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1
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências
JHENIFER NASCIMENTO DA SILVA
Padrão metabolômico relacionado ao metabolismo de glicose no
desenvolvimento embrionário do carrapato Rhipicephalus microplus
Macaé – RJ /2017
2
JHENIFER NASCIMENTO DA SILVA
Padrão metabolômico relacionado ao metabolismo de glicose no
desenvolvimento embrionário do carrapato Rhipicephalus microplus
Macaé – RJ /2017
CRISCILA DE SOUZA CRUZ
Dissertação apresentada à
Universidade Federal do Rio de
Janeiro para obtenção do grau de
mestre em produtos e bioativos e
biociências.
Orientador: Angélica Ribeiro
Co-Orientador: Carlos Logullo
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Padrão metabolômico relacionado ao metabolismo de glicose no
desenvolvimento embrionário do carrapato Rhipicephalus microplus
JHENIFER NASCIMENTO DA SILVA
COMISSÃO EXAMINADORA
________________________________________________________ Prof. Dr. Thiago Barth - UFRJ – Campus Macaé
________________________________________________________ Prof. Dr. José Roberto da Silva –UFRJ - Campus Macaé
______________________________________________________ Prof. Dr. Leonardo Abreu - UFRJ - Campus Macaé
______________________________________________________ Prof.Dr. Carlos Logullo - LQFPP/LBCT/UEA/CBB/ LSA/CCTA/UENF - Campos RJ
(Co-orientador)
________________________________________________________
Prof. Drª Angélica Ribeiro – LIQ / UFRJ – Campus Macaé (Orientador)
Macaé – RJ /2017
Dissertação apresentada à
Universidade Federal do Rio de
Janeiro para obtenção do grau de
mestre em produtos e bioativos e
biociências.
Orientador: Angélica Ribeiro
Co-Orientador: Carlos Logullo
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AGRADECIMENTOS
Aos professores Carlos Logullo e Angélica Ribeiro por me aceitarem como
aluna, por me receberem de braços abertos no grupo, pelo esforço para que o
trabalho fosse realizado e pela confiança depositada a mim e no meu trabalho.
Aos meus grandes amigos e companheiros de trabalho, Adrian, Aline, Camila,
Christiano, Daniel e a Nathália, que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho.
Agradeço a todos os alunos do Grupo UEA e do Grupo GPNOA, que hoje são
como familiares para mim, obrigada por toda ajuda, por terem sido meus
companheiros, e pelos agradáveis lanches da tarde.
Agradeço aos meus familiares, por terem me dado à vida e por me ensinar a
vivê-la com dignidade, por todo apoio e incentivo que sempre me deram.
Agradeço ao professor Heitor Duarte, pela contribuição nas análises
estatísticas do meu trabalho.
Agradeço ao professor Leonardo Abreu por ter revisado este documento.
Aos membros da banca de defesa, Professor Thiago Barth, Professor
Leonardo Abreu e Professor José Roberto da Silva por aceitarem o convite para
participar e certamente agregar seus conhecimentos ao meu trabalho.
À coordenação de pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências, pelo
apoio. Às agências de fomento, FAPERJ, CAPES, CNPq e INCT – Entomologia
Molecular, pelo financiamento para este projeto.
E a todos que de forma direta ou indireta, me auxiliaram durante a execução
desse trabalho, meu eterno agradecimento.
5
Lista de Figuras ........................................................................................................... 7
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................ 8
RESUMO..................................................................................................................... 9
ABSTRACT ............................................................................................................... 10
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 11
1.1 Artrópodes: os carrapatos ................................................................................ 11
1.2 O Carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus .......................................... 12
1.3 Importância econômica e estratégias para o controle do Carrapato
Rhipicephalus microplus ........................................................................................ 14
1.4 Desenvolvimento embrionário do carrapato R. microplus ................................ 16
1.5 Perfil metabólico durante a embriogênese do carrapato R.microplus .............. 17
1.6 Plataformas “ômicas” e a metabolômica .......................................................... 23
2. Justificativa ............................................................................................................ 25
3. Objetivo ................................................................................................................. 26
3.1Objetivos específicos ........................................................................................ 27
4. Material e Métodos ................................................................................................ 27
4.1 Coleta e manutenção dos carrapatos Rhipicephalus microplus ...................... 27
4.2 Preparação dos extratos de embriões do carrapato R. microplus ................... 27
4.3 Preparação dos padrões externos ................................................................... 28
4.4 Preparação das amostras para análise por CG-EM ........................................ 29
4.5 Análise por Cromatografia Gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-
EM) ........................................................................................................................ 30
4.6 Processamentos dos dados ............................................................................. 31
5. Resultados e Discussão ........................................................................................ 31
5.1 Análise dos padrões externos .......................................................................... 32
5.2 Análise do extrato de embriões do carrapato R. microplus e o seu perfil
químico .................................................................................................................. 33
6
5.3 Perfil quimico nos diferentes estágios embrionário do carrapato R. microplus.
............................................................................................................................... 38
5.4 Alteração no comportamento metabólico de embriões do carrapato R.
microplus. .............................................................................................................. 47
5.5 Variação metabólica dos aminoácidos glicogênicos ao longo do
desenvolvimento embrionário do carrapato R. microplus. ..................................... 52
5.6 Perfil do metabolismo de nucleosídeos ao longo do desenvolvimento
embrionário do carrapato R. microplus. ................................................................. 58
6. Conclusão ............................................................................................................. 61
7. Referências ........................................................................................................... 61
Anexo - Espectros de massa obtidos para cada uma das substâncias identificadas 70
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Reprentação esquemática do ciclo de vida do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus ............ 13
Figura 2. Diferentes estágios embrionários do carrapato R. microplus.. .............................................................. 17
Figura 3. Esquema proposto para o metabolismo de glicose durante o desenvolvimento embrionário. ............. 19
Figura 4. Correlação entre a manutenção dos níveis de glicose e a concentração de glicogênio ao longo da
embriogênese. ....................................................................................................................................................... 20
Figura 5. Correlação do fluxo da via das pentoses fosfato em relação à glicólise ao longo da embriogênese. .... 21
Figura 6.Correlação da via gliconeogênica com os níveis de glicogênio durante o desenvolvimento embrionári.22
Figura 7.Esquema da reação de derivatização da glicose ..................................................................................... 29
Figura 8. Perfil cromatográfico do Ribitol derivatizado.). ..................................................................................... 32
Figura 9. Cromatograma do extrato de ovos em diferentes dias do desenvolvimento embrionário do R.
microplus obtido por CG-EM. ................................................................................................................................ 34
Figura 10. Cromatograma representativo do extrato de embriões de décimo nono dia de desenvolvimento do R.
microplus obtido por CG/EM. ................................................................................................................................ 35
Figura 11. Correlação entre o perfil químico e os diferentes estágios embrionários do carrapato R microplus -
Gráfico de dispersão da PCA (PC1 x PC2)............................................................................................................... 40
Figura 12. Gráfico de loadings (PCA1-49,9%) da PCA. ........................................................................................... 41
Figura 13. Gráfico de loadings (PCA2-17,4%) da PCA. ........................................................................................... 42
Figura 14.Representação esquemática da lançadeira malato – aspartato. .......................................................... 46
Figura 15. Dinâmica metabólica das substâncias marcadoras da transição metabólica durante o
desenvolvimento embrionário do R microplus. ..................................................................................................... 48
Figura 16. Possíveis caminhos metabólicos do piruvato na mitocôndria. ............................................................. 50
Figura 17. Dinâmica metabólica do succinato e do aspartato ao longo do desenvolvimento embrionário do R
microplus. .............................................................................................................................................................. 51
Figura 18. Coordenação metabólica dos aminoácidos glicogênicos e cetogênicos ao longo do desenvolvimento
embrionário do R microplus. ................................................................................................................................. 53
Figura 19. Perfil da variação dos aminoácidos glicogênicos ao longo da embriogênese do R microplus ............. 55
Figura 20. Perfil da variação do aminoácido alanina.. .......................................................................................... 56
Figura 21. Coordenação mtabólica dos nucleosídeos e da ribose ao longo da embriogênese do carrapato R.
microplus ............................................................................................................................................................... 59
8
LISTA DE ABREVIATURAS
CG-EM – cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
DAO- dia após a oviposição
DNA – ácido desoxirribonucleico
G6PDH – glicose 6-fosfato desidrogenase
HK – hexoquinase
PCA – análise dos componentes principais
PEP - fosfoenolpiruvato
PEPCK – fosforenolpiruvato carboxiquinase
PK – piruvato quinase
tR – tempo de retenção
9
RESUMO
O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasita que causa
grandes prejuízos aos hospedeiros bovinos, afetando na produção de leite, na
produção de carne, na depreciação do couro e na transmissão de patógenos. Sendo
assim, um maior entendimento dos processos metabólicos ao longo do seu
desenvolvimento, pode contribuir no entendimento da fisiologia e na busca por
novas estratégias para o controle deste organismo. Recentes trabalhos descrevem a
existência de um perfil metabólico caracterizado por importantes mudanças
relacionadas às fontes energéticas, tais como a glicose, durante o seu
desenvolvimento. Além disso, sugerimos que o embrião passa por uma transição
metabólica em um momento específico da sua embriogênese. Sendo assim, o
objetivo deste trabalho é entender a dinâmica metabólica resultante do metabolismo
de glicose durante a embriogênese do carrapato Rhipicephalus microplus, utilizando
a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), que é uma
técnica altamente seletiva e sensível em separar, detectar e identificar metabólitos.
Dentro da nossa análise, aminoácidos glicogênicos e intermediários do ciclo de
Krebs e da gliconeogênese puderam ser detectados e identificados. De acordo com
as variações desses metabólitos identificados, podemos reforçar a existência de um
controle metabólico em um momento chave da embriogênese do Rhipicephalus
microplus. Nossos dados corroboram com a hipótese de que, em determinado
período, o embrião assume seu metabolismo e passa a controlá-lo conforme suas
necessidades energéticas. Além disso, esse controle metabólico está coordenado
com os eventos morfológicos do seu desenvolvimento, onde a via gliconeogênica
pode ter uma participação crucial.
Palavras Chaves: Rhipicephalus microplus, Embriogênese, Perfil Metabólico, CG-EM
10
ABSTRACT
Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick it’s an ectoparasite that causes great
damage bovine hosts, affecting milk production, meat production, leather
depreciation and transmission of pathogens. Thus, a greater understanding of the
metabolic processes throughout it’s development, can contribute in the
understanding of the physiology and the search for strategies of the control this
organism. Recent studies describe the existence of a metabolic profile characterized
by important changes related to energy sources, such as glucose, during it’s
development. In addition, we suggest that the embryo undergoes a metabolic
transition at a specific time of its embryogenesis. Therefore, the propouse of this
work is to understand the metabolic dynamics resulting from glucose metabolism
during the embryogenesis of the Rhipicephalus microplus tick, using gas
chromatography coupled mass spectrometry (GC-MS), which is a highly selective
and sensitive technique in separating, Detecting and identify metabolites. Within our
analysis, glycogenic amino acids and Krebs cycle intermediates and
gluconeogenesis could be detected and identified. According to the variations of
these identified metabolites, we can reinforce the existence of a metabolic control at
a key moment of Rhipicephalus microplus embryogenesis. Our data corroborate the
hypothesis that, in a certain period, the embryo assumes its metabolism and starts to
control it according to its energetic needs. In addition, this metabolic control is
coordinated with the morphological events of its development, where the
gluconeogenic pathway may play a crucial role.
Key Words: Rhipicephalus microplus, Embryogenesis, Metabolic Profile, CG-MS
11
1. INTRODUÇÃO
1.1 Artrópodes: os carrapatos
Os carrapatos são artrópodes ectoparasitas hematófagos subdivididos em
duas grandes famílias: a Argasidae (carrapatos moles) e a Ixodidae (carrapatos
duros) (SONENSHINE; KOCAN; DE LA FUENTE, 2006). Eles são encontrados em
quase todas as regiões do mundo, com predominância em áreas tropicais e
subtropicais, abrangendo regiões com produção de gado de corte e leiteiro na
América, África, Ásia e Austrália(JOHNSTON; KEMP; PEARSON, 1986).
Os carrapatos da família Argasidae e alimentam-se de sangue dos seus
hospedeiros vertebrados, repetidas vezes, abandonando-os em seguida
(SONENSHINE; ROE, 2014). São organismos ovíparos e as fêmeas efetuam várias
posturas de ovos, alternando com a alimentação sanguínea. Cada postura não
ultrapassa 150 ovos, sendo um número pequeno quando comparado a postura dos
carrapatos da família Ixodidae que chega a atingir de 3000 – 4000 ovos. A
alimentação dos carrapatos da família Ixodidae é prolongada, onde é ingerindo
grandes quantidades de sangue do seu hospedeiro vertebrado. Essa grande
ingestão de sangue pode aumentar em até 100 vezes a massa corporal inicial
desses carrapatos (SONENSHINE; ROE, 2014), e é de extrema importância para a
formação de novos indivíduos, pois grande parte do sangue é metabolizada para
produção e armazenamento de reservas energéticas nos ovos. Esses ovos irão
apresentar uma cor amarronzada que é devido à presença de vitelina, que em
carrapatos é classicamente descrita como uma heme-proteína (BOCTOR; KAMEL,
1976; JAMES; OLIVER, 1997; ROSELL; COONS, 1991).
Os carrapatos constituem um dos principais grupos de vetores de doenças
infecciosas, sendo mais dinâmicos que os mosquitos, devido ao fato de poder
transmitir uma maior quantidade de organismos patogênicos tais como vírus, fungos,
bactérias e protozoários durante o processo de alimentação (SONENSHINE; ROE,
2014). Possuem a capacidade de infestar vertebrados terrestres, tais como:
mamíferos, pássaros, répteis e até anfíbios, além de serem capazes de transmitir
12
várias doenças também aos seres humanos (SONENSHINE; KOCAN; DE LA
FUENTE, 2006).
1.2 O Carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus
O Rhipicephalus microplus (R. microplus) é uma espécie popularmente
conhecida como carrapato do boi e é classificadano filo Arthropoda, classe
Arachnida, ordem Acarina e família Ixodidae, sendo o gênero Rhipicephalus
(FLECHTMANN, 1985). Esses organismos são caracterizados por apresentarem um
escudo protetor endurecido, característica comum nos Ixodídeos. As ninfas e os
adultos apresentam um aparelho bucal ou capitulum proeminente que se projeta
para frente do corpo do animal para a alimentação sanguínea, em um único
ingurgitamento das fêmeas. Após essa alimentação, as fêmeas se preparam para o
período de postura de um grande número de ovos (FLECHTMANN, 1985).
Em seu ciclo de vida, composto por duas etapas, o carrapato R. microplus se
alimenta de sangue em apenas um hospedeiro para se tornar adulto e, portanto, é
classificado como um parasita monoxeno (SONENSHINE; ROE, 2014). A primeira
etapa é parasitária e dura aproximadamente 21 dias, iniciando com a fase larval,
passando por estágios de metalarva, ninfa e metaninfa, antes de ocorrer o
dimorfismo sexual, que originará o neandro e posteriormente gonandro (macho) e
neógina, paternógena e teleógina (fêmea).A segunda etapa é a fase de vida livre
que ocorre no solo, podendo durar de dois a três meses, dependendo principalmente
das condições climáticas existentes e da presença de hospedeiros (Figura1)
(GONZALES, 1975).
13
Na fase parasitária, o carrapato apresenta três variações morfológicas: larva,
ninfa e adulto, a larva apresenta três pares de patas e é muito ativa para que possa
encontrar o hospedeiro para nele se fixar e sobreviver. Fixa-se em locais específicos
do hospedeiro utilizando algumas importantes estruturas, como as quelíceras, as
quais seccionam a pele para a introdução do hipostômio, órgão responsável pela
fixação da larva na pele do hospedeiro (GONZALES, 1975).
Após a fixação, a larva alimenta-se e inicia o processo de desenvolvimento e
crescimento tegumentário. Em seguida, passa por um período de inércia entre o
quarto e quinto dia e atinge a fase de metalarva. Em torno do sexto dia, adquire uma
nova estrutura, outro tegumento, mais um par de patas e uma fileira de dentição do
hipostômio entre outras alterações, para em seguida entrar na fase de ninfa. Esta
fase dura em média de dois a quatro dias. Ao continuar seu desenvolvimento, uma
nova alteração no exoesqueleto se processa, havendo mais um período de
inatividade, denominado de metaninfa, para que ao final do processo, em torno do
décimo dia, surja o indivíduo adulto (GONZALES, 1975).
Ao atingir a fase adulta, inicia-se o processo de diferenciação entre machos e
fêmeas, sendo que em torno do décimo sétimo dia os machos já estão aptos à
cópula. As fêmeas nas últimas horas próximas ao ingurgitamento completo sua
alimentação intensifica-se, a ponto de apresentarem um tamanho cerca de 10 vezes
superior ao tamanho dos machos (GONZALES, 1975).
A fase não parasitária compreende os estágios de fêmea adulta (teleógina),
ovo e larva infestante. A fêmea adulta fecundada e ingurgitada, ao desprender-se do
bovino procura um local no solo para efetuar a postura. Após a queda no solo, em
torno de 3 dias, inicia-se a postura dos ovos. Estes ovos podem durar até 60 dias no
meio ambiente em condições adequadas de temperatura (26-27 ºC) e humidade
(~80 %). Posteriormente à postura, a teleógina, que apresenta uma coloração mais
amarelada, chega à morte. Os ovos podem iniciar a eclosão a partir da terceira
semana, após o início da postura (GONZALES, 1975).
Figura 1. Reprentação esquemática do ciclo de vida do carrapato Rhipicephalus (Boophilus)
microplus. Retirado de (GONZALES, 1975)
14
As larvas necessitam de um período de maturação médio de uma semana
para estarem aptas a fixarem-se no hospedeiro e continuarem o desenvolvimento
(GONZALES, 1975). No meio ambiente, este processo pode ser longo, sendo uma
forma estratégica de sobrevivência do parasita frente às adversidades climáticas.
Após esse período, deslocam-se às extremidades da vegetação para alcançarem
mais facilmente o bovino. Nessa fase de larva infestante, elas podem sobreviver por
até 36 semanas (GONZALES, 1975).
1.3 Importância econômica e estratégias para o controle do Carrapato
Rhipicephalus microplus
O R. microplus é o principal ectoparasita bovino de maior importância
econômica e médico-veterinária do hemisfério sul, causando prejuízos econômicos
mundiais devido as perdas na produção de leite e carne (JOHNSTON; KEMP;
PEARSON, 1986; MENDES et al., 2011; SUTHERST et al., 1983), depreciação no
valor do couro do gado por danos causados por reações inflamatórias nos locais de
fixação do carrapato, na transmissão de uma grande variedade de organismos
patogênicos (GONÇALVES; PASSOS; RIBEIRO, 1999; MCCOSKER, 1981;
SONENSHINE; KOCAN; DE LA FUENTE, 2006; SONENSHINE; ROE, 2014;
WILLADSEN, 2006) e custos relacionados à aquisição, manejo e equipamentos
para aplicação dos carrapaticidas nos rebanhos como forma de combate desses
parasitas (CORDOVES CESPEDES, 1997).
O método mais eficaz de controle para populações de carrapato é o uso de
acaricidas, que demanda um alto custo com a aquisição dos produtos químicos,
instalações adequadas e a mão-de-obra para a aplicação dos produtos (MERINO et
al., 2013). Porém, a utilização excessiva deste método químico de controle vem
tornando-se inviável pela seleção de carrapatos resistentes aos pesticidas, além do
crescente aumento dos resíduos químicos encontrados em produtos de origem
animal como a carne e o leite. Outro ponto negativo é a poluição dos solos e dos
rios, que pode gerar a necessidade do uso de técnicas de biorremediação que eleva
ainda mais os custos para os criadores de gado (GHOSH; AZHAHIANAMBI; YADAV,
2007; PARIZI et al., 2012; RODRIGUEZ-VIVAS et al., 2011). Diante desses fatores,
torna-se cada vez mais necessária a criação de novas estratégias para o controle
15
adequado dos carrapatos de forma mais eficiente, econômica e de menor impacto
ambiental.
Podemos encontrar alguns trabalhos que tem como objetivo a criação de métodos
alternativos aos métodos químicos utilizados (acaricidas) para o controle do R.
microplus (DA SILVA VAZ et al., 1998; JOHNSTON; KEMP; PEARSON, 1986;
MERINO et al., 2013; PARIZI et al., 2012). Dentre essas alternativas encontra-se o
controle biológico que utiliza microorganismos como a bactéria Bacillus thuringiensis
(FERNÁNDEZ-RUVALCABA et al., 2010; ZHIOUA et al., 1999), e a utilização de
fungos entomopatogênicos como Metarhizium anisopliae (BASSO et al., 2005;
GARCIA et el., 2008). Além disso, outra abordagem utilizada é a identificação de
genes do hospedeiro envolvidos na resistência aos carrapatos, tendo em vista o
melhoramento genético do bovino (GASPARIN et al., 2007). No entanto, a
alternativa que mais se destaca é o desenvolvimento de vacinas para o hospedeiro
(DA SILVA VAZ et al., 1998; PARIZI et al., 2012), sendo considerado o melhor
custo/benefício, oferecendo uma maior segurança ao aplicador quanto para o
consumidor, sem nenhuma contaminação ambiental e nem dos produtos, como a
carne e o leite (DA SILVA VAZ et al., 1998). Entretanto, elas tendem ser espécie-
específicas, o que estabelece um desafio para o desenvolvimento de uma vacina
que proteja contra várias espécies de carrapato e que seja comercialmente viável
(GUERRERO; MILLER; PÉREZ DE LEÓN, 2012). A vacina comercial produzida com
base em uma proteína recombinante, bm86, fornece proteção contra Rhipicephalus
microplus e algumas espécies relacionadas. No entanto, esta proteção varia muito
dependendo da cepa de R. microplus e do estado nutricional do hospedeiro bovino.
Desta forma, a busca por novos alvos de estudo e controle torna-se necessária.
O estudo da embriogênese, por sua vez, pode desempenhar um papel
importante na busca de novos alvos de estudo para o controle populacional dessa
espécie (DA SILVA VAZ et al., 1998; FONSECA, 2012). O nosso grupo de pesquisa
tem dedicado os últimos anos para identificar alvos moleculares, particularmente
durante a fase embrionária do carrapato R. microplus, a fim de compreender
aspectos importantes relacionados ao metabolismo energético e que possam
interferir na proliferação de novos indivíduos.
16
1.4 Desenvolvimento embrionário do carrapato R. microplus
Em condições laboratoriais, a embriogênese do carrapato R. microplus dura
cerca de 21 dias, e compreende um período que inicia com a fecundação do zigoto e
termina na eclosão do ovo (FONSECA, 2012).Durante esta fase, o carrapato pode
estar mais vulnerável a mudanças ambientais, pois é a única etapa em que se
encontra imóvel (SONENSHINE; ROE, 2014). Portanto, a embriogênese é um dos
aspectos fisiológicos mais importantes no controle populacional de organismos
ovíparos, pois nesta fase o ovo não consegue se dispersar (FONSECA, 2012).
Nos ovíparos, a embriogênese é caracterizada pela mobilização inicial de
metabólitos de origem materna ao ovo, assim o embrião consegue desenvolver
novos tecidos e órgãos na ausência de nutrientes exógenos (VLECK; HOYT,
1991).Desta forma, esse processo em artrópodes como o carrapato R. microplus
começa com a mobilização principalmente de grânulos de vitelo aos ovócitos
(CAMPOS et al., 2006; FAGOTTO, 1990; SAPPINGTON; RAIKHEL, 1998). O vitelo
é um conjunto de proteínas (como a vitelina) e lipídeos, que nutrem o embrião em
desenvolvimento (SANTOS, J. E; GODINHO, 1994; SAPPINGTON; RAIKHEL, 1998)
e mais especificamente em embriões do R. microplus as proteínas são os
constituintes mais abundantes deste vitelo (LOGULLO et al., 2002). Durante a
maturação dos ovócitos, ocorre uma fase prévia à oviposição caracterizada por um
rápido aumento no tamanho do ovário, onde os ovócitos apresentam rápido
crescimento, acúmulo de RNAs maternos, carboidratos, lipídios e proteínas que irão
satisfazer as necessidades regulatórias e metabólicas do embrião nas fases iniciais
do desenvolvimento (CAMPOS et al., 2006; CHERRY, 1973; CHIPPENDALE, G. M.;
ROCKSTEIN, 1978).
Alguns estudos têm ajudado a compreender o processo da embriogênese do
carrapato R. microplus depois da oviposição a nível bioquímico e celular (CAMPOS
et al., 2006; MORAES et al., 2007; SANTOS et al., 2013; SEIXAS et al., 2012).
Seixas (2012) demonstrou alguns aspectos gerais da morfologia em diferentes
momentos embrionários do carrapato R. microplus, demonstrando que a
embriogênese começa com uma grande divisão de núcleos do zigoto, seguida por
intensa multiplicação celular até a formação do blastoderma sincicial (Figura 2A, B e
C). Logo após, começa a migração destas células para a periferia do ovo e no quinto
dia após a oviposição (DAO) começa o estágio de blastoderma celular (Figura 2D).
17
No sétimo dia após a oviposição, começa o estágio de fechamento dorsal (Figura
2E), e no décimo segundo dia após a oviposição (Figura 2F) os embriões atingem o
estágio de organogênese tardia (SEIXAS et al., 2012).
Figura 2. Diferentes estágios embrionários do carrapato R. microplus. Ovos permeabilizados em
diferentes dias após a oviposição foram submetidos a microscopia confocal de varredura a laser. (A)
1º dia após a oviposição (DAO). (B) 3º DAO. (C) 4 º DAO - estágio sincicial. (D) 5º DAO - estágio de
blastoderma celular. (E) 7º DAO - estágio de fechamento dorsal. (F) 12º DAO - fase tardia da
embriogênese (SEIXAS et al., 2012).
Após estabelecer o protocolo de permeabilização dos ovos do R. microplus,
Santos e colaboradores (2013), de uma forma mais detalhada caracterizaram a
embriogênese do carrapato. Por meio de marcação dos núcleos celulares do ovo
com 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI), dividiu a embriogênese do R. microplus em 14
estágios morfológicos e seus resultados estão de acordo com os dados publicados
por Seixas (2012). Já Campos e colaboradores (2006) e Moraes e colaboradores
(2007), descreveram a dinâmica de utilização do aporte energético de origem
materna e o uso de importantes vias metabólicas responsáveis pela produção de
energia durante o desenvolvimento embrionário do R. microplus.
1.5 Perfil metabólico durante a embriogênese do carrapato R.microplus
18
Moraes e colaboradores (2007) demonstraram um padrão bioquímico durante
o desenvolvimento embrionário do carrapato R. microplus. Por meio de análises
bioquímicas, a embriogênese deste artrópode foi dividida metabolicamente em duas
fases, com base no balanço de utilização da glicose pelo embrião. A primeira fase é
caracterizada pelo consumo acentuado de glicogênio, e compreende do 1º ao 5º dia
do desenvolvimento que abrange a oviposição até a formação do blastoderma
celular (SANTOS et al., 2013; SEIXAS et al., 2012). A segunda fase compreende do
blastoderma celular até a eclosão das larvas, sendo caracterizada por intensa
gliconeogênese. A figura 3 indica a utilização das vias metabólicas relacionadas ao
metabolismo de glicose durante o desenvolvimento do carrapato, as setas
vermelhas representam o principal fluxo metabólico durante a primeira fase do
desenvolvimento e as setas azuis indicam a preferência metabólica na segunda fase
do desenvolvimento.
19
Figura 3. Esquema proposto para o metabolismo de glicose durante o desenvolvimento
embrionário. O esquema baseia-se em atividades enzimáticas e na quantificação de glicogênio
durante a formação embrionária. HK - Hexoquinase, G6PDH -Glucose 6-fosfato desidrogenase, PK-
Piruvato Quinase e PEPCK – fosfoenolpiruvato carboxiquinase. A seta vermelha indica o fluxo
metabólico durante a fase inicial do desenvolvimento. A seta azul indica o fluxo metabólico durante a
fase final do desenvolvimento. Adaptado de (MORAES et al., 2007).
Importantes mudanças metabólicas acontecem durante os primeiros seis dias
do desenvolvimento (primeira fase), entre elas a diminuição acentuada do conteúdo
de lipídeos totais (CAMPOS et al., 2006) e a mobilização do conteúdo de glicogênio
(MORAES et al., 2007). Esses dados (Figura 4) sugerem que as reservas de
glicogênio são preferencialmente mobilizadas para apoiar o processo de consumo
intensivo de energia nesta fase e para a produção de biomoléculas necessárias ao
crescimento. A figura 4 mostra a correlação dos níveis de glicose e glicogênio ao
20
longo do desenvolvimento embrionário, o que ajudou na elaboração do esquema
publicado por Moraes (2007) e que estão representados na figura 3.
Figura 4. Correlação entre a manutenção dos níveis de glicose e a concentração de glicogênio
ao longo da embriogênese. (A) O conteúdo de glicose. (B) O conteúdo de glicogênio. Foram
medidos em homogenatos de ovos em diferentes dias de desenvolvimento. Adaptado de (MORAES
et al., 2007).
O aumento da atividade enzimática da glicose 6 fosfato desidrogenase
(G6PDH) (Figura 5B), enzima que catalisa a reação da glicose 6-P em6-P-
gliconolactona, durante a fase inicial (3º ao 6º dia após oviposição) do
desenvolvimento embrionário do carrapato, sugere que preferencialmente a glicose-
6-fosfato está sendo desviada para a via das pentoses-fosfato, que é uma via
alternativa para a oxidação da glicose e que tem como produto final a ribose, além
de produzir NADPH (nicotinamida adenina difosfato). Esta conclusão metabólica
pode ser apoiada nos eventos morfológicos que ocorrem nessa fase, pois durante a
fase inicial da embriogênese ocorre intensa multiplicação celular e a formação de
núcleos, onde é necessário o fornecimento da ribose-5-fosfato para a síntese de
nucleotídeos, e a disponibilidade de NADPH um redutor crucial nos processos
anabólicos, como por exemplo, na biossíntese de fosfolipídios necessários à
celularização (MORAES et al., 2007).
Além do aumento da atividade enzimática da G6PDH (Figura 5A) e do
declínio na concentração de glicogênio (Figura 4B) do primeiro ao sétimo dia do
desenvolvimento, pode-se observar um decaimento da atividade enzimática da
hexoquinase (HK), a primeira enzima da via glicolítica, e um aumento progressivo da
atividade enzimática da piruvato kinase (PK), última enzima da via glicolítica
(MORAES et al., 2007) (Figura 5B) mostrando que as atividades destas enzimas
21
coincidem dentro da embriogênese do carrapato R. microplus. Esses dados
corroboram com a ideia de que a utilização do glicogênio estocado durante o
período da ovogênese é então mobilizado para a via das pentoses-fosfato e para a
via glicolítica apoiando energeticamente o desenvolvimento nessa fase inicial
(MORAES et al., 2007).
Figura 5. Correlação do fluxo da via das pentoses fosfato em relação à glicólise ao longo da
embriogênese. (A) A atividade específica da enzima G6PDH. (B) A atividade específica das enzimas
PK (▵ ) e HK (▾ ). Adaptado de (MORAES et al., 2007).
Durante a fase inicial do desenvolvimento do R microplus, Campos e
colaboradores (2006) observaram um aumento abrupto no consumo de oxigênio e
entre o 7º e o 9º dia após a oviposição, foi observado uma consequente redução no
peso seco e um aumento no teor de água dos embriões, sugerindo assim, um
aumento no processo de respiração celular. Além disso, uma grande redução no
conteúdo de carboidratos ocorreu nessa fase, o que pode ser correlacionado com a
alta taxa metabólica durante este período de celularização, formação da banda
germinal e segmentação deste embrião (MORAES et al., 2007).
O aumento na concentração de glicogênio pode ser observado a partir do 9º
dia após a oviposição (segunda fase), onde é observado o aumento da atividade
enzimática da Hexoquinase e Piruvatokinase, as quais são a primeira e a última
enzima da glicólise, respectivamente (Figura 5 B). Além disso, há um aumento na
atividade da enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) (figura 6 A) que é a
principal enzima reguladora da via gliconeogênica. A gliconeogênese é uma via
capaz de sintetizar glicose a partir de substratos não glicídicos, tais como prolina e
aspartato, os quais são aminoácidos classificados como aminoácidos glicogênicos
(BERG; TYMOCZKO, 2002).
22
Junto ao aumento da atividade enzimática da PEPCK, pode ser observado
um acúmulo de glicose, na forma de glicogênio, que poderá ser utilizado na fase
final da embriogênese (figura 6 A e B). Sendo assim, Moraes e colaboradores
sugerem que neste estágio embrionário a via gliconeogênica é preferencialmente
utilizada para a resíntese de glicose, que poderá apoiar energeticamente o embrião
em desenvolvimento até a eclosão da larva. Então podemos dizer que o embrião
passa de um momento metabólico onde é priorizado o consumo da glicose fornecida
pela mãe na oogênese, e passa a assumir o controle do seu metabolismo para
manter o equilíbrio energético e assim, garantir o sucesso do seu desenvolvimento
resintetizando a glicose. Desta forma, podemos sugerir que existe um momento que
chamamos de transição metabólica, o qual este embrião utiliza do seu metabolismo
para sintetizar os metabólitos necessários ao seu desenvolvimento.
Figura 6.Correlação da via gliconeogênica com os níveis de glicogênio durante o
desenvolvimento embrionário. (A) Atividade específica da enzima PEPCK. (B) O conteúdo de
glicogênio, adaptado de (MORAES et al., 2007).
Diante desse perfil metabólico, o metabolismo de carboidratos mostra-se
essencial para o desenvolvimento embrionário. Desta forma, a identificação e a
quantificação de metabólitos oriundos do metabolismo de glicose, formados durante
a embriogênese, podem auxiliar na identificação dos momentos cruciais do controle
metabólico e que pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias racionais de
controle do carrapato.
23
1.6 Plataformas “ômicas” e a metabolômica
As plataformas tecnológicas conhecidas como “ômicas” apresentam como objetivo a
identificação do maior número possível de biomoléculas pertencentes a um
determinado organismo ou parte do mesmo (ROBERTSON, 2005; ROCHA et al.,
2006). Dentre essas moléculas figuram o DNA (Ácidos desoxirribonucleicos), que
são o objeto de estudo na genômica, o RNA (Ácidos ribonucleicos), que são o objeto
de estudo na transcriptômica e as proteínas que são estudadas naproteômica. Há
ainda os estudos de prospecção de metabólitos, que estabelecem o perfil químico,
de um organismo, denominados metabolômica. O conjunto destas abordagens
proporcionam grandes progressos na descoberta de mecanismos intracelulares em
diferentes níveis moleculares, os quais podem ser correlacionados com os eventos
fisiológicos dos mais diferentes modelos de estudo (DYAR; ECKEL-MAHAN, 2017;
PETRIZ; FRANCO, 2017). Um exemplo disso é a proteômica, que pode fornecer
informações sobre pontos chave de qualquer processo bioquímico num organismo
(FIEHN et al., 2000), pois gera informações de proteínas expressas em determinado
tempo em um sistema biológico (GALDOS-RIVEROS et al., 2010; SALVATO et al.,
2010).
No entanto, a quantificação de proteínas não é suficiente para entender o
fluxo metabólico de um modelo experimental, pois as células possuem mecanismos
refinados para o controle da atividade das enzimas como controle da expressão
gênica e modificações pós traducionais (LEHNINGER; NELSON; COX, 2009;
NELSON et al., 2014). Um dos mecanismos de regulação pós traducional é
realizado por proteínas quinases, as quais são enzimas que catalisam a adição de
grupamentos fosfato aos seus substratos em resíduos de aminoácidos específicos.
Um exemplo é a Glicogênio Sintase Quinase-3 (GSK3), que é uma proteína quinase
com diversos substratos. Um dos substratos da GSK3 é a enzima Glicogênio Sintase
(GS), que é responsável pela síntese de glicogênio intracelular. Ao ser fosforilada no
aminoácido serina na posição 14 pela GSK3, a GS tem sua atividade inibida e,
portanto, podemos dizer que ela pode ser regulada por um mecanismo pós
traducional (DA ROCHA FERNANDES et al., 2014; DYAR; ECKEL-MAHAN, 2017;
LOGULLO et al., 2002; WARBURG; WIND; NEGELEIN, 1927). Sendo assim, a
metabolômica pode contribuir no estudo dos processos bioquímicos, pois dentro
24
desta abordagem é realizada a quantificação dos produtos das reações catalisadas
pelas enzimas e é mais confiável para inferir a respeito do balanço de utilização de
recursos energéticos. Esses recursos abrangem diferentes classes de substâncias,
que podem ser monitoradas simultaneamente, tais como açúcares, aminoácidos e
ácidos graxos que podem desempenhar importantes funções, como o
armazenamento de energia, por exemplo. Além disso, a metabolômica pode
complementar os dados obtidos por outras ferramentas, como a proteômica, por
exemplo, (SCHRIPSEMA, 2010) tendo como objetivo final uma análise ampla e
quantitativa dos metabólitos em um sistema biológico. Desta forma, aproximando a
variação dos metabólitos com a fisiologia do organismo.
O estudo do perfil metabólico é uma das abordagens de análise da
metabolômica e visa à detecção simultânea da totalidade ou de um conjunto de
metabólitos de uma amostra. Para esta finalidade, algumas técnicas analíticas
podem ser usadas como a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector por
Ultravioleta (CLAE-UV), a Eletroforese Capilar acoplada à Espectrometria de Massas
(EC-EM), a Cromatografia em fase Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
(CG-EM) (SHULAEV, 2006; SUMNER; MENDES; DIXON, 2003). Dentre estas
técnicas a Cromatografia em fase Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
(CG-EM) é uma das técnicas utilizadas para análises de perfis metabólicos ( ARETZ
2016; ROESSNER et al., 2000; TENNESSEN 2014). Com esta técnica é possível
estabelecer os perfis de centenas de substâncias que pertencem a diferentes
classes químicas, incluindo açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, ácidos graxos
e outras.
As principais vantagens do uso do CG-EM para metabolômica é a
disponibilidade de bibliotecas espectrais acessíveis ( ARETZ 2016; HALKET et al.,
2005; LUBES et al., 2017) e a alta seletividade e sensibilidade em separar, detectar
e identificar as substâncias, possibilitando assim, a análise de metabólitos em baixa
concentração (CHINCHOLE et al., 2012; GILBERT-LÓPEZ; GARCÍA-REYES;
MOLINA-DÍAZ, 2012; NAKASHIMA, 2005; SILVA et al., 2012; XU et al., 2012).
Diante disso, a utilização do CG-EM se apresenta como uma das técnicas mais
recomendadas para a análise quantitativa dos mais variados metabólitos.
Encontramos diferentes trabalhos que tem usado o CG-EM para uma análise
metabolômica, tendo como foco o perfil químico nas mais variadas amostras
biológicas. Por exemplo, Ye e colaboradores buscaram entender os disturbios
25
metabólicos e identificar potenciais biomarcadores associados à toxicidade induzida
por tetrabromobisfenol (H-BPA) em embriões do peixe-zebra (Danio rerio) (YE et al.,
2016). Um outro tabalho publicado por Onjiko e colaboradores (2014), que por meio
da análise do perfil quimico, elucidaram a dinamica metabólica em células
individuais de embriões da rã-de-unhas-africana (Xenopus laevis) visando a
compreensão da fisiologia que regula a embriogênese deste organismo (ONJIKO;
MOODY; NEMES, 2015).
Outros estudos com foco em artrópodes também adotaram a metabolômica,
visando o estudo do perfil quimico das amostras utilizando o CG-EM. Um destes
estudos foi publicado por Hou e colaboradores (2015), que utilizaram a
transcriptômica e o perfil metabólico para entender o envolvimento do hormônio
juvenil (JH) e o hormônio 20-hidroxiecdisona (20E) na coordenação do metabolismo
de carboidrato em fêmeas do mosquido Aedes aegypti (HOU et al., 2015). Um
dostrabalhos que se aproxima do que pretendemos neste estudo e o tamamos como
referência, foi publicado por An (2014) que fez uma análise metabolômica durante o
desenvolvimento embrionário da mosca da fruta (Drosophila melanogaster) (AN et
al., 2014).
Para uma Compreensão mais profunda dos processos metabólicos durante o
desenvolvimento embrionário do carrapato R. microplus, pretende-se utilizar uma
abordagem metabolômica com foco no perfil quimico, e desta forma incorporar
novos dados acerca do metabolismo embrionário correlacionando aos diferentes
momentos embrionários do R. microplus. Este estudo tem um grande potencial para
elevar a compreensão do metabolismo que pode regular a embriogênese.
2. Justificativa
O carrapato R. microplus, é um dos principais transmissores de patógenos
para os bovinos, causando perda econômica para os criadores de gado. Atualmente,
26
o seu controle dependem da aplicação tópica de acaricidas químicos, o que implica
na seleção de organismos resistentes, além da contaminação do meio ambiente e
dos produtos provindos do gado, gerando assim, uma crescente preocupação com a
saúde pública. Além disso, o desenvolvimento de vacinas para o hospedeiro tende à
ser espécie-específicas, dificultando a proteção contra diferentes espécies de
carrapato. Desta forma, entende-se que são necessárias estratégias alternativas
para o controle dos carrapatos, e para isso é necessária uma maior compreensão
sobre a biologia desses organismos.
Além de reforçar as observações prévias quanto ao metabolismo durante a
embriogênese deste carrapato, o presente trabalho incorpora novos dados
relacionados ao momento de transição metabólica durante o desenvolvimento do R.
microplus. Desta forma, este trabalho pode abrir novas perspectivas de estudo sobre
o metabolismo energético que não haviam sido observadas anteriormente.
Ademais, a correlação dos resultados apresentados neste documento com os
resultados prévios das análises bioquímicas pode nos esclarecer a dinâmica do
metabolismo de glicose durante o desenvolvimento embrionário. Fornecendo assim,
uma compreensão mais detalhada do metabolismo energético no desenvolvimento
embrionário do carrapato R. microplus, que podem ajudar na elaboração de novas
estratégias para o controle da sua proliferação.
3. Objetivo
Elucidar a dinâmica dos metabólitos envolvidos no metabolismo de glicose
durante a embriogênese do carrapato Rhipicephalus microplus, utilizando
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.
27
3.1Objetivos específicos
Estabelecer o método de análise para os embriões do carrapato R. microplus
por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas;
Analisar os extratos dos ovos do carrapato Rhipicephalus microplus obtidos
em cada dia do seu desenvolvimento;
Avaliar a dinâmica dos metabólitos relacionados aos estágios embrionários do
carrapato Rhipicephalus microplus.
4. Material e Métodos
4.1 Coleta e manutenção dos carrapatos Rhipicephalus microplus
Os carrapatos da espécie R. microplus foram criados em bovinos na
Faculdade de Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).
Os organismos se desenvolveram em bovinos isolados em estábulos, livres de
qualquer contato com o campo. Três gerações de fêmeas ingurgitadas foram
coletadas de forma independente com auxílio de peneiras e foram mantidas em uma
estufa com temperatura de 28ºC e umidade de 80% para postura dos ovos. Durante
o período de oviposição, que ocorreu em momentos diferentes para cada geração
de fêmeas, cerca de 2g de massa de ovos de um único dia de postura foram
coletados e mantidos em uma estufa com temperatura de 28ºC e umidade de 80%.
Ao longo do período do desenvolvimento embrionário, cerca de 80mg de ovos foram
coletados diariamente e para que o desenvolvimento embrionário fosse
interrompido, esses 80mg de ovos foram banhados em nitrogênio líquido e
estocados no freezer -80ºC. Esse procedimento foi repetido uma vez por dia durante
21 dias seguidos após a postura dos diferentes conjuntos de fêmeas. Desta forma
obtivemos três amostras biológicas independentes para cada dia do
desenvolvimento embrionário do R. microplus.
4.2 Preparação dos extratos de embriões do carrapato R. microplus
28
O preparo dos extratos de embriões do R. microplus foi realizado com base
nos métodos estabelecidos por An e Colaboradores (2014). Inicialmente 80 mg de
ovos em cada dia do estágio embrionário que previamente foram coletados e
estocados em um freezer com temperatura de -80°C, foram liofilizados por 48 horas.
O preparo de cada amostra foi realizado macerando 5 mg dos ovos previamente
liofilizados em frascos de vidro com o auxílio de um micropistilo. Em seguida, foi
adicionado 1ml da mistura de água, clorofórmio e metanol nas proporções 1:1:2.5,
respectivamente. Logo após, 60µl de ribitol (Sigma Aldrich), um álcool derivado do
açúcar D-ribose, na concentração de 0,1mg/ml foi adicionado a cada amostra como
padrão interno para a análise. Todas as amostras foram, então, centrifugadas em
um microtubo de 2 ml à 16.000 x g por 3 minutos em temperatura de 4 ºC, o
sobrenadante (900 µl) de cada amostra foi transferido para um novo microtubo de
2ml contendo 400 µl de água destilada. Cada microtubo foi centrifugado novamente
sob as mesmas condições anteriores e 400 µl da fase polar da amostra foi
transferido para um novo frasco e evaporado a temperatura ambiente. Todas as
amostras foram congeladas e liofilizadas para garantir a retirada completa de
resíduos de água, antes do procedimento de derivatização.
Com o objetivo de determinar o método de análise cromatográfica, a primeira
análise dos extratos de embriões do R. microplus foi realizada com uma mistura de
ovos em diferentes dias do desenvolvimento. O preparo do extrato da mistura de
embriões foi realizado como descrito acima.
4.3 Preparação dos padrões externos
O padrão externo é analisado separadamente da amostra e a identificação da
substância desejada é feita através da comparação do tempo de retenção e de seu
espectro de massas que contém seu perfil de fragmentação. Portanto, para
obtermos um conhecimento prévio do comportamento cromatográfico do padrão
interno da nossa análise, preparamos uma solução aquosa do ribitol (Sigma Aldrich)
na concentração de 2 µg/ml. Essa solução aquosa foi então congelada para o
procedimento de liofilização.
Além disso, realizamos a preparação de padrões comerciais não analíticos de
outras substâncias como a glicose, o piruvato e o isocitrato (Merck), malato, prolina,
29
glutamina e glutamato (Sigma Aldrich), sob as mesmas condições realizadas para o
ribitol.
4.4 Preparação das amostras para análise por CG-EM
Os extratos dos ovos que correspondem cada dia do desenvolvimento
embrionário foram derivatizados utilizando uma reação de oximação seguida por
sililação como proposto por An (2014). A derivatização altera as características
químicas das substâncias menos voláteis, tornando-as volatilizáveis e termicamente
estáveis por meio da adição de grupos funcionais, como o grupamento silil. Abaixo
segue uma representação do processo de derivatização da glicose com dois dos
seus possíveis derivados (Figura 7).
Figura 7.Esquema da reação de derivatização da glicose. O processo de metoximação permite a
exposição das hidroxilas presentes na estrutura da glicose e no passo de trimetilsilização são
adicionados grupamentos silil na posição dessas hidroxilas.
Inicialmente, todas as amostras e os padrões externos foram liofilizados para
garantir a retirada completa de resíduos de água antes do procedimento de
derivatização. Em cada amostra foi adicionado 50µL de cloridrato de metoxiamina
solubilizada em piridina (Sigma Aldrich) numa concentração de 10mg/ml. Todos os
vials foram mantidos à 37ºC durante 90 minutos sob agitação. Em seguida, para a
reação de sililação das substâncias, foram adicionados 25µl de N-metil-N-
(trimetilsilil) trifluoroacetamida (MSTFA) + 1% de TMCS (Sigma Aldrich) às amostras.
Os frascos foram novamente mantidos a 37ºC durante 30 min sob agitação em uma
30
incubadora de agitação orbital. O conteúdo foi transferido para insert de vidro e
acondicionado em viasl de 1,8ml, e em seguida foram estocados no dessecador até
o momento das análises por CG-EM.
4.5 Análise por Cromatografia Gasosa acoplada a espectrometria de massas
(CG-EM)
A primeira parte do desenvolvimento desse trabalho foi o estabelecimento dos
métodos para o preparo das amostras e as análises por CG-EM. O estabelecimento
das melhores condições cromatográficas dos extratos foi realizado adequando-se o
tipo de coluna e a programação de aquecimento do forno e tempo de análise.
As primeiras análises por CG-EM, que incluiu o extrato da mistura de
embriões em diferentes dias do desenvolvimento e o ribitol, foram realizadas em um
cromatógrafo QP2010 Plus Shimadzu com uma coluna capilar de sílica fundida do
tipo DB5, do fabricante quadrex, modelo 007-5MS (30 m, 0.25mm, 0,25 µm) com um
auto-injetor AOC-20i/s (Shimadzu), no modo ionização eletrônica (70 V). Este
cromatógrafo está localizado no Laboratório de Produtos Bioativos (LPBIO) no
Instituto Macaé de Ciência e Tecnologia (IMMT). As temperaturas do injetor da
interface CG-EM e fonte de íons foram 250 C, 200 C e 260°C, respectivamente. A
temperatura do forno foi ajustada de acordo com a seguinte programação:
temperatura inicial de 80 C por 2 minutos, com rampa de aquecimento de 15 C/min.
até 320 C, que foi mantida por 6 minutos e reduzida até a condição inicial para uma
nova injeção.
As análises subsequentes foram realizadas em um cromatógrafo do mesmo
modelo com uma coluna capilar de sílica fundida DB1 Rtx-1MS (30m, 0.25mm, 0.1
µm) equipado com um auto-injetor AOC-20i/s (Shimadzu), que está alocadono
laboratório integrado de Química (LIQ) localizado no Núcleo em Ecologia e
Desenvolvimento Sócio-Ambiental de Macaé (NUPEM). As temperaturas do injetor
da interface CG-EM e da fonte de íon foram de 250°, 290ºC e 200ºC,
respectivamente. Além disso, a temperatura do forno foi ajustada de acordo com a
seguinte programação: temperatura inicial de 70 C por 2 minutos, com duas rampas
de aquecimento uma de 15 C/min. até 200 C e a outra de 18 C/min até 290 C,
mantida por 6 minutos. Em todas as análises o gás de arraste utilizado foi o Hélio
31
(pureza de 99, 9999%) com um fluxo constante de 1,0 mL min. O volume de injeção
foi de 1µL no modo Split na razão 10:1 (V/V). Os espectros de massas foram
registrados na faixa entre 45 a 600 m/z.
4.6 Processamentos dos dados
Os dados brutos de cada cromatograma foram convertidos em texto (bloco de
notas, *. Txt) usando o pacote de software GC-MS Solution (Shimadzu). Os dados
foram importados para o Excel, onde o valor da média obtida das intensidades de
cada pico foi normalizada com base na intensidade do pico do padrão interno, o
ribitol adicionado em cada amostra. Nesta abordagem, as áreas de cada
cromatograma foram igualadas para aumentar a informação proporcional entre
picos. As tabelas de cada cromatograma gerada no Excel com os dados
normalizados foram importadas para o software Correlation Otimizeid
Warping “COW tool” (http://www2.biocentrum.dtu.dk/mycology/analysis/cow/), onde
foi realizado o alinhamento de base de cada cromatograma e a correção dos desvio
de tempo de retenção dos picos usando COW como descrito em (NIELSEN et al.,
1998). Para a execução do COW foi utilizado o cromatograma com o maior número
de picos.
O alinhamento é necessário devido a desvios mínimos de tempos de
retenção, originados de pequenas oscilações no sistema cromatográfico que
precisam ser removidos para que a análise multivariada se sustente apenas nos
tempos de retenção e intensidade relativa das bandas cromatográficas. A utilização
dos dados não alinhados implicaria, por exemplo, na utilização de mais
componentes principais do que aquelas realmente necessárias, podendolevar a
interpretações equivocadas dos resultados.
Uma matriz de dados composta dos cromatogramas totais alinhados e
normalizados foi submetida à Análise de Componentes Principais (PCA – do
inglês Principal Component Analysis). Esta matriz teve sua média centralizada antes
de executar PCA, que foi feita em linguagem R (www.r-project.org) usando o pacote
"ChemometricsWithR" (WEHRENS, 2011).
5. Resultados e Discussão
32
5.1 Análise dos padrões externos
Para testar os parâmetros cromatográficos e do espectro de massas, e
conhecer o perfil do ribitol nas análises de CG-EM, a primeira parte do trabalho
consistiu na análise dessa substância comercial utilizando as mesmas condições
cromatográficas que seriam aplicadas aos extratos. Essa análise inicial foi realizada
no cromatógrafo do Laboratório de Produtos Bioativos (LPBIO), que possui uma
colunaDB5 (007-5MS). A identificação das substâncias indicadas nos
cromatogramas foi obtida pela comparação com a biblioteca NIST (versão 2011)
contida no software do CG-EM. A biblioteca Nist contém mais de 100.000 espectros
de massas, constituindo uma ferramenta importante na comparação do perfil de
fragmentação de cada uma das substâncias que compõem as amostras.
A identificação da substância formada a partir da derivatização do ribitol foi
obtida através da comparação com o banco de dados da biblioteca NIST. A
substância Ribitol, 1,2,3,4,5-pentacis-O-(trimetilsilil) é o produto da reação de
derivatização do ribitol e apresenta um (tR) = 11,0 minutos. O eixo Y indica a
intensidade relativa e o eixo X indica o tempo de análise em minutos (Figura 8).
Figura 8. Perfil cromatográfico do Ribitol derivatizado. O pico da substância Ribitol, 1,2,3,4,5-
pentacis-O-(trimetilsilil) está indicado pela seta vermelha Análise realizada em cromatógrafo que
contém uma coluna DB5 (007-5MS).
Ao analisar um padrão comercial pela cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massas espera-se observar no cromatograma picos referentes ao
33
padrão analisado, uma vez que há um grau de pureza dessas substâncias
comerciais. O cromatograma que corresponde à nossa análise do padrão interno
apresentou picos referentes à outras substâncias, o que não interferiu na
identificação da substância alvo, o ribitol. Sabe-se que este dado obtido não é o
ideal para uma análise onde se há o interesse de uma quantificação absoluta, no
entanto dentro de uma análise para o conhecimento do perfil cromatográfico do
ribitol, este dado torna-se satisfatório pois conseguiu-se identificar o tempo de
retenção do ribitol derivatizado. Sendo assim, seu tempo de retenção pode ser
comparado com a análise dos extratos de embriões do R. microplus, e assim
identifica-lo dentre todos os picos presentes no cromatograma referente a esses
extratos.
A análise dos padrões comerciais do piruvato, isocitrato, malato, glicose,
prolina, glutamina, glutamato, não estão aqui representados, pois os picos destas
substâncias não foram identificados nos seus respectivos cromatogramas. Acredita-
se que a identificação destas substâncias não foi possível devido ao grau de
purificação das mesmas, pois entende-se que se padrão comercial não apresenta
um alto grau de pureza, sua concentração pode estar subestimada relação aos
demais componentes deste padrão. Portanto, pretende-se adquirir padrões
analíticos destas e de outras substâncias do nosso interesse, com um maior grau de
pureza e assim, estabelecer o perfil cromatográfico desses metabólitos dentro dos
parâmetros de análise abordados na metodologia.
5.2 Análise do extrato de embriões do carrapato R. microplus e o seu perfil
químico
Com o objetivo de determinar as melhores condições para o preparo dos
extratos do material biológico e obter biomassa suficiente para as primeiras análises
químicas, o extrato da mistura de embriões foi obtido e em seguida analisado por
CG-EM
Após a determinação das condições cromatográficas para análise do ribitol,
as mesmas foram utilizadas para a análise do extrato da mistura de embriões, que
foi realizada no cromatógrafo com uma coluna capilar do tipo DB5, modelo 007-
5MS. A análise do extrato e a comparação dos dados com os tempos de retenção
do ribitol (tR 11,0 min.) e com os dados de espectrometria de massas da biblioteca
34
NIST permitiram identificar a glicose, que apresentou três isômeros com tempos de
retenção diferentes (tR 12,2; 12,3 e 12,5 min.), e alguns aminoácidos envolvidos no
metabolismo energético como a prolina (tR 10,0 min.), lisina (tR 12,8 min.), aspartato
(tR 9,7 min.) e tirosina (tR 13,0 min.). Os metabólitos que possuem maior
porcentagem de área de pico no cromatograma, tais como prolina, glicose e tirosina,
estão indicados no cromatograma, figura 9. Observa-se que o aminoácido tirosina (tR
13,0 min.) foi o composto majoritário no extrato.
Figura 9. Cromatograma do extrato de ovos em diferentes dias do desenvolvimento
embrionário do R. microplus obtido por CG-EM. Alguns dos derivados das substâncias
majoritárias estão destacados: O derivado da prolina está destacado em amarelo (tR 10,06 min.), as
três isoformas do derivado da glicose em vermelho (tR 12,26; 12,35 e 12,51 min.) e o derivado da
tirosina em roxo (tR 13,09 min.). O derivado do ribitol está destacado em azul (tR 11,0 min.). Análise
realizada em cromatógrafo QP2010 Plus Shimadzu que contém uma coluna tipo DB5 de modelo 007-
5MS.
Após a determinação das melhores condições para obtenção e análise dos
extratos dos embriões procedeu-se à continuidade de todo o estudo dos metabólitos
envolvidos na embriogênese de R. microplus no cromatógrafo localizado no
Laboratório Integrado de Química, utilizando uma coluna capilar DB1 (Rtx-1MS). As
condições foram readequadas para a análise, como descrito na parte experimental e
35
pequenas modificações nos tempos de retenção das substâncias foram observadas,
como o encontrado para o ribitol em tR= 11,0 min, anteriormente identificado em tR=
13,0 min., bem como uma melhor resolução dos sinais nos cromatogramas pode ser
observada. A Figura 10 apresenta o cromatograma do extrato do dia 19,
representativo das substâncias encontradas nas amostras individuais dos embriões
de R. microplus.
Figura 10. Cromatograma representativo do extrato de embriões de décimo nono dia de
desenvolvimento do R. microplus obtido por CG/EM. Cada pico corresponde
a uma substância derivada de cada um dos metabólitos derivatizados e identificados; e os números
acima de cada pico correspondem ao seu tempo médio de retenção na coluna cromatográfica. O
derivado da serina está destacado em preto (tR 6,8 min.), o derivado do malato está destacado em
verde (tR 10,0 min.), o derivado do ribitol está destacado em azul (tR 13,0 min.), o derivado da tirosina
está destacado em roxo (14,0), e as três isoformas do derivado da glicose em vermelho (tR 14,7; 14,8
e 14,9 min.). Análise realizada em cromatógrafo QP2010 Plus Shimadzu que contém uma coluna tipo
DB1 de modelo Rtx-1MS.
A análise dos espectros de massas das substâncias (anexo I) presentes nos
extratos dos embriões de cada dia do desenvolvimento e a identificação das
substâncias foram realizadas com base na comparação dos dados da biblioteca
36
NIST. A Tabela 1 apresenta o resumo de todos os metabólitos identificados nos
extratos dos embriões durante a embriogênese do carrapato R. microplus.
Tabela1. Identificação dos metabólitos nos extratos dos embriões obtidos ao longo de todos os dias de desenvolvimento do R. microplus. Os tempos de
retenção médios (tR) e a porcentagem de Similaridade do espectro obtido com a
biblioteca NIST são apresentados.
tR Médio (Min.) Metabólitos
% de Similaridade
com NIST
1 6,3 Valina 90
2 6,5 Urea 93
3 6,8 Serina 96
4 7,0 Fosfato 95
5 7,2 Leucina 92
6 7,3 Glicerol 92
7 7,4 Treonina 97
8 7,6 Succinato 82
9 7,7 Glicina 94
10 8,0 Ácido glicérico 94
8,6 Metionina 92
11 8,8 Aspartato 96
12 9,2 Alanina 82
13 10,0 Malato 93
14 10,2 Prolina 94
15 10,4 GABA 82
17 11,2 Fosfoenolpiruvato 91
18 11,4 Ácido 2-Aminoadípico 91
19 11,6 Glutamato 90
20 12,4 Ribose 93
21 12,8 Ornitina 90
22 13,0 Ribitol 95
23 13,9 Lisina 85
37
24 14,0 Tirosina 94
25 14,6 Frutose 91
26 14,8 Glicose 91
27 15,0 Treose 74
28 15,6 Àcido Palmítico 94
29 16,2 D-glicosamina 91
30 16,4 Inositol 95
31 16,7 Triptofano 89
32 16,8 Galactose 89
33 17,0 Àcido Esteárico 95
34 17,6 2-deoxi uridina 94
35 17,8 Timidina 95
36 18,2 Uridina 92
37 18,8 Inosina 90
38 19,4 Alfa-D-Glicopiranosídeo 95
39 19,9 Maltose 92
A análise do perfil químico do extrato de embriões do carrapato R. microplus
obtido por CG/EM nos permitiu identificar 39 substâncias, as quais pertencem ao
metabolismo de glicose e ao metabolismo de aminoácidos, além disso foram
identificados dois ácidos graxos, o ácido palmítico (c16) e o ácido esteárico (c18).
Portanto, a técnica e o método de análise aqui abordados se mostrou eficiente em
detectar metabólitos que se mostram importantes para o metabolismo energético
durante o desenvolvimento embrionário do R. microplus.
Entretanto, podemos identificar trabalhos que por meio de outras técnicas
analíticas, tiveram como foco a dinâmica de metabólitos relacionados às fontes
energéticas durante o desenvolvimento embrionário de outras espécies, tais como a
do caranguejo marinho Charybdis japônica. Para investigar a composição química
deste organismo, Xu (2013) utilizou a técnica de cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC) acoplada a um detetor específico de aminoácidos (LC 98-I AAA
Automatic Amino AcidAnalyzer- BASIC, China) para determinar o teor de
aminoácidos, e a Cromatografia gasosa acoplada a um detector de ionização de
chamas (FID) para quantificar os ácidos graxos (WEHRENS, 2011). Em seu estudo,
os aminoácidos classificados como essenciais predominantes na análise foram
38
lisina, leucina, arginina e valina, e os principais aminoácidos não essenciais foram
ácido glutâmico e ácido aspártico. E assim como em minha análise, os ácidos
graxos predominantes foram o ácido palmítico (c16) e o ácido esteárico (c18)
(WEHRENS, 2011).
Isto demonstra que objetivos em comum podem ser alcançados por diferentes
abordagens analíticas, a utilização da CG-EM viabilizou este estudo dentro de um
tempo hábil, levando em consideração a sua principal vantagem que é a
disponibilidade de bibliotecas espectrais. Diante disso, as injeções de padrões
comerciais de cada substância detectada se tornaram dispensável dentro desta
análise inicial. Todavia, se faz necessário a análise individual de cada metabólito
aqui identificado, tendo como foco os metabólitos que mais variaram dentro das
nossas análises. A fim de direcionar nossos estudos às substâncias que mais
variaram dentro dos 21 dias de desenvolvimento embrionário, aplicou-se a Análise
de Componentes Principais.
5.3 Perfil quimico nos diferentes estágios embrionário do carrapato R.
microplus.
Para avaliar as possíveis variações nos perfis químicos das amostras
provenientes dos diferentes dias do desenvolvimento embrionário, as quais foram
analisadas no cromatógrafo gasoso com uma coluna Rtx-1MS tipo DB1, realizou-se
a comparação das amostras utilizando métodos estatísticos que permitissem uma
melhor visualização da dinâmica metabólica entre as amostras.
A Análise de Componentes Principais (Principal ComponentAnalysis-PCA) é
um método multivariado que consiste em transformar um conjunto dimensional de
variáveis originais em outro conjunto de variáveis de menor dimensionalidade
chamadas de Componentes Principais (Principal Component-PC). Cada PC é uma
combinação linear de todas as variáveis originais e são independentes e ortogonais
entre si e estimados com o propósito de reter, em ordem de estimação, o máximo de
informação, em termos da variação total contida nos dados.
A análise agrupa os metabólitos segundo suas variâncias, ou seja, a técnica
agrupa os metabólitos de um conjunto de amostras segundo a variação de suas
características.
39
Os valores que representam a variação de cada substância desses
subconjuntos são chamados de fatores de pontuação (Scores factor), os quais
podem ser interpretadas geometricamente nos gráficos de disperção, onde as
amostras podem se agrupar conforme suas similaridades de variância. (ABDI;
WILLIAMS, 2010; RENCHER, 2002).
Além do gráfico de disperção, esta análise nos fornece um gráfico de loading
que nos permite identificar quais foram as substâncias responsáveis pelo
agrupamento ou distânciamento de cada amostra representada no gráfico de
dispersão. Ou seja, informa as variáveis (substâncias) que são compartilhadas por
cada grupo representado no gráfico de scores (ABDI; WILLIAMS, 2010; RENCHER,
2002).
A análise dos nossos dados mostrou que as duas primeiras componentes da
análise de PCA foram responsáveis por explicar juntas 67.3% de toda a variação
dos dados estudados (PC-1 49.9% e PC-2 17.4%) conforme consta no gráfico de
scores. A partir da visualização do gráfico de scores é possível notar que as
amostras se agruparam conforme suas similaridades no perfil químico, e se
distribuíram em torno dos eixos positivos e negativos das PCs 1 e 2 seguindo uma
sequência temporal. Podemos observar três grupos distintos distribuídos no gráfico:
Grupo 1 - círculo vermelho: do 1º ao 5º dia do desenvolvimento – inserido no
quadrante PC1 e PC2 negativo; Grupo 2 – círculo azul: 6º, 7º e 8º dia do
desenvolvimento, variando fortemente no quadrante PC2 positivo, mas ainda no lado
negativo da PC1; e grupo 3 – círculo verde, do 9º ao 21º dia, variando no lado
positivo da PC1 com pouca variação na PC2 (Figura 11).
40
Figura 11. Correlação entre o perfil químico e os diferentes estágios embrionários do carrapato
R microplus - Gráfico de dispersão da PCA (PC1 x PC2). Os embriões de cada dia do
desenvolvimento embrionário foram coletados durante 21 dias, cada dia representa uma amostra, ou
seja 21 amostras, que estão indicadas por codigo d1-d21. Todas as amostras foram analisadas em
replicatas. O gráfico de disperção da PCA mostra 3 grupos principais: Grupo1 – em vermelho, Grupo2
– em azul e Grupo3 –em verde.
Ao analisarmos a tendência de agrupamento das amostras no gráfico de
dispersão, percebemos que este agrupamento está de acordo com os processos de
desenvolvimento que ocorrem durante a embriogênese do R.microplus, além de
demonstrar uma correlação entre o perfil metabólico e os estágios do
desenvolvimento embrionário.
O agrupamento das amostras é realizado conforme as similaridades da
variação do perfil das substâncias que compõem os cromatogramas. A principal
substância responsável pelo agrupamento das amostras no quadrante positivo da
PC1 foi o glicerol, cuja concentração aumenta para o lado positivo desta
componente. Opostamente, a principal substância responsável pelo agrupamento
das amostras no quadrante negativo da PC1 foi o malato, cuja concentração
aumenta para o lado negativo desta componente (Figura 12). Evidenciando assim
41
que nos primeiros dias de desenvolvimento (d1 a d5) temos maior abundância de
malato, se comparado as amostras presentes no quadrante PC1 positivo. Já nos
demais dias (d9 a d21) o glicerol foi a principal substância com maior importância na
variação metabólica. Pode-se destacar ainda que o d1 é o dia do desenvolvimento
que apresenta menor concentração de glicerol e o d18 menor concentração de ácido
málico, pois estes foram os dias extremos da dispersão ao longo do eixo da PC1 no
gráfico dos scores (Figura 11).
Figura 12. Gráfico de loadings (PCA1-49,9%) da PCA. O eixo Y indica a intensidade relativa e o
eixo X indica o tempo de retenção dentro da análise cromatográfica em minutos. Glicerol (tR
médio7,3), malato (tR médio10,0), fosfoenol piruvato (PEP) (tR médio11,1) e Ribtiol (tR médio13,0)
Em relação aos loadings referente à PC2 (Figura 13), o gráfico indica que as
principais substâncias que são responsáveis pelos agrupamentos das amostras no
gráfico de scores (ou gráfico de dispersão) desta componente, foram o malato e a
glicose, ambas no quadrante positivo da PC2 (Figura 11). Neste quadrante no
gráfico dos scores se encontra predominantemente os dias d6 e d7 do grupo
destacado em azul, ressaltando uma maior concentração desses dois metabolitos
nesses dias.
42
Figura 13. Gráfico de loadings (PCA2-17,4%) da PCA. O eixo Y indica a intensidade relativa e o
eixo X indica o tempo de retenção dentro da análise cromatográfica em minutos. Malato (tR médio
10,0), fosfoenol piruvato (PEP) (tR médio11,1) e glicose (tR médio 14,8)
As principais variáveis que estão presente na PC1 e na PC2 e que contribuem
para o agrupamento das amostras no gráfico de scores, estão descriminadas na
tabela abaixo (Tabela 2). As substâncias que estão no lado negativo no gráfico de
loading estão destacadas em vermelho e as que têm um traço (----) não tiveram
envolvimento dentro da PC2.
Tabela 2: Substâncias responsáveis pela distribuição das amostras no gráfico
de pontuações.
componentes principais
(PC1)
componentes principais
(PC2)
tR Médio(Min.) Metabólito tR Médio(Min.) Metabólito
6.3 Valina 6.3 Valina
6.5 Urea 6.5 Urea
6.8 Serina 6.8 Serina
7.1 Fosfato 7.1 Fosfato
7.4 Glicerol 7.4 Glicerol
7.6 Glicina 7.6 Glicina
43
8.0 Ácido glicérico 8.0 --------
8.9 Aspartato 8.9 Aspartato
9.2 Alanina 9.2 --------
9.8 Prolina 9.8 Prolina
10.0 Malato 10.0 Malato
10.4 GABA 10.4 --------
11.1 Fosfoenolpiruvato 11.1 Fosfoenolpiruvato
11.4 Ácido 2-Aminoadípico 11.4 Ácido 2-Aminoadípico
12.4 Ribose 12.4 --------
12.8 Ornitina 12.8 Ornitina
13.9 Lisina 13.9 Lisina
14.0 Tirosina 14.0 Tirosina
14.5 Frutose 14.5 --------
14.7 Glicose 14.7 Glicose
15.6 Àcido Palmítico 15.6 --------
16.2 D-glicosamina 16.2 --------
16.4 Inositol 16.4 --------
17.0 Àcido Esteárico 17.0 Àcido Esteárico
17.5 Deoxyuridina 17.5 --------
17.8 Deoxycitidina 17.8 --------
18.2 Uridina 18.2 --------
Na figura 11 (gráfico de scores) o agrupamento das amostras d1 (Dia 1) até
d5 (Dia 5) indica que estas amostras estão correlacionadas entre si, ou seja,
possuem particularidaddes na composição química que os demais grupos não
possuem. Esta fase inicial é caracterizada pelo crescimento e migração das células
e metabolicamente caracterizada como uma fase de consumo de nutrientes de
origem materna (MORAES et al., 2007; SANTOS et al., 2013; SEIXAS et al., 2012).
44
Portanto, há uma coesão entre o perfil químico do grupo1 com o momento
embrionário.
A partir do sexto e sétimo dia de desenvolvimento esse conjunto de células
formadas durante os cinco primeiros dias passam a subdividir-se em duas regiões
que futuramente originarão a segmentação do embrião (SANTOS et al., 2013;
SEIXAS et al., 2012), embora este momento embrionário ainda seja de consumo de
nutriente provindos da mãe (MORAES et al., 2007). Dessa forma, sugere-se que o
sexto, o sétimo e o oitavo dia do desenvolvimento sejam um ponto de transição
metabólica que desencadeia uma mudança nas variações morfológicas,
ocasionando o agrupamento do grupo 2. Podemos sugerir que nestes dias
acontecem variações metabólicas proeminentes, o que justifica a grande separação
dos dis 6 e 7 do desenvolvimento dentro do grafico de score. E junto à esta
alteração metabólica acontecem alterações morfológicas com o fechamento dorsal e
o surgimento de patas e (SANTOS et al., 2013; SEIXAS et al., 2012).
Após esta fase de transição metabólica, podemos observar um terceiro
estágio do desenvolvimento embrionário formado pelos dias 9 até o dia 21, grupo 3,
onde ocorre a diferenciação celular e consequentemente alterações morfológicas
importantes para a completa formação deste embrião. É nesta fase que acredita-se
que o embrião já tenha assumido o controle metabólico para sintetizar e degradar
substâncias necessárias ao seu metabolismo e assim, apoiar os processos
morfológicos que acontecem nessa fase.
Este padrão de agrupamento das amostras no gráfico de scores (figura 11)
torna-se muito interessante, pois mostra que a variação metabólica acompanha e se
comporta de acordo com as variações morfológicas do embrião, indicando a íntima
relação entre o metabolismo e o desenvolvimento embrionário. Dados similares
foram publicados por An (2014) que investigou o perfil metabólico durante o
desenvolvimento embrionário da mosca da fruta (Drosophila Melanogaster). Estes
dados demonstram que ao longo da embriogênese desses dois artrópodes existe
uma dinâmica metabólica que acompanha as diferentes fases do desenvolvimento
destes organismos.
As substâncias responsáveis pelo agrupamento destas amostras estão
descritas na tabela 2, onde se pode observar que existem algumas substâncias que
são encontradas em ambas componentes principais, como a glicose, a glicina, a
prolina, o malato e o aspartato, em contrapartida, substâncias como a alanina e a
45
frutose estão presentes apenas na PC1. Estes dados ajudam a apoiar a semelhança
do perfil metabólico durante o desenvolvimento embrionário do R. Microplus e da
mosca Drosophila melanogaster, que também teve estas substâncias como
variáveis responsáveis pelo agrupamento no gráfico de scores (AN et al., 2014).
Estas substâncias estão envolvidas no metabolismo da glicose e dos aminoácidos,
sendo fontes energéticas importantes para a célula. Isto demonstra que o
metabolismo energético gera metabólitos essenciais que sustentam o
desenvolvimento embrionário tanto da D. Melanogaster quanto do R. microplus.
O desenvolvimento embrionário do R. microplus foi dividido metabolicamente
em duas fases, a fase inicial, representado como grupo1 no gráfico de dispersão,
que foi caracterizada como um momento de intenso consumo energético o que
implica num aumento da produção de ATP; e a segunda fase, representado como
grupo3 no gráfico de dispersão, sendo caracterizada pela ressintese do glicogênio
por meio da via gliconeogênica (MORAES et al., 2007).
Para um dos processos de produção de ATP, em mamíferos, são necessários
os equivalentes redutores do NADH citossólico, forma reduzida de nicotinamida
adenina dinucleótida (NAD) na cadeia transportadora de elétrons a qual está
localizada na membrana interna da mitocôndria. O NADH, no entanto, é
impermeável à membrana mitocondrial interna, sendo necessário um transportador
para seus equivalentes redutores à cadeia transportadora de elétrons. Um dos
transportadores desses equivalentes redutores é a lançadeira malato-aspartado que
desempenha papéis importantes em diferentes processos biológicos (SHANG et al.,
2017). De modo sucinto, a translocação do equivalente redutor inicia-se no citosol
onde o íon H+ do NADH+ é transferido para o oxaloacetato por meio da atividade da
enzima malato desidrogenase, formando malato. Na membrana interna mitocondrial
tem um transportador de malato - α-cetoglutarato, que leva o malato do citosol para
dentro da mitocôndria e, simultaneamente, transporta um α-cetoglutarato da matriz
mitocondrial para o citosol. Na matriz mitocondrial, o malato é convertido à
oxaloacetato pela ação da enzima malato desidrogenase, que transfere o íon H+do
malato para o NAD+ mitocondrial, formando NADH+. A enzima aspartato-
aminotransferase converte o oxaloacetato à aspartato, que pode sair da mitocôndria
pelo transportador glutamato-aspartato que transfere glutamato do citosol para a
matriz mitocondrial. Este sistema de transporte permite que o NADH gerado no
citoplasma durante a glicólise possam ser usados na cadeia transportadora de
46
elétrons da mitocôndria para gerar ATP (Figura 14) (LEHNINGER; NELSON; COX,
2009).
Figura 14.Representação esquemática da lançadeira malato – aspartato. Baseado em Lehninger
- Princípio de Bioquímica 3° edição.
Um exemplo da atuação da lançadeira malato aspartato é na reprodução de
artrópodes, em células foliculares de Dipetalogaster maximus e Triatoma infestans,
que são insetos vetores da doenças de Chagas. Essas células desempenham um
papel importante na síntese de macromoléculas como glicoproteínas, fosfolipídeos e
triacilglicerídeos que compoem o vitelo. Uma das características destas células
foliculares é a abundancia de mitocôndrias, e os dados sugerem que a lançadeira
malato – aspartato estaria mais ativa na transferência de equivalentes redutores
para as mitocôndrias nessas células (SCARAFFIA et al., 2001).
Extrapolando a importância da lançadeira malato-aspartato durante o
desenvolvimento, Tennessen e colaboradores (2011), ao silenciarem um gene
ortólogo ao Receptor Relacionado ao Estrogênio (dERR) em larvas da Drosophila
melanogaster, observaram que os silenciados morreram com baixos níveis de ATP e
47
elevados níveis de açúcares circulantes na hemolinfa, demonstrando um papel
crucial do dERR no metabolismo glicolítico (TENNESSEN et al., 2011). As larvas
silenciadas apresentaram uma diminuição na abundância relativa dos intermediários
do ciclo de Krebs, incluindo o malato, e um aumento na abundância relativa de
aspartato. Estes dados podem ser um indicativo de uma diminuição na atividade do
transporte de malato-aspartato devido à baixa disponibilidade de substrato
intracelular, que neste caso é a glicose, justificando desta forma o elevado aumento
do aspartato (TENNESSEN et al., 2011).
No nosso estudo, sugere-se que a baixa abundância do malato nos cinco
primeiros dias do desenvolvimento embrionário do carrapato R. Microplus, se
comparado às amostras do sexto, sétimo e oitavo dia do desenvolvimento, pode ser
explicado pela intensa atividade metabólica durante esta fase inicial, caracterizada
pela intensa multiplicação celular que requer alta demanda energética. E podemos
apoiar esta ideia de alta demanda energética baseando em quatro fatores: pela
intensa multiplicação celular que acontece neste momento inicial (SANTOS et al.,
2013; SEIXAS et al., 2012); O abrupto consumo de oxigênio (CAMPOS et al., 2006);
pelas atividades enzimáticas da hexoquinase e piruvato quinase (MORAES et al.,
2007), que foram descritos na introdução deste documento (Figura 5B); e pela
abundância relativa dos outros metabolitos identificados em nossa análise, tais como
o aspartato e succinato.
5.4 Alteração no comportamento metabólico de embriões do carrapato R.
microplus.
Identificar a dinâmica metabólica ao longo do desenvolvimento embrionário
nos permite entender o controle metabólico do embrião em cada uma de suas fases
embrionárias. De acordo com os dados de Moraes e colaboradores (2007), o
metabolismo da glicose está diretamente relacionado aos processos fisiológicos do
desenvolvimento para a embriogênese do nosso modelo de estudo. Portanto uma
análise quantitativa de cada pico do cromatograma que representa abundância
relativa de cada metabólito detectado na espectometria de massas, nos ajuda a
correlacionar o metabolismo com os diferentes momentos embrionário do carrapato
48
R. microplus e, ainda, nos permite definir transições metabólicas sequenciais
durante os diferentes estágios embrionários.
A correlação da variação metabólica entre malato e fosfoenolpiruvato nos
indicou uma mudança no perfil metabólico entre o quinto e o sétimo dia de
desenvolvimento embrionário (Figura 15). Comparando a variação desses dois
metabólitos com os dados da atividade enzimática da hexoquinase (HK), da piruvato
quinase (PK) e da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) obtidos por Moraes e
colaboradores (2007), podemos inferir que o embrião ao atingir o quinto dia de
desenvolvimento pode alterar sua dinâmica metabólica ao diminuir o seu fluxo
energético. Atenuando a degradação de glicose no quinto dia de desenvolvimento,
pode interferir na atividade mitocondrial, levando à um aumento da abundância
relativa do malato e do fosfoenolpiruvato (Figura 15).
Figura 15. Dinâmica metabólica das substâncias marcadoras da transição metabólica durante
o desenvolvimento embrionário do R microplus. Metabólitos que são importantes para a via
gliconeogênica. A intensidade de pico de cada substância foi normalizada com base no ribitol e pela
média de sua intensidade durante a embriogênese. DAO – Dias após a oviposição.
O fato de observarmos uma maior abundância do malato (figura 15), também
nos indica que este metabólito pode não estar sendo utilizado pelo metabolismo
neste momento, e correlacionar este dado ao decréscimo da atividade enzimática da
hexoquinase, publicado por Moraes colaboradores (2007) nos permite sugerir um
menor fluxo metabólico entre o quinto e o sétimo dia do desenvolvimento. E isto
pode ser interpretado como um preparo metabólico para a próxima fase do
desenvolvimento embrionário, o qual é caracterizado pela ressíntese de glicose, pela
via gliconeogênica.
49
O aumento dos níveis de fosfoenolpiruvato corrobora com a ideia de que
neste período de quinto ao sétimo dia de desenvolvimento é o ponto de partida em
que o embrião assume o controle do seu desenvolvimento por meio do seu
metabolismo. Como foi dito anteriormente, o embrião se desenvolve dentro do ovo
não tendo contato com o meio externo, portanto este embrião não se alimenta de
fontes nutritivas externas ao ovo. Ao perceber o acúmulo de glicogênio entre o
sétimo e o décimo quinto dia do desenvolvimento, nos surgiu o questionamento de
como este embrião poderia ter acesso a uma quantidade considerável de glicose a
ponto de poder estocá-la em sua forma de glicogênio, sem ter uma fonte de nutrição
externa?
O produto final da glicólise, o piruvato, é convertido à oxalacetato na
mitocôndria pela ação da enzima piruvato carboxilase. Esse oxalacetato é então
convertido, a fosfoenolpiruvato (PEP) pela ação da enzima fosfoenol piruvato
carboxiquinase (PEPCK). Em humanos, essas reações acontecem quando há um
aumento dos níveis de ATP e NADH e quando o ciclo de Krebs é inibido (Figura 16).
Com o ciclo de Krebs inibido, o oxalacetato, que não foi detectado nas nossas
análises, é desviado para via gliconeogênica, sendo convertido a PEP que é um dos
principais intermediários desta via (VOET, DONALD.;JUDITH G.; PRATT, 2014).
Portanto, a detecção do aumento nos níveis de PEP (Figura 15) exatamente no
período de quinto ao sétimo dia de desenvolvimento reforça a sugestão de que
neste momento há um preparo metabólico para o start da via gliconeogênica, que
pode estar reabastecendo este embrião com uma substância que ao ser oxidado
fornece energia, a glicose.
50
Figura 16. Possíveis caminhos metabólicos do piruvato na mitocôndria. O Piruvato pode ser
convertido a Acetil-CoA e entrar no ciclo de Krebs ou ser convertido à oxalacetato gerando o
substrato para a via gliconeogênica (fosfoenolpiruvato).
Sugere-se aqui, que para o start da via gliconeogênica é necessária uma
preparação metabólica, e que esta preparação pode acontecer a partir do quinto dia
do desenvolvimento embrionário devido ao aumento da abundância relativa de
malato e PEP. Este preparo metabólico acontece concomitantemente ao final da
primeira fase e se prolonga ao início da segunda fase embrionária. Neste intervalo
temporal pode ser observada a divisão da massa celular, que formará a banda
germinal e, por conseguinte, entre o sétimo e oitavo dia começa a diferenciação
destas células (SANTOS et al., 2013; SEIXAS et al., 2012). Ou seja, observa-se uma
alteração no fenótipo do embrião, onde a intensa multiplicação celular é diminuída
para iniciar a diferenciação celular com a formação da banda germinal. Portanto,
sugere-se que essa coordenação metabólica, pode estar relacionada às mudanças
morfológicas no embrião ao longo do seu desenvolvimento.
Vital e colaboradores (2010) ao analisar o metabolismo de glicose ao longo da
formação dos embriões do mosquito Aedes aegypti, sugeriram que assim como no
carrapato R. microplus, existe uma preferência metabólica em momentos distintos da
embriogênese desse mosquito. Curiosamente, demonstraram que após a retração
51
da banda germinal, que é um evento morfológico necessário para a completa
formação do embrião, a atividade enzimática da PEPCK dobrou entre 24 e 48 horas
após a postura, permanecendo em níveis elevados até o final da embriogênese,
concomitantemente com uma diminuição significativa no conteúdo de proteína.
Sugerindo uma correlação entre o conteúdo de proteína, a via gliconeogênica e as
modificações morfológicas que ocorrem durante a retração da banda germinal (24
HAE) (VITAL et al., 2010).
Além da abundância de malato e do fosfoenolpiruvato, podemos observar um
leve aumento de succinato no sexto dia de desenvolvimento (Figura 17), um dos
intermediários do ciclo de Krebs, e um aumento do aspartato que é um dos
aminoácidos glicogênicos, podendo ser convertido à oxalacetato nas reações de
desaminação. Estes aumentos nos níveis de succinato e aspartato entre o quinto e o
sétimo dia de desenvolvimento apoia a ideia de que houve uma diminuição na
utilização do ciclo de Krebs durante esta fase de transição metabólica.
Figura 17. Dinâmica metabólica do succinato e do aspartato ao longo do desenvolvimento
embrionário do R microplus. O succinato é um metabólito intermediário do ciclo de Krebs e o
aspartato é um metabólito importante para a via gliconeogênica. A intensidade de pico de cada
substância foi normalizada com base no ribitol e pela média de sua intensidade durante a
embriogênese. DAO – Dias após a oviposição.
A atenuação do fluxo glicolítico e consequente diminuição na atividade do
ciclo de krebs como foi sugerido aqui, foi demonstrado por Tennessen e
colaboradores (2014), que ao explorarem a dinâmica metabólica ao longo da
52
embriogênese da mosca Drosophila melanogaster, mostraram a diminuição do ciclo
de Krebs. Isto pode ser sugerido, devido à estabilidade da abundância relativa dos
níveis de citrato, isocitrato, α-cetoglutarato nas primeiras 6 horas de
desenvolvimento e ao aumento da abundância relativa desses intermediários na
fase mais tardia da embriogênese (TENNESSEN et al., 2014). Em nossa análise, o
citrato, isocitrato e α-cetoglutarato não foram detectados, no entanto, o succinato
apresentou um perfil metabólico semelhante aos perfis destes intermediários no
desenvolvimento da Drosophila melanogaster, o que apoia nossa hipótese de que
há uma diminuição do fluxo energético e consequente formação de intermediários
que podem abastecer a via gliconeogênica e assim, iniciar um novo momento
embrionário de diferenciação celular.
Além do malato e do fosfoenolpiruvato, os aminoácidos servem como
precursores à síntese de glicose por meio da gliconeogênese (LEHNINGER;
NELSON; COX, 2009). Moraes e colaboradores (2007) demonstraram que durante a
segunda fase da embriogênese do carrapato R. microplus há um aumento na
concentração de glicogênio, seguido pela degradação de proteínas (MORAES et al.,
2007). Isto pode ser comprovado pela atividade da enzima aspartato
aminotransferase (AAT) e da glutamato desidrogenase (GDH), as quais são
importantes enzimas no catabolismo de aminoácidos. Suas atividades tornam-se
elevadas após a formação das células embrionárias (Dados não publicados). O
conjunto destes dados reforçam nossa teoria de que após a celularização (a partir
do 5º dia do desenvolvimento), existe uma mudança metabólica, caracterizada pela
ressíntese de glicose e estocada na forma de glicogênio pela via gliconeogênica, e
que os aminoácidos podem servir de precursores para esta via a partir da segunda
fase do desenvolvimento embrionário. Desta forma, o metabolismo de aminoácidos
possui um papel essencial no metabolismo energético desse carrapato.
5.5 Variação metabólica dos aminoácidos glicogênicos ao longo do
desenvolvimento embrionário do carrapato R. microplus.
Os aminoácidos são classificados como glicogênicos quando podem ser
convertidos em intermediários da via da glicólise ou a via gliconeogênica. Além de
glicogênicos esses aminoácidos podem ser classificados como cetogênicos, quando
53
são convertidos em intermediários do ciclo de Krebs, como por exemplo o acetil-CoA
e oxalacetato, e Ceto-glicogênicos, quando são convertidos à intermediários do ciclo
de Krebs e da via glicolítica (BERG; TYMOCZKO, 2002).
Dentro da classificação dos aminoácidos detectados, cada um deles podem
desempenhar papéis distintos ao longo do desenvolvimento embrionário. Podemos
observar que todos os aminoácidos glicogênicos (Figura 18A) e cetogênicos (Figura
18B) detectados em nossa análise apresentam uma variação similar até o quinto dia
do desenvolvimento embrionário, e uma abundância reltivamente baixa se
comparada aos dias mais tardios da embriogênese. Isto pode ser uma
demonstração da coordenação metabólica no embrião ao utilizar as diferentes
biomoléculas à favor do seu desenvolvimento. Curiosamente, entre o quinto e o
sétimo dia do desenvolvimento há um aumento na detecção desses aminoácidos se
comparado aos dias que precedem o quinto dia de desenvolvimento, o que
corrobora com a nossa sugestão de que há um momento de transição metabólica
nestes embriões a partir do quinto dia do desenvolvimento.
Figura 18. Coordenação metabólica dos aminoácidos glicogênicos e cetogênicos ao longo do
desenvolvimento embrionário do R microplus. No eixo Y está indicada a intensidade relativa e no
54
eixo X estão indicados os diferentes dias após a oviposição (DAO). (A) Aminoácidos glicogênicos:
alanina, serina, treonina, glicina, aspartato, isoleucina, metionina, valina e prolina (B)
Aminoácidoscetogênicos: leucina e lisina e Aminoácido não padrão: ornitina. A intensidade de pico de
cada substância foi normalizada com base no ribitol e pela médiad e sua intensidade durante a
embriogênese.
Além de sua participação no metabolismo energético, os aminoácidos são
precursores para a síntese de proteínas. O aporte energético do embrião, chamado
de vitelo, é constituido principalmente por proteínas. Nos embriões do R. microplus,
o conteúdo total de proteínas permanecem inalterados durante a fase inical do
desenvolvimento (CAMPOS et al., 2006). Esta informação em conjunto com a
dinâmica de utilização da glicose apoia os resultados descritos na figura 18, pois
entendemos que se o níveil de degradação proteica na fase inical do
desenvolvimento é baixo, é esperado baixos níveis de aminoácidos livres neste
momento embrionário.
Além disso, nossos dados reforçam os dados publicados por Moraes e
colaboradores (2007) que demonstraram uma intensa degradação de proteínas após
o período de celularização, a partir do quinto dia do desenvolvimento.
Consequentemente, foi observada uma maior disponibilidade de aminoácidos livres
em embriões do carrapato R. microplus a partir do quarto e quinto dia após a
oviposição (Figura 18).
Devido à observação do acúmulo de glicose na forma de glicogênio
(MORAES et al., 2007), nós direcionamos nossa atenção aos aminoácidos
glicogênicos. O perfil metabólico dos aminoácidos e dos outros metabólitos
anteriormente citados nas figuras 15 e 17 nos permitem defender a ideia de que o
embrião possui um controle metabólico que o permite atingir a segunda fase de
desenvolvimento, utilizando a via gliconeogênica para aumentar os seus níveis de
glicose.
O perfil metabólico dos aminoácidos detectados na nossa análise, os quais
são classificados como glicogênicos, que tiveram maior abundância relativa estão
representados na figura 19. Podemos notar que a abundância relativa da serina e da
prolina decaem até o quinto dia do desenvolvimento. Além disso, sua abundância é
relativamente baixa na fase inicial, se comparado aos dias mais tardios da
embriogênese, o que se repete para os demais aminoácidos como a glicina, a
55
treonina e o aspartato. Já o aminoácido valina não teve muita alteração em sua
abundância ao longo da embriogênese (Figura 19).
Figura 19. Perfil da variação dos aminoácidos glicogênicos ao longo da embriogênese do R
microplus. Variação dos aminoácidos que são importantes para a via gliconeogênica em diferentes
dias após a oviposição (DAO). A intensidade de pico de cada substância foi normalizada com base
no ribitol e pela média de sua intensidade durante a embriogênese.
De uma forma geral, todos estes aminoácidos apresentaram um leve aumento
entre o quinto e o sétimo dia de desenvolvimento embrionário. O que apoia a
sugestão de que neste momento há uma diminuição no fluxo metabólico neste
embrião, favorecendo assim, o aumento da abundância relativa dos precursores da
via gliconeogênica.
Assim como o malato, a abundância relativa dos aminoácidos glicogênicos é
menor durante os primeiros cinco dias do desenvolvimento embrionário e após este
período, cada metabólito tem a sua dinâmica de utilização particular, o que nos leva
a acreditar que há uma mobilização seletiva destes metabólitos nas diferentes fases
do desenvolvimento embrionário do embrião de R. microplus.
Estas observações estão de acordo com os dados que obtivemos
anteriormente, reforçando a ideia de que na fase inical o comportamento metabólico
do embrião seja caracterizado pelo consumo dos nutrientes como lipídeos e
56
carboidratos, previamente depositados nos ovos pelas fêmeas e a partir do sexto dia
de embriogênese, esse embrião passa à assumir metabolicamente o controle do seu
desenvolvimento utilizando precursores como os aminoácidos para a ressintese da
glicose e garantir energeticamente o seu desenvolvimento.
Outro aminoácidos que tem grande importância no metabolismo de glicose é
a alanina, que em nossa análise, apresentou um comportamento diferente dos
demais aminóácidos durante a fase de transição metabólica. No segundo dia de
desenvolvimento apresentou uma maior abundância relativa se comparada ao
período em que chamamos de transição metabólica (entre o quinto e o sétimo dia).
Além disso, a maior abundância relativa da alanina pode ser detectado no oitavo dia
dedesenvolvimento (Figura 20).
Figura 20. Perfil da variação do aminoácido alanina. Variação da alanina ao longo em diferentes
dias após a oviposição (DAO). A intensidade de pico de cada substância foi normalizada com base
no ribitol e pela média de sua intensidade durante a embriogênese.
O produto final da oxidação da glicose é o piruvato, que ao entrar na
mitocôndria é convertido à acetil-Coa. Esse acetil-Coa é convertido à citrato, que é
um dos intermediário do ciclo de Krebs. Quando há uma diminuição do fluxo no
ciclo de krebs, o piruvato provindo da glicólise pode ser convertido em alanina e vice
versa (LODISH, 2000). Esse dado, junto ao perfil do fosfoenolpiruvato, se tornam de
grande importância pois é mais um indicativo de que o período entre o quinto e
Alanina
57
sétimo dia do desenvolvimento é um momento preparatório para início da segunda
fase da embriogênese.
Na nossa análise, o piruvato não foi detectado, entrentanto, os níveis de
fosfoenolpiruvato e alanina nos ajudam a entender a sua dinâmica, pois um dos
precursores para a síntese de alanina e de fosfoenolpiruvato é o piruvato (LODISH,
2000). Então com os níveis de alanina relativamente baixo e os níveis de
fosfoenolpiruvato relativamente alto entre o quinto e o sétimo dia de
desenvolvimento, nos indica que ao diminuir o fluxo metabólico na fase transitória, o
piruvato provindo da oxidação da glicolise e a alanina podem estar sendo utilizados
para a formação do fosfoenolpiruvato, que é um dos principais metabólitos que pode
abastecer a via gliconeogênica.
Metabolicamente, podemos comparar o desenvolvimento embrionário do
carrapato R. microplus com o desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila
melanogaster (AN et al., 2014), que é um organismo modelo para estudos em
artrópodes e diversos outros organismos, inclusive humano. Assim como no
carrapato, foi sugerido que o metabolismo de aminoácidos pode ser essencial
durante a embriogênese da Drosophila e que os diferentes aminoácidos parecem
desempenhar papéis distintos em diferentes estágios de desenvolvimento do
embrião. Por exemplo, foi demonstrado que o nível de glicina é mais elevado do que
o nível de alanina no estágio de gastrulação, fase que corresponde à organização
estrutural do blastoderma celular e que no carrapato corresponde ao período entre o
sexto e oitavo dias. Como dito anteriormente, esses aminoácidos são classificados
como glicogênicos, pois, ambos podem ser convertidos à piruvato. Esses resultados
estão de acordo com os nossos dados e portanto, podemos reforçar que existe um
perfil metabólico durante o desenvolvimento desses organismos.
Este trabalho investigou o perfil de utilização do metabolismo de glicose
durante o desenvolvimento embrionário do carrapato R. microplus, demonstrando a
importância das vias de síntese e degradação da glicose para apoiar a
embriogênese. Ao longo da nossa discussão, comparamos o compartamento
metabólico do desenvolvimento da mosca Drosophila melanogaster e do mosquito
Aedes aegypti com a embriogênese do R. microplus, e identificamos semelhanças
na dinâmica de utilização destas vias. Sendo assim, isso nos permite explorar um
pouco mais o nosso entendimento acerca do comportamento metabólico de células
em intensa multiplicação.
58
As células que se proliferam rapidamente, como células cancerosas e células
embrionárias, dependem de um programa metabólico especializado, conhecido
como glicólise aeróbica (TENNESSEN et al., 2014). Este programa metabólico pode
ser caracterizado pelo aumento da atividade dos transportadores de glicose,
enzimas pertencentes à via glicolítica, e a via das pentoses fosfato e outras
proteínas que são responsáveis por promoverem o fluxo glicolítico e que são
importantes para a produção de energia e manutenção da fisiologia celular. Além
disso, este fluxo glicolítico também proporciona metabólitos importantes para a
síntese de aminoácidos, nucleotídeos, e ácidos graxos, os quais são necessários
para a acumulação da biomassa necessária ao crescimento celular (TENNESSEN et
al., 2011; VANDER HEIDEN; CANTLEY; THOMPSON, 2009; WARBURG; WIND;
NEGELEIN, 1927).
Recentemente, foi proposto que a mosca da fruta Drosophila melanogaster
também utiliza a glicólise aeróbica para apoiar o seu crescimento durante sua fase
larval, onde ao inibir a glicólise, estas larvas se tornavam incapazes de metabolizar
quantidades suficientes de glicose necessárias ao seu crescimento e morriam
(TENNESSEN et al., 2014). Esses dados demonstram a dependência dessas larvas
à glicólise, assim como já foi demonstrado esta dependência nas células
cancerosas, as quais exibem um elevado fluxo glicolítico e diminuição da
fosforilação oxidativa para gerar biomassa (TENNESSEN et al., 2011; VANDER
HEIDEN; CANTLEY; THOMPSON, 2009; WARBURG; WIND; NEGELEIN, 1927).
Os dados apresentados neste documento, ajudam a apoiar a hipótese de que
durante os primeiros estágios do desenvolvimento embrionário do carrapato bovino
R. Microplus pode ter um perfil metabólico dependente da glicólise, e em conjuntos
aos dados de Moraes e colaboradores (2007), sugerimos que a glicose é um
importante suporte para a intensa celularização que ocorre durante esta fase do seu
desenvolvimento.Isto demonstra uma semelhança na preferência metabólica em um
momento de intensa multiplicação celular.
5.6 Perfil do metabolismo de nucleosídeos ao longo do desenvolvimento
embrionário do carrapato R. microplus.
59
Além de apoiar energeticamente os embriões do carrapato R. microplus,
sugerimos que parte da glicose internalizada pelas células embrionárias é convertida
em glicose-6-fosfato, e pode ser direcionada para a via das pentoses fosfato com a
finalidade de apoiar a produção da biomassa, que é necessária à intensa
multiplicação celular que acontece na fase inicial do seu desenvolvimento. Moraes e
Colaboradores (2007) demonstraram o aumento da atividade enzimática da glicose
6 fosfato desidrogenase (G6PDH) entre o 3º e o 6º dia após oviposição (Figura 5A).
Esta enzima é reguladora da via das pentoses fosfato, que é uma via alternativa
para a oxidação da glicose e que tem como produto final a ribose. Esta ribose pode
ser utilizada na formação de várias moléculas intracelulares como os nucleotídeos,
NADH e Coenzima-A (RIGANTI et al., 2012).
Em nossa análise, tanto a ribose quanto alguns nucleosídeos puderam ser
detectados em maior abundância relativa na segunda fase do desenvolvimento se
comparada à fase inicial. Na figura 21, podemos observar uma grande similaridade
na variação da ribose e dos nucleotídeos ao longo da embriogênese do R.
microplus, e assim como para os aminoácidos existe uma coordenação na utilização
destes metabólitos.
Figura 21. Coordenação mtabólica dos nucleosídeos e da ribose ao longo da embriogênese do
carrapato R. microplus. Variação dos nucleotídeos e da ribose em diferentes dias após a oviposição
(DAO). A intensidade de pico de cada substância foi normalizada com base no ribitol.
Este perfil observado está de acordo com toda discussão metabólica que
fizemos até aqui e pode ser apoiado com o que se sabe sobre os eventos
morfológios do embrião ao longo do seu desenvolvimento. Durante a fase inicial da
60
embriogênese ocorre intensa multiplicação celular, evidenciada pela presença de
núcleos celulares (SANTOS et al., 2013; SEIXAS et al., 2012), onde é necessário o
fornecimento da ribose-5-fosfato para a síntese de nucleotídeos, a disponibilidade de
NADPH, um redutor crucial nos processos anabólicos, como por exemplo, na
biossíntese de fosfolipídios necessários à celularização (MORAES et al., 2007).
Sendo assim, neste momento há uma maior necessidade de mobilizar metabólitos
envolvidos no metabolismo de nucleotídeos. Portanto do ponto de vista metabólico e
fisiológico há um sentido para a menor abundância relativa destas substâncias
envolvidas no metabolismo de nucleotídeos.
Outros trabalhos também demonstraram a importância da via das pentoses
fosfatos. Ao inibir esta via Preter e colaboradores (2016) observaram uma
diminuição na proliferação em células cancerosas que apresentam um fluxo
glicolítico intenso (DE PRETER et al., 2016), onde o piruvato formado pode ser
deslocado da fosforilação oxidativa para a produção de lactato, indicando que os
tumores exibem metabolismo anaeróbico mesmo na presença adequada de
oxigênio. Esta característica metabólica e chamada de efeito Warburg (LI; GU;
ZHOU, 2015; WARBURG; WIND; NEGELEIN, 1927; ZHOU; HUANG; WEI, 2010).
Interessantemente a fase inicial da embriogênese do mosquito Aedes aegypti,
também apresenta uma alta atividade da enzima G6PDH (glicose-6-fosfato
desidrogenase), o que apoia a ocorrência de sucessivas divisões nucleares, que
ocorre no inicío do seu desenvolvimento (RAMINANI; CUPP, 1978; VITAL et al.,
2010). Assim como discutido acima, esse perfil metabólico ocorre nas células
cancerosas, que se encontra em constante crescimento, onde a via das pentoses
fosfato pode ser regulada positivamente para equilibrar a condição redox, por meio
da produção de NAPH e para assegurar um fornecimento adequado de ribose-5-
fosfato (R5p) para a síntese de nucleótideos (AKRAM, 2013), um passo limitante da
velocidade na proliferação de célular de diferentes modelos experimentais como
discutido aqui.
O conjunto de todos os dados apresentados neste documento demonstram
uma coordenação metabólica que acompanha os diferentes momentos
embrionários em diferentes organismos. Há muitos dados gerados pela nossa
análise e que não estão apresentados aqui, e que necessitam de uma análise mais
aprofundada, no entanto, neste documento priorizamos substâncias que de alguma
forma podem ser produtos ou precursores da glicose. Um direcionamento à estas
61
substancias será dado nas próximas análises, onde pretende-se realizar uma
análise quantitativa absoluta dos metabólitos destacados nas discussões sobre a
dinâmica do metabolismo, tais como o malato, fosfoenolpiruvato, e os diferentes
aminoácidos, visando um trabalho coeso para uma futura publicação. Além disso
padrões comerciais com alto grau de pureza serão adquiridos para a confirmação de
cada metabólito discutido aqui. Acreditamos que as informações obtidas por este
trabalho possam contribuir relevantemente no aumento do conhecimento dos
processos bioquímicos envolvidos no desenvolvimento do R. microplus e dos
diferentes artrópodes revelando alvos adicionais e que possivelmente poderão ser
suscetíveis ao desenvolvimento de metodologias de controle desses organismos
que atualmente causam enormes problemas na área de saúde pública, veterinária e
agricultura.
6. Conclusão
O método utilizado neste trabalho foi viável para a identificação dos
metabólitos envolvidos no metabolismo da glicose nos extratos de embriões do
carrapato R microplus. Nossos dados corroboram com a hipótese de que o
metabolismo de glicose no embrião é coordenado com os eventos morfológicos
durante a embriogênese.
Neste estudo foi identificado um possível momento de transição metabólica
onde a via gliconeogênica pode ter uma participação crucial. Além disso, as
variações dos aminoácidos glicogênicos, do malato e do fosfoenolpiruvato nos
indicam o possível momento que o embrião passa a se prepara metabolicamente
para controlar tais mudanças no metabolismo.
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Anexo - Espectros de massa obtidos para cada uma das substâncias
identificadas
1. Substância: L-Valina O-trimetilsilil (L-valina); Tempo de retenção (Min.): 6,3;
Similaridade: 90%.
2. Substância: Urea N,N’-(trimetilsilil) (Urea); Tempo de retenção (Min.): 6,5;
Similaridade: 92%.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
144
73
21845 100
59 72 133 15686 117 189 246
71
3. Substância: Serina O,O’-(trimetilsilil) (Serina); Tempo de retenção (Min.): 6,7;
Similaridade: 97%.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
147
189
73148
45 66 17179 1318752 99 117 204157105 179
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
116
73 132
5745 147103 117
219159 2348866 188 206
72
4. Substância: Fosfato de O,O’,O’’-(trimetilsilil) (Fosfato); Tempo de retenção
(Min.): 7,0; Similaridade: 95%.
5. Substância: L-Leucina N,O-(trimetilsilil) (L-Leucina); Tempo de retenção
(Min.): 7,2; Similaridade: 92%.
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
299
73
314158
45 174133 283147 207 22519359 10086 115 269253 318
73
6. Substância: Glicerol O,O’,O’’-(trimetilsilil) (Glicerol); Tempo de retenção
(Min.): 7,3; Similaridade: 92%.
7. Substância: L-Treonina N,O,O’-bis(trimetilsilil) (L-Treonina); Tempo de
retenção (Min.): 7,4; Similaridade: 97%.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
158
73
102
14745 86 11657 232131 160 21869 93
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
73
147
205
117103
218133
754559 191101 177 293163 263248
74
8. Substância: Succinato O,O’-(trimetilsilil) (Succinato); Tempo de retenção
(Min.): 7.6; Similaridade: 82 %.
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
73
218117
14710157
29112945
20286 320261230186
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
147
7324756
45 30913379 101
75
9. Substância: Glicina N-bis-,O-(trimetilsilil) (Glicina); Tempo de retenção (Min.):
7.7; Similaridade: 94%.
10. Substância: Ácido glicérico O,O’,O’’-(trimetilsilil) (Ácido glicérico); Tempo de
retenção (Min.): 8.0; Similaridade: 94%.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
174
73
14786
248
10045 13359 276
130117 246158 188 204
76
11.Substância: L-metionina O-(trimetilsilil) (L-metionina); Tempo de retenção (Min.):
8.6; Similaridade: 92%.
12. Substância: Aspartato de O,O’-(trimethilsilil) (Aspartato); Tempo de retenção
(Min.): 8.8; Similaridade: 96%.
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
73
147
189
102 29213345117
20559 79 307217175
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
56 75 104
61
45 131
147116 22117883 93
77
13. Substância: β-alanina, N-bis,O-(trimetilsilil) (β-alanina); Tempo de retenção
(Min.): 9.2; Similaridade: 82%.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
73
160
130116
14745
245100 23414861 202 22076 26218717493
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
73
248
147 174
228
86100 29059 13345 110 217130 184
160
78
14. Substância: Malato de O,O,O-(trimetilsilil) (Malato); Tempo de retenção
(Min.):10.0; Similaridade: 93%.
15. Substância: L-Prolina O,N-(trimetilsilil) (L-Prolina); Tempo de retenção (Min.):
10.2; Similaridade: 94%.
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
73
147
233
133 24518945 55 101 307117 175 265217 33520385
79
16. Substância: Ácido 4-aminobutanóico N-bis,O(trimetilsilil) (GABA); Tempo de
retenção (Min.):10.5; Similaridade:82%.
17. Substância: Anidrido fosfoenol O,O’-(trimetilsilil) fosfato de hidrogênio
(Fosfoenolpiruvato); Tempo de retenção (Min.): 11.2; Similaridade: 91%.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
156
73
15725823045 84
17413359 120 214112100 186 273
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
174
73
147
304
86
1005945 216133117 246155
229
80
18. Substância: ácido L-2-aminadípico N,O’,O’’-(trimetilsilil); Tempo de retenção
(Min.):11.4; Similaridade: 91%.
50 100 150 200 250 300 3500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
369
73 147
217 299
13345 243227
189 38459 285181115 266103 328
81
19. Substância: Glutamato de N,O,O’-(trimetilsilil) (Glutamato); Tempo de retenção
(Min.):11.6; Similaridade: 90%.
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
98
18875
56
24412945
147 17230984 117 200 267223 294
50 100 150 200 250 300 3500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
246
73 128
156
230
56 10045348204114 363174 258
188
82
20. Substância: D-ribose 2,3,4,5-O-(trimetilsilil) O–metil oxima (D-ribose); Tempo de
retenção (Min.):12.4; Similaridade: 93%.
21. Substância: Ornitina N,N',O-(trimetilsilil) (Ornitina); Tempo de retenção
(Min.):12.8; Similaridade: 90%.
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
73
103
217
147 307
189133117 27745 160 2058959 233173 262
83
22. Substância: Ribitol 1,2,3,4,5-O-(trimetilsilil) (Ribitol); Tempo de retenção (Min.):
13,0; Similaridade: 94%.
23. Substância: N-α-acetil-L-lisina, N(bis),N’,O(trimetilsilil) (N-α-acetil-L-lisina);
Tempo de retenção (Min.):13.9; Similaridade: 85%.
50 100 150 200 250 300 3500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
174
73
18614286
34824445 59 130117 216 258159
50 100 150 200 250 300 350 4000.0
25.0
50.0
75.0
100.0
125.0%
73
217
147
103319
129
18933227775 24345 229 422291175 395
84
24. Substância: Tirosina O,O’-trimetilsilil (Tirosina); Tempo de retenção (Min.):14.0 ;
Similaridade: 94%.
50 100 150 200 250 300 3500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
174
73
200
156100 2585945 128 362230 309114 186 289
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
179
73
20821945 31014691 130119 165 29210357 265 325
85
25. Substância: D-Frutose 1,3,4,5,6-O-trimetilsilil O-metil oxima (D-Frutose); Tempo
de retenção (Min.): 14.6; Similaridade: 91%.
26. Substância: D-Glicose 2,3,4,5,6-O-trimetilsilil O-metil oxima (D-Glicose); Tempo
de retenção (Min.): 14.8; Similaridade: 91%.
50 100 150 200 250 300 3500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
73
103217
307147
133277117 36418945 20517358
86
27. Substância: L-Treose 2,3,4-O-trimetilsilil O-metil oxima (L-Treose); Tempo de
retenção (Min.):15.0; Similaridade:74%.
28. Substância: Palmitato de trimetilsil (Ácido palmítico) ; Tempo de retenção (Min.)
15.6; Similaridade: 94%.
50 100 150 200 250 300 3500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
73
319
147
205
160129 217
103117 321
45 189 29123159 277 364262 376344
50 100 150 200 250 300 3500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
20573
147
189 273117
129363103 160
45 25922166231
87
29. Substância: N-Acetil-D-glucosamina 3,4,5,6-O-trimetilsilil O-metil oxima (N-Acetil-
D-glucosamina); Tempo de retenção (Min.): 16.2; Similaridade: 91%.
30. Substância: Mio-Inositol 1,2,3,4,5,6-O-trimetilsilil (Mio-Inositol); Tempo de
retenção (Min.): 16.4; Similaridade: 95%.
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
117
73
313
132
14555
83 20145 97 328269 285185 243229171
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
73
147
319205129
87 217103 173117
243 27445 231189 32156269
88
31.Substância: L-Triptofano N,O-trimetilsilil; Tempo de retenção (Min.): 16.7;
Similaridade: 89%.
100 200 300 400 500 6000.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
73
305217
147
191
265129103432
36729145 393 507343 612
89
32. Substância: D-Galactose 2,3,4,5,6-O-trimetilsilil O-metil oxima (D-Galactose);
Tempo de retenção (Min.):16.8; Similaridade:89%.
33. Substância: Octadecanoato de trimetilsilil (Ácido de octadecanóico); Tempo de
retenção (Min.): 17.0; Similaridade: 95%.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
202
73
45 21957 130 157 23169 83 145117
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
73
319
147
205
103129
217
117 3212298945 18916159 277 291
90
34. Substância: 2'-Desoxiuridina O,O’-trimetilsilil (2'-Desoxiuridina); Tempo de
retenção (Min.: 17.6; Similaridade: 94%.
50 100 150 200 250 300 3500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
117
73
341
132
145
55
20195 35631345 297257185159 243 271215227 327
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
103
73
171
11781129
14545 26159 155 17299 217189
91
35. Substância: Timidina O,O’-trimetilsilil (Timidina); Tempo de retenção (Min.): 17.8;
Similaridade: 95%.
36. Substância: Uridina 2',3',5'-O-trimetilsilil (Uridina); Tempo de retenção (Min.:
18.2; Similaridade:92%.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
103
73
171117
81145129
26145 59 133 169 189 198 217 281225
92
37. Substância: Inosina 2’,3’,4’-O-trimetilsilil O-trimetilsilil (Inosina); Tempo de
retenção (Min.): 18.8; Similaridade: 90%.
50 100 150 200 250 300 350 400 4500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
73
217
259147103169
243129 1914529977 445
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
73
217
230
281
259103 147193
54112930745 348
93
38. Substância: α-D-Glicopiranosil 1,3,4,6-O-trimetilsilil β-D-fructofuranosil 2,3,4,6-O-
trimetilsilil (α-D-Glicopiranosil β-D-fructofuranosil); Tempo de retenção (Min.):19.4;
Similaridade: 95%.
39. Substância: Maltose octa-trimetilsilil O-metil oxima (Maltose); Tempo de retenção
(Min.):19.9; Similaridade: 92%.
50 100 150 200 250 300 350 400 4500.0
25.0
50.0
75.0
100.0%
361
73
217
147 169437363103 271129 243
191 319 45145 89 305281
94
50 100 150 200 250 300 3500.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
73
361
147204 217
103 12945 191169117 243 31928159
