético pH 3,5 com concentração final ajustada para 1,0%, determinada por liofilização.

O extrato de semente de uva foi obtido da Empresa Galena – Química e Farmacêutica Ltda, com o nome comercial de Procianin® (extrato de semente de uva padronizado), contendo quantidade superior a 96% de proantocianidinas.

2.2. Preparação das esponjas

Inicialmente foram preparadas soluções de quitosana e colágeno 1% em ácido acético 1%. Para o preparo das esponjas foram feitas duas misturas, (1:2) de quitosana, colágeno e (1:2:0,25) de quitosana, colágeno e glicerol. Posteriormente foi adicionado o extrato de semente de uva nas proporções de 0,5, 1,0 e 2,0% de extrato em relação à mistura. O material obtido foi liofiolizado e as esponjas obtidas foram denominadas de QC0,5, QC1, QC2, QCG0,5, QCG1 e QCG2, sendo Q = quitosana, C = colágeno, G = glicerol e os números 0,5, 1 e 2 são a porcentagem do extrato utilizado.

2.3. Caracterização

O grau médio de acetilação da quitosana foi determinado por titulação condutimétrica [CARDOSO, 2008] e a massa molar por viscosimetria capilar [TSAIH & CHEN, 1999].

Para a análise de estabilidade térmica e temperatura de desnaturação do colágeno, presente nas esponjas liofilizadas, utilizou-se as técnicas de termogravimetria (TG) e calorimetria exploratória diferencial (DSC), usando equipamentos da TA Instruments, modelos DSC – 2010 e TGA – 2050.

Para o DSC foram colocados aproximadamente 10,0 mg do material no suporte de alumínio hermético sob fluxo de ar sintético de 80 mL min-1 com razão de aquecimento de 10°C min-1, com variação de 5 – 120°C.

Para a análise termogravimétrica foram colocados aproximadamente 10,0 mg do material e posicionados no porta amostra de alumina sob atmosfera de ar sintético de 80 mL min-1 com razão do aquecimento de 10°C min-1, com variação de 25 – 800°C.

Nos ensaios de liberação in vitro, as esponjas foram imersas em frascos contendo 100mL de solução de tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4, e colocado em um Banho Dubnoff sob agitação e temperatura constante de 37,0±0,1°C. Alíquotas de 3,0 mL foram retiradas em intervalos de tempo que variaram de 10 min a 48 h e retornadas após análise em espectrofotômetro de U.V.-visível da HITACHI, modelo U-1100, em comprimento de onda de 278,6 nm. As quantidades liberadas de extrato de uva foram determinadas através de interpolação em curva de calibração. Foram feitas três determinações independentes.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Observou-se quanto aos aspectos macroscópicos das esponjas que de acordo com o aumento da concentração de extrato incorporado ‘a esponja, sua coloração foi se intensificando, iniciando com uma coloração bege para as esponjas contendo 0,5% de extrato para uma coloração mais escura para as esponjas contendo 2,0% de extrato ( Fig.1). Outro aspecto de diferenciação ocorreu entre as esponjas com glicerol, no qual, notou-se que as esponjas possuíam uma superfície com um aspecto mais liso e uniforme se comparado às esponjas sem glicerol, além da aparente maior flexibilidade.

Figura 1: Fotografia digital das esponjas (1) QCE05, (2) QCE1, (3) QCE2.

3.1. Caracterização

Determinação do grau médio de acetilação da quitosana

Para o cálculo do grau médio de acetilação da quitosana por titulação condutimétrica usa-se o gráfico com os valores de condutividade versus o volume de NaOH utilizado na titulação. Para a elaboração do gráfico (Fig 2) foram utilizados os valores médios das medidas feitas em triplicata.

Figura 2: Curva de titulação condutimétrica da amostra de quitosana.

Com o auxilio do gráfico de titulação é possível determinar o valor de V1 (ponto no qual determina o fim da neutralização do HCl pelo NaOH) e V2 ( neutralização total do ácido fraco pertencente aos grupos amino da quitosana) [CARDOSO, 2008], sabendo-se a massa de quitosana, a concentração de NaOH e os valores de V1 e V2, a Equação 1 pode ser utilizada.

Desta forma, o grau médio de acetilação obtido foi de 8,82%.

Determinação da massa molar média da quitosana

Com os valores da Tabela 1 foi possível obter o valor da viscosidade intrínseca, através da elaboração da curva de viscosidade reduzida versus a concentração, mostrada na Figura 3:

Tabela 1: Valores de tempo médio de escoamento, viscosidade especifica e viscosidade reduzida das soluções com diferentes concentrações de quitosana.

Concentração (g mL-1)

Tempo médio de escomento (s)

Viscosidade especifica (mL g-1)

Viscosidade reduzida (mL g-1)

Solução padrão 508,977 ----------------- -----------------1,5x10-4 633,162 0,243989414 1626,5960631,8x10-4 659,593 0,295919069 1643,9948282,0x10-4 680,656 0,337302078 1686,510392,5x10-4 730,045 0,434337897 1737,3515883,0x10-4 785,399 0,543093302 1810,3110073,5x10-4 838,265 0,646960471 1848,4584894,0x10-4 925,443 0,818241295 2045,603238

Com a extrapolação da curva de viscosidade reduzida, determinou o valor da viscosidade intrínseca como sendo de 1446,22 mL g-1.

Figura 3: Curva de viscosidade reduzida em função das concentrações das soluções da quitosana.

De acordo com RINAUDO, 2006, os valores de K e α para um grau de acetilação da ordem de 9% é de 0,074 mL g-1 e 0,80, respectivamente. Utilizando a Equação 2 de Mark-Houwink-Sakurada foi possível determinar a massa molar média da quitosana, resultando em 2,31x105 g mol-1.

Análise térmica

As curvas DSC (Fig. 4 e 5) permitiram a determinação da temperatura de desnaturação (Td) do colágeno presente nas esponjas. A Tabela 2 mostra um aumento na Td com a presença do extrato e quanto maior a concentração deste maior a Td, indicando que o extrato promove reticulação no colágeno. A presença do glicerol induz a um aumento na Td, provavelmente pelo efeito plastificante que aumenta o volume entre as cadeias poliméricas, facilitando o acesso da proantocianidina, um dos principais componentes do extrato de uva e responsável pelo efeito reticulante [HAN et al., 2003].

Tabela 2: Temperatura de desnaturação (Td) das esponjas, obtidas por DSC.

Figura 4: Curvas DSC para as esponjas: (a) QC; (b) QCE0,5; (c) QCE1; (d) QCE2

Para as esponjas contendo glicerol (Figura 5) observou-se um aumento na temperatura de desnaturação que é proporcional ao aumento na concentração do extrato.

Figura 5: Curvas DSC para as esponjas com glicerol: (a) QCG; (b) QCGE0,5; (c) QCGE1; (d) QCGE2.

Esponja Td °CQC 44,7

QCG 46,9QCE0,5 68,5

QCGE0,5 72,3QCE1 74,0

QCGE1 79,2QCE2 77,4

QCGE2 79,3

A curva termogravimétrica mostrada na Figura 6 é representativa das demais esponjas. Observou-se que a decomposição ocorre em três etapas, sendo a primeira entre (25 – 100 °C) referente a perda de água estrutural da esponja, a segunda entre (100 – 200 °C) devido à degradação das cadeias poliméricas do colágeno e a terceira entre (200 – 380 °C) representa a carbonização dos materiais poliméricos. O conteúdo de água presente nas esponjas praticamente não varia com a presença do glicerol, como observado pela perda de massa até 120°C, sendo de aproximadamente 10% para todas elas. O glicerol induz a uma diminuição na estabilidade térmica das esponjas verificada pela menor temperatura de decomposição (~160°C) quando comparada com as esponjas na ausência de glicerol (acima de 250°C).

Figura 6: Curvas TG para esponjas: (A) QCE1.

Ensaios de liberação in vitro do extrato de semente de uva

Os ensaios in vitro de liberação do extrato de semente de uva das esponjas são mostrados nas Figura 7 e 8. Inicialmente a liberação é bastante rápida atingindo pelo menos 80% do total liberado em cada amostra nas primeiras 5 h. Em todas as amostras a liberação atingiu a concentração máxima em torno de 24 h. A liberação de extrato para a amostra QCE2 é de aproximadamente 44% enquanto que para QCE0,5 tem-se por volta de 26%, em 24 h, indicando que a liberação é dependente da concentração do extrato. As esponjas contendo glicerol apresentaram uma liberação menor que as esponjas sem glicerol. Essa diminuição pode ser associada a maior fixação do extrato de semente de uva às cadeias poliméricas, modificando o coeficiente de difusão, causadas pelo efeito plastificante do glicerol.

Figura7: Perfil de liberação in vitro do extrato de semente de uva das esponjas : Q1C2E05 (a), Q1C2E1 (b), Q1C2E2 (c).

Figura8: Perfil de liberação in vitro do extrato de semente de uva das esponjas : Q1C2GE05 (a), Q1C2GE1 (b), Q1C2GE2 (c).

Para o entendimento do tipo de mecanismo de liberação predominante nas esponjas, devem-se analisar os resultados de acordo com os valores de n obtidos através da equação 1:

M t

M 0=K t n (Equação 1)

Sendo o valor de n o expoente de liberação que, de acordo com o valor numérico que assume, caracteriza o mecanismo de liberação do fármaco. Quando o valor de n é próximo de 0,5 ocorre o transporte de difusão ou Fickiano, se n é próximo de 1 ocorre o transporte de Caso II ou não-Fickiano que se dá pelo intumescimento e relaxação do sistema e quando o valor de n está entre 0,5 e 0,89 ocorre o transporte anômalo que são os fenômenos simultâneos do transporte Fickiano e Caso II [RUVALCABA et al., 2009].

Os valores de n mostram um mecanismo anômalo para liberação do extrato em esponjas sem glicerol (QCE0,5 e QCE1). A presença de glicerol leva a uma diminuição no valor de n para todas as concentrações de extrato, tendo-se para a esponja QCGE0,5 ainda um transporte anômalo (0,5<n<0,89). Contudo, para a esponja QCGE1 o efeito é mais pronunciado fazendo com que ocorra uma modificação na característica de liberação passando do transporte anômalo para um transporte quase fickiano, ou seja, com n assumindo um valor próximo de 0,5.

Para as esponjas contendo extrato a 2% (QCE2 e QCGE2) os valores de n obtidos são relativamente baixos em comparação aos outros, não sendo possível até o momento caracterizar o tipo de transporte envolvido na liberação do extrato para essas esponjas. Outros estudos serão necessários para melhor interpretar os resultados obtidos nas amostras com 2% de extrato.

CONCLUSÃO

O extrato de semente de uva promove reticulação no colágeno presente nas esponjas. Essa reticulação é dependente da concentração do extrato e da presença de glicerol. O glicerol como um plastificante induz a uma diminuição na estabilidade térmica como observado pela

menor temperatura de decomposição. A liberação do extrato de semente de uva ocorre principalmente nas cinco primeiras horas (~80% do total) e permanece constante após 24 h, o que torna essa dinâmica interessante no uso de curativos onde se queira uma ação imediata. A quantidade de extrato liberado é dependente da concentração do mesmo e da presença de glicerol. A liberação do extrato ocorre por um mecanismo anômalo e a presença de glicerol leva a alteração do mecanismo tendo-se um mecanismo quase Fickiano para as esponjas com menor concentração de extrato.

AGRADECIMENTOS

A Capes pela bolsa concedida (D.A.L.). À Miami Comércio e Exportação de Pescados Ltda. (Cananéia – SP) pelo fornecimento dos gládios.

REFERÊNCIAS

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CHITOSAN:COLLAGEN SPONGES AS A SUPPORT FOR THE LIBERATION OF GRAPE SEED EXTRACT

Danilo A. Locilento1, Virgínia C. A. Martins2, Ana M. G. Plepis1,2

1Programa de Pós-Graduação Interunidades Bioengenharia, USP, São Carlos (SP), Brasil.2Instituto de Química de São Carlos, USP, São Carlos (SP), Brasil.

E-mail: daniloloc@usp

Natural polymers such as collagen and chitosan have been used as a biomaterial in the process of

tissue regeneration. Chitosan has properties such as biocompatibility and stimulation of cell

proliferation. Collagen has been used in the coating of wounds, tissue reconstruction and drug

delivery systems. Herbal medicines as grape seed extract that contains proanthocyanidin has bees

used as a stimulant of vascular endothelial growth factor and fibroblast proliferation. Chitosan was

obtained from squid pens and prepared as a 1% solution with 1% acetic acid. Collagen was obtained

by treatment of bovine tendon and prepared as a 1% solution with 1% acetic acid. The sponges were

obtained by lyophilization of the blends of chitosan, collagen (1:2) and chitosan: collagen: glycerol

(1:2:0.25) containing 0.5, 1 and 2% of extract in relation to blend. Thermal analysis (DSC and

TGA) was used for characterization. In vitro release of the extract as measured in PBS, pH 7.4 at

37°C. Concentrations were determined by interpolation from the calibration curve of UV-Vis

spectrophotometer at 278.6 nm. There was an increase in denaturation temperature of collagen with

increasing extract concentration indicating that the crosslinking effect is more pronounced in the

presence of glycerol and a decrease of thermal stability. The quantities of released extract increase

until about 24 h for all samples. The highest percentage of liberation occurs for chitosan: collagen:

extract 2% sponge (44%), demonstrating a mechanism for release of anomalous transport (0.5> n

<1), which occurs when there is simultaneously transport by diffusion (Fickian) and case II (non-

Fickian). However, sponges containing glycerol as plasticizer, showed a behavior almost Fickian (n

~0.5) changing therefore the release mechanism.

Keywords: Chitosan, Collageno, Grape seed extract, drug delivery