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16/09/2015
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Amostragem
Amostragemconjunto de operações com as quais se obtém, do material
em estudo, uma porção relativamente pequena, detamanho apropriado para o trabalho no laboratório, masque ao mesmo tempo represente correctamente todo oconjunto da amostra
maior ou menor dificuldade na amostragem depende dahomogeneidade da amostra
processo de amostragemsérie sucessiva de etapas operacionais especificadas
para assegurar que a amostra seja obtida com a necessária condição de representatividade
3 etapas principais:colheita da amostra brutapreparação da amostra de laboratóriopreparação da amostra para análise
1
Amostragem
colheita da amostra brutaamostra bruta deve ser uma réplica, em
ponto reduzido, do universo considerado, tanto no que diz respeito à composiçãocomo à distribuição do tamanho dapartícula
amostras fluidas homogéneas – recolhidasa partir do topo, meio e fundo do recipiente, após agitação ehomogeneização
amostras sólidas – previamente moídas emisturadas
2
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2
Amostragem
fórmula geral para determinar qual aamostra bruta a colher
N – nº de unidades colhidasc – factor ligado ao grau de precisão e
homogeneidade da amostra (c < 1 parapopulação homogénea e c > 1 parapopulação heterogénea)
n - população
N c n
3
Amostragem
preparação da amostra de laboratórioamostra bruta frequentemente grande
demais para ser convenientementetrabalhada no laboratório
reduzidaalimentos secos – redução manual ou por
equipamentosalimentos líquidos – líquido bem
homogeneizado no recipiente; retirarporções de diversas zonas e misturá-lasno final
alimentos semi-sólidos – amostras raladas, procedendo de seguida de modo análogo ao das amostras sólidas
queijos duros, chocolates
4
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3
Amostragem
alimentos húmidos – amostra picada oumoída e misturada; retirar uma alíquotasuficiente para a análise
armazenar sob refrigeraçãocarnes, peixes, vegetais
alimentos semi-viscosos e pastosos e líquidos contendo sólidos – amostraspicadas em liquidificador, misturadas e alíquotas retiradas para análise
pudins, molhos, compotas, produtosenlatados
alimentos com emulsão – amostrasaquecidas a 35 ºC num frasco comtampa e depois agitado para homogeneização. Retiradas as alíquotasnecessárias para análise
manteiga, margarina
5
Amostragem
frutasfrutas grandes cortadas ao meio nos
sentidos longitudinal e transversal de modo a obter 4 partes. 2 partes opostas sãojuntas e homogeneizadas numliquidificador
frutas pequenas homogeneizadas inteiras no liquidificador
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4
Amostragem
preparação da amostra para análisedepende da natureza da amostra e do
método analítico envolvido
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Amostragem
conservação da amostraquando não é possível analisar as amostras em
frescoinactivação enzimáticadiminuição das alterações lipídicascontrolo do ataque oxidativocontrolo do ataque microbiológico
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Amostragem
variabilidade da amostraalimentos têm composição muito variada
alimentos frescos de origem vegetal têmcomposição mais variada que os deorigem animal
frutas e vegetais da mesma variedadepodem ter composições diferentes ou acomposição pode variar após a colheita
9
Amostragem
factores que influenciam a composição dosalimentos de origem vegetal:
constituição genética; variedadecondições de crescimentoestádio de maturaçãotempo e condições de armazenamentoparte do alimento a ser analisada
factores que influenciam a composição dosalimentos de origem animal:
teor em gorduraparte do animalalimentação do animalidade do animalraça
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Amostragem
factores que influenciam a composição dosalimentos após a colheita:
perca ou absorção de humidadeperca de constituintes voláteisdecomposição química e enzimáticaoxidação provocada pelo arejamento
durante a homogeneizaçãoremoção de materiais estranhosataque microbianocontaminações (metais, …)
11
Técnicas Analíticas
Química analíticaanálise qualitativa
identificação dos componentes de uma amostraanálise quantitativa
determinação da quantidade de material presente numa amostra
alguns métodos mais adequados para análise qualitativa, outros para análise quantitativa. Existem métodosadequados para ambas
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Técnicas Analíticas
tipos de métodos:gravimétricos
métodos baseados na medida do pesopor titulação
métodos baseados na medição de um volumeelectroquímicos
medição do potencial, intensidade, resistência, carga, …
espectroscópicosinteracção de um analito com radiação
electromagnéticacromatográficos
separação de um material devido à sua interacçãocom 2 fases diferentes
quimiométricostratamento estatístico dos dados
13
Técnicas Analíticas
calibração do métodoresposta medida é proporcional à concentração do
analitoestabelecer uma relação entre a resposta medida e a
concentração do analitoutilizam-se padrões para calibrar essa relação
padrões devem ser preparados do mesmo modo que a amostra
padrões devem ter uma composição semelhante à da amostra
padrões devem ser preparados na gama de concentrações esperada para a amostra
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Técnicas Analíticas
análises gravimétricasmétodos baseados na precipitação de compostos
insolúveismétodos baseados na volatilização de um analito
depois de volatilizado, é pesado e determina-se quanto perdeu
15
Técnicas Analíticas
começa-se por pesar a amostraconverte-se a amostra num precipitado mensurávelse a forma mensurável for o analito
% analito = (peso analito/ peso amostra) x 100
normalmente, a forma mensurável contém o analito juntamente com outros materiais
peso do analito determinado através do factorgravimétrico
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9
Técnicas Analíticas
características desejáveis num precipitado:baixa solubilidadefácil de recuperar por filtraçãonão reagir com o ar, água, …analito seja apenas uma pequena parte do
precipitadofacilita cálculo da estequiometria
mecanismos de precipitação:nucleação
quando há união inicial de um pequeno nº de iões, átomos ou moléculas
espontânea ou induzidacrescimento de partículas
crescimento tridimensional de uma partícula, originando um cristal
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Técnicas Analíticas18
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Técnicas Analíticas
nucleação e crescimento de partículas são processos competitivos
desejável que o crescimento de partículas seja o factor preponderante na formação de precipitados
resulta em precipitados cristalinos e não em suspensões coloidais
formação de precipitados cristalinos favorecida por:
temperatura elevadacontrolo do pHutilização de soluções diluídasadição lenta de reagentesagitação da solução
19
Técnicas Analíticas
problemas encontrados durante a precipitação:coprecipitação de materiais que normalmente são
solúveisabsorção à superfície
contra-iões absorvem à superfícieoclusão
se o crescimento do cristal for muito rápido, alguns contra-iões não têm tempo para escapar da superfície
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Técnicas Analíticas
formação de cristais mistosse estiverem presentes iões semelhantes,
estes podem substituir parcialmente o analito
aprisionamento mecânicoquando crescimento rápido aprisiona parte
da solução
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Técnicas Analíticas
após filtração do precipitado, este é seco até se obter um peso constante
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Técnicas Analíticas
vantagens e desvantagens dos métodos gravimétricoslentos; longos tempos de esperarequerem pouco equipamento; balança, fornonão requerem calibraçãoexactidão de 1 – 2 ppmsensibilidade limitada a concentrações do analito
> 1 %razoavelmente selectivos
23
Técnicas Analíticas
Densimetriausada sobretudo em amostras líquidas, embora
também possa ser utilizada em sólidospicnometria
método mais comum de medição da densidademede o peso de um volume conhecido de líquido
num frasco, cujo volume é calibrado em termos do peso de água pura no mesmo frasco
métodos por flutuaçãoum corpo total ou parcialmente imerso num líquido
flutua por uma força igual ao peso do líquido deslocado
flutuação de um corpo mergulhadorflutuação de um corpo flutuante (hidrometria)
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Técnicas Analíticas
hidrometria baseia-se no princípio de que o mesmo corpo desloca pesos iguais de qualquer líquido em que flutue
volumes de diferentes líquidos deslocados pelo mesmo corpo flutuante sãoinversamente proporcionais às densidades dos líquidos
1 2
2 1
d V
d V
25
Técnicas Analíticas
Refractometriaíndice de refracção
razão entre a velocidade de radiação de umafrequência no vácuo e a velocidade de radiaçãoda mesma frequência no meio considerado
índice de refracção no ar e no vácuo diferem de apenas 0.03 %
usa-se o ar como referênciamagnitude da refracção é uma característica de
cada substânciadesignada índice de refracção (hD)
sen
sen D
i
rh
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Técnicas Analíticas
índice de refracção padrão dado pela linha D daluz de sódio monocromática a 589 nm e a uma dada temperatura
análise qualitativacada átomo, ligação e grupo funcional contribui
para o índice de refracção total de umcomposto
índice de refracção específico – soma das diversas contribuições
refractividade molar – índice de refracçãoespecífico multiplicado pelo pesomolecular
específica de cada composto
2
2
1
2x
MR
d
h
h
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Técnicas Analíticas
análise quantitativaíndice de refracção de uma solução varia com a
concentração do solutovaria linearmente quando concentração
expressa em peso do soluto por volume de solução
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Técnicas Analíticas
Medida de pHpH = -log aH+
em soluções diluídas (alimentos) considera-seactividade igual a [H+]
medido por eléctrodosum de medida e outro de referência,
geralmente combinados
29
Técnicas Analíticas
eléctrodo de vidro é o eléctrodo de medidamais usado
em solução aquosa, os catiões damembrana de vidro permutam com H+
formação de uma camada de sílicahidratada
funciona como uma membrana de permuta catiónica, sensível a H+
eléctrodo de Calomelanos geralmente usadocomo eléctrodo de referência
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Técnicas Analíticas
determinação da acidezacidez nos alimentos pode provir de:
compostos naturais dos alimentosresultado de fermentações ou outro tipo de
processamentoácidos adicionados durante o processamentodeterioração do alimento
principais ácidos encontrados nos alimentoscítrico, málico, oxálico, succínico e tartárico
outros ácidosisocítrico, fumárico, oxalacético e cetoglutárico
31
Técnicas Analíticas
acidez total tituláveltitulação usando um indicador ou um medidor de
pHacidez volátil
determinação pela separação dos ácidos voláteispresentes, principalmente ácido acético e traçosde ácido fórmico
separação feita por evaporação em banho--maria, destilação directa e destilação a vapor
destilado ou resíduo titulados com uma base padrão até o ponto final, usando um indicador (fenolftaleína)
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Técnicas Analíticas
Cromatografia“escrever com cores”introduzida em 1906 por Tswett
E:\Bromatologia I\article Tswett.pdf
componentes da amostra são distribuídos entre 2 fases, uma das quais estacionária, enquanto a outra fluiatravés dessa
cada componente da amostra será diferentementeretido pela fase estacionária devido a diversas interacções com esta
adsorção à superfíciesolubilidade relativacarga
33
Técnicas Analíticas
tipos de cromatografia
CP – cromatografia em papelCCD – cromatografia em camada fina (TLC)CGL – cromatografia gasosa líquidaCGS – cromatografia gasosa sólidaCSS – cromatografia supercrítica sólidaCSFL – cromatografia supercrítica de fase ligada
CLL – cromatografia líquida líquidaCLS – cromatografia líquida sólidaCE – cromatografia de exclusãoCLFL – cromatografia líquida de fasse ligadaCTI – cromatografia de permuta iónicaCB – cromatografia de bioafinidade
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Técnicas Analíticas
em função da polaridade das 2 fases, cromatografia pode ser de:
fase normalfase estacionária polar e fase móvel apolar
fase reversafase estacionária apolar e fase móvel polar
35
Técnicas Analíticas
transferência dos componentes da fase móvel para a fase estacionária depende de:
adsorção na superfície das partículas sólidas da fase estacionária
partição entre os líquidos da fase móvel e da fase estacionária que fica nos poros de um suporte sólido inerte
formação de ligações heteropolares com componentes iónicos da fase estacionária
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Técnicas Analíticas
separação dos componentes de uma mistura baseia-se no facto de que a velocidade de passagem de um soluto individual na fase estacionária depende da partição da molécula entre as 2 fases
K – coeficiente de partiçãoCS - concentração do soluto na fase estacionáriaCm – concentração do soluto na fase móvel
K elevado significa que o soluto tem maior afinidade com a fase estacionária
maior tempo de retenção
37
Técnicas Analíticas
razão de retenção (R)dá a migração de uma substância em relação à
fase móvel
fracção de tempo que as moléculas do soluto gastam na fase móvel em relação à fase estacionária
cromatografia em papel e TLC usam-se distâncias de deslocamento
Rf – factor de retenção
velo. soluto
velo. fase móvelR
distância percorrida pelo centro da zona do soluto
distância percorrida pela frente do solventefR
•R e Rf não são constantes cromatográficas; dependem das condições cromatográficas
•impossível reproduzir valores obtidos por outros autores
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Técnicas Analíticas
tipos de desenvolvimento do cromatogramaeluição
mais utilizado em análiseamostra introduzida numa extremidade do
sistemaadiciona-se um eluentecomponentes da mistura arrastados com
diferentes velocidadesfunção da afinidade relativa com as 2 fases
39
Técnicas Analíticas
má separação pode dever-se a:coeficientes de partição muito próximos e
pequenoscomponentes eluem todos ao mesmo
tempo, praticamente junto como eluente
coeficiente de partição muito grandecompostos ficam retidos muito tempo e
separam malseparação pode melhorar por uso de
gradientesvariar tipo e concentração da fase
móvelvariar a pressão da fase móvelvariar a temperatura da coluna
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Técnicas Analíticas
deslocamentoutilizado em cromatografia preparativa
deseja-se recuperar componentes damistura
componentes da amostra eliminados da faseestacionária usando uma fase móvel queé mais atraída por ela
fase móvel liga-se à fase estacionária e desloca os componentes da mistura para seguirem livremente
41
Técnicas Analíticas
análise frontalpouco utilizadapassagem da amostra dissolvida num solvente
através da fase estacionária sem aplicação de eluente
componentes da amostra descem a colunapor gravidade
usada para separação de um componenteindesejável na amostra, que ficaria retidona fase estacionária, enquanto os outroscomponentes sairiam todos misturados
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Técnicas Analíticas
mecanismos de separaçãoprocessos físicos
processos de adsorção e absorção (partição)baseados principalmente em atracções
electrostáticas ou dipolares (forças deVan der Waals), incluindo formação depontes de H
adsorção dá-se quando fase estacionária éum sólido e fase móvel gás ou líquidos
em TLC, adsorção dá-se na interface entre sólido e fase móvel
43
Técnicas Analíticas
absorção ou partição dá-se quando faseestacionária é um líquido espalhado nasuperfície de um suporte sólido inerte, ou aderido às paredes do tubo cromatográfico
baseia-se nas diferentes solubilidadesdos componentes da amostra na fase estacionária líquida e nafase móvel também líquida
dá-se na cromatografia em papel, nalíquida-gasosa e na líquida-líquida
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Técnicas Analíticas
mecanismo misto entre a partição e a adsorção
fase estacionária tem partes que actuam como adsorvente e outras como líquidos
dá-se na cromatografia líquida de fasereversa
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Técnicas Analíticas
processo químicoprocesso de permuta iónicafase estacionária constituída por uma matriz
onde são adicionados grupos funcionais ionizáveis
permutadores aniónicos possuem sítiosactivos carregados positivamente, retendo aniões
permutadores catiónicos possuem sítioscarregados negativamente, retendocatiões
fase móvel geralmente uma solução iónicatampão
se a fase estacionária retém catiões, fase móvel deve conter catiõescapazes de os substituirpreferencialmente
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Técnicas Analíticas
processo mecânicocromatografia por exclusãofase estacionária é uma matriz inerte, com
partículas de forma, tamanho e porosidade uniformes
moléculas da amostra separadas por tamanhomenores penetram facilmente os poros da
fase estacionáriamaiores excluídas de todos os porosmoléculas intermédias penetram
selectivamente nos poros, entrando em apenas alguns, saindo da coluna em ordem relacionada com o seu tamanho efectivo
moléculas maiores saem primeiro da coluna
47
Técnicas Analíticas
nomenclaturacromatograma
gráfico demonstrativo da separação obtidacromatografia planarcromatografia em coluna
áreas dos picos proporcionais às concentrações
tempo de retenção efectivo - tempo em que as moléculas ficam retidasna fase estacionária
tM (tempo morto) – tempo gasto pelosoluto não retido a atravessar a coluna
volume da fase móvel necessário paraeluir um componenteF – fluxo da fase móvel
VM (volume morto) – volume de fasemóvel gasto para eluir um componente não retido
Volume total dentro da colunaVe – volume da fase estacionária
'
r r Mt t t
r rV t F
M MV t F
t M eV V V
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Técnicas Analíticas
na cromatografia em coluna, a retenção de um componente é dada pelo factor de retenção (k)
quantificação feita por medida das áreasdos picos
'
r
m
tk
t
tm– tempo em que as moléculas percorrem a coluna na fase móvel
49
Técnicas Analíticas
eficiência da separaçãoseparação entre 2 picos adjacentes medida por:
factor de separação (a)
razão entre os respectivos factores deretenção
resolução (R)razão entre a diferença dos tempos de
retenção entre 2 picos adjacentes e a média das suas larguras na linha de base
2
1
k
ka
2 1
1 2
2r r
S
b b
t tR
l l
medida da largura na linha de base faz-se traçando tangentes nos lados dos picos
50
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Técnicas Analíticas
eficiência de uma coluna cromatográficanº de pratos teóricos (N)
prato teórico é o equilíbrio de distribuição do soluto entre a fase móvel e a estacionária
quanto maior o nº de pratos teóricos, mais eficaz a separação, devidoa maior número de equilíbrios
2 2
/ 2
16 5.545r r
b h
d dn
l l
n – nº de pratos teóricoslh/2 – largura do pico a meia-altura
usa-se quando pico mal definido e não se podem traçar as tangentes
Afase móvel Ý Afase estacionária
51
Técnicas Analíticas
descontando a distância do tempo mortoobtém-se o nº de pratos teóricosefectivos (N)
N varia com:tempo de retençãocomprimento e diâmetro da colunatipo de solutofluxo da fase móveltamanho da amostratécnica de injecçãotemperatura…
2 2' '
/ 2
16 5.545r r
b h
d dN
l l
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Técnicas Analíticas
altura equivalente de um prato teórico (H)
razão entre o comprimento total da coluna (L) e o nº equivalente de pratos teóricos
quanto maior o valor de N e menor ode H, maior a eficácia da coluna
LH
N
53
Técnicas Analíticas
equação de van Deemter (teoria da velocidade)relaciona o valor da altura equivalente do
prato teórico com a velocidade linear (m)
da fase móvel e factores que causamalargamento das bandas dos compostos ou dos picos dos cromatogramas
alargamento dá-se porque as moléculas do soluto não se deslocam simultaneamente na fase estacionária
BH A Cm
m
A – efeito dos múltiplos caminhosrelacionado com o empacotamento da coluna
B – difusão molecular do soluto na fase móvelapenas relevante em GC
C – resistência à transferência de massa das moléculasdo soluto da fase estacionária para a móvelmais importante na LC
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Técnicas Analíticas
A
B
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Técnicas Analíticas
pretende-se encontrar Hmin para umaeficácia óptima da coluna
A é uma constante, B diminui e C aumenta com o aumento dofluxo da fase móvel
utilização de colunas de diâmetro interno pequeno esuportes sólidos de tamanho pequeno euniforme diminui A
aumentar densidade do gás de arrastodiminui B
diminuir espessura e viscosidade do filme líquido da fase estacionáriadiminui C
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Técnicas Analíticas
curvas de van Deemter
Colunas capilares
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Técnicas Analíticas
análise qualitativacromatografia não permite identificar um composto
indica a presença de uma substância mas não a identifica
em certas condições, é possível comparartempo de retenção com o de um padrão
padrão deve ser uma parte da amostra ouadicionado a ela (padrão interno)
deve eluir aproximadamente a meio daanálise
amostra deve ser pequenavalores razoavelmente constantes ao longo
de diversas “corridas”
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Técnicas Analíticas
análise quantitativadetectores produzem uma resposta por unidade de
concentraçãodependente da substância, pelo que deve
sempre usar-se um padrãorequer picos razoavelmente bem resolvidosárea do pico proporcional à concentração
59
Técnicas Analíticas
método do padrão externosolução padrão contendo todos os analitos a
quantificarpadrões devem ter concentrações semelhantes
às dos componentes da amostrapadrão e matriz da amostra devem ser
semelhantescondições analíticas devem ser idênticas
desconhecida
desconhecida padrão
padrão
áreaconc = conc
área
60
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Técnicas Analíticas
método do padrão internosubstância conhecida adicionada em
concentração constante a todas as amostras
tem em conta variações durante a análisedeve ser estável e mensurável nas
condições analíticas utilizadasnão deve interferir na análise nem coeluir
com componentes da amostra
padrão int.1 desconhecido
desconhecida padrão
padrão int.2 padrão
área áreaconc = conc
área área
61
Técnicas Analíticas
Cromatografia em papelcromatografia líquido-líquidoseparação ocorre por partição do soluto entre 2
líquidoscomponentes menos solúveis na fase estacionária
movem-se mais rapidamente ao longo do papel, mais solúveis retidos no papel, movendo-se mais lentamente
simples e baratapequena quantidade de amostraboa capacidade de resoluçãoprática
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Técnicas Analíticas
mecanismo de separaçãolíquidos polares (como H2O) têm grande
afinidade pelos grupos OH da celulose do papel, formando pontes de H
líquido retido funciona como fase estacionária
líquidos menos polares (solventes orgânicos) são repelidos
funcionam como fase móvel
63
Técnicas Analíticas
aplicação da amostraamostra preferencialmente dissolvida num
líquido volátilaplicada com um capilar
mancha pode ser detectada por:métodos químicos
reveladores químicos que tornam as manchas coloridas
métodos físicosfluorescência de algumas substâncias
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Técnicas Analíticas
análise/identificaçãomede-se a distância percorrida pelo soluto num
tempo determinado, desde o ponto de aplicação da amostra até ao centro da mancha
mede-se a distância percorrida pela fase móvel, desde o ponto de partida até à linha de chegada
pode fazer-se a extracção dos componentes separados no papel com um solvente adequado
método instrumental para quantificar o componente isolado
espectrofotometria
distância percorrida pela substância
distância percorrida pela frente da fase móvelfR
65
Técnicas Analíticas
tipos de desenvolvimentoascendente
mais simples e comumdescendente
manchas colocadas na parte de cima do papel
papel colocado numa cuba com solventesolvente desce por capilaridade e gravidade
mais rápida, mas necessita de equipamento mais complexo
horizontal (circular)solvente colocado no centro do papel e a
amostra em voltaseparação dá-se de modo circular
bidimensionalfase móvel desloca-se ascendentementede seguida roda-se o papel 90º e faz-se
novo deslocamento ascendente
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Técnicas Analíticas
eficiência de separaçãoconcentrações muito elevadas provocam
formação de cauda, devido a movimentação do soluto de regiões de maior concentração para regiões demenor concentração
se solutos e fase móvel percorrem distâncias diferentes – difusão lateral
se o fluxo for muito rápido, não há um tempo ideal de contacto entre a fase móvel e afase estacionária
depende da composição da fase móvel
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Técnicas Analíticas
Cromatografia em camada fina (TLC)separação dos componentes de uma mistura por
migração diferencial sobre uma camada fina deadsorvente preso sobre uma superfície plana
superfície de vidro ou alumínio
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Técnicas Analíticas
vantagens:fácil execuçãorapidezversatilidadegrande reprodutibilidadebaixo custo, embora mais cara que
cromatografia em papelaplicação analítica ou preparativaseparação mais rápida e eficaz que na
cromatografia em papelpermite utilização de agentes de revelação
corrosivosmais sensível e requer menor quantidade de
amostra que cromatografia em papelmais versátil em relação à fase estacionária que
cromatografia em papel
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Técnicas Analíticas
desvantagens:maior dificuldade de retirar as manchas da
placa para análise por outros métodos que na cromatografia em papel
menor uniformidade para fazer a camada fina
70
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Técnicas Analíticas
separação baseada na adsorçãosoluto separado entre fase estacionária sólida e
fase móvel líquidapodem existir fases estacionárias que
permitem separação por partição oupermuta iónica
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Técnicas Analíticas
detecção feita com reagentes cromogénicos convencionais ou por uso de radiação UV
“identificação” feita com padrõesquantificação feita por raspagem da placa, seguida
por dissolução em solvente e análise em espectrofotómetro
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Técnicas Analíticas
Cromatografia em camada fina de alta eficiência (HPTLC)
diferentes adsorventes utilizados como fase estacionária
aumento da eficiência de separação relativamente à TLC clássica
Parâmetros TLC HPTLC
Tamanho habitual da placa 20x20 cm 10x10 cm
Volume aplicado de cada amostra 1 – 5 mL 0.1 – 0.2 mL
Nº de amostras por placa 7 – 10 10 - 20
Diâmetro da mancha 3 – 6 mm 1 mm
Distância de migração do solvente 10 – 15 cm 3 – 6 cm
Tempo de corrida 30 -200 min 3 – 20 min
Diâmetro médio da partícula de sílica gel 20 mm 5 mm
Limites de detecção
por absorção de luz ~5 ng ~0.5 ng
por fluorescência ~0.1 ng ~0.1 ng
Pratos teóricos até 600 até 5000
73
Técnicas Analíticas
Cromatografia líquida em coluna abertadividida em 4 partes de acordo com o mecanismo
de separaçãocromatografia de adsorçãocromatografia de partiçãocromatografia de exclusão molecular
filtraçãopermeação em gel
cromatografia de permuta iónica
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Técnicas Analíticas
cromatografia de adsorção (líquida-sólida)fase estacionária é um sólido de superfície
activasílica gel, alumina, celulose, ...sólido empacotado dentro da coluna de
vidro ou de açofase móvel é um solvente composto de um ou
mais líquidos orgânicoselui os componentes da amostra através da
colunafase normal – fase estacionária é polar; fase
móvel apolarfase reversa – fase estacionária é apolar; fase
móvel polar
75
Técnicas Analíticas
separação resulta da diferente adsorção dos componentes da amostra sobre a superfície do sólido (fase estacionária)
solutos fracamente adsorvidos caminham mais rapidamente
solutos mais fortemente adsorvidos são retardados
interacções moleculares envolvidas na adsorção:
pontes de Hforças electrostáticas (van der Waals)forças de transferência de carga...
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Técnicas Analíticas
funções dos eluentes:dissolver componentes da amostraeluir componentes da amostra pela coluna
desvantagem da técnica:produz cauda (tailing) ou alargamento da
banda (efeito de difusão)prejudica separação
77
Técnicas Analíticas
2 tipos de cromatografia de adsorção em coluna:
convencional, à pressão atmosféricacoluna de vidroamostra colocada no topo de uma
coluna de vidro empacotada com um adsorvente
eluição com um solvente, à pressão atmosférica
recolha na saída da coluna, a tempos ou volumes constantes
fracções recolhidas analisadas por:métodos físicos – fluorescência,
absorção electrónica, pH, actividade óptica, índice de refracção, ...
métodos químicos – adição de um reagente que produza um composto colorido ou fluorescente
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40
Técnicas Analíticas
HPLC, a pressão elevadacoluna de aço estreitaseparação mais rápidaalém da separação, permite a
identificação e quantificação através de detectores e processadores
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Técnicas Analíticas
cromatografia de partição (líquida-líquida)coluna empacotada com um suporte sólido de
grande área superficial embebido com uma fase líquida
amostra aplicada no topo da colunaeluída com fase móvel líquida imiscível com a
fase estacionáriaseparação devida a migração mais lenta de
solutos relativamente mais solúveis na fase líquida estacionária, relativamente à dos solutos com maior solubilidade relativa na fase móvel líquida
solutos são sempre mais solúveis na fase estacionária que na fase móvel
80
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41
Técnicas Analíticas
cromatografia de partição normal (ex.)para separar uma mistura polar, usa-se um
líquido polar (H2O) como fase estacionária e um líquido menos polar (solvente orgânico) como fase móvel
cromatografia de partição de fase reversa (ex.)solutos não polares separados numa fase
estacionária menos polar (óleo mineral) com uma fase móvel mais polar (metanol)
81
Técnicas Analíticas
forças intermoleculares envolvidas na partição:pontes de Hforças de dipolos induzidosforças de dispersãoforças de interacção específica
82
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42
Técnicas Analíticas
cromatografia líquida de permuta iónicacoluna empacotada com uma fase estacionária
sólida contendo grupos iónicosgrupos iónicos podem trocar
reversivelmente catiões ou aniões com uma solução iónica
separação dá-se por troca de iões entre os solutos da amostra e os componentes iónicos das fases móvel e estacionária
83
Técnicas Analíticas
amostra colocada no topo da coluna e eluída com uma fase líquida iónica
iões da amostra são atraídos para a fase estacionária por forças electrostáticas
arrastados pelo eluente, por troca de lugarvelocidades de arrastamento dependem da
sua afinidade relativa para com a resinaos mais atraídos pela resina movem-se
mais devagarregras de selectividade do permutador iónico:
prefere iões com maior cargaprefere iões de menor tamanhoprefere iões altamente polarizáveisprefere iões com fracas interacções com a
fase móvel
84
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43
Técnicas Analíticas
fase móvel é um líquido ou mistura de líquidos com cargas iónicas do mesmo sinal que os solutos da amostra, mas com maior força iónica
solução ácida, básica ou tampãofase estacionária é um material poroso, inerte,
insolúvel em água e em solventes orgânicos
possui grupos permutadores iónicos ligados covalentemente
natural ou sintéticaorgânica ou inorgânica
também existe a cromatografia de permuta iónica de alta eficiência
fase móvel a pressão elevada
85
Técnicas Analíticas
cromatografia líquida de exclusão molecular (permeação em gel)
componentes da amostra não possuem afinidade nem com a fase móvel nem com a estacionária
separados por selecção de tamanho das moléculas, através da fase estacionária
fase móvel apenas dissolve e arrasta os componentes da amostra
moléculas menores penetram no interior da fase estacionária, sendo retardadas relativamente às moléculas maiores, as quais percorrem trajectos mais curtos (pelo exterior das partículas da fase estacionária)
86
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44
Técnicas Analíticas
vantagens:simplicidade técnicainsensibilidade a solventes e temperaturacondições suavesversatilidade
87
Técnicas Analíticas
fase estacionária pode ser um gel hidrofílico e a fase móvel um solvente aquoso salino
alternativamente, um gel hidrofóbico e um solvente orgânico
características da fase estacionária:inércia química
evitar ligação irreversível entre fase estacionária e componentes da amostra
estabilidadepermitir uso contínuo quando mantida
em condições moderadas de pH e temperatura
88
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45
Técnicas Analíticas
cromatografia líquida de bioafinidademais utilizada na área da farmácia que na dos
alimentosmacromoléculas biológicas ligam-se
reversivelmente a ligantes específicosfase estacionária constituída por um suporte
sólido inerte onde estão presos os ligantes
fase móvel formada por soluções com diversos valores de pH ou força iónica (tornam instável ligação por bioafinidade) ou com substâncias que possuem maior afinidade pelo ligante do que o componente da amostra
89
Técnicas Analíticas
escolha do solvente em LC1º - determinar se vamos trabalhar em fase normal
ou fase reversase a amostra for não polar ou insolúvel em
água – usar fase normalse a amostra for solúvel em água ou não
solúvel mas polar – usar fase reversafrequentemente tem que se usar uma mistura de
solventestirar partido de diferentes polaridades e
propriedades de solventepolaridade determina tempo de
retenção dos eluentesselectividade do solvente determina a
retenção relativa; pode afectar forma dos picos
90
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46
Técnicas Analíticas91
Técnicas Analíticas
alguns solventes não podem ser usados por:não serem quimicamente inertespossuirem absorção no UV ou viscosidade
elevadasserem tóxicos ou inflamáveispossuirem pressão de vapor elevadaserem demasiado carosserem pouco miscíveis
92
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47
Técnicas Analíticas
eluição com gradientes permite variar a polaridade e melhorar a separação
redução no tempo de análisepicos melhor formadosmaior sensibilidadepode provocar deriva na linha de base
93
Técnicas Analíticas
tipos de cromatografia líquida compatíveis comuso de gradientes:
permuta iónicafase ligadaadsorção
94
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48
Técnicas Analíticas
Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)optimização da cromatografia em coluna
solvente atravessa a coluna a pressão elevadaseparação mais rápida e eficiente
fase móvel é um líquidofase estacionária pode ser sólida (mais comum) ou
líquida
Coluna clássica HPLC
Depende da experiência do analistaMaiores resolução, sensibilidade e
reprodutibilidade
Fase estacionária menos durável
Detecção demorada e manual Maior rapidez e automação
BarataEquipamento, operação e manutenção mais caras
95
Técnicas Analíticas
GC HPLC
Técnica e equipamento maisbaratos
Analisa amostras não voláteis e termicamente instáveis
Menor tempo de análiseAmostras com maior variedade de
peso molecular
Maior sensibilidade (10-12 g) Maior variedade de aplicação
Maior capacidade analítica (podeseparar até 200 componentes)
Ambas as fases têm afinidade comos componentes da amostra
Menor tempo de formação técnica Maior versatilidade
Maior diversidade de mecanismosde separação
vantagens de HPLC em comparação com GC
96
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49
Técnicas Analíticas97
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCreservatório da fase móvel
resistente aos líquidos usados como fasemóvel
aço, vidro, plástico inertefase móvel deve ser filtrada e
desgaseificadaevitar entupimento e entrada de gases
no equipamentogases provocam aparecimento de
picos no cromatograma e podem alterar a fase móvel e degradar afase estacionária
desgaseificação feita por:ultra-sons, aquecimento, vácuo,
refluxo
98
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50
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCbombas de pressão elevada
garantem fluxo constantereprodutibilidade, sensibilidade e
resoluçãomedidores de pressão
permitem verificar existência de problemasentupimento – aumenta pressãovazamento – baixa pressão
pressão influenciada por:viscosidade da fase móveldimensões da colunadiâmetro das partículas da fase
estacionáriaempacotamento da coluna
99
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCinjectores
devem ser:reprodutíveispermitir diversos volumes de injecção
10 – 100 mL
tipos de injector:micro-seringaválvula rotatória
gira de modo a que a fase móvel se ligue com o “loop” da amostra, arrastando-a para dentro da coluna a pressão elevada
100
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51
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCcolunas
3 tipospré-colunas
colocadas entre a bomba e oinjector para:
reter impurezas da fase móvel e preservar a coluna analítica
saturar a fase móvel com olíquido da fase estacionária em cromatografia líquida-líquida (evitar que se misturem, destruindo o enchimento da colunaanalítica)
actualmente pouco utilizadas, poisfase móvel é filtrada e fasesestacionárias mais resistentes
101
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCcolunas de guarda
colocadas entre o injector e acoluna analítica
mais curtas mas com mesmo diâmetro e fase estacionária queas colunas analíticas
retêm impurezas da amostrarenovação frequente necessária
colunas analíticasresponsáveis pela separaçãofeitas de materiais inertes
aço, vidro reforçado, sílicafundida
diâmetro interno uniformeresistentes à fase móvel e pressão
elevada
102
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52
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCdetectores
medem, de forma contínua, umapropriedade física dos componentes da amostra
enviam um sinal eléctrico que seráregistado como um pico
tipo de detector usado depende doscompostos a analisar
requisitos:alta sensibilidadeeficiente detecção mínimabaixo nível de ruídolargo intervalo de linearidadeelevada estabilidadeboa repetibilidade
103
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCsensibilidade
relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gerao sinal
alta sensibilidade – grande resposta para um dado componente daamostra
detecção mínimamínima quantidade do composto
que pode ser detectadaquantidade que gera um sinal 2
vezes superior ao ruído de fundo
ruído de fundovariação do sinal do detector,
devida a variações eléctricas, defluxo, de temperatura, bolhas de ar, …
104
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53
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLClinearidade
proporcionalidade entre a respostaquantitativa do detector e a concentração do compostodetectado
verificada através de uma recta padrão que relaciona área dopico com diversas concentraçõesde um composto padrão
estabilidaderelativamente a variações de fluxo
e composição da fase móvel
105
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCrepetibilidade
capacidade do detector manteruma resposta constante paramais que uma injecção da mesma amostra, tantoqualitativa comoquantitativamente
106
16/09/2015
54
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCtipos de detector
universalresponde a qualquer tipo de
amostra (índice de refracção)selectivo
responde a uma propriedade do soluto (absorção electrónica)
específicoresponde a um único tipo de
amostra (fluorescência)
107
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCdetector de absorção electrónica
sensível e capaz de detectar grandenº de compostos
detector de absorção electrónica por vector de díodos
permite obtenção do espectro de absorção do composto a serseparado
ajuda à identificaçãodetector por índice de refracção
mais universalsensibilidade e reprodutibilidade
muito baixasvariação com composição da
fase móvel, temperaturae pressão
não permite utilização degradientes
108
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55
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCdetector de absorção no infravermelho
pouco utilizado, devido à baixasensibilidade
apenas eficaz em cromatografia de exclusão molecular (maior quantidade deamostra)
detector de fluorescêncialimitado a compostos com
capacidade de fluorescer, ou que foram derivatizados para tal
elevadas sensibilidade e especificidade
109
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCdetectores electroquímicos
constante dieléctricamede variação de polaridade
na fase móvelamperométricos
medem capacidade de oxidarou reduzir um composto
mais usado dos detectoreselectroquímicos
condutimétricosmedem condutividade do
solventeusados em soluções de iões
polarográficospotenciométricos
110
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56
Técnicas Analíticas
componentes de um equipamento de HPLCregistadores
integrador ou computadoridentificação e quantificação de cada pico
111
Técnicas Analíticas
tipos de fase móvel em HPLCescolha baseada na afinidade entre os
componentes da amostra e os solventespolaridade
requisitosalto grau de purezadissolver a amostra sem decompor os seus
componentesnão dissolver ou decompor a fase
estacionáriater baixa viscosidadeser compatível com o detector utilizadoter disponibilidade e baixo custonão ser tóxica nem inflamável
112
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57
Técnicas Analíticas
tipos de fase estacionária em HPLCcaracterísticas:
elevada resolução entre os componentes daamostra
fácil introdução na colunapequena queda de pressãodiâmetro uniformepartículas porosas ou peliculares
quanto menor a partícula, maior a eficiência da separação
melhor difusão dos componentes da amostra
eficiência aumenta com regularidade das partículas
113
Técnicas Analíticas
Cromatografia gasosa (GC)fase móvel é um gás
inerte, apenas serve para transportar componentes da amostra através dacoluna
fase estacionária pode ser um sólido (cromatografia sólido-gasosa) ou um líquido (cromatografia líquido-gasosa)
separação dá-se por adsorção no sólido na GSC e por partição na GLC
na GSC, fase estacionária é um sólido de grandeárea superficial
na GLC, fase estacionária é um líquido que ficapreso na coluna através de um suporte sólidoinerte ou por capilaridade
114
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58
Técnicas Analíticas
Vantagens GC Desvantagens GC
Rapidez – fase móvel gasosa tem maior
velocidade; equilíbrio entre solutos e as 2 fases
mais rápido
Analisa apenas componentes voláteis, ou que
se tornam voláteis após derivatizados
Alto poder de resolução e separação – fase
móvel tem baixa resistência ao fluxo (colunas
longas, com grande nº de pratos teóricos)
Preparação da amostra pode ser trabalhosa –
aumenta o tempo de análise
Elevada sensibilidadeNecessita de técnicas complementares para
identificação de componentes
Requer pequenas quantidades de amostra Não é uma boa técnica preparativa
115
Técnicas Analíticas
amostra pode ser um gás ou líquido volátilinjectada através de micro-seringa ou injector
automáticoaquecida e vaporizada no injector do
cromatógrafoarrastada pela fase móvel para a coluna que
contém a fase estacionáriacoluna aquecida para manter amostra
vaporizada
116
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59
Técnicas Analíticas
componentes da amostra selectivamenteretardados pela fase estacionária
componentes em equilíbrio com ambas as fasesequilíbrio curto devido à chegada de mais
gás de arrastocomponentes dissolvidos deixam a fase líquida
para restaurar o equilíbriocomponente completamente removido da
secção da fase estacionáriamais moléculas do componente deixam a fase
gasosa dissolvendo-se na fase líquidaatinge novo equilíbrio
fase gasosa puxa novamente os componentes, destruindo o equilíbrio
processo repetido muitas vezes
117
Técnicas Analíticas
velocidade de movimentação dos componentes na coluna depende de:
solubilidade na fase estacionáriavolatilidade para a fase móvel
separação dada pela maior ou menor retenção na fase estacionária
adsorção pelo suporte sólido também podeinfluenciar separação
após separação, componentes da amostraentram num detector
registador capta sinais do detectorcromatograma
118
16/09/2015
60
Técnicas Analíticas
características de um cromatograma:primeiros picos mais agudos e simétricos
que os últimosquanto maior o tempo de retenção,
maior o alargamento da bandapodem aparecer picos não completamente
separadosseparação melhora por aumento do
comprimento da colunapicos podem ter assimetria frontal ou
caudalfrontal causada por injecção de
amostra em excesso ou temperatura da coluna inferior à ideal
caudal aparece devido a defeito na injecção ou a adsorção excessiva da amostra na fase estacionária ou suporte sólido
119
Técnicas Analíticas
análise pode ser isotérmica ou por gradiente de temperatura
gradiente melhora a separação e reduz tempo de análise
picos melhor separadosredução do tempo de retenção dos
compostos com maior ponto de ebuliçãopicos mais simétricoslinha de base tende a subir com aumento
de temperatura
120
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61
Técnicas Analíticas
características do gás de arrasteinerte
não interagir nem com a fase estacionária nem com amostra
compatível com o detectormínima difusão gasosadisponível, barato e seguropureza elevada
coloca-se um filtro entre o cilindro de gás e o aparelho
peneira molecular que retira água e hidrocarbonetos
gases mais utilizados:azoto (mais barato)hélio (elevada condutividade térmica)hidrogénio (inflamável)
121
Técnicas Analíticas
fluxo do gás de arraste tem que ser controlado e mantido constante durante a análise
reprodutibilidade dos tempos de retenção e quantificação
122
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62
Técnicas Analíticas
injectorvaporização rápida e completa da amostra
(geralmente líquida)não decompor nem fraccionar a amostra
tipos de injector:por seringade splitde splitlesscold-on column
123
Técnicas Analíticas
tipos de injectorpor seringa
usada em colunas empacotadasvolume de injecção entre 0.1 – 2.0 mL
em amostras voláteis, solvente e compostos mais voláteis podem sair da seringa antes dos menos voláteis
modifica composição original da amostra
124
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63
Técnicas Analíticas
tipos de injectorde split
usada em colunas capilares e de sílica fundida
pequenos diâmetros e longasinjector faz a vaporização da amostra,
enquanto ela é misturada com o gás de arrasto
apenas uma pequena fracção da amostra entra na coluna (split)
restante sai para fora do equipamento
125
Técnicas Analíticas
requisitos:mínimo alargamento da banda fora
da colunainertelarga faixa de operação nas razões
do splitmínima contaminaçãodivisão da amostra linear e
reprodutíveloperação em larga gama de
temperaturasselecção da temperatura do injector,
velocidade de injecção e razão do split dependem do tipo de amostra
126
16/09/2015
64
Técnicas Analíticas
tipos de injectorde splitless
possui uma válvula que pode ser fechada por um período de tempo (30 – 90 s) quando a amostra está a ser injectada, vaporizada e transferida para a coluna
cerca de 95 % da amostra entra na coluna durante esse período
restante eliminado pelo splitaplica-se a:
soluções muito diluídascomponentes que saem na cauda
do solventecompostos termolábeis
127
Técnicas Analíticas
amostra injectada em grande volume e lentamente
temperatura da coluna cerca de 20 ºC inferior ao ponto de ebulição do solvente da amostra
solvente condensa no início da coluna, retendo os componentes da amostra
gás de arrasto vai evaporando o solvente (mais volátil) e concentrando a amostra
programa de temperatura vaporiza imediatamente o solvente
componentes da amostra concentrados para a análise
128
16/09/2015
65
Técnicas Analíticas
tipos de injectorcold-on column
amostra directamente injectada na coluna por uma seringa
sem pré-aquecimento nem mistura com o gás de arrasto
agulha da seringa tem diâmetro muito estreito, para poder entrar na coluna capilar, através de um septo
vantagens:maior exactidão com compostos
muito voláteisexcelente quantificação de
componentes individuais da amostra
diminuição da decomposição térmica da amostra
129
Técnicas Analíticas
coluna2 tipos de coluna:
empacotadatipos de empacotamento:
adsorvente sólido (GSC)fase líquida adsorvida num suporte
sólido (GLC)fase líquida ligada quimicamente a
um suporte sólido (GLC)metálica ou de vidrocaracterísticas do suporte sólido:
grande área superficialdiâmetro uniforme dos porosinércia químicaforma regularresistência mecânicapreço acessível
130
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66
Técnicas Analíticas
características das fases estacionáriaslíquidas:
apolares, polaridades altas oubaixas
dissolver bem os solutos da amostra
grande resolução dos solutos da amostra nas condições de tempoe temperatura seleccionadas
não ser volátil na temperatura máxima de utilização
termicamente estávelquimicamente inerte
131
Técnicas Analíticas
características das fases estacionáriaslíquidas:
pode ocorrer sangramento se forultrapassado o limite máximo da temperatura
fase estacionária vai contaminar o detector(diminui sensibilidade)
subida na linha de basefase estacionária perde solubilidade
se temperatura estiver abaixo do mínimo
sangramento – parte da faseestacionária arrastada com afase móvel
132
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67
Técnicas Analíticas
colunacapilar
maiores e com maior nº de pratos teóricos
não têm suporte sólidofase estacionária líquida adere às
paredes da coluna por capilaridade
tubo externo de níquel, aço, vidro ou sílica fundida
inerteelevada purezamuito flexível
133
Técnicas Analíticas
colunaproblemas comuns:
alta velocidade do gás de arrasto pode deslocar filme da coluna
perda de fase estacionária por volatilizaçãosangramentopresença de impurezas
oxigénio e água na fase móvel podem decompor a fase estacionária
134
16/09/2015
68
Técnicas Analíticas135
Técnicas Analíticas136
16/09/2015
69
Técnicas Analíticas
detectorescaracterísticas:
rapidezdetecção deve ser feita em alguns
segundosalta sensibilidade
quantidade mínima detectável deve ser 2 vezes o ruído de fundo
baixo nível de ruídolinha de base deve ser constante
ampla faixa de resposta linearlinearmente proporcional à
concentração de solutosó ocorre a baixas
concentraçõesselectividade
detectores universaisdetectores selectivos (mais sensíveis)
não destrutivoalguns detectores destroem a amostra
137
Técnicas Analíticas
detectorestipos de detectores:
condutividade térmica (TCD)mede a capacidade de remover calor
de um objecto quenteresponde à condutividade térmica do
gás que o atravessa
Vantagens Desvantagens
Universal Menos sensível que os outros
Não destrói a amostraRequer temperatura e velocidade do
gás de arrasto constantes – nãopode ser usado com gradiente
138
16/09/2015
70
Técnicas Analíticas
detectoresionização de chama (FID)
responde a qualquer substância que aoqueimar forme um compostocom carga eléctrica
maioria dos compostos orgânicos; não o gás de arrasto
Vantagens Desvantagens
Mais sensível que TCD Destrói a amostra
Não sensível a variações de temperatura nem de velocidade do
gás de arrasto – permite uso degradiente
Resposta diferencial – 2 compostoscom mesma concentração podem
dar respostas diferentes(requer factor de correcção, para
quantificar)
Ampla faixa linear (adequado para análise quantitativa)
139
Técnicas Analíticas
detectorescaptura electrónica (ECD)
baseado na capacidade de certos compostos em capturar electrões livres
Vantagens Desvantagens
Muito sensível a compostos capazes de capturar electrões – compostoscom átomos electronegativos [O2, N2, S2 e halogénios (pesticidas)]
Destrói a amostra
Altamente selectivo – não detecta hidrocarbonetos, álcoois, cetonas,
…
Necessita limpeza constante –facilmente contaminado pela
amostra
Faixa linear limitada – problemas na análise quantitativa
140
16/09/2015
71
Técnicas Analíticas
termostatoscontrolam as temperaturas no injector, detector
e colunatemperatura de injecção
ideal para vaporizar totalmente a amostra sem causar reacções indesejáveis
temperatura do detectorsuficientemente alta para evitar
condensação da amostra, dafase líquida proveniente desangramento e de impurezas no gás de arrasto
141
Técnicas Analíticas
termostatostemperatura na coluna
não deve exceder o limite da fase estacionária líquida (podeocorrer sangramento)
se temperatura muito alta, compostosnão interagem com faseestacionária (má separação)
se temperatura muito baixa, aumentainteracção com fase estacionária, mas análise muito longa
142
16/09/2015
72
Técnicas Analíticas
registadoressimples
registam apenas o cromatogramaintegradores
registam e quantificam os picoscomputador
registam e quantificam de modo automatizado
143
Técnicas Analíticas
identificaçãobaseada no tempo de retenção
tr depende de:tamanho da coluna% da fase estacionáriatemperatura da colunavelocidade do gás de arrasto
tempo de retenção efectivo
'
0r rt t t
t0 – tempo morto
144
16/09/2015
73
Técnicas Analíticas
identificaçãotempo de retenção relativo
retenção do composto em relação a um composto de referência
composto de referência injectadoseparadamente da amostra
tira-se o tempo de retenção relativo dos componentes da amostra e dos padrões
co-cromatografia (spiking)misturar um composto padrão
à amostra antes dainjecção
identificação não é conclusiva, mas permite excluir
confirmação por outros métodos analíticos
padrãodesconhecido
referência referência
rr
rr
r r
ttt
t t
145
Técnicas Analíticas
quantificaçãocálculo da área do pico por triangulação
triangulação com altura totaltriangulação a meia altura
método mais exactoelimina erro da largura de picos
assimétricos
2
xbl h
A
/ 2x
hA h l
146
16/09/2015
74
Técnicas Analíticas147
Técnicas Analíticas
quantificaçãonormalização interna
percentagem relativa de cada pico emrelação à composição total da amostra
todos os componentes da amostra devem ser eluídos e ter a mesmaresposta no detector
% 100área A
xárea total
A
148
16/09/2015
75
Técnicas Analíticas
quantificaçãonormalização da área corrigida com o factor de
respostaquando compostos não têm mesma
resposta no detectorcorrigir com factor de resposta
injectar uma mistura deconcentração conhecida nas substâncias cujos factores se quer determinar
relacionar a percentagem conhecida e observada
calcular % da substância presentena amostra multiplicando áreaobtida pelo factor de resposta edividindo pelo somatório detodas as áreas multiplicadaspelos respectivos factores deresposta
conhecida
observada
% A
% AA
f
149
Técnicas Analíticas
quantificaçãopadrão externo
compara área da substância de concentração desconhecida com área damesma substância em soluções padrão com concentração conhecida
amostra e mistura de padrões injectadas separadamente
possibilidade de erro na injecção das soluções e preparação dospadrões
150
16/09/2015
76
Técnicas Analíticas
quantificaçãopadrão interno
adição de concentrações conhecidas de uma substância padrão à amostra, antesda injecção
área de cada pico da amostrarelacionada com área dasubstância padrão
padrão interno deve ser:similar à substância analisada e ter
um tr próximo (mas diferente)inertenão fazer parte da composição da
amostramétodo menos sensível a erros de
injecção
151
Técnicas Analíticas
quantificaçãoadição de padrão
adição de quantidades conhecidas do padrão da substância a ser analisada aquantidades conhecidas da amostra
traça-se um gráfico com a melhor recta que passe pelos pontos experimentais, prolongando-seaté ao eixo dos x
concentração de cada pico da amostramedido desde a intersecção até ao ponto x=0
método utilizado em amostras que aindacontenham interferentes
interferentes estarão presentes tantona amostra como no padrão
152
16/09/2015
77
Técnicas Analíticas
derivatizaçãonecessária para tornar amostras analisáveis em
GCalquilaçãoesterificação
153
Técnicas Analíticas154
16/09/2015
78
Técnicas Analíticas
Cromatografia com fluídos supercríticos (SFC)técnica complementar das cromatografias líquida e
gasosautiliza fluídos supercríticos
gás aquecido a uma temperatura superior à crítica e comprimido a uma pressão superior à crítica
fluído densoviscosidade similar aos gases e 100
vezes menor que líquidoscoeficiente de difusão maior que
líquidos e menor que gasespoder de solubilidade maior que gases
e semelhante a líquidos
155
Técnicas Analíticas
usada para separar:amostras termicamente instáveisamostras de mais elevado peso molecular que
em GCmais eficiente e rápido que HPLCprincipal desvantagem
poucos equipamentos e caros
156
16/09/2015
79
Técnicas Analíticas
Métodos hifenadoscombinação de métodos cromatográficos com
espectrométricosGC-MSGC-FTIRGC-AESLC-MS
157
Técnicas Analíticas
Espectrometria de massa (MS)interface é um dos pontos críticos
transferência quantitativa do analitoredução do fluxo/pressão proveniente do
cromatógrafo para um nível compatívelcom espectrómetro
preço acessívelnenhuma interface obedece a todos os
requisitos
158
16/09/2015
80
Técnicas Analíticas
Espectrometria de massa (MS)opção mais simples é a divisão do fluxo
permite entrada no MS mas perde-se amostra
mais fácil interface em GC que em LCtipos de interface
separador moleculardivisão aberta (open split)capilaridade directa
159
Técnicas Analíticas
Espectrometria de massa (MS)separador molecular
mais usado com colunas de empacotamento
moléculas maiores difundem mais lentamente eentram em maior nº no MS
open splitusado com colunas capilares e
fluxos ~1 mL/minMS puxa ~1 mL/min através do
restritor
160
16/09/2015
81
Técnicas Analíticas
Espectrometria de massa (MS)capilaridade directa
funciona com colunas capilaressimples, barato e não selectivonão há volume mortolimita a gama de fluxos usada
pela colunalimita diâmetro interno da
colunaparte da coluna é “perdida”
(usada como restritor de fluxo)
161
Técnicas Analíticas
Espectrometria de massa (MS)GC-MS
2 possibilidades de operaçãovarrimento
recolha de dados numa dada gamainformação qualitativa
monitorização de ião individual (SIM)valores de massa pré-determinadosinformação quantitativa
162
16/09/2015
82
Técnicas Analíticas
Espectrometria de massa (MS)GC-MS
para maximizar informação quantitativa e qualitativa:
fazer várias “corridas”procurar compostos alvo
163
Técnicas Analíticas
Espectrometria de massa (MS)procurar compostos alvo
funciona melhor se se estiver a analisar um nº limitado decompostos
requer um padrão interno marcado com um isótopo
para cada composto identificam--se,pelo menos, 3 linhas do espectro
maior – quantificação2 ou mais iões qualificadores,
bem resolvidosadiciona-se padrão interno à
amostraanálise SIM às 6 linhas
qualificação baseada em:•tempo de retenção•iões encontrados•razões entre iões•padrão interno
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Técnicas Analíticas
Espectrometria de massa (MS)LC-MS
principais tipos de interface:nebulização térmica (thermospray)
amostra aquecida e rapidamenteexpandida em vácuo
formam-se gotículas carregadas docomposto, livres de solvente, que entram no MS
ionização electrónica (electrospray)carga transferida para as gotículasnebulizadas para uma câmara de
vácuo, onde perdem o solventeiões ejectados da gota para o MS
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Técnicas Analíticas
Espectrometria de massa (MS)LC-MS
sequência de ionização
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Técnicas Analíticas
Espectrometria de massa (MS)LC-MS
interpretação de dados é mais difícil que em GC-MS
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Técnicas Analíticas
Infra-vermelho (FTIR)interface directaGC-FTIR
quantidade de espectros de referência élimitada
maioria dos dados de IV são de amostras líquidas ou sólidas
espectros na fase gasosa são diferentes
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Técnicas Analíticas
Emissão atómica (AES)funciona por emissão de plasma pela amostrarelativamente caroGC-AES
espectro de emissão específico de cadaelemento
por vezes usa-se um reagente gasosoassegura atomização e excitação
adequadas
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Técnicas Analíticas
Emissão atómica (AES)devido a limitações do fotodíodo, só se
consegue analisar um nº limitado de linhas
permite obter análise elementar e fórmulaempírica
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