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13.001 - CARACTERIZAÇÃO HISTOLÓGICA DOS PERICÁRDIOS
BOVINO E CAPRINO DESENVOLVIDOS PARA APLICAÇÃO
CIRÚRGICA.
Menezes, M. C. , Braga, V. A. ,
Biotecnologia - UFPB
Introdução:
O pericárdio bovino é rotineiramente utilizado em enxertos biológicos
compatíveis, indicado nos enxertos vasculares, valvulares e em hernioplastias.
Apesar de haver muitos estudos com biomaterial de origem bovina, não há
pesquisas em pericárdio caprino, justificando o estudo.
Objetivos:
Caracterizar histologicamente os pericárdios bovino e caprino mantidos em
glicerina, visando o desenvolvimento de uma alternativa a utilização
dasbiomembranas bovinas, bem como avaliar se a glicerina é indicada como
meio de preservação tecidual.
Métodos:
O trabalho utilizou amostras de animais mortos naturalmente.
Foram coletados somente dois pericárdios: um bovino e outro caprino,
provenientes de dois animais, que tiveram morte natural, criados no Centro de
Ciências Agrárias (CCA) da UFPB. Após manutenção em glicerina por 90
dias, as membranas foram processadas histologicamente pela técnica padrão
em parafina e coradas com hematoxilina e eosina (HE). Para diferenciação
específica das fibras conjuntivas, os pericárdios foram corados com três tipos
diferentes de corantes: Tricromo Masson, Verhoeff e Rio Hortega, que
evidenciam, respectivamente, as fibras colágenas, elásticas e reticulares. Além
disso, as membranas foram medidas dez vezes em micrômetros para
comparação das espessuras.
Resultados:
Macroscopicamente, o pericárdio caprino se demonstrou mais delicado, mais
maleável e mais fino do que o de bovinos. Microscopicamente, essa
característica foi confirmada pela média de 10 medições, pois, o pericárdio
bovino mediu 186µm (±2µm) e o caprino 85µm (±1µm), p<0,05.
Histologicamente, pela coloração HE, observou-se que ambos pericárdios são
constituídos de fibras acidofílicas intactas de tecido conjuntivo, fibroblastos, e
pouco tecido adiposo, demonstrando a boa preservação das fibras em
glicerina. Com a coloração específica, observou-se que ambos pericárdios são
constituídos por fibras colágenas e elásticas na mesma proporção. A coloração
de Masson evidenciou grande quantidade de fibras colágenas e pequena
quantidade de outras fibras. A coloração de Verhoeff nos revelou a presença
de poucas fibras elásticas. Não foram encontradas fibras reticulares com a
coloração de Rio Hortega.
Conclusão:
Os pericárdios bovinos e caprinos são formados por fibras colágenas em
abundância e fibras elásticas em pequena quantidade, além de fibroblastos e
pouco tecido adiposo. Devido a preservação das fibras, a glicerina demonstrou
ser útil na conservação do biomaterial. A espessura do pericárdio bovino é,
aproximadamente, o dobro da espessura do pericárdio caprino. Devido a
grande semelhança na sua constituição tecidual, o pericárdio caprino surge
como alternativa na substituição do pericárdio bovino em cirurgias de
enxertos cardiovasculares e hernioplastias.
Apoio Financeiro:
Capes e CNPq.
Gerado em: 2014-5-21 16:22:56
13.002 - DESENVOLVIMENTO DE UMA PLATAFORMA
NANOESTRUTURADA PARA A DETECÇÃO ELETROQUÍMICA DE
BACTÉRIAS POTENCIALMENTE PATOGÊNICAS
Oliveira, C. V. J. , Nascimento, J. M. , Oliveira, M. D. L. , Oliveira, I. S. ,
Franco, O. L. , Andrade, C. A. S. ,
Departamento de Bioquímica - UFPE Centro Acadêmico de Vitória -
UFPE Centro de Proteômica de Brasília - UnB
Introdução:
Infecções hospitalares são um importante problema de saúde pública em todo
o mundo. As bactérias são responsáveis pela maioria das infecções que
acometem o homem. Entre as bactérias de interesse encontram-se a Krebsiella
pneumoniae, a Escherichia coli e a Enterococcus faecalis, as quais são
responsáveis por graves quadros de infecções do trato gastrointestinal e
urinário. Devida à elevada frequência de contaminação por estas bactérias,
diversas pesquisas vêm sendo desenvolvidas com uma nova classe de
antimicrobianos, os chamados peptídeos antimicrobianos (PAMs). Por outro
lado, o uso de nanotubos de carbono (NTC) na área de nanobiotecnologia tem
ganhado destaque devido as suas propriedades físico-químicas, as quais
permitem a associação dos NTCs com moléculas biológicas com propriedades
de reconhecimento.
Objetivos:
Este trabalho visa o desenvolvimento de uma plataforma de detecção
utilizando NTCs e a clavanina A (clavA), uma isoforma do PAM da família
das clavaninas, para a identificação de bactérias patogênicas (K. pneumoniae)
e potencialmente patogênicas (E. coli e E. faecalis).
Métodos:
O presente trabalho não utiliza em sua metodologia seres humanos ou animais
para fins de experimentação de seu objeto de estudo. As análises
experimentais foram realizadas por meio de voltametria cíclica (VC) e
espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE), utilizando uma célula
convencional contendo três eletrodos imersos em solução ferro-ferricianeto de
potássio. O eletrodo foi modificado primeiramente com cisteína (cis), foi
utilizado o composto ativador EDC (1-etil-3-[3-
dimetilaminopropil]carbodiimida) e o NHS (N-hidroxisuccinimida), seguido
da adição do NTC e da clavA. As amostras bacterianas foram utilizadas na
concentração de 106 cfu/mL e adicionadas ao sistema cis-EDC:NHS-NTC-
clavA através de droap-coating.
Resultados:
As análises das etapas de construção do sistema sensor demonstraram
aumentos sucessivos da resistência elétrica correspondente à efetiva
automontagem do sistema, fato evidenciado pela diminuição dos picos
anódicos e catódicos do voltamograma e aumento da resposta impedimétrica
após a adição de cada componente. Após 20 minutos de exposição às amostras
bacterianas, foi realizada a análise eletroquímica para avaliar eficiência da
plataforma sensora. Foi observado uma maior redução dos picos voltamétricos
e aumento da resposta impedimétrica em comparação à resposta obtida apenas
com o sistema sensor. Isso indica que houve a ligação entre a clavA e a
membrana bacteriana. Adicionalmente, foi observada uma maior resposta para
as bactérias gram-negativas. Isto ocorre devido ao fato da clavA apresentar
carga residual catiônica e ter maior atração por membranas com lipídios
carregados negativamente, como as bactérias gram-negativas apresentam uma
segunda camada lipídica mais externa ocorre uma melhor interação do PAM
com os lipídeos de membrana.
Conclusão:
De acordo com os resultados obtidos, o desenvolvimento de uma plataforma
biossensora composta por NTCs e a clavA apresenta eficiência e boa
sensibilidade para detecção e identificação de amostras contendo células
bacterianas. Desta forma, o sistema NTC-clavA pode ser utilizado na
construção de um biodispositivo rápido e eficiente para detecção de agentes
infecciosos de interesse clínico.
Apoio Financeiro:
FACEPE, Capes-Rede Nanobio e CNPq.
Gerado em: 2014-5-21 16:22:56
13.003 - PURIFICAÇÃO PARCIAL E CARACTERIZAÇÃO DE UMA
PROTEASE ALCALINA DO PEIXE PIRARUCU (Arapaima gigas) E
SEU POTENCIAL USO COMO ADITIVO PARA DETERGENTES
COMERCIAIS
Monte, F. T. D. , Nascimento, L. C. P. , Silva, M. M. , Ferreira, A. C. M. ,
Roberto, N. A. , Ferreira, A. C. M. , Lino, L. H. S. , Andrade, D. H. H. ,
Costa, H. M. S. , Freitas-Jr., A. C. V., Bezerra, R. S. ,
Departamento de Bioquímica - UFPE
Introdução:
A pesca representa um importante segmento na economia mundial. O
aumento da produção pesqueira e, consequentemente, do volume de pescado
processado mundialmente, tem gerado uma grande quantidade de resíduos e
de subprodutos. Diversos estudos indicam que os subprodutos do
processamento do pescado podem ser utilizados como fontes alternativas para
obtenção de biomoléculas, como enzimas, sendo passíveis de aplicação em
diversos segmentos do setor industrial. Adicionadas na formulação do sabão
em pó, estas proteases podem hidrolisar manchas proteicas como sangue,
leite, suor, entre outros. Seu desempenho é influenciado por diversos fatores, e
devem ser compatíveis com outros ingredientes da formulação do detergente,
como agentes oxidantes e surfactantes. Além de ser o maior peixe da
Amazônia, o pirarucu (Arapaima gigas) é considerado uma espécie de alto
interesse comercial e um dos peixes mais valorizados no mercado.
Objetivos:
O presente trabalho teve como objetivo purificar, caracterizar e avaliar o
potencial biotecnológico de uma protease alcalina obtida a partir de vísceras
do peixe pirarucu (Arapaima gigas).
Métodos:
O presente trabalho não possui código de experimentação animal, pois se trata
da utilização de resíduos (sub-produtos) da indústria pesqueira. Não houve
abate de espécimens para a realização de tal projeto. Vísceras de cinco
espécimes de pirarucu foram adquiridas através de resíduos de exemplares
cultivados na Estação de Aquicultura Continental Johei Koike – UFRPE, e
transportadas até o Laboratório de Enzimologia (LABENZ) na Universidade
Federal de Pernambuco (20 minutos de transporte, mantidas em gelo), para a
realização do extrato bruto (30 minutos para a sua produção). Uma protease
alcalina extraída do intestino do pirarucu foi purificada em três etapas:
tratamento térmico, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de
afinidade em coluna benzamidina-agarose. Após as etapas de purificação
foram realizadas SDS-PAGE e zimogramas com a fração obtida. A atividade
enzimática foi realizada utilizando azocaseína 1% (p/v) como substrato para
proteases alcalinas, e BApNA 8mM como substrato específico para tripsina.
As propriedades fisicoquímicas da enzima purificada (temperatura ótima,
estabilidade térmica, pH ótimo e estabilidade ao pH), assim como o efeito de
inibidores (PMSF, TLCK, TPCK, EDTA e benzamidina), foram avaliados
utilizando BApNA 8mM como substrato. Peróxido de hidrogênio (H2O2) foi
utilizado nos testes para efeito de agentes oxidantes, bem como Coleato de
Sódio, SDS e Tween 20 nos testes para efeito de agentes surfactantes. Nos
testes de compatibilidade com detergentes comerciais, foram utilizados os
seguintes: Ace (Procter & Gamble), Ala (Procter & Gamble) e Bem-te-vi
(Alimonda). Os controles foram realizados substituindo-se os
agentes/detergentes por água na reação.
Resultados:
Após a realização de todas as etapas, um fator de purificação de 93 vezes foi
obtido, com rendimento de 9%. Uma única banda com massa molecular
aparente de aproximadamente 30,8 kDa foi observada através de SDS-PAGE.
Através de zimograma, apenas uma banda proteolítica foi observada. O pH e a
temperatura ótima da reação encontrados foram 9,0 e 55°C, respectivamente.
Após 30 minutos de incubação, a enzima mostrou-se estável, em ampla faixa
de pH alcalino (pH 6,5 - 10,5) e foi detectada uma perda de 20% da atividade
tríptica à 70°C. A enzima manteve cerca de 44% de sua atividade na presença
de PMSF (inibidor de serinoproteases), cerca de 37% na presença de EDTA
(inibidor de metaloproteases), e perdeu toda a sua atividade na presença de
TLCK e benzamidina (inibidores clássicos de tripsina), não sendo inibida pelo
TPCK (inibidor de quimotripsina). A enzima manteve praticamente 100% de
sua atividade inicial na presença de agente oxidante, mostrando ser estável
mesmo em altas concentrações de peróxido de hidrogênio. A protease alcalina
também apresentou significativa estabilidade a alguns agentes surfactantes,
mantendo cerca de 99% de sua atividade na presença de Tween 20, e cerca de
80% de sua atividade na presença de Coleato de Sódio, sendo inibida apenas
pelo Dodecil Sulfato Sódico (SDS). A enzima manteve cerca de 77% de sua
atividade na presença do sabão Ace®, 55% na presença do sabão Bem-te-vi®,
e cerca de 40% na presença do sabão Ala®.
Conclusão:
Uma protease alcalina foi purificada utilizando uma única etapa
cromatográfica, a partir do intestino de A. gigas. A caracterização com
substratos e inibidores específicos produzem evidências de que a protease
purificada é provavelmente uma tripsina símile. A enzima demonstrou
características interessantes como alta atividade em pH alcalino e
temperaturas elevadas, além de termoestabilidade e compatibilidade com
componentes da formulação de detergentes. Estas características confirmam
que vísceras de peixes, podem ser utilizadas como fonte importante de
proteases alcalinas com potencial para aplicação industrial, principalmente na
indústria de detergentes.
Apoio Financeiro:
CNPq, CAPES, FACEPE, FINEP/RECARCINE.
Gerado em: 2014-5-21 16:22:56
13.004 - DESENVOLVIMENTO DE UM GENOSSENSOR PARA
LEISHMANIA CHAGASI BASEADO EM NANOPARTÍCULAS DE
OURO
Garcia, M. F. K. S. , Andrade, C. A. S. , Santos, J. F. , Balbino, V. Q. ,
Oliveira, M. D. L. ,
Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas - CCB UFPE
Bioquímica - BIONANO UFPE Genética - UFPE
Introdução:
A Leishmania é um gênero de protozoários da família Trypanosomatidae
transmitida ao homem por flebotomíneos. Causada por espécies do gênero
Leishmania do complexo donovani, destacando-se a Leishmania chagasi. O
número de cães infectados constitui um problema na transmissão para
humanos. A modificação do eletrodo, com nanopartículas metálicas tem
levado ao desenvolvimento de sensores eletroquímicos; em particular, as
nanopartículas de ouro. Os nanocompósitos de ouro e polianilina
(NcAuPANi) tem propriedades elétricas e ópticas diferenciadas que os tornam
elementos para o desenvolvimento de sistemas biossensíveis. O uso de
NcAuPANi advém da possibilidade do uso deste sistema para imobilização de
ácidos nucléicos na superfície do eletrodo.
Objetivos:
O presente estudo possui como objetivo avaliação impedimétrica da adsorção
do sistema AuNpPANi, Primer LITSR e Genoma para o desenvolvimento de
um biossensor para Leishmania chagasi.
Métodos:
Este trabalho é uma pesquisa de base para o desenvolvimento de um
biossensor eletroquímico e desta forma não envolve experimentação humana
nem animal. O eletrodo de trabalho (ET) utilizado foi de ouro modificado com
o nanocompósito e o primer, o eletrodo de ouro como contra eletrodo e o de
referência foi o Ag/AgCl saturado com KCl. O ET foi polido com alumina
0,5um e sonicado por 1 minuto em água deionizada, e seco com nitrogênio
(N2). Os espectros de impedância foram obtios nas faixas de frequência de
100 mHz a 100kHz com amplitude do potencial aplicado de 10 mV. Tem sido
realizada três repetições para cada ensaio. Em seguida, o eletrodo foi imerso
no sistema NcAuPANI por 2min, em seguida foi gotejado 2uL do primer para
formação do sistema NcAuPANi-PRIMERLeishmania.. Após obtenção do
sistema NcAuPANi-PRIMERLeishmania, o mesmo submetido a incubação
com o genoma de pacientes contaminados (n=3) com L. chagasi diluídos em
tampão fosfato de sódio pH 7,4.
Resultados:
Os dados de EIE demonstraram um aumento da resistência de transferência de
carga (RTC), devido à adsorção dos componentes, AuNpPANI e primer. O
eletrodo de ouro limpo (Au) exibiu um comportamento quase linear,
característico de um processo eletroquímico limitado por difusão, já o eletrodo
modificado com AuNpPANi e AuNpPANi-primer exibiu um aumento do
RTC com destaque para o sistema AuNpPANi-primer, por causa da interação
eletrostática entre os grupos fosfatos carregados negativamente da sonda com
os carregados positivamente do nanocompósito. Após a obtenção do sistema
AuNpPANi-primerLeishmania avaliamos a viabilidade da sonda LITSR
imobilizada sobre o compósito AuNpPANI para detecção do genoma de
Leishmania. Pode-se observar o processo de interação do primer-genoma de
Leishmania, através do aumento da RTC. A reprodutibilidade do biossensor
foi avaliada a partir da resposta de RTC % para a detecção de Leishmania
apresentando um valor aceitável de R.S.D. de 2,4%. Pode-se observar que
quando o sistema AuNpPANi-PRIMERLITSR interagiu com o genoma
concentrado (1 ng/uL) houve um aumento mais pronunciado da RTC em
relação à análise do genoma diluído (0,1ng/uL, 0,01ng/uL e 0,001ug/uL). Este
processo está relacionado a quantidade de moléculas disponíveis para a
biointeração.
Conclusão:
Através dos resultados obtidos pode-se concluir que o sistema NcAuPANi-
primerL.chagasi-genoma é viável para a biodetecção de leishmaniose,
apresentando boa sensibilidade e reprodutibilidade.
Apoio Financeiro:
Rede Nanobio/Capes, CNPq.
Gerado em: 2014-5-21 16:22:56
13.005 - CONSTRUÇÃO DE UMA PLATAFORMA
NANOESTRUTURADA PARA DESENVOLVIMENTO DE
BIOSSENSOR PARA SCHISTOSOMA
Santos, G. S. , Andrade, C. A. S. , Balbino, V. Q. , Oliveira, M. D. L. ,
Bioquímica - UFPE Ciências Biológicas - UFPE Genética - UFPE
Introdução:
: A Esquistossomose é um grave problema de saúde pública,
apresentandoampla distribuição geográfica, consistindo em uma das
parasitoses mais difundidas pelo mundo. Os métodos atuais de diagnóstico são
de baixa sensibilidade, demorados, complicados, ou exigem compostos
marcadores adicionais. O desenvolvimento de métodos sensíveis, rápidos,
resistentes e seletivos para detecção de antígenos de Schistosoma é de suma
importância. Neste contexto destacamos o uso da determinação eletroquímica.
Atualmente, as nanopartículas são elementos essenciais para o
desenvolvimento de sistemas biossensíveis com o uso de DNA e RNA, sendo
os genossensores eletroquímicos ferramentas úteis na detecção de um analito
de interesse, tal como genoma de esquistossomose.
Objetivos:
O presente estudo objetiva a construção de uma plataforma nanoestruturada
para desenvolvimento de um biossensorimpedimétrico para detecção do
Schistosoma mansoni.
Métodos:
o trabalho não possui experimentação animal ou humana, pois trata-se de um
trabalho de base para o desenvolvimento de um biossensor eletroquímico. Os
experimentos de EIE (Espectroscopia de Impedância Eletroquímica)e
Voltametria Cíclica (VC) foram realizados em uma célula convencional de
três eletrodos. O eletrodo de trabalho utilizado, foi o ouro modificado com as
camadas, o eletrodo de platina como contra eletrodo e o de referência foi o
Ag/AgCl saturado com KCl, imersos em solução de 10mM de ferro-
ferricianeto de potássio. O eletrodo de ouro foi polido com água deionizada e
depois submetido a potenciais de -0,2 a 0,7 V. Os espectros de impedância
foram registrados na faixa de frequências de 100 mHz a 100kHz. A montagem
das camadas teve a seguinte sequencia: adição de 2µl da solução de ácido
mercaptobenzóico(AMB) por 2min na superfície do eletrodo, em seguida
gotejou-se 2µl da solução de EDC:NHS por 10min, logo após adicionou-se
2µl do NPsFe3O4/Aupor 10 min. Posteriormente, acrescentou-se a
Sondaschistosoma e por fim o genoma, na superfície do eletrodo. As análises
de adsorção ao eletrodo foram realizados após cada etapa de modificação da
superfície.
Resultados:
Nas análises de EIE foram observados comportamentos característicos do
processo de modificação do eletrodo. Inicialmente, o gráfico de Nyquist para
o eletrodo de ouro refletiu um comportamento limitado por difusão, e após a
adição progressiva das camadas na superfície do eletrodo (AMB;
EDC:NHS;NPsFe3O4/Au; Sondaschistosoma egenoma), observou-se um
aumento gradual da resistência à passagem da corrente elétrica(Re),
evidenciado pelo aumento no diâmetro do semicírculo do diagrama de
Nyquist. Pode-se observar que após a interação do sistema AMB-
NPsFe3O4/Au-Sonda com o genoma de Shistosoma, houve um grande
aumento na Re, o que está associado ao processo debioreconhecimentodo
sistema via hibridação. Na análise do VC, foi observado que após a
modificação gradativa do eletrodo, houve uma diminuição na resposta
amperométrica do sistema,o levou a uma diminuição dos picos das ondas
catódicas e anódicas da sonda redox. Em adição, após o processo de
hibridação a curva voltamétricadismostrou um comportamento sigmoidal
característico de processoquase-reversível.Estes resultados comprovam a
interação do sistema NPsFe3O4/Au-Sondaschistosomacom o genoma.
Conclusão:
Os resultados demonstraram que a plataforma construída mostrou-se eficiente
para a construção de um biossensorseletivopara sequências específicas do
genoma do Schistosoma.
Apoio Financeiro:
Rede Nanobio/Capes, CNPq.
Gerado em: 2014-5-21 16:22:56
13.006 - ESPECTROSCOPIA DE IMPEDÂNCIA ELETROQUÍMICA
APLICADA AO DESENVOLVIMENTO DE BIODISPOSITIVO
NANOESTRUTURADO PARA O DIAGNÓSTICO DA DENGUE
Avelino, K. Y. P. S. , Andrade, C. A. S. , Melo, C. P. , Correia, M. T. S. ,
Coelho, L. C. B. B. , Nogueira, M. L. , Oliveira, M. D. L. ,
Departamento de Bioquímica - UFPE Departamento de Física - UFPE
Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias - FAMERP
Introdução:
A dengue é considerada a arbovirose mais importante que afeta o homem em
termos de morbidade e mortalidade. Esta é causada por um arbovírus de RNA
que possui quatro sorotipos geneticamente distintos (DS1, DS2, DS3 e DS4)
responsáveis por ocasionar três síndromes clínicas: dengue clássica, dengue
hemorrágica e síndrome do choque da dengue (Méd. Mal. Infect., 25; 888,
1995). Em decorrência do amplo espectro clínico, a obtenção de um
diagnóstico preciso é essencial para a implementação de medidas terapêuticas
eficazes para a dengue. Nesta área, os biossensores destacam-se por serem
dispositivos que fornecem informações analíticas específicas e seletivas, de
forma rápida e a um baixo custo (Anal. Chim. Acta, 681; 8, 2010).
Objetivos:
O presente trabalho possui como objetivo principal estudar a bioatividade da
lectina de Cratylia mollis (CramoLL) adsorvida em superfície modificada por
nanopartículas de ouro e polianilina (AuNpPANI) para detecção de
glicoproteínas presentes nos sorotipos DS1, DS2 e DS3, e nos soros de
indivíduos com dengue clássica (DC) e dengue hemorrágica (DH).
Métodos:
Este trabalho é uma pesquisa de base para o desenvolvimento de um
biossensor eletroquímico e desta forma não envolve experimentação humana
nem animal. Os experimentos de espectroscopia de impedância eletroquímica
(EIE) foram realizados em um Potenciostato/Galvanostato MicroAutolab
associado a uma célula convencional de três eletrodos imersos em solução de
ferro-ferricianeto de potássio a 10mM. Os espectros de impedância foram
obtidos numa faixa de frequência entre 100 mHz a 100 KHz com um
potencial de amplitude alternada de 10 mV. O eletrodo biomodificado foi
obtido após a adsorção eletrostática do sistema AuNpPANI-CramoLL através
do método de automontagem por imersão. Em seguida, o biodispositivo foi
exposto aos soros de pacientes infectados com o vírus tipo 1, 2, 3 e aos soros
de DC e DH, a fim de promover a interação lectina-glicoproteína. Para o
estudo dos limites de detecção, um número de cinco amostras nas diluições de
1:80, 1:50, 1:30, 1:10 e sem diluição foram analisadas para cada espécie de
soro da dengue e três repetições foram realizadas para cada ensaio.
Resultados:
A impedância eletroquímica possibilitou o monitoramento dos processos de
modificação da superfície do eletrodo de trabalho (eletrodo de ouro) e a
avaliação da bioatividade do sistema de detecção. Através das análises pode-
se observar que a curva de impedância para o eletrodo não modificado em
solução eletrolítica possui um semicírculo bastante pequeno e um
comportamento quase linear. A adsorção do complexo AuNpPANI-Cra
origina uma camada auto-organizada sobre a área de trabalho bloqueando
parcialmente o processo de oxido-redução dos eletrólitos na superfície do
eletrodo. Ao expor o biossensor aos sorotipos da dengue, verifica-se um
aumento na resistividade do sistema. Este fato indica que a lectina CramoLL é
capaz de reconhecer resíduos de carboidratos presentes em proteínas das
amostras biológicas, entretanto, os resultados demonstram que para o sorotipo
DS3 houve uma maior interação lectina-glicoproteína, seguida dos sorotipos
DS1 e DS2. Ao avaliar a atividade biomolecular do sensor frente aos soros de
pacientes com DC e DH, podem-se observar diferentes graus de
reconhecimento glicoprotéico, onde os valores de impedância real e
imaginária dos diagramas de Nyquist foram maiores para os soros de DH em
relação ao de DC. Os resultados obtidos demonstraram elevados níveis de
confiança com desvio padrão inferior a 10% para todas as amostras
biológicas.
Conclusão:
A partir das análises eletroquímicas, pode-se concluir que o biodispositivo
nanoestruturado baseado em AuNpPANI-CramoLL é capaz de detectar
glicoproteínas presentes nos soros de pacientes com DC e DH, além dos
sorotipos virais DS1, DS2 e DS3. Portanto, por apresentar sensibilidade,
reprodutibilidade e diferentes perfis de reconhecimento glicídico para cada
amostra em estudo, o sistema AuNpPANI-CramoLL poderá ser utilizado para
a construção de um método diagnóstico para a dengue.
Apoio Financeiro:
CNPq, CAPES-Rede nanobio/ELINOR e FACEPE.
Gerado em: 2014-5-21 16:22:56
13.007 - DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR
VOLTAMÉTRICO PARA TUBERCULOSE BASEADO EM
CAMADAS DE POLIALILAMINA E ACIDO
MERCAPTOBENZÓICO 1Costa, M.P.*, 2Andrade, C.A.S., 3Melo,
F.L., 1,2Oliveira, M.D.L. 1- Programa de Pós-Graduação de Bioquímica
e Fisiologia, Centro de Ciências Biológicas, UFPE, Recife/PE. 2-
Departamento de Bioquímica, Centro de Ciências Biológicas, UFPE,
Recife/PE. 3-Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, UFPE, Recife/PE.
Costa, M. P. , Andrade, C. A. S. , Melo, F. L. , Oliveira, M. D. L. ,
Bioquímica - UFPE Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - UFPE
Introdução:
A tuberculose é uma infecção global causada pelo Mycobacterium
tuberculosis (MTB) representando um problema de saúde pública.
Atualmente, o desenvolvimento de um teste rápido e eficiente para a
identificação de MTB é de extrema importância para o tratamento de
pacientes e proteção de profissionais da área de saúde. Os testes clínicos para
MTB são dependentes de cultura necessitando de tempo para o crescimento
do microrganismo. Desta forma, os biossensores eletroquímicos destacam-se,
por apresentar baixo custo e rapidez nas análises.
Objetivos:
O objetivo deste trabalho foi avaliar através da análise voltamétrica a
interação do Primer de tuberculose às camadas automontadas de polialilamina
(PAH)-nanopartículas de óxido de ferro (Fe3O4), e de ácido
mercaptobenzóico (AMB)-nanopartículas de óxido de ferro aminada
(NFe3O4) sobre a superfície do eletrodo de ouro (Au) para o desenvolvimento
de um genossensor para tuberculose.
Métodos:
Os experimentos realizados não envolvem a participação de animais nem de
seres humanos. As medidas de voltametria cíclica (VC) foram realizadas
em um Potenciostato AUTOLAB 128N, numa célula eletroquímica
convencional de três eletrodos imersos em 20 mL de solução de ferro-
ferricianeto de potássio, K4[Fe (CN)6] / K3[Fe(CN)6] (1:1), a 10 mM,
atuando como sonda redox. O eletrodo de trabalho utilizado foi o eletrodo de
Au modificado, o eletrodo de referência foi o de Ag?AgCl saturado com KCl
e o contra-eletrodo foi o de platina. Para cada analito adsorvido na superfície
do eletrodo,foram realizados n=3 ensaios,com (A=4) amostras para o
primeiro biossitema e (A=5) amotras para cada etapa do sistema
optimizado.Com um desvio padrão de 4,21. Os ensaios de VC para as
diferentes etapas da construção do biodispositivo, a um potencial de -0,2 a 0,7
V e velocidade de varredura de 50 mV. s-1. O sistema PAH-Fe3O4 foi
adsorvido sobre o eletrodo Au por 20min, em seguida 1mL do PRIMER TB
foi imobilizado sobre o sistema PAH-Fe3O4 por 30min. O AMB (2uL) foi
gotejado sobre a superfície do eletrodo por 2 min e em seguida as NFe3O4
foram imobilizadas sobre a camada de AMB tendo como agentes ligantes o
etilenodieltilcarbodiimida (EDC) e a N-hidroxisuccinimida (NHS) (1:1) por
10min. Em seguida, 1mL do Primer foi imobilizado sobre o sistema AMB-
NFe3O4 por 30 min via EDC:NHS sendo obtido o biosistema AMB-NFe3O4-
PrimerTB .
Resultados:
Através da VC foram obtidas informações sobre os processos de
modificação da superfície do eletrodo e as interações específicas do
biossistema. Em função da óxido-redução dos eletrólitos [Fe (CN)6]4-?
[Fe(CN)6]3- contidos na solução, uma corrente elétrica é gerada devido a
diferença de potencial aplicada na célula eletroquímica. A resposta do
eletrodo de ouro limpo (Au) exibiu um comportamento quase linear que é
característico de um processo eletroquímico limitado por difusão. Após a
imersão do eletrodo Au na solução de PAH, VC da camada revelou um
pequeno aumento da resposta amperométrica do sistema, indicando uma
possível transferência de elétrons entre a sonda redox e a superfície do
eletrodo. Quando as nanopartículas de Fe3O4 foram adicionadas ao PAH
(PAH-Fe3O4) foi obtido um novo incremento da resposta do eletrodo. Após o
primer TB ser adsorvido ao sistema PAH-Fe3O4 não foi observada alterações
significativas na resposta amperométrica total do sistema para os três ensaios
realizados. Desta forma, foi avaliada a adsorção da camada de AMB-NFe3O4
como estratégia para viabilizar a imobilização do Primer,após a adição do
AMB sobre o eletrodo Au, a VC da camada revelou uma diminuição da
resposta amperométrica do sistema, indicando que houve adsorção do AMB
sobre a superfície do eletrodo.Em seguida, após a adição de EDC:NHS, houve
um aumento significativo da resposta amperométrica, no entanto, quando
imobilizadas as nanopartículas de Fe3O4 modificadas houve uma redução das
correntes de pico.Após imobilização da Sonda(tuberculose) no sistema AMB-
NFe3O4 a resposta VC assumiu um caráter mais sigmoidal e com uma nova
queda da resposta amperométrica do sistema ao submeter o sistema sensor
AMB-NFe3O4-Primer a amostras de genoma de tuberculose, o que refletiu o
processo de interação por meio de hibridização de fitas complementares,em
que a resposta foi idêntica para os três ensaios realizados.
Conclusão:
Podemos concluir que o sistema PAH-Fe3O4 não foi satisfatório para a
imobilização da sonda TB que ficou evidenciado com os três ensaios
realizados foi obtido a mesma resposta. Já o sistema AMB-NFe3O4 mostrou
ser uma boa camada para adesão de biomoléculas, podendo ser utilizado pra o
desenvolvimento de um genossensor para a tuberculose em que os três ensaios
realizados para confirmar responderam satisfatoriamente e os resultados
mantiveram constante a resposta do primeiro ao terceiro ensaio.
Apoio Financeiro:
FACEPE,CNPq-CAPES
Gerado em: 2014-5-21 16:22:56
13.008 - Avaliação in vitro das atividades de quitosana de camarão
marinho, condroitim-4-sulfato, gelatina e ZnO em solução para potencial
aplicação na preparação de filmes bioativos
Silva, M. M. , Cahu, T. B. , Silva, R. P. F. , Monte, F. T. D. , Nascimento,
L. C. P., Roberto, N. A. , Ferreira, A. C. M. , Andrade, D. H. H. , Lino, L.
H. S. , Ferreira, A. C. M. , Bezerra, R. S. ,
Bioquímica - UFPE
Introdução:
O setor pesqueiro tem apresentado um expressivo crescimento nos últimos
anos, o que vem gerando quantidades significativas de resíduos. Com a
finalidade de agregar valor a esse material, estudos estão sendo realizados
visando à extração de biomoléculas e suas aplicações em diferentes áreas.
Dentre as biomoléculas de interesse, tem-se a quitosana, um polissacarídeo,
que possui propriedades, como atoxicidade, biocompatibilidade, atividades
antimicrobiana e antioxidante. Diante dessas características, estudos vêm
sendo realizados visando a produçao de biofilmes de quitosana.
Objetivos:
O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade da quitosana, produzida a
partir de resíduos do processamento de camarão, em associação à gelatina,
condroitim 4-sulfato (CS) e partículas de óxido de zinco (ZnO), com relação
aos efeitos citotóxicos, antioxidante e antimicrobiano, através de ensaios in
vitro.
Métodos:
O trabalho foi realizado a partir do processamento industrial de camarões e os
testes foram realizados in vitro, não necessitando de aprovação do comitê de
ética. A quitosana foi produzida por desacetilação alcalina da quitina extraída
de cabeças do camarão marinho Litopenaeus vannamei, apresentando grau de
desacetilação de 82% e peso molecular de150 kDa. A caracterização foi
realizada por espectroscopia de infravermelho (FT-IR), ressonância magnética
nuclear de 1H e 13C e análise elementar. Partículas de ZnO foram sintetizadas
e caracterizadas quanto aos espectros de excitação, emissão e absorção de
fotoluminescência. A gelatina e o CS, compostos envolvidos na estrutura da
matriz extracelular e particularmente da derme, foram obtidos
comercialmente.Os seguintes ensaios foram realizados em triplicata. A
citotoxicidade foi avaliada em cultura de células com as linhagens 3T3
(fibroblastos) e HaCaT (queratinócitos). A determinação da atividade
antibacteriana foi avaliada com o microrganismo Staphylococcus aureus em
meio líquido, sendo o crescimento bacteriano mensurado pela turbidez do
meio através do espectrofotômetro. Para determinação do potencial
antioxidante foi realizado o ensaio espectrofotométrico do efeito quelante de
Fe2+.
Resultados:
As amostras caracterizadas demonstraram espectros característicos para o
polissacarídeo estudado. Partículas de ZnO foram sintetizadas com sucesso,
apresentando um espectro de excitação e de emissão de 331 e 650 nm,
respectivamente, sugerindo a presença de partículas de ZnO. Sob luz u.v.
mostraram luminescência verde. Não foi identificada toxicidade elevada para
nenhum tipo de tratamento, com exceção de algumas associações entre
gelatina e CS com os ZnO, apresentando uma queda na viabilidade celular
tanto para as linhagens de 3T3(viabilidade reduzida para 40% ± 5,0) quanto
HaCat (viabidade reduzida para 37% ± 3,0). Todas as amostras de quitosana
inibiram o crescimento de Staphylococcus aureus. O CS foi o material mais
eficaz em quelar íons ferrosos (85% ±6,0), o que pode contribuir para a ação
antioxidante deste polissacarídeo.
Conclusão:
Estes resultados sugerem que a quitosana de camarão pode ser utilizada como
biomaterial em abordagens biomédicas, como por exemplo, na produção de
filmes bioativos, e suas propriedades podem ser melhoradas com a utilização
de outros materiais biocompatíveis
Apoio Financeiro:
UFPE, CNPq, Facepe.
Gerado em: 2014-5-21 16:22:56
13.009 - Produção e caracterização parcial de tanase por Colletotrichum
gloeosporioides URM 7130 sob Fermentação em Estado Sólido
Sena, A. R. , Gouveia, M. J. , Moreira, K. A. , Assis, S. A. ,
Agroindústria - IFPE Laboratório de Biotecnologia - UFRPE
Laboaratório de Enzimologia - UEFS
Introdução:
Tanase é um biocatalisador que hidrolisa as ligações éster e depsídicas de
galotaninos produzindo ácido gálico e glicose. Na produção de alimentos e
bebidas contribui para a eliminação dos efeitos indesejáveis dos taninos. É
uma enzima que pode ser obtida a partir de fonte microbiana, tais como os
gêneros Aspergillus e Penicillium.
Objetivos:
O objetivo foi produzir e caracterizar parcialmente tanase de C.
gloeosporioides URM 7130 utilizando sementes de jamelão como substrato
sólido.
Métodos:
Não foram realizados experimentos com humanos ou animais O micro-
organismo foi isolado de folhas do jamelão (Syzygium cumini (L) Skeels) e
utilizado para a fermentação. Para ativá-lo foi feito o repique em BDA, pH 6,8
e incubado em B.O.D a 28 °C/10 dias. As sementes foram secas em estufa a
60 °C/24 horas, moídas e passadas em peneira. A estimativa do teor de tanino
das sementes, utilizadas como única fonte de carbono, foi realizada seguindo
o método de precipitação proteica e o meio de fermentação utilizado foi o
Czapeck-Dox, pH 5,5. A fermentação ocorreu em Erlenmeyers a 28 ºC em
B.O.D por 96 h, após inoculação de 2 discos do fungo com 1,3 cm. Após a
fermentação, extraiu-se a enzima com tampão citrato de sódio 0,05 M (pH
5,0) e agitou-se a 180 rpm/1 h. O extrato foi passado através de papel de filtro
e centrifugado (4000 rpm/15 minutos). O sobrenadante foi congelado e
utilizado para ensaios de atividade. A atividade enzimática foi determinada
pelo método da rodanina etanólica utilizando ácido tânico como substrato.
Foram utilizados diferentes valores de pH (3 a 9) e temperaturas (30 a 90 ºC)
para caracterizar a enzima obtida. Todas análises foram realizadas em
triplicata. As análises estatísticas foram realizadas através do Sistema de
Análise de Variância (SISVAR), realizando-se a comparação de médias pelo
teste de Scott-Knott ao nível de 5 % de probabilidade.
Resultados:
O teor de taninos nas sementes do jamelão foi 50,102 mg/g de sementes secas.
A tanase foi produzida utilizando semente de jamelão como única fonte de
carbono, o que é um fator positivo. A atividade máxima de tanase (28,30 ±
0,11 U/mL) foi observada a 40 °C, onde esta diferiu das demais temperaturas
testadas ao nível de 5 % de probabilidade. Já para o parâmetro pH, foi
encontrada uma atividade máxima na faixa entre 4,0 e 6,0. Em relação à
estabilidade da enzima ao pH e temperatura, verificou-se que a tanase de C.
gloeosporioides URM 7130 mostrou 118,50 % de atividade residual a 80 °C,
76,21 % a 60 °C e 78,88 % a 70 °C após 1 hora de incubação. A enzima foi
estável na faixa de pH entre 3 e 9, onde reteve 97,71 e 88,96 % de atividade
residual, respectivamente.
Conclusão:
Pode-se verificar que a utilização de resíduos agroindustriais é uma alternativa
para bioprocessos, já que reduziu a geração destes no meio ambiente e custos
na produção. A tanase apresentou atividade enzimática em todos os tampões,
fazendo-se uma enzima altamente estável em situações diversas de pH. A
tanase também se mostrou termoestável, podendo ser utilizada nos mais
variados processos industriais, tanto para a redução do teor de taninos durante
o processamento de alimentos, quanto para a produção de ácido gálico a partir
da hidrólise do ácido tânico.
Apoio Financeiro:
IFPE
Gerado em: 2014-5-21 16:22:56
13.010 - α-AMILASE INTESTINAL DO Colossoma macropomum:
OBTENÇÃO E PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS
Ferreira, A. C. M. , Andrade, D. H. H. , Lino, L. H. S. , Monte, . F. T. D. ,
Bezerra, R. S. ,
Bioquímica - UFPE
Introdução:
O Colossoma macropomum, tambaqui, é um peixe tropical, nativo dos rios
Amazonas e Orinoco e amplamente distribuído em toda a América do Sul.
Este corresponde à segunda espécie de peixe mais cultivada no Brasil,
apresentando alta importância econômica na alimentação humana e animal. O
crescimento da aquicultura mundial atrelado ao aumento do processamento do
pescado tem gerado grande quantidade de resíduos oriundos da indústria
pesqueira. Estes resíduos apesar de serem descartados no meio ambiente,
muitas vezes sem tratamento algum, correspondem a uma importante fonte de
diversas biomoléculas, como por exemplo, a alfa-amilase que está presente no
trato digestório do animal. A utilização dos subprodutos pesqueiros para
obtenção de biomoléculas além de contribuir para redução do dano ambiental,
atua no desenvolvimento biotecnológico de processos industriais que utilizam
essas biomoléculas.
Objetivos:
Este trabalho teve como objetivo extrair e caracterizar alfa-amilases a partir
do intestino do tambaqui.
Métodos:
As vísceras utilizadas neste trabalho foram obtidas através da Codevasf-
Petrolina (Companhia de Desenvolvimento dos Vales do São Francisco e
Parnaíba), logo não foram realizados procedimentos diretos com o animal
vivo ou mesmo seu sacrifício. As vísceras do animal foram obtidas através da
Codevasf-Petrolina, maceradas com tampão fosfato pH 7.5 10mM, e
centrifugadas a 10.000g durante 25 min a 4°C para obtenção do extrato bruto.
Para caracterização físico-química foram avaliados pH ótimo utilizando os
seguintes tampões: Citrato-HCl (pH 2,5 a 4,5), Citrato-fosfato (pH 4,0 a 7,5),
Tris-HCl (pH 7,2 a 9,0) e NaOH-Glicina (pH 8,7 a 11,5); temperatura ótima
(25 a 70°C) e estabilidade térmica (incubação da solução enzimática durante
30 min em temperaturas de 25 a 70°C). Para mensurar a atividade amilolítica,
foi utilizado amido 2% como substrato, e DNSA para quantificar os açúcares
redutores. Foi realizado um controle enzimático sem a presença de substrato, e
um branco sem a presença da enzima. Todos os experimentos foram
realizados em triplicata.
Resultados:
A alfa-amilase apresentou maior atividade em meio neutro-alcalino,
apresentando discreta atividade em meio ácido. O pH ótimo da enzima foi de
7.0 +/- 0.013, sendo mantidos até 90% +/- 2.82% de atividade no pH 8.5. A
alfa-amilase apresentou temperatura ótima a 40°C +/- 0.033, sendo estável
durante 30 minutos sem sofrer desnaturação térmica, com atividade
amilolítica de 104.2% +/- 0.026 após o período de incubação.
Conclusão:
Alfa-amilases com alta atividade amilolítica podem ser obtidas através dos
resíduos pesqueiros correspondendo a uma importante e inovadora fonte de
enzimas. A alfa-amilase extraída do intestino do Colossoma macropomum
apresentou características importantes ao mercado enzimático, como atuarem
em meio alcalino e serem termoestáveis, propriedades essas que indicam seu
potencial uso em diversos setores da biotecnologia industrial.
Apoio Financeiro:
CNPq, Capes, FACEPE.
Gerado em: 2014-5-22 10:12:31
13.011 - ESTUDO BIOELETROQUÍMICO DA INTERAÇÃO DA
LECTINA DE Cratylia mollis/GLICANOS EMPREGANDO
ELETRODOS BASEADOS EM NANOTUBOS DE CARBONO.
Silva, P. M. S. , Dias, A. C. M. S. , Silva, B. V. M. , Coelho, L. C. B. B. ,
Dutra, R. A. F. , Correia, M. T. S. ,
Bioquímica - UFPE Engenharia Biomédica - UFPE
Introdução:
O estudo das interações lectina-glicanos é importante na elucidação dos
processos de diferenciação celular associados à neoplasias. CramoLL, lectina
de sementes de Cratylia mollis, já foi alvo em estudos de glicosilação no
câncer de mama e próstata (J.Biomed. Biotechnol. 6, 2010). Metil-α-D-
manopiranose (MeαMan), um monossacarídeo, e fetuína, uma glicoproteína,
são glicanos específicos para CramoLL (App. Biochem. Biotechnol. 55:261,
1995). Sensores eletroquímicos podem constituir-se em ferramentas
eficientes, pois quantificam interações moleculares de modo mais prático
comparados aos métodos convencionais (Toxic. 60:878, 2012). Maior
sensibilidade nestes sensores pode ser alcançada com nanotubos de carbono
(NTC), que proporcionam maior velocidade na transferência eletrônica
(Microchem. J. 109:10, 2013).
Objetivos:
Avaliar as interações CramoLL–glicano empregando sensor eletroquímico
baseado em NTCs.
Métodos:
Os experimentos realizados neste trabalho não envolvem animais ou
humanos/amostras de humanos. Os estudos foram realizados em um sistema
utilizando eletrodo de trabalho de carbono vítreo (ECV), eletrodo auxiliar de
platina e eletrodo de referência de Ag/AgCl conectados a um potenciostato
(Ivium Technologies,NDL). As medidas de voltametria cíclica (VC) foram
obtidas na faixa – 0,1 a 0,5 V, 50 mV/s, em solução de 5 mmol/L de
K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 em 100 mmol/L de KCl como sonda redox. O
eletrodo de trabalho foi preparado com filme de poli-L-lisina recoberto por
uma camada de NTCs carboxilados. Após imobilização de CramoLL nos
NTCs, os sítios reativos não específicos foram bloqueados com glicina. Para
estudos das interações, os eletrodos foram incubados (20 min) com soluções
de MeαMan 0,01; 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; e 0,5 M e fetuína [(0,01; 0,1; 0,5;
1,0; 2,5 e 5) x10-6 M], preparadas em 0,15M de NaCl. As correntes de pico
catódico (µA), as variações de corrente (Ibranco - Iglicano) e as áreas (%) das
VCs foram obtidos utilizando o software Ivium e o OriginPro 8 (OriginLab).
Os desvios padrão foram obtidos considerando n=3 medições.
Resultados:
NTCs promoveram aumento de 73,98%±4,04% na área eletroativa,
confirmando que foram depositados na superfície eletródica. A imobilização
de CramoLL foi evidenciada pela redução dos picos de corrente catódicos,
dado a sua natureza isolante. Houve redução de corrente dos picos na presença
dos glicanos, em comparação com a resposta sem os glicanos (branco). As
variações de corrente após interação com MeαMan, de 0,01 a 0,5 M, foram
3,25±0,01; 3,41±0,05; 3,50±0,04; 3,64±0,01; 3,85±0,02 e 4,10±0,01 µA, e
com fetuína foram 3,96±0,05; 4,51±0,03; 5,38±0,01; 6,58±0,01; 7,47±0,02 e
8,52±0,01 µA, de 0,01 a 5 (x10-6)M. A sensibilidade para MeαMan foi 3,96
µA/M e para fetuína 2,51x 106 µA/M. A constante de dissociação da
interação lectina-monossacarídeo é aproximadamente 1 mM, e com
glicoconjugados aproxima-se de 10 µM (Anal. Biochem. 274:203, 1999),
havendo uma maior afinidade na interação lectina-glicoconjugado, o que pode
explicar a maior sensibilidade na interação CramoLL-fetuína neste trabalho.
Conclusão:
A plataforma sensora foi sensível para detectar os glicanos utilizados podendo
ser útil para estudo de glicosilação em patologias como câncer.
Apoio Financeiro:
FACEPE,CNPq e CAPES.
Gerado em: 2014-5-22 10:12:31
13.012 - DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR BASEADO EM
MONOCAMADAS AUTO-ORGANIZADAS DE PEPTÍDEO
ANTIMICROBIANO PARA DETECÇÃO DE ESCHERICHIA COLI
Bezerra, T. M. O. , Oliveira, M. D. L. , Franco, O. L. , Andrade, C. A. S. ,
Bioquímica - UFPE Bioquímica - UCB
Introdução:
A Escherichia Coli é uma bactéria que habita naturalmente o intestino
humano, podendo até contribuir para a absorção dos nutrientes, porém quando
vai para outras partes do organismo humano pode provocar várias doenças. A
contaminação pode ser através de alimentos e da água. Diante disso esforços
têm sido realizados para a obtenção de um sensor com o desempenho desejado
em termos de sensibilidade e especificidade para detecção desta bactéria.
Ensaios realizados com imunossensores possuem grande vantagem, pois
apresentam especificidade, rapidez e baixo custo. Em adição, peptídeos
antimicrobianos mostram-se eficazes na interação com certos organismos
patogênicos, sendo desta forma, utilizados como ferramentas para estudo de
interação com bactérias, destacando-se o peptídeoclavanina A (Clav A).
Objetivos:
Elaboração de um imunossensor piezoelétrico baseado em monocamadas
auto-organizadas visando à detecção da bactéria Escherichia Coli em curto
intervalo de tempo.
Métodos:
O trabalho não envolve experimentação animal nem humana,uma vez que se
trata de pesquisa básica de estudo gravimétrica para avaliação da bioatividade
de um peptídeo. As variações de frequências foram registradas por um
contador de frequência acoplado a um microcomputador. Inicialmente para a
realização dos ensaios, os respectivos harmônicos de oscilação do cristal e
parâmetros de dissipaçãoforam estabilizados injetando-se água deionizada em
fluxo contínuo por 5 min. Posteriormente, injetou-se em fluxo uma solução
aquosa de L-Cisteína recém-preparada para modificação química do cristal
por 5 min. Após a injeção o fluxo foi desligado e a solução ficou em contato
com o cristal por mais 20 min. Em seguida foi injetada uma solução recém
preparada de carbodiimida e N-hidroxisuccinimida (EDC:NHS) misturada
com a partícula de ouro (NPsAu) modificada pela cisteína (10³) e a Clav, por
30 min.Após a obtenção do sistema biossensível o fluxo foi ligado novamente
e 100 uL da bactéria Escherichia Coli (10², 10³, 10?, 10? e 10? UFC/mL) foi
injetado na superfície do eletrodo modificado.Os ensaios foram realizados em
triplicata utilizando, pelo menos, três sensores diferentes.
Resultados:
A adsorção da bactéria resulta em respostas que confirmam um aumento na
massa presente na superfície do cristal, diminuindo a frequência do sensor.
Foi obtido um sensorgrama que reflete cada passo realizado para a
modificação do eletrodo. Na primeira etapa foi adicionada a cisteína (cys)
para a formação da monocamada (DF = 4994814Hz). Após a adição do
sistema EDC:NHS-NPsAuCys-Clav A (DF = 4994829Hz) houve uma nova
variação da resposta, promovendo uma diminuição da frequência. Este
processo denota que a superfície foi modificada pelo sistema em estudo. Após
obtenção da superfície modificada com Cys-NPsAuCys-Clav A foi possível
observar sinal de interação do sistema com E. coli (DF = 4994862 Hz). A
variação de resposta foi proporcional a concentração da bactéria testada. Estes
resultados estão de acordo com a equação de Sauerbrey. Os sensores obtidos
apresentam excelente reprodutibilidade possuindo desvio padrão de, no
máximo, 10%.
Conclusão:
No presente trabalho o sistema Cys-NPsAuCys-Clav A foi capaz de detectar
E. coli em diferentes concentrações. Desta forma, o referido sistema poderá
ser utilizado como biossensor para biodetecção da Escherichia Coli podendo
auxiliar no diagnóstico e tratamento em pacientes infectados.
Apoio Financeiro:
CAPES/Nanobio
Gerado em: 2014-5-22 10:12:31
13.013 - PURIFICAÇÃO PARCIAL DE PROTEASE DE Mytella
charruana (BIVALVIA: MYTILIDAE)
Souza, M. F. D. , Procopio, T. F., Paiva, P. M. G. , Pontual, E. V. ,
Napoleao, T. H. ,
Bioquímica - UFPE
Introdução:
Proteases são enzimas que catalisam seletivamente a hidrólise de ligações
peptídicas, resultando na degradação de proteínas. As proteases apresentam
diversas aplicações biotecnológicas nas indústrias química, farmacêutica e
alimentícia, dentre outras. O mexilhão Mytella charruana (sururu) é nativo do
leste do Oceano Pacífico, mas tem ampla ocorrência nas Américas Central e
do Sul, sendo bastante difundido no nordeste do Brasil. O isolamento de
proteases de M. charruana foi estimulado pela necessidade de novas fontes de
enzimas para aplicação biotecnológica.
Objetivos:
Purificar protease(s) a partir da massa visceral de M. charruana através de
precipitação proteica com sulfato de amônio e cromatografia em coluna de
troca iônica.
Métodos:
Os experimentos realizados nesse trabalho não necessitam de aprovação por
comitê de ética em experimentação animal ou humana. Os autores possuem
autorização (38690-1) do ICMBio/IBAMA para coleta dos moluscos. A massa
viceral (10 g), obtida de mexilhões vivos anestesiados por imersão em gelo,
foi homogeneizada com tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 (100 ml) em
liquidificador durante 5 minutos. Em seguida, o homogenato foi centrifugado
(9.000 x g, 15 min) e o sobrenadante correspondeu ao extrato bruto. O extrato
foi tratado com sulfato de amônio (60% de saturação) durante 4 h a 28 ºC. A
fração de proteínas precipitadas (FP) e a fração sobrenadante (FS) obtidas
após centrifugação (9.000 g, 15 min, 28 ºC) foram dialisados contra água
destilada (2 h) e Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 (2 h) e avaliados quanto à
concentração de proteínas (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275, 1951) e
atividade caseinolítica utilizando azocaseína como substrato (Azeez et al.,
Phytochemistry 68: 1352-1357, 2007). Uma unidade de atividade
caseinolítica foi definida como a quantidade de enzima que aumenta em 0,01
a absorbância em relação ao controle. FP foi então cromatografada em coluna
DEAE-celulose equilibrada com Tris-HCl 0,1 M pH 8,0. A eluição das
proteínas adsorvidas à matriz foi realizada com tampão Tris-HCl 0,1 M pH
8,0 contendo NaCl 1,0 M e o pool eluído (frações 11-16) foi avaliado quanto à
concentração de proteínas e atividade caseinolítica.
Resultados:
O extrato de M. charruana apresentou atividade caseinolítica de 339,5 U/mg.
O tratamento com sulfato de amônio, seguido de diálise, resultou em fração de
proteínas precipitadas (FP) sem atividade caseinolítica e fração sobrenadante
(FS) contendo atividade enzimática de 1122 U/mg. Dessa forma, o tratamento
com sulfato de amônio foi eficiente em precipitar contaminantes protéicos e
promover purificação parcial de protease(s), as quais permaneceram no
sobrenadante. O perfil da cromatografia em DEAE-celulose apresentou único
pico adsorvido à matriz, com atividade caseinolítica de 1789 U/mg, revelando
um fator de purificação de 5,26 vezes em relação ao extrato. Adicionalmente,
a interação da atividade enzimática da massa visceral de M. charruana com a
matriz trocadora de ânions (DEAE-celulose) indica que essa(s) protease(s)
apresenta(m) carga líquida negativa em pH 8,0.
Conclusão:
A massa visceral de M. charruana contém proteases com atividade
caseinolítica e carga líquida negativa em pH 8,0. Estudos estão em andamento
para determinar a homogeneidade da preparação enzimática obtida ao final da
etapa cromatográfica, bem como caracterizar físico-quimicamente a(s)
protease(s) purificada(s).
Apoio Financeiro:
CNPq, FACEPE, CAPES, MCTI.
Gerado em: 2014-5-22 10:12:31
13.014 - Atividade antifúngica de Óxido de Cério (IV) nanoparticulado
sobre cepa de Candida
Farias, I. A. P. , Albuquerque, A. J. R. , Ferreira, J. M. , Santos, C. C. L. ,
Sampaio, F. C. ,
Laboratório de Biologia Bucal - UFPB Departamento de Engenharia
Química - UFPB COAMA - IFPB
Introdução:
A aplicação do óxido de cério nanoparticulado (nanocéria) e do óxido de
zinco na área química e tecnológica industrial é ampla, entretanto, a aplicação
biomédica tem sido campo de investigação recente com constatação de
escassez de informações sobre propriedades antimicrobianas da nanocéria e
do óxido de zinco.
Objetivos:
O objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade antifúngica das
nanopartículas de Óxido de Cério (IV) e do óxido de zinco nanoparticulado e
dermatológico sobre cepa de Cândida.
Métodos:
Trabalho de pesquisa laboratorial sem envolvimento de animais e humanos na
metodologia da pesquisa. Candida albicans (ATCC 11006) foi padronizada na
escala 0,5 de Mc Farland e procedeu-se a preparação de soluções de nanocéria
a 5%, 10%, 20%; óxido de zinco nanoparticulado e micrométrico a 10% e
união de nanocéria e óxido de zinco dermatológico a 10%, controle positivo
(Miconazol a 50 µg/mL) e controle negativo (inóculo e meio de cultura).
Procederam-se os seguintes testes: (A) difusão em Ágar Sabourraud dextrose
duplamente concentrado com mensuração do diâmetro do halo de inibição
com paquímetro (mm) e (B) cinética de morte microbiana com determinação
da absorbância em espectofotômetro (FLUOstar OPTIMA - BMG Labtech,
Alemanha) no período de 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 e 48 horas. Os testes foram
realizados em triplicata. Além disso, foi avaliada a forma do óxido de cério
sintetizado pelo método hidrotermal no Microscópio Eletrônico e Varredura
(MEV) de alta resolução (VEGA 3, Shimadzuk, Japão). Empregaram-se teste
t de student para comparar médias dos halos de inibição e teste de Turkey para
identificar diferenças ente médias de absorbância, com nível de significância
de 5 %.
Resultados:
A média ± desvio-padrão (DP) do halo de inibição da solução de nanocéria a
10% e de Miconazol foi de 28,21 ± 0,33 mm e de 22,33 ± 1,82 mm,
respectivamente (p< 0,05). Não foi observado halo de inibição para soluções
de óxido de zinco. No teste de cinética de morte fúngica, as soluções de
nanocéria a 5% e 10 % foram capazes de interferir acentuadamente na fase
logarítmica de crescimento do fungo após 8 horas de exposição. No período
de 24 horas, o efeito antifúngico em relação ao controle negativo das soluções
de nanocéria a 5%, 10% e miconazol foi de 93,42 vezes, 94,28 vezes e 91,33
vezes, respectivamente, sendo verificada diferença estatisticamente
significativa entre as duas soluções de nanocéria e controle negativo (p<
0,001); entretanto não se obsevou diferença entre aquelas soluções e
Miconazol (p> 0,05), bem como entre as duas soluções de nanocéria (p>
0,05). Ao MEV, identificou-se nanocéria com formato hexagonal e óxido de
zinco formando aglomerados.
Conclusão:
Concluiu-se que as soluções de óxido de cério possuem atividade antifúngica
sobre Candida albicans com potencial promissor para aplicação terapêutica
dessas soluções.
Apoio Financeiro:
Gerado em: 2014-5-22 10:12:31
13.015 - DESENVOLVIMENTO DE CATETERES MODIFICADOS
COM PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS PARA REDUÇÃO DA
INCIDÊNCIA DE CONTAMINAÇÕES
RIBEIRO, K. L. , FRANCO, O.L., BAKUZIS, A. F. , SAUDE, A. C. M.
M. , OLIVEIRA, M. D. L. , ANDRADE, C. A. S. ,
Programa de Pós Graduação em Inovação Terapêutica - UFPE Centro de
Proteômica de Brasília - UnB Departamento de Bioquímica - UFPE
Instituto de Física - UFG
Introdução:
Os cateteres venosos centrais de longa permanência são utilizados em
situações em que há necessidade de acesso prolongado ou definitivo ao
sistema vascular, encontrando uso clínico frequente em hemodiálise,
hemoterapia, quimioterapia e nutrição parenteral prolongada). A infecção
associada a esses tipos de cateteres constitui riscos e agravos adicionais em
pacientes muitas vezes debilitados ou imunossuprimidos. Alguns peptídeos
antimicrobianos (AMPs) têm se mostrado como uma excelente estratégia para
o desenvolvimento de estruturas bactericidas devido a sua alta e múltipla
atividade (antimicrobiana e imunomodulatória). O peptídeo Clavanina possui
28 resíduos de aminoácidos e compõem uma família chamada de A-D com
atividade altamente eficaz contra bactérias Gram-positivas, incluindo
Staphylococcus aureus resistente a meticilina, bactérias Gram negativas e
fungos. Logo, os biofilmes se tornam um alvo óbvio devido à problemática
crescente de infecções causadas a partir da utilização de cateteres.
Objetivos:
Modificar a superfície de cateteres com nanopartículas magnéticas de óxido
de ferro (Fe3O4) e peptídeos antimicrobianos, a fim de prevenir e reduzir a
incidência de infecções gerando um produto comercial com clara utilidade
pública.
Métodos:
O trabalho até o presente momento se limita a testes in vitro. Não são
realizados experimentos in vivo. A Clavanina foi obtida em sistema
heterólogo de fermentadores. A modificação da superfície do cateter realizada
com aminopropiltrietoxisilano. As nanopartículas (NPs) de Fe3O4 foram
preparadas de acordo com Oliveira e colaboradores (Coll. Interf. Sci. 319;
441, 2008) e tiveram suas superfícies modificadas com ácido 3-tiofenoacético
ou meso-2,3 ácido dimercaptosuccínico, sendo posteriormente quimicamente
ligadas aos peptídeos. Realizou-se a análise morfológica das amostras através
das técnicas de microscopia eletrônica de transmissão (MET) e varredura
(MEV), além da composição elementar através de energia dispersiva de raios
X (EDS). Por fim, buscando avaliar a atividade antimicrobiana das amostras,
realizou-se o bioensaio in vitro contra Staphylococcus aureus.
Resultados:
As análises morfológicas das NPsFe3O4 através de MET demonstraram a
presença de partículas em formato de aglomerados, com tamanho homogêneo
e com diâmetro médio de 10nm. Micrografias de MEV em corte transversal
do cateter demonstraram a formação de um revestimento homogêneo na sua
parte interna. O mapeamento por EDS confirmou a presença das NPsFe3O4
aderidas à superfície do cateter. O bioensaio in vitro resultou na formação de
um alo de crescimento microbiano consideravelmente menor em relação à
ampicilina (controle). Além disso, houve uma redução considerável das
unidades formadoras de colônias em função do tempo.
Conclusão:
A síntese e modificação da superfície NPsFe3O4 foi realizada com sucesso.
Foi obtida uma cobertura eficiente para o cateteres contendo peptídeos
antimicrobianos nanoestruturados. O revestimento obtido apresenta uma boa
atuação contra a colonização microbiana. Cateteres modificados com
peptídeos podem ser uma nova alternativa para o controle de infecções e
obtenção de um novo produto com a possibilidade de aplicação direta no
Sistema Único de Saúde.
Apoio Financeiro:
FACEPE, Capes-Rede Nanobiotec e CNPq
Gerado em: 2014-5-22 10:12:31
13.016 - CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE COLAGENASE
EXTRAÍDA A PARTIR DE RESÍDUOS DIGESTIVOS DE Ctenosciaena
gracilicirrhus
Roberto, N. A. , Nascimento, R. M. , Monte, F. T. D. , Nascimento, L. C.
P. , Moreira, L. M. S. V. L. , Ferreira, A. C. M. , Bezerra, R. S. , Porto, A.
L. F. , Oliveira, V. M. ,
Departamento de Bioquímica - UFPE Departamento de Morfologia e
Fisiologia Animal - UFRPE
Introdução:
As colagenases são um grupo de enzimas que apresentam propriedades
colagenolíticas, ou seja, capacidade de clivar o colágeno nativo. Os
subprodutos oriundos da indústria pesqueira apresentam potencial para
extração e emprego deste grupo enzimático visando fins industriais, como
fonte rica, alternativa e de menor custo.
Objetivos:
Este trabalho objetivou caracterizar parcialmente a colagenase extraída de
vísceras intestinais de Pescada (Ctenosciaena gracilicirrhus) através da
exposição a diferentes condições de pH e temperatura e de suas estabilidades.
Métodos:
O presente trabalho foi realizado a partir dos resíduos da pesca artesanal
(vísceras intestinais).O material foi gentilmente cedido pela colônia de
pescadores local, após etapas de evisceração e limpeza das espécimes. Não
havendo, dessa forma, contato direto com a espécie biológica, mais sim,
apenas, com o resíduo descartado. Foram utilizadas 500g de resíduos
digestivos (vísceras intestinais) de C. gracilicirrhus obtidas através de colônia
de pescadores de Ponta Verde, Maceió, Alagoas, Brasil. A etapa de extração
enzimática foi realizada através de processo de maceração e homogeneização.
Para tanto, uma mistura de solução contendo 5 mg de azocoll (substrato
especifico) foram adicionados a 500 µl de tampão Tris-HCl pH 7,4, contendo
5 mM de CaCl2 0,05 M e de 500 µl da solução enzimática (extrato bruto).
Incubou-se a mistura durante 30 minutos a 55°C, sob agitação constante. Após
este período, foram adicionados 200 µl de ácido tricloroacético (TCA).
Transcorrido 10 min. de repouso a 25°C, centrifugou-se a 10.000 x g por 10
min. a 4°C. A leitura da amostra foi realizada usando espectrofotômetro (595
nm). Uma unidade de enzima foi definida como a quantidade de enzima
necessária para aumentar a absorvência de 0,01 a 595 nm a 25°C. Para análise
do efeito do pH sobre a atividade enzimática foram realizados ensaios em
quadriplicatas, com variações de tampões na faixa entre 4.0 e 12.0 (citrato-
fosfato: 4.0-7.5; Tris-HCl: 7.2 a 8.5; NaOH: 8.5 a 12.0), contendo 5 mM de
CaCl2 0,05 M (500 µl do tampão + 500 µl do extrato enzimático, e posterior
determinação enzimática). O ensaio de estabilidade foi realizado através da
exposição por 30 min. do extrato enzimático com os diferentes tipos e faixas
de tampões e, em seguida, essas soluções foram testadas em condições padrão
de determinação enzimática. A temperatura ótima da enzima foi avaliada
através da exposição do material a diferentes faixas térmicas, 25° a 90°C, com
intervalos de 5ºC. O perfil da atividade proteolítica frente à variação de
temperatura foi avaliado em microplaca de titulação. No ensaio de
estabilidade térmica, para cada temperatura, a enzima foi incubada por 30
min. em banho-maria. Em seguida, a atividade residual da enzima foi aferida
como descrito no protocolo. No resultados, foi estipulada como sendo o
100%, o valor mais alto de atividade enzimática específica obtida no
experimento para ambos parâmetros físico-químicos.
Resultados:
O pH ótimo da colagenase foi de 8.0, mantendo-se estável entre 6.5-11.5. A
temperatura ótima da enzima foi de 55°C, mantendo-se estável entre 25.0-
65.0°C.
Conclusão:
Os resultados indicaram potencial biotecnológico para futuras aplicações
industriais e barateamento do custo de produção da colagenase a partir dos
resíduos digestivos de C. gracilicirrhus.
Apoio Financeiro:
CNPq
Gerado em: 2014-5-22 10:12:31
13.017 - Desenvolvimento de hidrogel a base de galactomanana extraída
das sementes de Cassia grandis e K-carragenana.
Seixas, J. R. P. C. , Soares, P. A. G. , Cunha, M. D. G. C. ,
Bioquímica - UFPE
Introdução:
Hidrogéis são definidos como uma rede polimérica tridimensional capaz de
absorver grande quantidade de água ou fluído biológico. Devido à sua
capacidade de absorção, possuem ampla aplicação em diferentes áreas
biotecnológicas, por exemplo, materiais para lentes de contato, matrizes para a
imobilização de células, dispositivos para a liberação controlada de compostos
bioativos e em práticas clínicas da medicina experimental para a engenharia e
regeneração de tecidos.
Objetivos:
Desenvolver um hidrogel a base de galactomanana, extraída das sementes
da Cassia grandis, e de K-carragenana utilizando um planejamento fatorial
completo 23, de modo a obter as melhores condições de obtenção do hidrogel.
Métodos:
· Obtenção dos polissacarídeos: A galactomanana foi extraída das
sementes de Cassia grandis (e.g.:Albuquerque.104:127,2014).O
polissacarídeo k-carragenana foi obtido da Sigma (USA). · Preparação do
hidrogel em meio aquoso: A preparação do hidrogel foi realizada através do
método de reação direta em meio aquoso (e.g.:Abreu,2014). · Desenho
Experimental e Análise Estatística: A influência das variáveis independentes,
concentração de k-carragenana (Ck) (0,3; 0,4; 0,5 % p/v), concentração
de íons CaCl2 (Ci) (0,0; 0,1; 0,2 M) e pH (5,0; 5,5; 6,0), foram estudadas,
avaliando-se as variáveis resposta:viscosidade complexa (η *), razão entre o
módulo viscoso (G’’) e módulo elástico (G’) representada por Tan δ e
temperatura de mudança de fase (Tt), utilizando um planejamento fatorial
completo 23 mais um ponto central, que foi realizado em quadruplicata para
estimar o erro experimental puro.A análise estatística foi realizada por análise
de variância (ANOVA), com p ≤ 0,05.Toda estatística e análise dos gráficos
foram realizadas com o programa Statistica 7,0 (SatSoft Inc., 2004, Tulsa,
OK, USA).
Resultados:
Avaliando-se as variáveis independentes, foi observado que a Ck influencia
na preparação dos hidrogéis. Quanto maior a Ck maior foi a viscosidade
complexa (13,9 Pa.s). Mesmo na ausência de CaCl2 a viscosidade complexa
aumentou com o aumento da Ck. Contudo, o k-carragenana, por ser um
polissacarídeo sulfatado e apresentar carga negativa crescente do pH 5,0 para
6.0, explica os altos valores para a viscosidade complexa, uma vez que os
radicais sulfatos do k-carragenana, estariam interagindo com os íons
Ca+2 formando ligações cruzadas que fortalecem a matriz dos
hidrogéis. Reologicamente, todos os ensaios apresentaram valores para o
módulo elástico superiores ao módulo viscoso. A razão entre os módulos G’’
e G’ (Tan d) foi < 1,0 para todos os ensaios, atingindo os menores valores da
razão para a formulação constituída por 0,5% Ck,0,2% Ci e pH 5,0. Durante
as análises reológicas foi verificado que a temperatura afeta a estrutura física
dos hidrogéis e que quanto maior o Ci, maior é a Tt (sólido > líquido) dos
hidrogéis. Hidrogéis mais estáveis foram obtidos para os ensaios que
apresentaram maior Ck (0,5 % p/v), maior Ci (0,2% M) e menor valor de pH
(5,0).
Conclusão:
Os resultados obtidos demonstram a obtenção de hidrogéis estáveis,
constituídos de k-carragenana e galactomanana, com possíveis aplicações na
área da saúde, alimentar e/ou cosmética.
Apoio Financeiro:
PIBIC/CNPq/CAPES/UFPE.
Gerado em: 2014-5-22 10:12:31
13.018 - BIOPOLÍMERO DE CANA-DE-AÇÚCAR COMO NOVA
ALTERNATIVA DE SUPORTE IN VITRO NA DIFERENCIAÇÃO DE
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS HUMANAS EM
QUERATINÓCITOS
Araujo, P. H. C. , Dias, M. R. P. , Silva, M. B. , Santos, F. A. B. , Alves, L.
C. , Aguiar, J. L. A. , Silva, E. C. , Medeiros, P. L. ,
Departamento de Histologia e Embriologia - CCB - UFPE Departamento
de Biofísica e Radiobiologia - CCB - UFPE Centro de Pesquisa Aggeu
Magalhães - CPqAM - UFPE Programa de Pós-graduação em Cirurgia
do Hospital - UFPE
Introdução:
A engenharia tecidual constitui uma abordagem promissora no reparo e
regeneração de tecidos, que podem estar funcionalmente comprometidos em
decorrência de lesões, doenças ou senescência. Nesse contexto, dentre os
biomateriais, os biopolímeros se destacam em função da sua
biocompatibilidade. Em conjunto com esses avanços, a utilização de células-
tronco mesenquimais humanas (CTMs) em associação com novos biosuportes
a base de biopolímero de cana-de-açúcar podem constituir ferramentas
importantes no desenvolvimento da terapia celular.
Objetivos:
Avaliar os aspectos morfológicos das células-tronco mesenquimais (CTMs)
sobre os novos biosuportes (gel e membranas) de biopolímero de cana-de-
açúcar e diferenciação dessas em queratinócitos.
Métodos:
CEP/CCS/UFPE Nº482/10 Cordões umbilicais (n=20) foram doados por
puérperas do Hospital das Clínicas de Pernambuco/UFPE de acordo com
protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (nº482/2010). Cada
cordão teve sua veia preenchida com Colagenase tipo IV (Sigma) para a
extração das CTMs. Em seguida, as células foram cultivadas em meio DMEM
suplementado com Soro Fetal Bovino (SFB) e 1% de antibióticos. A
confirmação da linhagem mesenquimal foi realizada através da citometria de
fluxo, com a utilização de anticorpos monoclonais (CD 29, CD 44, CD 90,
CD 31, CD 34 e CD 45). A avaliação morfológica das células foi realizada
nos biosuportes (gel e membranas) do biopolímero de cana-de-açúcar
produzidos a partir da fermentação do melaço pela bactéria Zoogloea sp. A
biocompatibilidade celular foi acompanhada com o auxílio das microscopias
invertida e eletrônica de varredura. A diferenciação em queratinócitos foi
realizada em ambos os suportes e registros fotográficos foram confeccionados
durante essa avaliação.
Resultados:
Após 72 horas, observou-se colônias de CTMs com morfologia fibroblastóide.
A análise imunofenotípica revelou expressão positiva para marcadores
moleculares de superfície como CD 29, CD 44 e CD 90 e expressão negativa
para marcadores típicos de linhagens endotelial e hematopoética, como CD
31, CD 34 e CD 45. O cultivo de CTMs do cordão umbilical humano no gel
de biopolímero de cana-de-açúcar revelou células com morfologia alongada
em disposição radial e sobre as membranas foram observadas células com
formato variando de arredondadas a fibroblastóides, quando avaliadas através
de microscópio invertido com contraste de fase. A MEV de CTMs cultivadas
sobre as membranas também mostrou células com morfologia arredondada e
algumas com aspectos irregulares. Sob o efeito do diferenciador para
queratinócitos, no gel observou-se a clássica morfologia cubóide-arredondada
de colônias de queratinócitos por volta de 14 dias e sobre as membranas,
identificou-se células tanto arredondadas como agrupadas; sendo essas
análises realizadas com o auxílio de microscópio de contraste de fase.
Conclusão:
O biopolímero de cana-de-açúcar apresentou expressiva biocompatibilidade,
por ser capaz dar suporte ao desenvolvimento e a diferenciação de células com
elevada plasticidade como as CTMs e estudos nesse área devem ser
aprofundados para uma possível definição da aplicabilidade terapêutica desse
novo biomaterial.
Apoio Financeiro:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
Gerado em: 2014-5-22 10:12:31
13.019 - HIDROGEL DE ALGINATO E VITAMINAS DO COMPLEXO
B PARA A TERAPÊUTICA TÓPICA DE ÚLCERAS VENOSAS
Falcao, E. M. A. , Junior, A. G. S. , Pitta, M. G. R. , Silva, R. R. , Oliveira,
M. D. L. , Andrade, C. A. S. ,
Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica - UFPE
Departamento de Bioquímica - UFPE
Introdução:
A deficiência de vitaminas do complexo B, sobretudo folato, determina
estresse oxidativo e lesão tecidual, em virtude do acúmulo de homocisteína
(HCT). A HCT é um aminoácido não essencial, formado como produto
intermediário do metabolismo da metionina e que apresenta um grupamento
sulfidrila responsável por suas propriedades oxidativas. Pacientes com
insuficiência venosa crônica e úlcera venosa apresentam níveis mais elevados
de homocisteína. Assim, a associação de folato (vitamina B9), cobalamina
(vitamina B12) e piridoxina (vitamina B6) constitui uma alternativa tópica
para cicatrização de úlceras venosas de membros inferiores pela diminuição
local dos níveis de HCT com consequente estímulo à replicação celular
epitelial, aumento da microcirculação e efeito antioxidante local. O alginato
de sódio é um polissacarídeo biocompatível e biodegradável obtido de algas
marrons constituído de blocos de homopolímeros de manuronato e guluronato.
O alginato é utilizado como hidrocolóide e agente geleificante por formar gel
com cátions multivalentes como o Ca2+. Ele é utilizado em curativos de
feridas em virtude de suas propriedades hemostáticas. Portanto, o uso tópico
do hidrogel de alginato como carreador de vitaminas do complexo B atuaria
na diminuição da inflamação local, estímulo da multiplicação celular e
aumento do leito microvascular nutridor, favorecendo as condições locais
propícias para o crescimento celular, facilitando a aproximação dos bordos da
úlcera e acelerando o processo de cicatrização.
Objetivos:
A presente proposta visa o desenvolvimento de hidrogel de alginato com
vitaminas do complexo B para uso tópico com a finalidade de propiciar uma
mais rápida cicatrização do leito ulceroso, facilitar a adesão dos pacientes,
diminuir efeitos colaterais e melhorar a eficácia do tratamento.
Métodos:
15974213.6.0000.5208 O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em
Pesquisa da UFPE e encontra-se registrado com o protocolo número
15974213.6.0000.5208. O hidrogel de alginato de sódio com as três vitaminas
do complexo B foi homogeneizado em agitador mecânico. A análise
morfológica foi realizada através de microscopia óptica. A cinética de
liberação foi realizada durante 15 dias em intervalos de 48h e mensurada
através de espectrofotometria de absorção. O estudo contará com amostra não
probabilística de 50 pacientes oriundos do ambulatório de cirurgia vascular do
Hospital das Clínicas da UFPE. Homens e mulheres entre 30 e 80 anos de
idade, portadores de úlcera de membro inferior de etiologia venosa,
capacidade de entendimento necessário para realização de curativos, presença
de pulsos distais e que concordem com o termo de consentimento livre e
esclarecido (TCLE) serão incluídos no estudo.
Resultados:
As análises morfológicas demonstraram a obtenção de um sistema homogêneo
e com boa dispersão das vitaminas. As análises das cinéticas de liberação
demonstraram uma cinética lenta e gradual com pico de liberação máximo em
torno de 7 dias para as três vitaminas. Os valores do R-quadrado ajustado
foram de 0,9043±0,0810, 0,8552±0,0975 e 0,9360±0,0252 respectivamente
para as vitaminas B6, B9 e B12. Análise inicial dos quinze primeiros dias de
aplicação do hidrogel demonstra existir melhora da vascularização,
crescimento de tecido de granulação e melhora da cicatrização das úlceras.
Conclusão:
Foram obtidos géis homogêneos para a encapsulação de vitaminas. Os
resultados obtidos demonstraram a eficiência do sistema proposto para o
tratamento de úlceras venosas de membros inferiores. O sistema obtido se
apresenta como uma excelente alternativa para o tratamento de úlceras.
Apoio Financeiro:
CAPES - Rede Nanobiotec e CNPq.
Gerado em: 2014-5-22 10:12:31
13.020 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE
LIPOSSOMAS CONTENDO ÁCIDO BARBÁTICO DE Cladonia
Salzmanii
Tavares, C. A. , Medeiros, S. M. F. R. S. , Cabral, A. S. , Magalhães, N. S.
S. , Costa, J. O. , Silva, R. G. , Júnior, F. C. A. A. , Santos, N. P. S. ,
Laboratório de Nanotecnologia, Biotecnologia e Cul - UFPE Laboratório
de Biotecnologia e Fármacos - UFPE Laboratório de Imunopatologia
Keizo-Asami - UFPE
Introdução:
O ácido barbático (AB) é um metabólito liquênico que apresenta diversas
atividades biológicas tais como antimicrobiana, citotóxica e antitumoral. O
uso de sistema nanoparticulados com o propósito de direcionar e controlar a
liberação de fármacos contribui para uma melhor biodisponibilidade, redução
da toxicidade e aumento da atividade biológica.
Objetivos:
Desenvolver lipossomas contendo o ácido barbático e investigar sua atividade
antitumoral.
Métodos:
Processo nº 23076.050904/2011-69 Lipossomas convencionais (AB-LC) e
furtivos (AB-LF) contendo o ácido barbático foram preparados pelo método
de hidratação do filme lipídico. O tumor ascítico sarcoma 180 (5x 106
células/ml/animal) foi inoculado subcutaneamente na região axilar direita de
camundongos Swiss machos com 35-45g de peso corporal, 50-60 dias de
idade. Cinco grupos de animais experimentais (n=7) foram randomizados. O
tratamento foi iniciado 24 horas após a inoculação tumor, com injeções
intraperitoneal diária de ácido barbático (AB) em suspensão (0,5 % v/v de
Tween 80 em solução estéril de NaCl a 0,9%) ou lipossomas, convencionais
ou furtivos contendo o ácido barbático a uma dose de 20 mg/kg/dia durante 7
dias. Um controle positivo foi tratado com 5-Fu e outro grupo foi tratado
diariamente com de solução estéril (NaCl 0,9%), durante 7 dias. Após o
tratamento, os animais foram sacrificados, tumores foram excisadas, pesados e
submetidos à análise histológica. As experiências em animais foram sob a
aprovação do Comitê de Ética para Experimentos com Animais da
Universidade Federal de Pernambuco (Processo nº 23076.050904/2011-69).
As imagens histológicas dos tumores corados com Hematoxilina-Eosina
foram obtidas por câmera digital acoplada ao microscópio óptico. As imagens
foram avaliadas através do software Image J versão 1.44 onde se determinou a
média de mitoses por campo.
Resultados:
Após a preparação, AB-LC e AB-LF apresentaram tamanho e índice de
polidispersão (PDI) respectivamente de 115.6±5.88nm (0.255) e 109.3±2.82
(0.307). Os pesos dos tumores de grupo controle negativo, tratados com
solução salina, apresentaram 3,65±0,83g, já o controle positivo tratado com 5-
Fu mostraram 3,01±0,3g. Paralelamente os tumores dos animas tratados com
AB, AB-LC e AB-LF foram reduzidos 2,78±0,44g, 2,48±0,41g e 1,99±0,41g
respectivamente. Essas reduções deram taxa de inibição de 21,72; 30,27 e
42,97 %, respectivamente. O 5-Fu reduziu o peso do tumor em 8,91%. A
inibição promovida por AB-LC e AB-LF foi estatisticamente significativo
quando comparamos com o 5-Fu. Já a inibição promovida por AB-LF foi
estatisticamente significativo quando comparamos com o AB. Todos os
tratamentos reduziram significativamente o número de mitoses quando
comparado ao controle negativo. A inibição das mitoses por 5-Fu, AB, AB-
LC e AB-LF foi respectivamente: 25,78; 39,05; 39,22 e 33,58%. O
encapsulamento do ácido barbático, de fato, proporcionou uma maior
regressão do tumor, quando comparado ao composto não encapsulado.
Observou-se aumento da atividade antitumoral em 39,36% para a
encapsulação em lipossomas convencionais e 97,33% para os lipossomas
furtivos com relação ao composto em suspensão (AB).
Conclusão:
A encapsulação potencializou a atividade antitumoral do ácido barbático e a
peguilação (furtivos) dos lipossomas dobrou essa ação. O ácido barbático foi
mais eficiente do que o 5-Fu na redução das mitoses.
Apoio Financeiro:
Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia de Pernambuco - FACEPE
Gerado em: 2014-5-22 11:33:03
13.021 - IMUNOSSENSOR IMPEDIMÉTRICO PARA DETECÇÃO DE
COLESTEROL LDL BASEADO EM SISTEMAS HIBRIDOS DE
NANOPARTÍCULAS DE OURO E POLIVINIL FORMAL
Egito, E. M. N. , Andrade, C. A. S. , Oliveira, M. D. L. ,
Departamento de Bioquímica - UFPE Programa de Pós-Graduação em
Inovação Terapêutica - UFPE Departamento de Bioquímica Clínica -
LGC
Introdução:
A Doença arterial coronariana (DAC) é uma das principais causas de
mortalidade não somente nos países desenvolvidos, mas também em alguns
países em desenvolvimento (Cheng et al, 2005). Atualmente, a aterosclerose é
considerada uma doença crônica degenerativa que, quando não diagnosticada,
pode acarretar em infarto agudo do miocárdio. A adsorção de anticorpos
monoclonais anti-LDL em diferentes substratos, tem sido largamente estudada
no intuito do desenvolvimento de imunossensores “point of care”, com
aplicação em análises clínicas (Ahmadrajia e Killard, 2013). Desta forma, é de
grande interesse o desenvolvimento de novas tecnologias de detecção com
elevada especificidade e sensibilidade para LDL através do uso de ferramentas
eletroquímicas (Yan et al., 2008).
Objetivos:
Desenvolver um imunossensor baseado no sistema híbrido de nanopartículas
de ouro (AuNPs) e polivinilformal (PVF) com o uso do anticorpo monoclonal
anti-LDL e, posteriormente, avaliar sua capacidade de reconhecimento frente
à soro de pacientes contendo colesterol LDL (LDL-C).
Métodos:
O presente trabalho não necessita de aprovação do comitê de ética por se
tratar de pesquisa básica que não envolve questões éticas com seres humanos
e/ou animais. As medidas voltamétricas (VC) e de espectroscopia de
impedância eletroquímica (EIE) foram realizadas numa célula eletroquímica
convencional de três eletrodos imersos em 20 mL de solução de 10 mM de
K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6] (1:1), atuando como sonda redo. O eletrodo de
trabalho utilizado foi o eletrodo de disco de ouro, o eletrodo de referência foi
o de Ag/AgCl saturado com KCl e o contra-eletrodo foi o de platina. As
análises de VC foram realizadas a um potencial de varredura fixo de -0,2 a 0,7
V. Os espectros da EIE foram obtidos numa faixa de freqüência entre 100
mHz a 100 KHz com um potencial de amplitude alternada de 10 mV. Uma
mistura de 1mL de PVF (0,1%) com 150 µL da AuNPs foi preparada e
adsorvida sobre o eletrodo de ouro. Em seguida, foi adicionado 1 µL do
anticorpo anti-LDL. A análise da performance do imunossensor foi realizada
frente à amostras de sangue periférico humano e, posteriormente, comparado
ao método padrão atualmente utilizado para quantificar o LDL-C
(Imunoturbidimetria), onde pode-se obter dados analíticos compatíveis. As
análises imunoturbidimétricas (15 ensaios) foram realizadas em sistema
automatizado ADVIA 1800 (Siemens, USA), sendo realizada análise em 5
amostras séricas distintas onde cada anpalise foi realizada em triplicata. As
análises impedimétricas (15 ensaios) das mesmas 5 amostras também foram
realizadas em triplicata.
Resultados:
As análises impedimétricas apresentaram uma média de 53,55 ± 0,30 kW para
cada análise, demonstrando uma excelente reprodutibilidade nos ensaios. A
análise imunoturbidimétrica apresentou uma média de 89,0 ± 2mg/dL. As
análises voltamétricas revelaram uma redução dos picos anódicos e catódicos,
após a modificação do eletrodo com o sistema PVF_AuNPs_antiLDL ,
demonstrando a adsorção dos sistemas sobre a superfície do eletrodo. Após a
interação do sistema PVF_AuNPs_antiLDL com os soros contendo LDL-C
(30-135 mg/dL) foi observado um bloqueio quase que total da resposta
amperométrica do sistema na concentração de 135 mg/dL, indicando que
ocorreu biointeração entre anticorpo anti-LDL-antígeno. Os gráficos de
Nyquist demonstraram aumento gradativo da resistência de transferência de
carga (Rct) após o processo de biointeração. A resposta impedimétrica do
sistema PVF_AuNPs_antiLDL apresentou uma resistência a transferência de
carga (Rct) com valor de 3,27 kW e após a interação anticorpo-antígeno
houve um incremento da resposta impedimétrica, revelando um de
Rct=84,2kW para a maior concentração de LDL. Interpolando os dados
obtidos na imunoturbidimetria (mg/dL) e na EIE (Rct), foi possível observar
uma função do tipo linear onde através da Rct é possível se determinar a
concentração sérica de colesterol LDL, de forma 10 vezes mais rápida (~ 1
minuto), em comparação ao método imunoturbidimétrico (12 minutos).
Conclusão:
Os resultados obtidos neste trabalho apresentam uma nova possibilidade de
detecção de colesterol LDL-C através de técnica eletroquímica de VC e EIE.
Através do sistema PVF_AuNPs_Anti-LDL, foi possível detectar níveis
baixos de LDL-C (30mg/dL), demonstrando uma boa sensibilidade. O sistema
proposto se apresenta como uma alternativa 10 vezes mais rápida para
quantificação de LDL-C, em comparação com o método padrão utilizado no
mercado. Portanto, o sistema PVF_AuNPs_Anti-LDL apresenta grande
potencial para uso em análises clínicas.
Apoio Financeiro:
FACEPE, Rede Nanobiotecnologia-CAPES, CNPq e Laboratórios Gilson
Cidrim LTDA.
Gerado em: 2014-5-22 11:33:03
13.022 - EFEITO DOS ANIONS DE HOFMEISTER NA
SOLUBILIDADE DO POLIETILENOGLICOL E SENSIBILIDADE DO
NANOPORO DA ALFATOXINA
Machado, D. C. , Junior, J. J. S. , Pol-fachim, L. , Melo, M. C. A. ,
Rodrigues, C. G. ,
Biofísica e Radiobiologia - UFPE Química Fundamental - UFPE
Introdução:
Os canais iônicos representam um ambiente onde ciclos de hidratação e
desidratação ocorrem sistematicamente com as espécies permeantes. A
influência dos íons halogênios (Fluoreto, Cloreto, Brometo, Iodeto) no canal
iônico formado pela roflamicoina, demonstra claramente que algumas
propriedades biofísicas (condutância e seletividade) destes nanoporos podem
ser moduladas pelas condições físico-químicas do meio. O estudo dos efeitos
dos íons em sistemas confinados como os biossensores estocásticos baseados
em nanoporo protéico unitário, intensificou-se nos últimos anos, visando o
aumento da sensibilidade destes dispositivos e sua importância biotecnológica
(Jour. Phys. Chem. C. 115; 4255, 2011). Neste contexto recentemente
demonstramos que o simples aumento da concentração do KCl (1M para 4M)
(Biophys. Jour. 95; 5186, 2008) melhorou qualitativamente as características
do nanoporo da alfatoxina como sensor, permitindo, sua utilização como
protótipo de espectrômetro de massas para o polietilenoglicol (PEG).
Adicionalmente a composição aniônica da solução também aumentou a
capacidade de detecção deste elemento sensor, pois, a troca do I- pelo F-
aumentou a sensibilidade do nanoporo (Biophys. Jour. 100; 2929, 2011). Estas
melhorias são atribuídas à alteração no grau de estruturação da água, mudança
de solubilidade do PEG e consequentemente o efeito salting-out.
Objetivos:
Estudar os efeitos específicos dos íons da Série de Hofmeister na interação de
polímeros com o nanoporo protéico da alfatoxina através de simulação de
dinâmica molecular e determinação da solubilidade do polietilenoglicol.
Métodos:
Não envolve experimentos com animal ou humanos A solubilidade dos
polímeros foi determinada por adaptação do método “ponto de nuvem”.
Resumidamente pequenas quantidades (2 a 40 mg) do polímero (PEG 1500)
foi adicionada ao tubo de vidro de 10 mL. Posteriormente pequenos volumes
(300–500 μL) de solução salina foram adicionados a temperatura ambiente
(25°C). Após cada adição o tubo foi fechado com tampa de Teflon, agitado e
finalmente levado até um banho Maria a 100°C durante 10 a 30 minutos. A
formação de uma nuvem (mudança de fase) na solução foi visualizada. As
simulações de dinâmica molecular foram executadas nas seguintes condições:
Caixa de simulação dodecaédrica com uma molécula de PEG 456, água e os
íons KF ou KI em concentração de 4 M. As energias de interação água-PEG, a
área de acessibilidade do solvente e o raio de giro foram calculadas.
Resultados:
A solubilidade do polietilenoglicol aumentou proporcionalmente com o raio
do íon: KI (44,72 ± 3,21; (n=3)) mM e KF (0,16 ± 0,02; (n=3)) mM. Os
parâmetros energia de interação água-PEG (Kcal/mol), área de acessibilidade
do solvente (?2) e raio de giro (nm) foram: KI (-307 ± 2; n=3); (1127); (0465
± 0,002; n=3), e, KF (-263 ± 11; n=3); (1028); (0444 ± 0,008; n=3),
respectivamente.
Conclusão:
Os íons influenciam na solubilidade do PEG variando o grau de organização
das moléculas de água, tornando-o mais hidratado na presença de ânions de
maior raio.
Apoio Financeiro:
CNPq, FACEPE, INCT-Inami.
Gerado em: 2014-5-22 11:33:03
13.023 - Nanopartículas de óxido de cério (IV) como alternativa
antibacteriana sobre Pseudomonas aeruginosa
Albuquerque, A. J. R. , Farias, I. A. P. , Santos, C. C. L. , Ferreira, J. M. ,
Silva, A. C. B. , Silva, D. R. , Silva, P. M. F. , Sampaio, F. C. ,
Laboratório de Biologia Bucal - UFPB Departamento de Engenharia
Química - UFPB Departamento de Odontologia - UEPB COAMA - IFPB
Introdução:
A multirresistência das Pseudomonas aeruginosas e sua extrema
adaptabilidade a inúmeros ambientes tem colocado esta bactéria gram-
negativa no topo da estatística de infecções nosocomiais. Buscando-se
diversificar as estratégias de combate e prevenção a esta bactéria, encontra-se
na nanotecnologia uma nova perspectiva de ação antibacteriana, sobretudo
devido a grande resistência desta bactéria mesmo frente extratos vegetais
diversos. Encontra-se no óxido de cério (IV) uma promissora alternativa
principalmente na investigação da adesão celular bacteriana em superfícies.
Objetivos:
O objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade antibacteriana de
nanopartículas de Óxido de Cério (IV) frente Pseudomonas aeruginosa como
alternativa a extratos vegetais em diferentes frações.
Métodos:
O experimento não envolve testes em seres humanos e animais. A bactéria
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), devidamente padronizada para o
valor de 0,5 de MacFarland por espectrofotometria, foi submetida a testes de
sensibilidade frente à nanopartículas de óxido de cério (IV), utilizando-se a
técnica da microdiluição em placas de ELISA. As nanopartículas de óxido de
cério (IV) foram sintetizada através do método hidrotermal de micro-ondas
com síntese de 1 minuto em pH alcalino. As nanopartículas foram testadas em
concentrações que variaram de 800µg/mL a 100µg/mL. Como controle
positivo foi utilizado gluconato de clorexidina 0,12%. Foi realizada cinética
de crescimento bacteriano para avaliação da atividade bactericida e
bacteriostática durante 24h de crescimento em meio BHI-caldo, cuja avaliação
foi realizada por espectrofotometria e fluorescência, ambas em aparelho
FLUOStar OPTIMA - BMG Labtech-Alemanha, nos períodos de 0, 1, 2, 4, 8,
12, 24. Todos os testes foram realizados em triplicata. A morfologia do óxido
de cério sintetizado foi avaliada por Microscópa Eletrônica e Varredura
(MEV) de alta resolução (VEGA 3, Shimadzuk, Japão), e difração de raios-X
(Rigaku, DMAX2200).
Resultados:
A análise morfológica das nanopartículas de óxido de cério (IV) mostrou ser
este material predominantemente amorfo, com nanopartículas tendendo a um
formato tetragonal em diferentes tamanhos que variaram de 2,5nm a 45nm. A
média ± desvio-padrão (DP) da inibição da solução de óxido de cério (IV)
nanométrico a 800µg/mL, 100µg/mL e Clorexidina a 0,12% foi de
76,12±2,09células viáveis, 75,21±2,33 células viáveis e de 2,73±1,18 células
viáveis. O óxido de cério não foi capaz de inibir o pico de crescimento após 8
horas, mas permitiu redução de população bacteriana mesmo variando a
concentração de nanopartículas. Em concentrações de 800µg/mL à 100µg/mL
tiveram atividade semelhante, com redução de 25% da população bacteriana
em relação escala de MacFarland, e de 57% em relação ao pico de
crescimento livre em meio nutritivo.
Conclusão:
A aderência bacteriana nesses sistemas é fundamental no processo de
infecção, com possibilidade da nanocéria intervir positivamente diante de sua
propriedade antimicrobiana, o que se justifica pela ausência de significância
estatística entre a maior e a menor concentração de óxido de cério (IV)
testado. Esse dado representa uma promissora alternativa para o
desenvolvimento de polímeros tratados com nanopartículas com atividade
antiaderente.
Apoio Financeiro:
CNPq e Capes.
Gerado em: 2014-5-22 11:33:03
13.024 - Aumento na expressão de canais Kv1.3 e Kv3.1 inibem a
proliferação celular tumoral e induzem apoptose e parada no ciclo celular
Martins, G. V. F. , Araujo, D. A. M. ,
Biotecnologia - UFPB
Introdução:
As leucemias são um tipo de câncer do sistema hematopoiético que podem
afetar tipos distintos de células. Foram estimados cerca de 350 mil casos
novos de leucemia no mundo. Apesar de existirem terapias quimioterápicas
mais modernas, ocorrem aproximadamente 265 mil óbitos por leucemia no
mundo. Adutos de Morita-Baylis-Hillman (AMBH) são um novo grupo de
moléculas sintéticas que têm demonstrado muitas atividades biológicas.
recentemente, estas moléculas mostraram atividade anti-mitótica em células
embrionárias de ouriço-do-mar, sugerindo um potencial efeito anticâncer.
Nosso grupo tem demonstrado que estas moléculas induzem uma potente
citotoxicidade em células tumorais humanas, tais como, leucemia mielóide
aguda e crônica, câncer de cólon e de mama. Embora, pouco é conhecido
sobre o mecanismo induzido pelos AMBH em células tumorais como o tipo
de morte celular e sua relação como a apoptose e os canais iônicos. Muitos
canais iônicos de membrana possuem função essencial na proliferação celular
e apoptose. O Kv1.3 é um canal de potássio voltagem-dependente
predominantemente expresso na membrana plasmática de linfócitos humanos
e também foi demonstrada sua expressão na mitocôndria destas células e sua
participação em processos apoptóticos.
Objetivos:
Este estudo buscou investigar a atividade citotóxica de A2CN em células
tumorais humanas visando demonstrar o mecanismo de morte celular e o seu
envolvimento com a expressão dos canais de Kv e outros genes envolvidos no
ciclo celular e apoptose.
Métodos:
O trabalho foi realizado com cultura de células imortalizadas, por isso não
faz-se necessário a aprovação em comitê de ética animal ou humano. Células
(HL-60, MOLT-4, K562, K562-lucena, MCF-7, Ht-29, L929, and PBMC)
foram plaqueadas a 3-5 x 104 cel/poço em placas de 96-poços. Então, células
foram cultivadas com (A2CN) (0 – 200 μM) e incubadas por 24h. A
citotoxicidade foi avaliada usando o teste de MTT. Experimentos usando
citometria de fluxo foram usados para avaliar: ciclo celular, despolarização
mitocondrial (tetrametilrodamina) e produção de ROS (DCFDH).
Adicionalmente, os efeitos de A2CN foram investigados na expressão de p53,
p21, p27, ciclina D1, Ciclina E, além dos canais Kv1.3 e Kv3.1 que foram
investigados por real-time PCR usando Sybr green e foram comparados com o
gene endógeno GAPDH.
Resultados:
A2CN demonstrou potente atividade citotóxica, principalmente em leucemia
mielóide aguda e crônica, com CI50 de ~ 22 μM para HL-60 e MOLT-4 e 60
μM para K562 e K562-lucena após 24 horas de incubação. As células K562,
de leucemia mielóide crônica, foram usadas para análise do mecanismo de
morte celular com A2CN (15, 30 e 60 μM) por 24 h. A2CN promoveu parada
no ciclo celular na fase G0/G1 (15 e 30 μM) e na fase S (60 μM) (p<0,001).
Nas mesmas concentrações (60 μM), ocorreu despolarização mitocondrial e
produção de ROS, características de apoptose e envolvimento com a via
mitocondrial. Além disso, A2CN (60 μM) aumentou significativamente a
expressão de p53, p21 e p27 e reduziu as ciclinas D1 e E. Os genes para os
canais Kv1.3 e Kv3.1 aumentaram significativamente sua expressão após o
tratamento com A2CN (60 μM), tornando a célula mais sensível a apoptose e
inibindo a sua progressão no ciclo celular.
Conclusão:
Baseado nestes resultados nós sugerimos que o composto A2CN inibiu a
proliferação de células de leucemia mielóide aguda e crônica. O mecanismo
de ação demonstrado em células K562, revelou parada no ciclo celular com
aumento da expressão das proteínas p53, p21, p27 e inibição das ciclinas D1 e
E. A2CN também promoveu o aumento da expressão dos canais Kv1.3 e 3.1
reguladores da apoptose. Este efeito demonstra o potencial antitumoral desta
molécula.
Apoio Financeiro:
CNPq e CAPES
Gerado em: 2014-5-22 11:33:03
13.025 - IDENTIFICAÇÃO DE VARIÁVEIS SIGNIFICATIVAS NA
PRODUÇÃO DE TANASE POR Serratia marcescens UTILIZANDO
PLACKETT-BURMAN DESIGN
Lopes, L. M. M. , Mello, M. R. F. , Lima, G. M. S. , Sena, A. R. ,
Agroindústria - IFPE Departamento de Antibiótico - UFPE
Introdução:
Tanino Acil Hidrolase (E.C. 3.1.1.20), conhecida como tanase, é uma enzima
produzida de forma intracelular ou extracelular e atua na hidrólise de taninos
hidrolisáveis, como o ácido tânico, em glicose e ácido gálico. A tanase
encontra-se presente em diferentes micro-organismos do ambiente como
leveduras, fungos filamentosos e bactérias. A maior parte de suas aplicações,
em alimentos, é na fabricação de chás instantâneos, produção de cerveja,
vinho e café. No entanto, a produção e otimização dos parâmetros que afetam
a síntese enzimática deve sempre ser investigada, porque as condições ótimas
variam entre diferentes organismos.
Objetivos:
Identificar variáveis significativas na produção de tanase através de Plackett-
Burman (PB).
Métodos:
Não foi realizado experimento com animais ou humanos. A partir de uma
cultura de 24 h, da bactéria Serratia marcescens crescida em meio TSA,
alçadas foram inoculadas em solução salina a 0,85% até obter uma suspensão
com densidade ótica entre 0,6 e 0,8 na escala de MacFarland. A produção
enzimática ocorreu em frascos Erlenmeyers de 125 mL contendo 25 mL de
meio de fermentação (0,3 % NaNO3; 0,1 % K2HPO4; 0,05 % MgSO4; 0,05
% KCl; 0,0001 % FeSO4, ácido tânico e extrato de levedura). Os parâmetros
pH, temperatura de incubação, agitação e tempo de fermentação, além do
ácido tânico, extrato de levedura e inóculo seguiram o planejamento. Foi
proposto um Planejamento PB composto por 16 ensaios e 2 pontos centrais
totalizando em 18 ensaios. Todas as variáveis foram avaliadas a dois níveis:
pH (5 e 6), temperatura (26 e 32ºC), ácido tânico (1 e 3%), tempo de
fermentação (24 e 72 h), agitação (100 e 150 rpm), inóculo (2 e 4%) e extrato
de levedura (1 e 5%). Todos os experimentos foram realizados aleatoriamente
e a resposta avaliada foi a atividade enzimática. Após centrifugação a 4000
rpm por 15 minutos, o sobrenadante foi utilizado para ensaios de atividades. A
atividade da tanase foi estimada utilizando rodanina etanólica e ácido tânico
como substrato. Os resultados obtidos foram tratados no software Statistica
7.0 ao nível de 5% de probabilidade.
Resultados:
A produção de tanase com o planejamento PB mostrou uma variação de
atividade enzimática (0,25 a 59,05 U/mL), um aumento de 236,2 vezes,
somente manipulando os parâmetros de processo e reagentes da formulação
do meio. A significância da equação do modelo avaliada pela Análise de
Variância revelou que a regressão foi significativa (p<0,05) e somente a
temperatura de incubação, a concentração do inóculo e a concentração de
ácido tânico foram significativos para a produção enzimática. A temperatura e
a concentração de ácido tânico tiveram efeitos positivos na produção
enzimática, se seus valores aumentarem, haverá um aumento no valor da
resposta desejada. Ao contrário, o inóculo teve seu efeito negativo,
aumentando seus valores, a atividade enzimática será diminuída.
Conclusão:
O planejamento Plackett-Burmam, baseado nos fundamentos estatísticos, é
sem dúvida uma ferramenta interessante para se chegar às condições
necessária para aumentar a produção de um processo/produto em
desenvovimento. Verifica-se então a possibilidade de otimização da produção
de tanase, pela bactéria S. marcescens, e sua aplicação biotecnológica.
Apoio Financeiro:
CnPQ
Gerado em: 2014-5-22 11:33:03
13.026 - Avaliação in vitro da atividade antioxidante e antimicrobiana de
quitosana e derivados hidrossolúveis obtidos de resíduos do
processamento do camarão marinho Litopenaeus vannamei
Mendonça, M. R. , Silva, R. P. F. , Cahu, T. B. , Silva, M. M. , Monte, F.
T. D. , Nascimento, L. C. P. , Santos, S. D. , Moreira, L. M. S. V. L. ,
Soares, K. L. S. , Bezerra, R. S. ,
Bioquímica - UFPE
Introdução:
A expansão do mercado de pescados tem gerado um volume cada vez maior
de resíduos pelas indústrias de processamento de pescados. A Carcinicultura
tem ocupado um lugar de destaque na economia pesqueira mundial. Os
resíduos chegam a apresentar cerca de 50% do total do camarão beneficiado.
Deste material, pode-se obter uma variedade de moléculas bioativas com
amplo potencial de aplicabilidade, como a quitosana, polissacarídeo que
possui diversas propriedades interessantes, principalmente, quanto convertido
em polímeros solúveis em pH neutro.
Objetivos:
Com o objetivo de determinar o potencial de aplicação dos derivados
hidrossolúveis de quitosana (quitosana quimicamente modificada) a partir de
resíduos do processamento do camarão L. vannamei, foi avaliada sua
atividade antioxidante e antimicrobiana in vitro.
Métodos:
Testes realizados in vitro, a partir de resíduos do processamento do camarão
marinho Litopenaeus vannamei, A quitosana foi obtida a partir de cabeças de
camarão pelo método de autólise enzimática. A derivatização química, foi
realizada através de diferentes metodologias para a formação de carboximetil
quitosana (CHCM), quitosana sulfato (CHS), quitosana carboximetil-sulfato
(CHCMS), quitosana-glicose (CHGlc), quitosana-glicosamina (CHGlcN) e
quitooligossacarídeos (COS). Os derivados foram caracterizados por
espectroscopia de infravermelho (FT-IR), ressonância magnética nuclear de
1H e 13C e análise elementar. Para determinação do potencial antioxidante
foram realizados ensaios espectrofotométricos do radical 1,1- difenil-2-
picrilhidrazil (DPPH), potencial redutor e quelante de ferro (Fe2+). A
determinação da atividade antibacteriana foi realizada por técnica de
microdiluição contra cepas Gram-positivas, Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis e Gram-negativas, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
Salonella enteretidis, Vibrio parahaemolyticus, Shigella sonnei e Klebsiella
pneumoniae, o resultado foi expresso em concentração mínima inibitória
(CMI) e concentração mínima bactericida (CMB).
Resultados:
A atividade antioxidante se mostrou variável entre as amostras, CHCM
apresentou 59,6±0,76%, 88,0±0,07% e 0,01±0,01nm; CHS, 99±0,82%,
83,6±0,38% e 0nm; CHCMS, 98± 2,85%, 86,9±0,16% e 0,04±0,01nm;
CHGlc, 90,1±2,22%, 5,1±4,2% e 0nm; CHGlcN, 65,5±1,38%, 19,61±2,79% e
0,14±0,02nm, e COS, 44,93±0,25%, 90,12±3,39% e 0,05±0,02nm para a
capacidade de sequestro do radical DPPH, quelante de íons Fe2+ e potencial
redutor, respectivamente. Todos os derivados, com exceção de COS e CHCM,
exibiram atividade de inibição contra as bactérias testadas, com valores que
variaram de acordo com o microrganismo estudado, CHGlc e CHGlcN,
apresentaram CMI de 0,63-10g/mL e CMB de 0,63 a > 10mg/mL, CHS e
CHCMS obtiveram CMI de 5-10mg/mL e MBC de 10 a > 20mg/mL. CHCM
exibiu inibição apenas contra E. coli e S. sonnei na concentração de 5 mg/mL
e 10mg/mL e CMB de >5mg/mL e 10mg/ml, respectivamente. COS não
apresentou atividade
Conclusão:
. Dessa forma, este trabalho identifica a oportunidade de obtenção de
biomoléculas com propriedades interessantes, a partir de um material
abundante e de baixo custo, possibilitando um amplo espectro de aplicações
na área alimentícia e biomédica.
Apoio Financeiro:
UFPE, CNPq, CAPES.
Gerado em: 2014-5-22 11:33:03
13.027 - IMUNOELETRODO BASEADO EM FILME DE
POLIPIRROL-NANOTUBO DE CARBONO PARA DETECÇÃO
LABEL-FREE DA TROPONINA CARDÍACA T HUMANA.
Menezes, C. E. L. , Silva, C. E. , Silva, B. V. M. , Silva, P. M. S. , Ribeiro,
R. T. , Dutra, R. A. F. ,
Engenharia Biomédica - UFPE Bioquímica - UFPE
Introdução:
Troponina cardíaca T humana (cTnT) é um marcador sensível e específico de
lesão cardíaca, sendo considerado como o marcador padrão ouro para o
diagnóstico do infarto agudo do miocárdio (IAM). Recentemente, várias
tentativas para determinação da cTnT utilizando imunossensores foram feitas
por diferentes transdutores baseados em ressonância de plasma de superfície e
técnicas piezoelétricas. Devido aos avanços fenomenais em nanotecnologia,
imunossensores eletroquímicos baseados em nanotubos de carbono (NTC)
surgiram como ferramenta útil para detecção de quantidades mínimas de
proteínas no sangue. NTCs aumentam a transferência de elétrons e reação
eletrocatalítica, além de facilitar a incorporação de grupos funcionais á sua
superfície, garantindo a imobilização abundante e orientada de biomoléculas
(Biochem. Eng. J. 67:225, 2012). Novas abordagens empregando NTCs
associados a filmes poliméricos mostraram-se como boas estratégias para a
construção de biossensores mais sensíveis (Carbon 50:3, 2012).
Objetivos:
Construir um imunossensor eletroquímico baseado em polipirrol-NTCs para
detecção de troponina cardíaca T humana.
Métodos:
Os experimentos realizados neste trabalho não envolvem animais ou
humanos/amostras de humanos. Neste trabalho, um filme nanocompósito de
polipirrol (PPy) e NTCs carboxilados foi eletroquimicamente sintetizado por
cronoamperometria (0,8 V vs Ag / AgCl). Após a pré-ativação dos NTCs
carboxilados com solução de EDC/NHS, os anticropos anti-TnT foram
imobilizados. As respostas analíticas foram registradas por voltametria de
pulso diferencial utilizando o sistema ferri-ferrocianeto como sistema redox.
Uma curva analítica foi gerada quando o imunoeletrodo foi incubado como
soluções de cTnT (comercial) por 20 min e 25 ºC.
Resultados:
O filme PPy + NTCs carboxilados promoveu aumento da área eletroativa,
tornando o sistema mais sensível. O efeito sinérgico entre NTCs e o filme
condutor PPy resultou em uma imunossensor com alta confiabilidade .A curva
analítica de calibração mostrou resposta linear entre 0,1 e 0,5 ng/ml (r =
0,996, n = 3, p < 0.001). De acordo com critérios estabelecidos pela
Organização mundial de saúde (OMS, 1970), o ponto de corte para detecção
de cTnT no diagnóstico do infarto agudo do miocárdio é de 0,1 ng/ml. Assim,
será efetuado uma curva de calibração em uma faixa mais ampla, incluindo
concentrações abaixo e acima das que já foram testadas para avaliar a
lineariedade e limite de detecção.
Conclusão:
O filme nanocompósito de polipirrol e NTCs carboxilados resultou na
formação de um imunossensor sensível para detecção da troponina cardíaca T
humana, podendo ser útil para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio.
Apoio Financeiro:
FACEPE, CNPq e CAPES.
Gerado em: 2014-5-22 11:33:03
