7

1. Introdução:

As bactérias são organismos que apresentam grande diversidade na natureza

e que por muito tempo não lhes foi dada devida importância em relação às grandes

transformações que causaram na moldagem e na alteração, no passado e no

presente, da terra como conhecemos hoje (OLSEN et. al, 1994). Cada organismo é

produto de uma história de vida complexa e para entender totalmente suas relações

evolutivas é necessário analisar além das características fenotípicas, as

características filogenéticas de cada espécie (OLSEN et. al, 1994). Segundo Woese

et. al (1990), foi apenas em nível molecular, com as análises das sequências do

16S, que foi possível a visualização da divisão de três grupos primários distintos de

divisão das bactérias (eucaria, bacteria e arquea).

A caracterização desses organismos muitas vezes é dificultada, pois, os

métodos tradicionais, como por exemplo analise da coloração de Gram, testes

bioquímicos e o crescimento em determinados meios de cultura nem sempre

possibilitam a classificação bacteriana correta (MARCHESI et. al, 1997). Além disso

os métodos tradicionais de cultivo limitam as análises da real diversidade dos

ambientes, pois se acredita que apenas 10% desses organismos sejam cultiváveis

(SILVEIRA, 2004), do mesmo modo as características fenotípicas de cada espécie

podem se apresentar de forma muito variável, e com resultados muito próximos e de

difícil analise para espécies intimamente aparentadas (WOO et. al, 2008).

Para melhor analise da diversidade bacteriana são utilizadas técnicas

moleculares, como a hibridação de DNA - DNA. Este tipo de técnica considera uma

mesma espécie quando há acima de 70% de hibridação DNA-DNA, mas por ser

uma técnica trabalhosa poucos laboratórios a utilizam, mas ainda é requerida para

identificação de novas espécies (CAMACHO, 2010). Ainda segundo CAMACHO,

2010, as técnicas mais utilizadas para identificação bacteriana são, Dot Blot que não

utiliza eletroforese, pois a sonda se encontra em um filtro, Southern Blot que é a

hibridização DNA-DNA. Essas técnicas não são mais o “padrão ouro” da

identificação bacteriana, pois estão sendo substituídas por técnicas de

sequenciamento de genes como o rpoB em conjunto com a região 16s (CAMACHO,

2010). Mas ainda são muito utilizadas e aceitas para identificação de novas

espécies.

8

Outra forma de avaliação de diversidade é o sequenciamento (total ou parcial)

da região 16S com a utilização da reação de polimerase em cadeia (PCR) com

primers específicos para amplificação dessa região do genoma ribossomal

bacteriano (MARCHESI et. al, 1997). Essa região se apresenta muito conservada ao

longo da evolução no DNA bacteriano, pode ser utilizada como um indicador da

diversidade, e quando somado a analises de outros marcadores moleculares, das

relações filogenéticas dos microorganismos (TOLEDO et. al, 2009). A utilização da

sequência 16S não é restrita para propósitos de pesquisa, mas também é utilizada

na identificação de muitas espécies de bactéria na área da clínica e hospitalar, com

grande importância na identificação de bactérias importantes para a saúde (WOO et.

al, 2008).

Durante a elaboração do projeto de iniciação científica intitulado “Ralstonia

solanacearum: Caracterização bioquímica e molecular de amostras de bactérias

extraídas de solo, agua e tomateiros doentes”, sete isolados bacterianos foram

submetidos a testes para confirmação da presença da R. solanacearum. Esses

isolados foram selecionados devido à suspeita desse patógeno, a ocorrência da

doença nas plantas coletadas e o resultado preliminar por coloração de Gram que

indicou bastonetes gram negativos. Esses testes consistiam da observação de

resultados bioquímicos e de PCR’s de regiões polimórficas do genoma que geraram

dados, que quando comparados a literatura indicavam que de fato tratava-se de R.

solanacearum. Os testes bioquímicos utilizados foram, a coloração de Gram para

identificação da forma e da coloração, teste de catalase, crescimento em meio

suplementado de Asparagina (mínimo) como única fonte de carbono, teste de

tolerância em altas temperaturas que inibiriam o seu crescimento, e por fim teste

com meio 2% NaCl que também restringiria seu crescimento. Todos esses testes

foram utilizados para a confirmação através de características bioquímicas a

presença da R. solanacearum. Dentre todos os testes apenas a observação do

exsudato em agua de uma região da planta acometida foi negativo para todas as

amostras. Em seguida testes de metabolização de álcoois e açucares foram feitos

para separação das amostras em grupos denominados Biovares, separados por

capacidade de metabolização de certos álcoois e açucares.

Duas das amostras investigadas no trabalho anterior, denominadas R1 e GC

foram utilizadas no projeto aqui apresentado. Ambas apresentavam características

9

semelhantes a todas as outras analisadas em relação aos testes bioquímicos, mas

são de biovares diferentes.

O presente projeto tem como objetivo a utilização da técnica de

sequenciamento da região rRNA 16S para caracterizar as amostras bacterianas R1

e GC do Laboratório de Virologia e Microbiologia (CCBS, Universidade Presbiteriana

Mackenzie). As informações obtidas nesse trabalho foram importantes para

caracterização destas amostras, e as sequencias obtidas mostraram a possibilidade

de analisar a diversidade das amostras utilizando apenas dados genéticos da região

16S, mostrando também as limitações desta técnica.

2. Material e métodos

2.1 Material biológico

O material biológico utilizado são amostras investigadas em trabalhos

realizados no laboratório de biologia molecular e virologia (LBMV) que inclui,

bactérias isoladas de tomateiros (caule, raiz e ramos) acometidos pela murcha

bacteriana, e bactérias isoladas de amostras de solo e agua de regiões com possível

contaminação. As amostras são R1 e GC. R1 tem sua origem da raiz de um

tomateiro doente, na região mais apical. Já GC tem sua origem de uma mistura de

solo e agua contaminados.

2.2 Extração de DNA bacteriano e eletroforese

A extração do DNA bacteriano foi realizada utilizando o reagente Brazol

(Invitrogen), através das instruções, e procedimentos fornecido pelo fabricante. As

amostras R1 e GC, assim como a amostra de Pseudomonas aeruginosa, usada para

comparação (amostra P1), após crescimento de 48 horas em estufa foram

centrifugadas para a separação das células bacterianas do sobrenadante e em

seguida resuspendida com o reagente Brazol. Em seguida series de resuspensões,

seguidas de centrifugações foram realizadas de acordo com o protocolo a fim de que

o precipitado final seja formado apenas pelo DNA das amostras a serem analisadas.

Ao final da extração as amostras foram submetidas a eletroforese em géis de

agarose 0,8% para estimativa da concentração final de DNA extraído através da

intensidade da banda formada.

10

2.3 Reação em cadeia da polimerase ou síntese da região 16S

Foi realizada a reação de PCR para amplificação da região do 16s. Para esse fim foi

feito um “mix” de reagentes para a reação de PCR com volume final de 50µL,

contendo, 1µL do DNA extraído em uma concentração de aproximadamente 20

ng/µL, 1µL de cada primer, 27f e 1387r (quadro 1) de concentração 10µM, 5µL de

tampão PCR reaction buffer MgCl2 10x concentrado, 1µL da enzima Taq Polimerase

na concentração 5U/µL, 40µL de agua ultrapura (mili-Q).

As condições do PCR serão as utilizadas no LBMV como indicado a seguir:

30 ciclos de

Fase de iniciação: 94ºC por 4 minutos

Fase de desnaturação: 94ºC por 45 segundos

Fase de anelamento: 50ºC por 45 segundos

Fase de extensão: 72ºC por 90 segundos

Quadro 1- Sequência de primers

PRIMER Sequência do primer 5’-3’ Referência

27f AGAGTTTGATCMTGGCTC MARCHESI et. al,

(1997)

1387r GGGCGGWGTGTACAAGGC MARCHESI et. al,

(1997)

2.4 Purificação, eletroforese e quantificação

O produto da amplificação foi em seguida purificado utilizando-se o GFX™ PCR

DNA and Gel Band Purification Kit (Ilustra™, GE Healthcare), seguindo-se o

protocolo informado pelo fabricante. Foi feita uma eletroforese em gel de agarose a

0,8% para se confirmar o sucesso da purificação. Após isso, foi feita a quantificação

desse material em aparelho nanodrop 2000c (Thermo scientific)

2.5. Sequenciamento

11

Uma vez feitos a purificação e a quantificação dessas amostras amplificadas, foi

realizado o sequenciamento do fragmento do 16S. A reação de sequenciamento foi

feita segundo o protocolo do kit Big Dye Terminator v3.1 sequencing RR - 100 (PE

Applied Biosystems). Foram feitas pelo menos 2 reações para cada amostra. Para

cada reação de 5 µL foram utilizados: 1µL de primer 27f e 1387r (tabela 2) na

concentração de 5pmol, 8 µL do Bigdye e 6µL de água Mili-Q para completar o

volume, com volume total de 20µL de reação. A reação de síntese dos fragmentos

foi feita com o termociclador PTC 100 (BioRad) e o programa utilizado consistia 96ºC

por 1 minuto, 35 ciclos de 96ºC por 15 segundos; 50ºC por 15 segundos; 60ºC por 4

minutos e uma extensão final de 60ºC por 2 minutos (programa JLW10). O produto

da reação de sequenciamento foi então precipitado com isopropanol 75%. Aos 20µL

de reação foram adicionados 80µL de isoproapnol 75% (1,5 ml de isopropanol + 0,5

ml de água mili-Q) em seguida foi vortexado e deixado na geladeira por 15 minutos

protegido da luz. Posteriormente foi centrifugado por 35 minutos a aproximadamente

14500RPM marcando-se a orientação dos tubos, foi então removido

cuidadosamente o sobrenadante e adicionado 200µL de etanol 70%, vortex

rapidamente e em seguida centrifugado a 14500RPM por 10 minutos. Foi então

removido cuidadosamente o sobrenadante e deixado para secar em banho seco a

96°C por 2 minutos.

As amostras então foram levadas ao Instituto de Biociências (IB) da USP no centro

de pesquisas sobre genoma humano e células-tronco para a analise no

equipamento de sequenciamento, no programa de Sequenciamento de produtos de

PCR (Sanger). Link do Programa: http://www.genoma.ib.usp.br/pt-

br/servicos/sequenciamento/sequenciamento-de-produtos-pcr.

2.6. Analise dos resultados do sequenciamento

Os resultados do sequenciamento foram recebidos, e convertidos após montagem

dos contigs no CodonCodes Aligner (CodnCode Corporation) no formato FASTA.

Foi utilizado para análise, verificação de erros, e alinhamento das sequencias

(contigs) o programa CodonCodes. A verificação dos erros é feita a partir de um

gráfico de cores gerado pelo programa que indica qual comprimento de onda (cor)

foi capturado para chegar aquela base (A, C, T ou G), e a partir disso é possível

12

descartar, e reduzir ambiguidades geradas por possíveis erros durante o

sequenciamento. Em seguida os dados obtidos foram comparados a sequencias

encontradas no GenBank.

3. Resultados e discussão

3.1 Extração de DNA e PCR da região 16S

Inicialmente os resultados foram analisados observando as bandas formadas após o

processo de extração do DNA total das amostras R1, P1 e GC. Foi observado, já

como esperado na eletroforese, uma banda única na região mais superior do gel que

indica amostras de alto peso molecular. Em seguida as amostras passaram pelo

processo de PCR para amplificação da região 16s com os primers 27f e 1387r. Na

corrida eletroforética foi observado bandas de aproximadamente 1600pb quando

comparadas ao padrão lamdahind como indicado na figura 1, e uma relação 260/280

nm de 1,97 e concentrações médias de 21,36 ng/µL de DNA.

Em seguida foi feita a purificação do material amplificado. Após a purificação foi feita

mais uma corrida eletroforética para avaliação da purificação, e foram observadas

bandas com aproximadamente 1600pb indicando que não ouve perda de material

amplificado durante o processo de purificação.

1 2 3 4

Figura 1: padrão de bandas observado após reação de PCR com primers 27f e 1387r para

amplificação da região 16s. 1- DNA padrão (lamda HindIII); 2- amostra R1; 3- amostra P1; 4- amostra

GC.

3.2 Reação de sequenciamento e montagem de contigs

Após a reação de sequenciamento os resultados foram analisados observando-se a

sequência resultante do sequenciamento com o programa CodonCodes que indica a

qualidade dos fragmentos sequenciados e alinha as sequencias. A partir desse

13

alinhamento as amostras encontradas foram comparadas entre si para verificar

similaridade entre elas. Ao comparar as amostras R1 (possível Ralstonia extraída da

raiz de um tomateiro doente) e GC (possível Ralstonia) extraída de uma mistura de

terra e agua contaminada) se verificou grande similaridade entre elas, as sequencias

se alinhavam sem formação de ambiguidades, e se complementavam com poucos

erros em regiões com qualidade mais baixa. Podendo indicar que essas amostras

são possivelmente de mesma espécie, e esses erros encontrados podem ser tanto

pela baixa qualidade da região, quanto a polimorfias encontradas nessas bactérias,

uma vez que possuem variante ambientais (Biovares) diferentes. Já ao comparar as

amostras R1 ou GC com a sequência da amostra de Pseudômonas aeruginosa

foram observadas ambiguidades ao longo das sequencias indicando baixa

similaridade entre elas. Indicando amostras diferentes, e possivelmente espécies

diferentes, mas pela identidade observada ter sido de 95% indica que pertencem

com grande certeza ao mesmo gênero.

3.3 Análise das sequências

O passo seguinte foi comparar os alinhamentos (contigs) gerados com o banco de

dados GenBank (BLAST). Nas amostras R1 e GC ao serem comparadas com o

banco de dados foi observado, como mostra a figura 2, uma identidade de 97% com

a amostras de Pseudomonas, uma bactéria muito similar a Ralstonia, que antes do

desenvolvimento de técnicas moleculares mais sensíveis, como estudos de

homologia DNA -rRNA, eram pertencentes ao mesmo gênero (Pseudomonoas)

sendo diferenciadas em dois grupos pela presença ou ausência de fluorescência

(MIORANZA, 2014).

Em seguida foram selecionadas amostras do GenBank seguindo o critério de ser

uma amostra de Ralstonia solanacearum com sequenciamento total da região 16s.

Utilizando o BLAST e as amostras selecionadas com o critério acima, R1 e GC

foram comparadas entre as amostras selecionadas e observou-se uma identidade

de 83% com todas as selecionadas, indicando baixa similaridade com o gênero

Ralstonia como mostra a figura 3.

14

Figura 2: resultados observados após o teste com BLAST das amostras R1 e GC, indicando alta similaridade

com amostras do gênero Pseudomonas. Fonte: NCBI BASLT.

Figura 3: resultados observados após teste com BLAST2 comparando as sequencias adquiridas de Ralstonia do

banco de dados com as sequencias de R1 e GC. Fonte: NCBI BLAST2.

Em uma comparação entre Pseudômonas aeruginosa e R1 a identidade observada

das amostras foi de 94%, um alto grau de semelhança entre as amostras. E na

comparação de Pseudômonas aeruginosa com GC a identidade observada foi de

95%, mais uma vez um alto grau de identidade.

15

Esses resultados mostraram que as amostras analisadas são muito próximas, mas

de espécies diferentes, confirmando o gênero Pseudomonas.

As observações feitas nas análises acima mostraram que os resultados encontrados

no projeto Ralstonia solanacearum: caracterização bioquímica e molecular foram

interpretadas de forma equivocada, por serem resultados muito próximos em relação

ao gênero pseudômonas e de caráter muito variável, mesmo dentro de uma mesma

espécie. Com isso percebe-se que analises de caráter bioquímico apenas não são

suficientes para caracterização de uma espécie ou, como mostrado, de um gênero

bacteriano.

Além da Ralstonia solanacearum outros gêneros de bactéria já foram observados

como causadores da murcha bacteriana em tomateiros, assim como o gênero

Pseudomonas. Durante esse estudo, como observado nos resultados acima, as

amostras encontradas possuem grande similaridade com o gênero Pseudomonas.

Durante os testes com Blast foi observado que as principais espécies encontradas

são, P. lutea, P. syringae, e P. fluorescens. A partir das comparações com a

literatura se averiguou qual seria a espécie mais provável, uma vez que essas

bactérias foram isoladas de tomateiros doentes apresentando sintomas de murcha

bacteriana comumente causado por Ralstonia solanacearum, e de solo e água

contaminada.

A espécie Pseudomonas syringae, se mostrou uma bactéria importante para a

produção de tomates por causar a murcha bacteriana, e outros sintomas em

tomateiros (MALAVOLTA JUNIOR et. al., 2002). P. fluorescens é comumente

encontrada na região de raiz de diversas plantas e possui capacidade de inibir a

colonização da região por fungos que levam a doenças nas plantas, possui

fluorescência em luz ultra-violeta (HOWELL; STIPANOVIC, 1978). P. lutea é

comumente encontrada em solos na região de raiz de gramíneas principalmente, e

não possui fluorescência (Peix et. al., 2004).

A partir das informações acima sobre as bactérias encontradas pode-se perceber

que as três apresentam características próximas em relação a região em que são

encontradas, a forma de colonização, e algumas o potencial patogênico para as

plantas. Para se ter maior certeza de qual bactéria está sendo observada nas

amostras do trabalho, novas comparações foram feitas analisando cada base não

16

igual da sequência a fim de identificar se são erros no sequenciamento ou de fato

diferenças nas amostras.

A avaliação foi feita com a utilização do programa CodonCode e cada região

ambígua foi avaliada quanto à possibilidade de sobreposição de sinais no momento

do sequenciamento, como indicado na figura 4.

1 2 1

Figura 4: A figura acima indica a maneira como são analisadas as sequencias após análise pelo sequenciador

com o programa CodonCodes, as ondas coloridas em vermelho, azul, verde e preto indicam o comprimento de

onda absorvida no momento do sequenciamento. Cada pico (indicado com o número 1) mostra alta qualidade,

podendo ser observado picos bem definidos. Regiões de menor qualidade podem ser observadas pela não

formação de picos (indicado pelo número 2).

Com essa avaliação se chegou à conclusão que a amostra GC é muito próxima

principalmente a Pseudomonas flurescens. E a amostra R1 apesar de ter dado uma

similaridade alta com a P. fluorescens, ao ser avaliada novamente essa

possibilidade foi descartada por grande quantidade de ambiguidades que não eram

erros, e sim diferenças nas sequencias. O mesmo acontece na avaliação dessa

amostra com a P. lutea. Com a P. syringae também foram observadas

ambiguidades, mas poucas, e ao ser comparada com avaliações bioquímicas

17

realizadas anteriormente se observaram diferenças no metabolismo de álcoois em

relação ao álcool Sorbitol que quando comparado ao encontrado por Malavolta

Junior et. al. onde havia metabolização do sorbitol se mostra diferente pela não

observação disso na amostra R1. Em seguida a amostra foi mais uma vez

submetida ao teste com Blast e foi observada uma identidade de 99% com a P.

koreenses. Ao se realizar mais uma vez a avaliação pelo CodonCode se observou

poucas ambiguidades, como o observado anteriormente com a P. syringae.

4. Conclusão

Através dos resultados apresentados acima é possível se concluir que a

identificação precisa de espécies de bactéria através, unicamente, do

sequenciamento total da região 16S se torna dificultada pela grande similaridade

dessa região entre as mesmas, e também pela baixa ocorrência de polimorfismos,

uma vez que é uma região muito conservada. Pode-se observar isso nos resultados

de R1 e GC que quando analisadas com banco de dados geraram resultados muito

similares com mais de uma espécie bacteriana, mas sempre no mesmo gênero

Pseudomonas. Indicando que para análise de gêneros essa região é uma ótima

ferramenta por ser de rápida e relativamente simples reprodução.

Para uma análise mais precisa e especifica seria necessário o sequenciamento de

outras regiões do genoma. Adékambi et. al (2008), propõe a utilização do gene rpoB,

que codifica a subunidade β da RNA polimerase, para analises filogenéticas e

estudos de bactérias muito próximas. E juntamente com o 16S o rpoB pode ser

utilizado para determinar novas espécies e refinar a análise de comunidades

bacterianas em nível especifico.

18

Referências Bibliograficas:

WOO, P. C. Y.; Lau, S. K. P.; TENG, J. L. L.; TSE, H.; YUEN, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Universidade de Hong Kong. China. 2008.

WOESE, R. C.; KANDLER, O.; WHEELIS, M. L. Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Universidade de Ilinois. California, EUA. 1990.

MARCHESI, J. R.; SATO, T.; WHEIGHTMAN, A. J.; MARTIN, T. A.; FRY, J. C.; HIOM, S. J.; WADE, W. G. Design and Evaluation of Useful Bacterium-Specific PCR Primers That Amplify Genes Coding for Bacterial 16S rRN. Universidade de Wales. United Kingdom. 1998.

TOLEDO, B. F. B.; MARCONDES, J.; LEMOS, E. G. M. Caracterização de rizóbios indicados para produção de inoculantes por meio de sequenciamento parcial do 16S rRNA. Faculdade de ciências agrarias. Universidade estadual paulista. Jaboticabal. 2009.

OLSEN, G. J.; WOESE, C. R.; OVERBEEK, R. The Winds of (Evolutionary) Change: Breathing New Life into Microbiology. Universidade de Ilinois. California. 1994.

SILVEIRA, Érico Leandro da. Identificação de comunidades bacterianas de solo por seqüenciamento do gene 16S rRNA. 2004. ix, 83 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2004. Disponível em: <http://hdl.handle.net/11449/94868>.

MALAVOLTA JUNIOR, V.A.; ALMEIDA, I.M.G; RODRIGUES NETO, J.; BERIAM, L.O.S; de MELO, P.C.T. Caracterização de pseudomonas syringae pv. syringae em tomateiro no brasil e reação de cultivares/genótipos de tomateiro a esse patovar e ao patovar tomato, Instituto Agronômico, Campinas, SP, v. 69, n.1, p. 63-66, Jan./Mar., 2002.

HOWELL, C. R.; STIPANOVIC, R. D. Control of Rhizoctonia solani on Cotton Seedlings with Pseudomonas fluorescens and With an Antibiotic Produced by the Bacterium. Disease control and pest management. EUA, v. 69, n. 5. 1979. Disponível em: http://www.apsnet.org/publications/phytopathology/backissues/Documents/1979Articles/Phyto69n05_480.pdf>. Data de acesso: 27/04/2016.

PEIX, A.; RIVAS, R.; SANTA-REGINA, I.; MATEOS, F. P.; MARTINEZ, M. E.; BARRUECO, C. R.; VELAZQUEZ, E. Pseudomonas lutea sp. nov., a novel phosphate-solubilizing bacterium isolated from the rhizosphere of grasses. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiolog, Salamanca, Spain, v. 54, p. 847-850. 2004. Disponível em: http://ijs.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/ijs.0.02966-0#tab2>. Data de acesso: 06/04/2016.

19

ADÉKAMBI,T; DRANCOURT, M.; RAOULT, D. The rpo B gene as a tool for clinical microbiologists. Trends in Microbiology, USA, v.17, n.1, p. 37-45. 2008.

CAMACHO, R. A. P. (2010). Detecção de bactérias no ar em ambiente hospitalar com recurso a técnicas moleculares. Dissertação (Mestrado em Biodiversidade e Conservação), Universidade da Madeira, Portugal, 205 pp.

MIORANZA, T. M.; MULLER, M. A.; KUHN, O. J. Pseudomonas: principais características e espécies fitopatogênicas. Journal of Agronomic sciences, Brasil, v. 3, n. especial, p. 74-85, 2014.