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p- c . TG]J A

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Dr. J ose Ol ive ira de Al me ida

Cont ribuição pa r a o estudo da r eação de fixa ção do complemento em l epra .•

Tese de Concurso par a catedrá H co de Microbiclogia e I munologi a Apl icadas na Facul dade de Higiene - e Saúde P~blica da Uni vers i dade de s ã o Paul o .

Trabal~o realizado no Depa rtamento de Microbiologi a e I munol og i a da Faculdade de Medicina de Ri be irão Pr ê tc . da Univers i dade de s ã o Paulo .

1958

PREFÁCIO

INTRODUÇÃO

, I N o 'I C E

Reaç~o ~e Eitner.EsbSço hist6rico Antígenos da reação de Eitner

CAPíTULO I Generalidades sSbre as reações quantitativas de fixação do complemento pela técnica de WADSWORTH, MALTANER e MALTANER. Princípios básicos. ' Nomencl atura empregada~ e métodos para análise das curvas hemolíticaso' ,

CAPl'~Ei' E Preparo d~' antígenos do bacilo da tuberculose. · Antígenos aquosos precipitados e antígenos soláVeis em piridina. ' ~ropriedades gerais.

6

CAPI'fuu.J III ____________________________ 9

Os elementos da reação de fixação de complementoo ' Hemá-9ias de ca~neiro"Complemento

CAPITULO IV Reação de fixaç~o do complemento com sSro diluido. ' Efeito · do diluente sôbre o título do sôroo ' Ação do cálcio e · do '9agnésioo

CAPITULO V Curvas de isofixação ~omo método de estudo das reações •

11

17

~uantitativas de fixação do complementoo ! CAPITULO VI ' _______________ 25

Linearidade entre antígeno e complemento.· Influência da guantidade d~ saro presente na reaç~o. ,

CAPITULO VII ...... ____ .___ _ ________ 28

Linearidade~ntre sôro e complementoo ' Influência da quan-~idade de antígeno presente na reação. ;

CAPITULO VIII ____ ............ __ .. _ ........... __ ... _ ... _. _____ ._ .... _____ .. __ .____ _ ___ 34 Influência da concentração de antígeno sôbre os parâme­~ros da linha de regress~o sôro-complemento. '

CAPITULO IX .... ' _______________________ 42

Antígenos aquosos do bacilo da tuberculoseo:Efeitos sôbre 9 complemento. Antígenos aquosos lecitinados. '

CAPITULO X ______ . __ . . _._ .• ____ · 48

Efeito da lecitina sôbre os antígenos soláveis em piri­dina. ' Influênc ia do modo de se misturar a lecitina e de ,ua dose. Comparação de antígenos.

CAPI TU LO XI _ ___ .. __ ._._ ... _._ ... _ ... _ ... _ .. _ .. _. __ .. _ .. _ ..... ___ ._._ ... __ ._ .... ____ .. __ _ 6 5 Fatôres de convel'são para o sistema leprao ' Definição de h da relação logística de von KROGH. Dependência da percen­ragim de complemento fixado. '

CAPlruLO XII _____ -.. --.-.. - ................ --............ -...... - .-.... - .......... _ .... _ ... __ 77 Estudo comparativo de antígenos. Método de análise seqüêncial para o sistema lepra.

RESUMO GERAL E CONCLUSÕES 92 REFERÊNCI AS ________ .......... _ .. __ ...................... _. __ ............ _ ...................... _ ..... _ .. __ ... _ .. ____ .... __ 93

ERRATA 100

AGRADECIMENTO

Deixamos aqu i. expreSBOS nossos mais sinc eros agradeo i ine.J1toB aos Dra." LAURO DE SOUZA LIMA e ANTENOR CONSONI do Departamento de Profilaxia da Lepra, ' a.o Dr.' Rl!lNATO PIZA SOUZA CARVALHO, , do Departa.mento de Miorobiolo­gia o Imunologia da Faculdade de Medioina d~ são Paulo e à Dra." ALBA SANCRES da Faouldade de Medi6ina de Ribeii:-go Pr~to"da Uni.ersidade de São Paulo} ' por terem cooperado efieasmente na seleç~o de pacientes e na colheita do sangue de leprosos. "

Parte do equipamento utilizado nest~ trabalho foi ced i do por empr~s­timo à , Faouldade de Medioina de Ribeirão ErSto, ' pela Faouldade de Medi~ oina de são Paulo e pelo Departamento de Profilaxia da Lepra."Dei~amoa registrado nes s as linhan não s& nonsa. gratidão o omo a a.f irmação de que tal equi~amento era iinpreBaindr~el na realização 46 nosso trabalho. "

O trabalho desenvolvido no~ Laborat&ribs de Sadde Pdbl i ba do Estado de Nova Iorque, ' sob a direção de GILBERT DALLDORF teve apoio ~m MARY C~"

PANGBORNna manuf'atura. d~ ant!geno~e oontou com a assistBncia permanen­te de WILLIAM RAE THOMPSON; o trabalho tóon i 60 foi prati c ado por J'ACK JACOBS e LORBlTTA DUNGAN:" oontando ainda. com a ajuda. ineBtiinável da. biblioteoa sob a. direção de ANNA SEXTON~"

Deixo consignada. a. minha apre c iação ao a.po i o que re c eb e mos" quando assi~tente do Departa.mento_de Mibrobiblogia. e Iinunologia _da Fa.culdade de Medicina de Sgo Paulop , do Prof. " Dr.~ERNESTO DE SOUZA CAMPOS" então titu­lar da oadeira.. "

Não quero dei~ar esta oportunidade sem externa.r o meu d~bito ao Prot. " Dr. " ZEFERINO VAZ~ ' D i ~etor da. Faouldade de Medi6iria d e R i bei~io

Pr~top ~ não a6pelo apoio dado à , presente inveBtiga.9~o, ' como ta.mb~mpelas suas pala.vras de enc ora.jamento e ori~n~a.ção. "

Na. feitura do preBente volume colaborara.m' eficientemente> a Bnrtl!> .. "LllJA, PERDIZA e anrs."HELGIO WERNECK e SEBASTIIO PORTO. :

P R E F Á c I O

A ESTE TRABALHO QUE APRESENTAMOS COMO TESE AO CONCURSO DA CADEIRA DE

' MICROBIOLOGIA ~)MUNOLOaIA APLICADAS, DA FACULDADE DE HIGIENE E SAaDE P~BLICA, TEVE 1NICI0 EM 1951, QUANDO NOS PROPUZEMOS \ APLICAÇÃO DA T~C-

- - -N I CA QUANT Ir AT I VA DE F I XAÇÃO 00 COMPLEMENTO, · PELO M~TODO ~DE WADS'YQRTII. , MALTANER eMALTANER. EM SOROS DE LEPROSOS EM TRATAMENTO. ESPERÁVAMOS

. , ENCONTRAR UMA CORRELAÇÃO ENTRE REATIVIDADE SOROL6GICA E ESTADO CLINICO DO PAClENTE, POIS TRABAL~OS DE V'RIOS AUTORES PERMIT1AM TAL PLANI~ FICAÇÃO.

D~NTRE AS PRIMEIRAS DIFICULbADES ENCONTRADAS, ' AVULtAVA A INSTABIL~-• t . . .

DADE DO ANTIGENO AQUOSO EXTRAIDO 00 BACILO DA TUBERCULOSE, ' ALIADA A , ,

INCERTEZA DE SE PODER REPRODU Z1R ANTIGENOS A PART1R DO MESMO LOTE DE BACILOS DESSECADOS. No ENTANTO, ESTUDOS De BIER E SEUS ASSOCIADOS INDICAVAM SER O ANTfGENO SOLJVEL' EM PIRIDINA, ' ESJ'VEL~REPRODUTrVEL'E DOTADO DE CAPACIDADE DE R~AÇ~O COM SÔRO DE L~PROSO.

OS DOIS GRUPOS D~ ANTíGENOS FORAM ESTUDADOS COM A COOPERAÇ~O VALIOSA DE PANGBORN, ' DO DEPARTAMENTO DE SAÚDE P~BLICA DO ESTADO DE NOVA IbR9UE E COM A COLABORAÇÃO TÉCNICA DE PADRON.' ASSISTENTE DA CADEIRA DE QUIMICA BIOLÓGICA DA ESCOLA PAUL~STA DE MEDICIN~ E T~CNOLOGISTA DA FAOULbADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃo PAULO. ,

NA INVEST16AÇÃO DAS PROPRIEDADES DOS ANTIGENOS TIVEMOS OCASIÃO DE VERIFI~.R A IMPROPRIEDADE DE CERTOS CONCEITOS FUNDAMENTAIS 00 M~TODO DE ALBANY; OBSERYAÇÕES DA MESMA ORDEM v, TINHAM SIDO FEITAS POR V'RIOS INVESTIGADORES. O ESTUDO MAIS DETALHADO DAS CONDiÇÕES EM QUE A REAÇAO DE FIXAÇÃO DE COMPL~MENTO SE PROCESSA, ' COM SOROS DE LÉPROSOS, ' E, ' POSTERIOR­MENTE DE OBSERVAÇÕES SEMELHANTES EM OUTROS SISTEMAS PERMITIU-NOS APRE­SENTA~ O .Itodo daBc~fua8 de isofixaçio PARA A N(TI0A COMPREENSAO DA REAÇAO.

' _o A ,

O M~TODO INDICAVA AS CONSEQUENCIAS POSSIVEIS NO USQ DE DIFERENTES I • . I . .

DOSES DE ANTIGENO PARA DETERMINAÇAO DOS TITULOS DOS SOROS. A SIMPLIFICA-çÃO DA T~CNICA EXIGINDO A APLICAÇ~~ DOS FATaRES DE CONVERSXO DEU OPORTU­NIDADE PARA OBSERVA~ A INFLU~NCIA DA QUANTIDADE RELATIVA DE COMPL~MENTO FIXADO SÔBRE A INCLINAÇÃO DA FUNÇÃO LOGíSTICA, E ESTABEL~CER OS PONTOS DE CONTATO ENTRE AS T~CNI.CAS ADOTADAS EM ALBANY E AQUELAS EMPREGADAS PELO GRUPO DE HEIDELBERGER. ,

NA COMPARAÇÃO DE ANTIGENOS UTIL~ZO (I-SE O M~TODO SEQU~NCIAL DE AN~LisE DE PARES DE RESULtADOS DE MANEIRA SEM~LHANTE AO M~TODO EMPREGADO _ i . .

NA PADRONIZAÇAO DOS ANTIGENOS DE CARDIOLIPINA. Ao APRESENTAR AS CONCL0sÕES OESTE TRABAL~O~ ' TEMOS A N{TIDA IMPRESSÃO

QUE .ATUALMENTE ESTAMOS · MAIS PREPARADOS PARA RETOMAR O PROBL~MA PROPOSTO EM 1951, C9M O ESTUDO DA REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPL~MENTO DE L~PROSOS EM TRATAMENTO •

• ) Com ajuda de uma bolsa de estudos da FUNDAÇÃO ROCKEFELLER.

1 __________________________________ ___

I N T R O D U çà O

A reação de fixação do complemento para a lepra, conhecida como rea­ção de EITNER tem sido empregada entre nós, não em rotina hospitalar, mas como instrumento de investigação científica.

Os antígenos empregados têm variado, desde extratos de lepromas até frações extra~das de bactérias álcool-ácido resistentes, mas de um modo geral, a .reação de EITNER tem se mostrado de valor no estudo da sorolo­gia da lepra em suas diversas formas, tendo sido evidenciado certo para­lelismo ~ntre reatividade sérica e estado clínico. do paciente.

Neste trabalho apresentamos um estudo sistemático da reação de fixa­ção de complemento para a lepra, com a padronização dos diversos elemen­tos da reação e com a descrição pormenorizada dos métodos utilizados na preparação de antígenos.

Utilizamos a técnica de fixação do complemento descrita por WADS­WORTH, MALTANER e MALTANER para os sistemas sífilis e tuberculo­se. Os result.dos obtidos por êsse método tem se mostrado de gran­de utilidade não só no diagnóstico de infecções como para o contrSle do tratamento.

De 1952 a 1953 empregamos o antígeno descrito por PADRON (1952) no estudo s6rológico de pacientes do Sanat6rio Padr~ Bento, com a finalida­de de ~o)~êr informações a respeito da reatividade do sBro do leproso durante as diversas fase~ por que passa o doente durante o tratamento pela sulfona.

O antígeno aquoso precipi tsdo era um' passo avante. do antígeno prepa­rado simplesmente por ebuli~ao em água destilada de bacilos da tubercu­lose, previamente tratados pela acetona, segundo o método de.MALTANER.

O antígeno de MALTANER não s6 era difícil de se manter como também possuia pequeno poder fixador do complemento. O antígeno aquoso precipi­tado de PADRON conservava-se melhor e seu título era maior, em presença de sôro de lepra que outro preparado da mesma partida de bacilos, pela técnica de MALTANER.

Desde que antígenos aquosos são difíceis de serem re~roduzidos, foi empregada uma ánica partida de .antígeno no estudo dos doentes do Sanat6-rio Padre Bento; os resultados obtidos então puderam ser comparados. Es­se antígeno; no entanto, era turvo, apresentando parte que se precipita­va depois de uma sem'ana, quando mantido em geladeira. Propriedades anti­complementares apareciam concomitantemente, obrigando-nos ~ fazer sema­nalmente a diluição do antígeno liofilisado.

O problema do antíge~6 a ser itilizado na sorologia da lepra deveria ser re~investigado e por sugestão nossa foi organizado um programa de estudos sistemáticos envolvendo a comparação de atividade antigênica, métodos de avaliação e a purificação dos antígenos propostos para .as rea­ções quantitativas de fixação do ~omplemento.

O presente trabalho investiga as relações quantitativas entre sôro de leproso e os antígenos soláveis em piridina. A experiência de BIER e ARNOLD (1935) em lepr~, com o antígeno de WITEBSKY,KLINGENSTEIN e KUHN indicava ser solável em piri9ina, o princípio ativo do bacilo da tuber- ' culose que reagia com sôro de lepra.

PANGBORN (1954), seguindo o método de WITEBSKY ET AL • . (1931) para a extração dos princípios antigênicos do bacilo da tuberculose, verificou

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sua solubilidade em água, éter e álcool. O antígeno preparado pelo novo m'todo é descrito neste trabalho.

Ulterior fracionamento do antígeno sol~vel em piridina levou ao iso­lamento de uma fração específica, encerrando pràticamente toda a ativi­dade antig~nica do preparado original.

Durante a experimentação com essas frações e saro de lepra, tivemos ocasião de verificar a impropriedade de certos conceitos adotados na re­ação quantitativa de fixação dp complemento utilizada em ALBANY, N.r. , Consideramos então outros métodos para apreciar o fenômeno de 'fixação de compleménto, como por exemplo, a determinação do título do saro, o aban­dono do título por quociente e apresentamos as chamadas curua, de i.o­fi%ação doco.ple.ento como método 'para o estudo das relaçõeaentre s8-ro, antígeno e complemento ••

Na presente tese estudamos a reação de fixaçãQ je complemento para a lepra com o antígeno aquoso de MALTANER e com as frações purificadas ativas extraídas dos antígenos solúveis em piridina. t mais um roteiro de métodos ~ não pretende mais que dar uma contribuição ao estudo da so­rologia da lepra; o valor da reação de EI~ER como meio semiológico na apreciação do tratamento da leprose será avaliado oportunamente pelos leprologistas.

A REAÇÃO DE EITNER. ESBÔÇO HIST6RICO

Quando em 1906 EITNER experimentou um extrato de leproma com saro de lepro&o em uma prova de fixação de complemento, já a l 'iteratura médica assinalava semelhantes reações praticadas com bacilos da tuberculose e saro de tuberculo~o. ' '

Doia anos mais tarde EIT.WER examinava 'um saro de leproso com um an­tígeno prepar~do de ' c~~ação de cobaia; obteve resultados positivos na reação de fixação do complemento, semelhantes aoa por ~le de~critos an­teriormente.

A reaçio seria específica para a lepra ou havia um particular com­portamento do saro do hanseniano?

STATINtANU , DAMELOPOLU em 1908 descreviam anticorpos específicos no saro de leproao, mas já no ano seguinte assinalavam reações entre sus· pensões coloidais salinas ~e lecitiria e soros de lepra.

Era de .e esperar, dado o parentesco entre os bacilos da lepra e o da tuber,culose, que soro. de leprosos pudessem reagir em provas de fixa­ção do complemento com suspensões bacilares. Já em 1909 FRUGONI e PIZANI obtinham reações po.itiva. examinando onze soros de leprosos com suspen­.õea de bacilos da tuberculose.'

Antígenos preparados de lepromaa conservado. em álcool podiam ainda reagir com aoroa de lepra, segundo BABES e BUSILA (1909).

A prefer8ncia dos investigadores se orientou no emprêgo de antígenos preparados de bacilos da tuberculose, porque eram mais fáceis de se ob­

,terem e por ae procurar uma reação sorol6gica ~ara a tuberculose. O~ ca­.oade lepra estudados na oca.iib eram raros e as reaÇões eram pratica­das por aquiles sorologist.s empenhados nos estudos de tuberculose. , Em 1910 STENFFENHAGEN obtinha tr~s reações posi ti"vu em oito soros de leprosos, com o antígeno preparado de 8uapensõeiJ ' de bacilo. de KOCHi em 1913 WILLIS teve ocasião de estudar treze soros de lepra comantíge­nos preparados de diversas espécies de bacilo. da lepra, de bacilos da tuberculose, variedades humana e bovina, e outros ácidoAresistentes sa­pr6fitas. Obteve reações positivas com os diversos antígenos, definindo

III

,então a e.opoeidod. polifisadoro" do saro leproso. Os anticorpos encon­trados na lepros~ seriam relacionados com todo o grupo de microrganismos álcool-ácido resistentes. Haveria no saro anticorpos anti-ácido graxos; na tuberculose os anticorpos seriam diferentes,embora houvesse notável reciprocidade no comportamento dos soros de lepra" e dos de tuberculose.

As relações imunobiológicas entre lepra e tuberculose foram estuda­das por MUCH (1913); no ano anterior, numa reunião da Sociedade de Medi­cina e Higiene. e.Londres. em 16 de fevereiro, tivera ocasião de moaM trar a semelhança entre os anticorpos da lepra e da tub~rculose e ·· foi quaai prof~·ticamelite que disse ser possível tal vez produzir uma imunisa­ção para ambas as infecções.

Trabalhos esporádicos sSbre fixação de complemento com a~tígelio. de lepromas somavam até 1915 um total de 185 reações, com 75% de positivi­dade na formacutân.ea, contras"tando com 25% observados na forma anesté­aiea; todas essas reações" tinham sido praticadas com an"tígenosillcoóli­cOSi os resultados obtidos com antígenos aquosos indicavam maior positi­vidade, com 84% na forma cutinea e 41% na forma anestésica.

Reações com .n~ígenos bacterianos somavam 279 até 1916, com 180 delas praticadas com tubercu-lina bruta de KOCJI~ com positividade de 68%; 89 soros testados com suspensões bacilares in-d.icavam reatividade em 83%.

Em 1919COOK estudou 20 casos de lepra / empregando 19 diferentes antígenos, preparados de cul turas de boc~ 108 da. l.pro, . bacilos tuber­culosos, difteróides e ácido resistentes saprófitas. Mostrou que anticoE pos fixadores de complemento estavam presentes em grande concentração em soros de leprosos na formanodul~r~ Esses so~os teriam tend~ncia para dar reaçõesposi ti vas com o antí.êp,o q~ WASSERMANN, porém', s?>mente em baixas diluições. A fixação de complemento era positiva com todos os antígenos de bactérias álcool-ácido resistentes e daí a impropriedade da reação co'mo argumento favorável a atribuir a certas' culturas de ~ot'8ani.lloa isolados de lepromas, papel eti~lógico esp~cífico. ·.· '

Essa propriedade de multi-fixação do complemento seria, na opinião de LEWIS e ARONSON (1923) um caracter diagnóstico do saro de lepra, . pois não obtiveram com 'soros sifilíticos ou tuberculosos a percentagem d~ 93% de reações positivas quando praticadas com antígenos de . b.ctérias ácido resistentes, em 26 soros examinados. Os antígenos de LEWIS e ARONSON (1923) eram suspensões aquosas de cul turas (ba~iIos da lepra de CLEGG, de DUVAL, de KEDROWSKY, bacilo do smegm~. A extração com acetona retio raria a gordura, permi tindo uma suspensão mais estávid, segundo TAYL.OR e MALONE (l924'L que examinaram 100 soros de lepra, com positividade de 90%. Contrôles consistindo de 14 soros normais e 23 sifilíticos deram reações negativas, enquanto 30 casos de tuberculose apresentaram 6 reao ções+;o antígeno enlpregado era uma suspensão a 2% 'em salina, de bacilos desengordurados pela acetona. .

. No BRASIL, GOMES (192'1 ) utilizaase de um antígeno p'reparado com o Streptothrix leproide de DEYCKE; examinando 83 leprosos em reações de fixação do complemento ençontrou positividade de 82%; . a forma tube.rosa · com 89% .• a mista cam '95% a máculo-anestésica com 70% e · a forma frustra com 50%; na forma nervosa a positividade foi de 87%.

No mesmo ano FREUND observava que a lecitina aumentava o poder anti­gênicodo extrato '"lc06Iico de Leptothrix até 200 vêzes, em provas ~e fixação do complem~nto. -

O trabalho de GOMES. despertou grande inter~sse entre os 1eprologis­tas; a reação teria grande 'valor no diagnóstico precoce da lepra (GOMES e PATTEO. 1928) e na profilaxia 'da infecção (MARCONDES, 1929) • .

IV

Em 1928 SOUZA LIMA apresentou os resultados obtidos com a reação de '(x)MES em 96 leprosos: em 9 casos de lepra tuberosa, 8 reagiram: ·~O rea­çõe s positivas em 42 soros de lepra mista: 31 casos de lepra nervosa com 28 positivas: em8 pacientes de forma frustra, apenas 4 reações foram po s itivas; examinando 28 comunicantes, encontrou 9 reações positivas. Incluiu contrôles consistindo de 46 , casos de tuberculose, com reações ligeiramente positivas.

'GOMES em uma série de publicações entre 1927 e 1935 aponta a utili­zação da reação de fixação de complemento nos serviços de rotina dos le­prosários e também para o contrôle dos comunicantes ' (OOMES" 1935). Os leprosos poderiam ser sensibilizados por administração de iodeto de potássio, com maior positividade sorol6gica(OOMES e ANTUNES" 1930). A reação de OOMES-DEYCKE teria também sua aplicação na descoberta da lepra latente ' (FAILLACE" 1931; 'OOMES" 1931). :

Em 1931,WITEBSKY" KLINGENSTEIN e KUHN descrevem o antígeno solúvel em piridina e benzol,extraído do bacilo da tuberculose: o antígeno era estável e reprodutível, sendo desde então até 1939 produzido pela casa BAYER.

O antígeno se destinava A sorologia da tuberculose, mas BRANTS (1932) o aplicou em 80 soros de lepra, encontrando 74 reações positivas ; as seis reações negativas se localizavam entre leprosos de forma ner­vosa. Das 50 reações positivas em lepra tuberosa, 43 o eram fortemente; isso contrastava com 15 reações fracamente positivas encontradas em 20 soros de lepra nervosa: o antígeno de WITEBSKY era nitidamente superior ao antígeno proposto por BESREDKA e JUPILLE (1914).

Resultados semelhantes foram obtidos por AOKI e MURA0 (1933) que ob .. tiveram com ~sse antígeno 9 reações positivas em 16 leprosos com a forma tuberosa e 9 em 24 casos de forma nervosa. rQuatro soros em 10 de tuber­culose reagiram, enquanto apenas um mostrou reação entre 5 sifilíticos.

KORNEL (1933) obteve 10 reações positivas em 10 casos de lepra cutâ­nea: uma reação foi negativa em 3 pacientes de lepra maculosa; fracas reações em dois casos suspeitos mas em 3 comunicantes duas reações foram fortemente positivas. ' Soros de tuberculose, em número de 10, mostraram apenas 4 reações positivas~ : Comparando seus resultados com o antígeno W.JoJ . com os obtidos com antígenos preparados de lepromas, achou con­cordância em lepra, mas não em tuberculose. Soros de lepra dera~WASSER­MANN positivo, mas não os soros de tuberculose. Soros sifilíticos reagi­ram com antígenos preparados de lepromas, mas não com o antígeno de WITEBSKY ' (W.J .((. ).

No Brasi 1 a reação de 'GOMES continuava a ser praticada; em 1935 ASSUMPÇÃO e SILVEIRA obtinham 90% de positividade na lepra cutinea, 85% na lepra nervosa e 70% na forma mista. Em seu trabalho relatam ter en­contrado 10% de positividade em leishmaniose.

Em 1935 BIER e ARNOLD examinaram 272 casos de lepra, empregando o antígeno 'W.J.J.; obtiveram 79% de reações positivas. ' Nos casos de forma mista (186 casos) a incid~nci~ foi de 94% ; a lepra nervosa (14 soros) reagiu com 57% enquanto em 12 casos de lepra incipiente a positividade foi apenas de 44%. , 0 valor da reação de fixação de complemento na lepra foi mais uma vez apontada por BIER (1936) em um estudo sôbre a soroloiia da lepra. Confirma o achado de ASSUMPÇÃO e SILVEIRA, , mostrando a reação cruzada entre W.K.~. e leishmaniose.

Entre nós outros autores consagram o emprêgo da reação de fixação do complemento na lepra, com o antígeno deWITEBSKY ' (PEREIRA" 1936;RABELLO FIlJ'() e MAaIADO, 1936; , RABELLO FILHO, MACHADO e PINTO, 1.938 i PEREIRA, 1938).

V

o 'método de WITEBSKY, KLINGENSTEIN e KUHN, poderia ser empregado no p-reparo de antígenos a partir do Streptothrix de DEYCKE (BIER e PLANET, 1936) •• As reações' não seriam ·tão in tensas, podendo haver causas de erros em soros fracamente positivos.

O s8ro leproso reagia inte~samente c~m o antígeno de W.K.K.; 50 rea­ções positivas em 51 casos de lepra tuberosa; na forma nervosa a positi­vidade era menor (74% em 39 casos), segundo BIER e PLANET (1936). O antígeno de W.K.K. era no entanto capaz de reagir com outros soros 14bei. como de p~nfigo e leishmaniose. Em 13 casos de p~nfigo ~sses ~utdtes entontrartm 5 reações positivas (38,5%) e 26 soros de leishma­niose, em um grupo de 34, reagiram (76,5%). Em soros não lábeis WASSER­MANN negativos (74 soros) encontraram apenas 4% de reações positivas; em 51 soros WASSERMANN positivos encontraram 7 positivos comW.K.K. (13,7%)

O antigeno de W.K.K. podezia ser utilizado no reconhecimento das formas cl ínicas da lepr., pois as formas .. t.ubeI:culoides apresentav.m em 70% dos casos, reações neg.tivas, S'e.gundo MBELLO FILHO e PINTO (1938).

Os resultados obtidos na INDIA por GREVAL, LOWE e BOSE, (1939), con­firmav.m integralmente os achados da escola de BIER; em 12 casos de le­pra leptomatosa, tiver.m gases autores apenas uma reação negativa; n. forma nervosa d. infecção houve alta positividade: 37 reações em 38 so­rOI.Os títulos dos soros er.m altos, .té 1:150:40s soros contr8les, 25 sorol sifilíticos deram reações negativas, com exceção de um, com re.ç~o fr.c.mente positiva com W.K.K. Assinalam. reação com soros de cal azar e .ponta~ • pouca especificidade da reação.

Oa traI tipos de lepr., lep~omatosa, nervos. e mista, diferiam em leu comport.mento lorol6gico de m.neira tão nítida que haveria . raz~is pu,' •..•. ~irmar que a reapolta imune era provocada pela presença do bacilo da lepra, segundo ROW, 1939.

O trabalho de BIER em leishmaniole e antígeno W.K.K. foi confirmado ; por LOWE e GREVAL (1939) em 17 casos decalazar e 3 de leishmaniose cutlnea. Em se tratando de lepra e c.lazar e reação com a última infec­ção aeria de maior intenlidade, segundo GREVAL, LOWE e BOSE (1939).

Antísenol preparadol de culturas de bacilos da lepra de ratos, com ou aem cefalina, foram utilizados por ICHIATA em 1940, em um inquérito loro16Sieo entre criançal com longo contacto com leprolos em Shorokuto, no COEfEA. Dentre 34, 2 crianç .. apreuntaun reações positivál~ Uma de­lal mOltrou lintomal de lepra doil anal depoil. O autor acredita eltar em face de um ant~,eno elpecífico para a l~pra e o recom~nda para o diasnóltico precoce da infecção.

Antí.enol aquolol de bacilol da tuberculos., pr~viamente extraidol com acetona, rea,iram com 47 lorol de lepra, em reação de fixação de complemento quantitativa (MALTANER E. 1940); títulol mail altOI foram encontradol na forma cutlnea.

A reação de fixação de complemento com 18ro de leproso e antísenol preparadol de bact'ri'l 'cido-reliltente~ iloladal de lepromaj, nio po­dia .. ~vir de ar,umento para identificar o, pàpel etiopatoS8nico d .. cul­tur .. , u,undo :'DARMENDRA ' e BOSE (1941) e DARMENDRA (194U,· poia .ndse­nOI preparadol de cul tur .. de bacilol de DUVAL,. ·d • . BAYQN, de KEDROWSKY e de LLF,MS, assir ,como bacilos do tuberculose ~ M phle.i. dera", ' reaçõu­prlticamente isuai. com 12 loroa de lepra l~promatosa. ExperiSnciaa com

. absore; ão de sorol com IUlpenlaes baci lar('\1 ,e fil tuç ão mOltl' aram-se i,n­capazes de diltinsuir as diferentes cul tur .. teatad .. : (DARMENDRA, 1941).

O trabalho de BIER e PLANET (1936) indicando a reatividade do 18ro

VI'

de leishmaniose com o antígeno de W.K.K. continuáva a ter larga reper­cussão na INDIA. GREVAL, CHANDRA e DAS (1941) recomendaram seu uso em rotina. LOWE (1942) experimentou o antígeno de W.K.K. não s6 em lepra como em calazar, obtendo resultados muito nítidos na lepra nodular e no leishmaniose. A reação seria mais precoce que o teste à formalina. Na forma n~rV08a da lepra a reação seria de pouca utilidade, em vista da baixa 'percentagem de reaç5es positivas. O sBro de cal azar teria maior poder 'de reação com o antígeno de W.K.K. que o pr6prio sôro de lepra. LOWEcompara a reação com o calazar ao WASSERMANN em sífilis secundária.

O 'antígeno de W.K.K. foi experimentado em dermatoses tropicais por EICJlBAUM (1942) que examinou 300 soros "incluindo leishmaniose., pênfigo, lepra, bl astomicose e casos contrôles de tuberculose pulmonarot A p.ercen­tagem de reaç5es positivas nas diversas entidades clínicas foi ia seguin­te: leisbmaniose 20%; pênfigo 20%; lepra 88%; blastomicose 0%; tubercu­lose pulmonar 27%. Os anticorpos responsáveis pela reação foram analiza­dos por provas de absorção específica, quer com o mesmo antígeno de W.K. K. quer com suspensões de bacilo da tuberculose. S~mente soros de tuber­culose eram f\cilmente absorvidos; os soros de lepra puderam ser dividi­dos em dois grupos ; um semelhante ao sôro tuberculoso, pois mostra ab­sorção integral dos anticorpos, com o antígeno deW.K.K., porém difer~ do grupo tuberculoso, por não se deixar absorver com suspensões de baci­los de KOCJI; outro grupo de soros de lepra não 'se deixaria absorver nem pelo antígeno de W.K.K. nem por suspensão bacilar. Os soros de leishma­niose, pênfigo e blastomicose se comportam de maneira semelhante aos so­ros de lepra do segundo grupo. Isso seria um caracter de labilidade · a/rica não necesslriamente demonstrável pela reação de WASSERMANN. mas capaz de ser evidenciada por outro antígeno lip6idico ·como o de WITEBS­KY.

A reação entre lecitina e sôro de lepra foi estudada por EICHBAUM (1942), empregando lecitina de ovo, do comércio, e de diversas marcas, tanto em provas de' floculação como de fixação do complemento. Em 229 so­ros de lepra obteve 141 reaç5es positivas (61%); a maior freqUência (72%) foi encontrada na · lepra tuberosa e mista, enquanto.penas 37% na forma máculo anestésica. A 'reação com lecitina concord'aria com 80% das reações WASSERMANN positivas no grupo de leprosos. Em 335 contrôles. in­cluindo 151 soros sifilíticos e tuberculosos, leishmaniose, gravidez, a reação com a lecitina foi positiva em 4% dos soros · testadoa. Maior inci­dência (8%) foi ach.da entre os soros sifilíticos. Os anticorpos ou rea­gina anti. lecitina teriam sua formação relacionada à ação dos fosfat{­deos haptênicos liberados do tecido doente (EICHBAUM. 1942); poderia no entanto haver antígenos comuns presentes no bacilo de HANSEN. em ovos. tecidos de mamíferos, bactérias. fungos. Essa ubiqUidade de ' subst~ncias

· lip6ides expl icaria a polifÍ%ação ;dos soros leprosos (EICHBAUM, 1942). O antígeno de W.K.K. continuava a ter grande emprêgo na sorologia da

lepra e , do calazar na 'INDIA (SENGUPTA. 1945; DHARMENDRA. BOS~ e SEN WPTA. 1946; GREVAL. 1947; SEN GUPTA. 1948).

A reação obtida com o cal azar com o antígeno de W.K.K~ seria igual­mente demonstrável com antígenos metílicos segundo BAYARRI e AHUIR (1947), que em 20 pacientes com punção esplênica positiva para leisbmâ­nia, obtiveram 18 reaç5es de fix'ação de comp'lemento positivas com o an­tígeno de BOQUET e NEGRE.

Na impossibilidade de se obter o antígeno original de W.K.K., os ind'ús prepararam antígenos pela técnica original de WI'tEBSKY, KLINGENS­TEIN e KUHN. a partir de culturas do bacilo de KEDROWSKY (DHARMENDRA •

.lLll.

BaSE e BEN 'GUPTA, 1946) e os usaram com :bons resul t aáos ·. no Sirtllçu m7

Ca l aza i , da E$cola de Medic i na .Tropical ' de Calcut~ : , a reação · fo i 94 , 6% espe · íf · ~ a para o calazar em 1917 ·~oxos examinados de pacientes ·com lei-

.'Jhll ~~ir..J" ..J~ :'lonstl'adas e -; om o teste de .aldeido posi ti VOe

&. 19ti6 p "ALMEIDA, ;OARVALHO e PADRON. p.ublicaram' os. resultados de um 1 ~~~ )r ito sorológi co fe ito no Sanat6rio ' Padre ·Bento du r ante os anos de

1952 e 1954. O an t ígeno f oi pr eparado de bacil ~ s de t uberculose pela têA nica de PADRON (1952). , Todos os pacien teli '-m número de . 534 foram examinJ! dos rad ~~ I ~gi camente para ' exc lusão de · tubercalo ••• Oa :anti cor pos fixado­r es de complemento fo r am t itulados pelo m'todo daa :seis un i dades de com­p emen t oe O p ""me i ro grupo de doen t e s s em ~ ra t amento , num t otal de 74 oa so s mo s tra am bac i los de Hansen nas :les5es .c u t lneas e na mucosa nasal7 19% ' del en ti nham t í t u os r.'lD eno r es que 10 ; 51" títulos ent r e 10 e 100 e 30% ~ í tul oo ma i o r es que 100 • . 0 segundo grupo com 270 pacientes em trata­mento não mais ap resentavam ' ~acilos no muco na.al ma. ' s~men te nas les5es cutAneas. Os tí t ulos em fixação de . co.ple~en to eram menores que 10 em 33" ' deles; entre 10 e 100 em 52% e ma i or es que 100 em 15%. ' 0 terceiro grupo de 24 3 l ep r osos tra t ados pela su l fona :apreaen t ava ' resultados nega-

· ti vos na l e 3i o e no mu co. Nes te grupo os títu los ,eram menores que 10 em 70% dos c a os; en tre 10 e 100 em 27% e mai Qr es que 100 apenas em ·3%.0

gr upo con trôl e leg ~ a ~ egat i va . e ra constituido de t 86 doadores de sangue ,. ' supos t os norma i s. Trinta ' e sete ' so r os r eagiram com o antígeno aquoso pl!~

' cipitado p ,..: iCJm 3 un i dades de .complelaen.to, ' dando :umain d dên1lia de 4 , 7% de resul tados p03iti ~os em pessoas presumivelmente sadias. ;!sse grupo não foi exami nado radiol ~gicamen te " eALMEID,(;'PBDR!rBA :DE .BBEITAS : e 'BRANDÃO. 1954) • .

A i nci d@n c i a de .re aç5es positi vas com an t í,eno aquoso foi de 4 , 41, em um grupo de 205 I'es s o'as ·.no r ma i s; .em ou t 'ro gr upo de 403 :.soros o" a per e

centagem de t ítul os maio r e s que ' 3 foi ' de 13 , 6% ' (~1ANBB, 1938J. , Até 1953 PANGBORN tentou i solar a fração antiglnica do bac i lo da tu­

berculose , psrtindo do ex t ra to .aquoso. Por n.ou, iniciativa e insis t lnd a, o antígeno de '''.((.((. ; foi prepa o

' rado por. PANGBORN (1954 ) :e util izado na ' sarologia da ' tuberculose e lepra em ·ALBANY. N.Y. j A r e ação de EIlNER · poderi a ' ser ·eatudada quan t itativaaen G

te , podendo en tão ' s e faaer um es t ude comparati vo en tre os doi s grupos de ant ígenos propostos : · os ' solúvei s ' em ~ 'gua e , aquEles solúveis em piridina.

-ANTfGENaS NA 'RfAéio 'DE ·EI.TNER

A r eação de f ixaç ão do complemento em lepra , na maior pa rte das _Ia ze s , e r a fe ita oca siona l mente , por ' sorologis t as empenhados na pesquisa de an t ígenos espec í fi cos para a tuberculose.

São tr abalhos espa r soa , ' os :auto r ea ge r e ' ·...:::t e não insis t indo no pro.!, ' segui mento de ' suas peaquisas. >A difi culdade na obtenção de ' aoros de le o

. pr a ... ·na EUROPA , " é j usti f i'.: á tb a ' para ' 1)s poUcos ' trabalhos , aparecidos ' des­de 1906 ; de ou t~o l ado o problema da ' lepra 'era ma i s colonial e não metiA poli tano .

'Na INDIA onde l epr a é endêmica, a reação co. o .antí,eno · t uberculoso de ".(( ' ((' . fo i mais empr egada no estudo do calaaa r que pr~priamente para a des cober t a de casos de lepr a.

A falta de um tratamento específico, ' fazia dos l~pros'rios, grandes dep6aitoa de doentes. 'A rotina do tratamen t o chalmugrico não incentiva­va a pesqu i sa soro . 6gica.

No BRASIL , no e~t aqt~ . o ~ s tudo das r eações de fixação ' do complemen-

' VIII

toloi leito de aodo ',aiaua'Úcoi{ 'GOMis (927) es ;;. udou a aplicação de aua reação ea lepra; ea 1929 concluia ser a reação do de.vio do' coapl •• .sento d~alto valor não ' 6 no diagnóstico precoce. coa0 para dei.rai"Gt~ , g t' :~ a de .infecção e . ú'.da conclue nos casos d. lepra obscura, lepro gun,!.ionar, quasi se. s i ntoaas, os., .alor aais se afiraa,pois os co­sos de lepra .. 6ro-ne,ativos são ea ,eral benignos.;, Estada.do 119 ca.o. de lepra, achou certa relação entre bacil08copia positi~a no .aco na.al e reação de fixação do complemento.

BlER (1935" 1936) e.tudou a reatiyidade do 881'0 de lepra com anti, •• nos lip6idicoa. Apontou a 'exiatlncia de, re~ções de fixação de coapleaea­to co. lip6ides ubiqlit'rioa (tipo WASSERMANN) e~o coa lip6ide. bacte-rianoa ou de leproma.. '

BlER e ARNOLD, 1935, definem a reação de fixação de complemento ea lep.aoO não como conseqt1enc'ia do poder po hfi"all ti dCl 58ro r.eprosot oui>' da marcada labiliaadi de suaa proteína., .a. coiao;erdadeira reação es­pecífica) Em 1~::5; ea .eu Jiyro .Bcacteriolo,ia ". I_olo,ia" BlES afirma:, ulla reação posl: t i va COM ° antígeno de '. ,K.K., e%c,luida a tuberculose e difteria; , bea coa0 certos casos ea que ° s3,.0 dá reações inespecíficas de labilidade (ea particular no p'"fi,o e ,na leiahaaniose), deve ser in­terpr'etada coa0 lepra, aa"iae s. houver su.pei ta cl Cn,ica.~

t portanto ponto pac"ficollf'irmar '~o yslor di a{;R cSi't i co ' ,la r.ação de fixação do complemento em . le,;pra. O antígeno utilizado pela escola d. BIES era o de WlTEBSKY. KLiNéENSTEIN e KUIIN .. especifico na tuberculoae, .as insensível ~ labilidade daa proteínos do s8,.0 tuberculoao. e, 00

aUaO teapo, isen to de lipóidea fi%adorude coap leaen to ea pruen~a dtl a8ro sifi Zítico (BlER., ' 1936), .

Uma exata reprodução do antígeno de WlTEBSKY nãó poude ser feita por 'BlES e PLANET (1935); p.ia ' aa · fi%asõea não atin,iaa. tão alta. dilui­~õu. · e p,r 'SStI aotitlo~ . dei%Gaeia dúvida certos resultados de aoroa fraca.ente pos i ti 1I0S (BIER;: 1936 r~' O an t1geno preparado por BIElt pos­suia diferente capaci~.de fixado~~l ' G .aior discord4ncia entre os dois antlgenos fo i encontrado ea ciricoClJSOS de blastoaicose que dtlrtJl& reação fraca ou forte coa'; antígenoodaina( (Jf .. K.' li; BAYES)i enquanto coa o antígeno de BlER. , rea'giraa todo. negati.oa8nteit; (ElCBBAUIt. 1942).

Tentativas t~m sido feita. para iaolar a fração específica do ba­cilo da tuber.-.:ulose. , PlNNER (l925)eatudou O comportamento aoro16gico de setenta diferentes antígenos pr..,araclos 'de ' cul tura. de bacilos da tuber­culQse, demonstrando que o 'ant.ígeno e.pecifico eàtayà _uaociado 1 fração in80lúYel na acetona, no éter e no clorof'órmio e ' que era 80lúYfll em 'sua e áloool."

t exti-ero .... nte per~ioao afirmar propriedades de ,aadgenos complexos por aua. propd,dades de solubilidade, po~" !il ,prellea .. a de certas fra .. õea aaa _iaturas altera .co.pleta.ente lIaas .prop::iedades; o fea8.eno , conhe­cido .como solubili8oção ,'ec{procae é particularmente eyidente entre os fo.f~Hpidea (FAURE~ 1940).: .

O ext"tato aquoso; , preparado por ebulição e. 'sua destilada de baci­' 1011 4~ , taberc1il o.epr~'.i à.en te tratados: 'pela acetona. rea,ia co. sBro tuberculoso e de lepra, lias não com .ífilis (JfADSfIOS7Jl. IiALTANB8 . e IIAL ... TANES. 1925). O antígeno conteria Hpides e provlvelm~nte polisacáddea.,

PolisacArides presentes em antígeno. aquosos seria. 08 re~pons'Yeis por sua atiyidade antigaaica (SEIBBRT. 1941); nas reações sorol6gica. de fixação do compleaento o hapteno estaria associado 1 fração glicidea '(itErES. 1937) ... : Ali proteina~ desnaturadu pelo tratamf!n t o químico empre­gado eram ainda capazes de adsorver (:al'boidratos ~ue então · reagi riam coa

IX

os . soros imunes (ANDERSON, 1927)., A exist~ncia de um antígeno protéico foi demonstrada por SCffAEFER,

]940, em preparados de culturas do bacilo da tuberculose. No sôro de tu­berculosos haveria anticorpos que reagiriam quer com a fração protéica quer com a fração polisacarídea.

A at~nção dos ~esquisadores foi no entanto focalizada na atividade sorol6gica dcmonst,rada pela fraç ão lipídica fosforada (ANDERSON, 1927; PINNER, 1928). ,Na opinião de CHARGAFF · eSWAEFER -· (193S) e MARCHEBOEUF ' e uus associados (1935. 1939) a atividade fixadora do ·complemento estava ligada a um fosfol ípide. .. t bastante difícil se orientar quando se computam os trabalhos rela­cionados · ao fracionamento do bacilo da tu~erculose, pois muitos dales não fazem referSncials propriedadessorol6gicasdas frações isoladas. Outras frações, ,aparentemente relacionada8~têm comportamefttodi~er80; assim o fosfatídeo de ANDERSON (1~7) continha 0,4% de nitrog3nio, en­quanto o isolado porMARCHEBOEUF (1935,1937) não continha ~sse elemento.

·Suas propriedades não eram as mesmas: enquanto o preparado de ANDERSON fixava o complemento ·(PINNER, 1928,DOAN, 1929) o de MACHEBOEUF não pos­suia nenhuma 'atividade sorol6gica, in vitro ou in vivo • .

O antígeno de WITEBSKY .. KLINGENSTEIN e KUHN, solúvel em benzol e' pi­ridina conteria lip6ides e talvez fosfolípides associados apolisacári­des.

Em 1940 FAURE publicou seus estudos sôbre os haptenos }ip6idicos da . fixaçao da alexina isolad~s dos bacilos da tuberculina. -! de interê.­se focalizar sua·s conclu$ões. pois pela primeira vez é comprC!!ensIvel a relação existente entre os antígenos aquosos e os antígenos lip6idicos. Suas co~clusõea podem assim ·ser resumidas:

1-) - Pode-se extrair o hapteno lip6idico .contidonos baciZos da tu­bereul i na, direta.ente pela água. Nos extratos aquosos o hapten6 lip6i­dico acompanha igualmente 08 fosfat{deo s , da mesma form,aque nos extra­tos alc06licos de baciZos~

2-) - A afinidade do hap teno I ip6idico para a água é tal que, ~ prA­ticamente imposs(uel sujeitar a sua SOlUÇa0 etérea A lavagea com água, pois 21e imediatamente passa para fase aquosa.

3-) - O hapteno lip6idico é insolúvel n'fI. acetona fervente. 4-.) - A açao coabinada da água, éter; acetona e cloreto de ·s6dio

·permite lavar a SOlUÇa0 aquosa de ' fosfat(deos, coa boa rendiaento. se) - Os preparados .ais ativos se apresenta. elll SOlUÇa0 clorof6 rmi­

ca~ como uma so luçao perfei ta . Por evaporaçao do so lven te, o res (duo toma uma apar2ncia vitrosa, transparente, quasi incolor. A fraçao mais ativa­ea fixaçao de compleaento I solúvel ea clor9f6raio, · no éter, na piridina­e no ácido acéticogiaciai; pouco solúvel no álcdOl mettlico e insolúv~l­na acetona .

6-) - O hapteno, em ,contacto cba a água, transforma-se ea ua gel viscoso, poréa l(apido. Forma SOlUÇa0 aticaaente vazia, coaportando-se no entanto ' como col6ide, pois apresenta o fen~meno daprecipitaçao re­vers(vel pelos sais neutros e por acidificaçao e nao se dialisa em mem­brana de co16dio.

, 7-) - A coaposiçao quCmica do hapteno é semelhante A 'dos ácidos gra- . xos, associados a glúcides; sao azotados na proporçao de 3%; os prepara­dos mais ativos soroZagicamente pa·recea consistir de sais de s6dio, ·cal­cio e magnésio de ácidos fosfa t {dicos, COBO co.p l exos de ácidos gl (cero­fosfat(dicos . ..

8-) - A atividade haptlnica dos p~eparados mais · ativos é perdida

x

.quando se fa z o fraciona.ento dOIl fosfátides ácidos. ' A atividade antig'­nica estaria ligada a uma pequena parte diZes.

ge)_ O hapteno é de natureza lipídica, pois sua atividade aco.pa­nha s«apre os fosfátides e nos diversos fra.ciona.entos eZa seapre é a.chada en tre 08 llÍpi des.

10e) - Ap6s aúltiplos fraciona.entos vi-se o hapteno se concentrar ea uaa so lução que não con té", pro te (nas, ne", glúcides 1 ivreB, aas que pos­sue ácidos gl(cero-foBfat(dicos coaple%os associados A 6sides e A inosi­tolo

Infelizmente o trabalho de FAURE não teve a repercussão que merecia. O mundo mergulhava, nação por nação , na Segunda Guerra Mundial e a pes­quisadora francesa paralisou suas pesquisas sabre os antígenos do baci­lo da tuberculina. ,

Nos Eatados Unidos PANGBORN 'se empenhava no isolamento dos fosfolí- , pides do coração de boi.

No mesmo ano que FAURE publicava seu trabalho, em ALBANY" MALTANER E. , examinava pouco mais de 40 soros de lepra enviados da JAMAICA. ~tili­sando-se do extrato aquoso do bacilo da tuberculose.

Até 1949 PANGBORN se ocupou dos fosfatídeos do coração de boi; iso­lada a cardiolipina, aperfeiçoQi sua extração e apresentou métodos mais simples para o isolamento da lecit i na. No entanto já em 1949 PANGBORN voltava-3c para os antígenos do bacilo da tuberculose. Apontava então a dificuldade existente na reprodu~ão de antígenos satisfatórios; ten­tando reproduzir o preparado de ANDERSON (1927) verificou que o nitrog~­nio e f6sforo variaram de partida par,a partida; ' se o elemento respons;­vel pela reação de fixação de complemento fSsse um fosfatídeo complexo, era de se esperar 'que seu sal de ,bário pudesse fornecer um ,antígeno mais puro. Realmente'os antígenos assim preparados reagiam com saro de cavalo imunisado com tuberculose, porém não com saro humano tuberculoso.

O fracionamento do extrato aquoso do bacilo da tuberéulose foi fei to por PADRON (19 S2); ,dois ' componen tes "foram encon trados: ' um reagindo com

' saro imune de 'cavalo e ou til: o fixando complemento em presença de saro hu­mano. Este comportamento não 'era ' estranho ' lqueles que conheciam o traba­,lho de ILLAND (1951) que demonstrou a diferença de resposta à imunisação tuberculosa, segundo A espécie do animal inoculado.

Tentativas de fracionar o antígeno aquoso, para reproduzir em forma de solução, não , tiveram resultados; entretanto 8 partidas de antígenos preparadas durante o ano de 1953 puderam ser comparadas em atividade an­

, tigê~~ ,ca" , porém não eram sensivelll)ente melhores que oprimi tivo antígeno preparado por simples ebulição dos bacilos em água destilada.

Esse antígeno"aquoso purificado foi empregado por ALMEIDA , CARVALHO e SOUZA LIMA (19'52) ,emaeu trabalho CO!ll soros de lepra e taJr.Lém por AL­MEIDA, PEDREIRA DE FREITAS e BRANDÃO (1954) ao examinarem soros proveni­entes de doadores de sangue em São Paulo.

Depois de longa série de experi~ncias, PANGBORN. achou que um bom método de extração; consistia no tratamento dos bacilos lavados em ace­tona ~ sêcos, com uma mistura de álcool, água e éter. , A precipitação do

, antígeno pela acetona pe~mitia sua separação de misturas complexas. O precipitado em acetona. quando tratados pela piridina, dissolvia-se bem. a maior parte do antígeno, 60%, passando para a piridina. ' A solução em

, piridina continha todo o princípio antigênico do extrato original. !sse achado de PANGBORN fez com que se experimentasse o antígeno descrito por r;ITEBSKY~ ,KLINGENSTEIN e KUHN. j á em 1931, como solúvel e\ll piridina e em benzeno. O antígeno solúvelem~ piridina era composto de lípides e poli-

sac'rides; eram lipopolisac'rides"contendo 2% de f6sforo e açácares n~o redutores; a reação do carbasol mostrava a presença de manose • .

Assim em 1954, PANGBORN voltava ao ponto de partida assinalado por WITEBSKY 23 anos antes e chegava a um composto, dotado de atividade an­tigênica, de aparência gelatiniforme já descrito por FAURE em 1940.

O antígeno solável em pi·ridina foi fraciona.do. O estudo dessas fra­ções com sôro de lepra permitiu o conhecimento das relações quantitati­vas entre os elementos da reação de fixação de complemento pela técnica de WADSWORTH. MALTANER e MALTANER • . Mui tas dessas informações são aqu i apresentadas e compreendem em sua maioria experiências realizadas com os antígenos soláveis em piridina, que tinham se mostrado nas mãos de BIER e seus associados, de grande especificidade e 'sensibilidade na sorologia da lepra.

XII

C A P f T U L O I .

GENERALIDADES SOBRE AS REA90~S QUANTITATIVAS DE FIXA~XO DE COMPLEMENTO PELA TECNICA DE WADSWORTH, MA~TANER e MAL­TANER. · PRINC!PIOS B.(SICOS. NOMENCLATURA EMPRBJaGADA E Mt:­TODOS PARA AN.(LISE DAS CURVAS HEMOL!TICAS • .

As reaç6es de fixaç~o de complemento s~o traduzidas por diferenças nos graus de hem61ise; essas diferenças refletem alteraç6es da atividade hemolítica complementar, resultantes da presença de um complexo antígeno an ti corpo • .

As mudanças da atividade complementar s~o evidenciadas pelo uso de métodos precisos de dosagem do complemento.

A unidade de complemento é a quantidade de sôro de cobaia necessária à hemólise de 50%. Comparando o número de unidades de complemento neces­sárias para 50% de hemólise quando sôro e antígeno est~o presentes, ve­rificaram WADSWORTH~ MALTANER e MALTANER que havia uma proporção direta

--~ ( entre complemento e sôro. Um considerável excesso de sôro n~o impede a reação de fixação do

complemento, mas antígeno em excesso pode diminuir sensivelmente a in­tensidade da reação. Muitas vêzes então, necessário se torna ajustar a quantidade de antígeno a ser empregada na reaç~o, a-fim de se obter uma intensidade máxima na fixaç~o do complemento. Or~:, e: .. quantidade de com­plemento a ser empregada no teste varia de ac6rdo ~om ~ quantidade do compl exo an tígeno- an ticorpo formado • . Devido a essa in ter- re 1 aç ão, as quantidades de antígeno, sôro e complemento, devem ser proporcionais, de forma a permitir n~o s6 uma fixação máxima, como também deixar livre aproximadamente uma unidade de complemento.

As relaç6es lineares entre saro e complemerrto, de uma parte, e as encontradas entre antígeno e complemento de outra, simplificam o ajuste dos elementos da reação.

O método pode ser considerado tridimensional, pois variamos ao mesmo tempo sôro, . antígeno e complemento. A representação gráfica de tal rea­ção seria um sólido. Tal sistema tem recebido críticas severas de muitos sorologistas. porém como veremos no estudo do sistema lepra. há realmen­te necessidade dês8e aj .uste para que se possa ter uma medida quantitati­va da capacidade fixadora específica do sôro leproso.

Desde que conheçamos a relaç~o entre complemento e antígeno, por ex· perimentaçãocom soros de diferentes positividades. podemos organizar um teste preliminar para a exclusão dos soros negativos. Sôro a examinar é posto em contacto com uma dose de antígeno capaz de dar reação máxima com soros fracamente positivos; a quantidade de complemento a ser usada no teste depende das condições em que a reaç~o é feita. Quando a incuba­ç~o preliminar é a 37°C.soluç6es diluidas de complemento deterioram-se. exigindo uma correção da unidade de complemento; em geladeira. a dete­rioraç~o é negligível não sendo necessária qualquer correç~o.A quanti­dade de complemento a ser usada num teste preliminar para exclusão de negativos é achada experimentalmente. Em·vários sistemas estudados pela técnica de WADSWORTH, MALTANER e, MALTANEB., três unidades de complemento têm sido empregadas no t~ste preliminar.

Simplificaç6es têm sido propostas para a técnica quantitativa de MALTANER; uma delas utiliza-se de dose única de antígeno. seis unidades de complemento e faz variar o sôro; a reatividade do sôro é calculada na base da diluição capaz de dar 50% de hem6lise. quando 6 unidades de com-

A

plemento est~o pr~s~nt~s. ~SRe m'todo adotado nos serviços de rotina de sífilis em ALBANY fOl proposto por MALTANER eGNESH (1948). '

E$sa técnica traz graves errOB j p01S Roros de,diferentes títulos, podem, numa mesma diluição, dar o mesmo grau de hemólise, sendo mantidos constantes o complemento e o antígeno. Basta que as linhas de regressão sôro-complemento tenham inclinaç5es diferentes. O método não pode,ser recomendado em sistemas como lepra, em que a proporção entre complemento e sôro é observada sbmente quando se computam os acréscimos em fixação em relação aos volumes empregados de sôro.

A medida da reação de fixação do complemento é f~ita segundo circun§ t&ncias da própria 'reação ou método. AlgulHl, autores dão o título do sôro em t~rmos da diluição capaz de dar um detirmiriado grau de inibiçio da hemólise; outro~ como CALMETTE e MASSOL (1909) 'determinam areativid~ de do ~ôro p~lo consumo de complemento.

WADSWORl1L MALTANER e MALTANER (931) uti li zaram ambos os cri térios: diversas quantidades de sôro são postas ~ reagIr com quantidades apro­priadas de antígeno e doses variadas de complemento. O títU)Q do sBro é baseado no número de unidades de complem~nto que sel'iam necessárias para 50% de hem6lise se sôro não diluido fôsse empregado com a dose ótima de antí~eno. .

E feita a dosagem de complemento, como primeiro passo; a unidade de complemento é aquela quantidade que det.ermina 50% de hemólise nas con­dições do teste que são mantidas constantes: temperatura<), volume, dos re­agentes (total), quantidade de hemicias sensibilizadas, tempo de hem6li-se.

Baseados nos resuI t'ados obtidos por BROOKS (1920) j WADSWORTH, MALTA­NER e MALTANER propuzeram~se- a determinar as mudanças que ocorrem na a· tividade do complemento, nas reações de fixação. BROOKS mediu somente pequenas variações de complemento produzidas por luz ultra-violeta; fi­cou evidente que maior precisão poderia ser obtida comparando as quanti­dades de complemento capazes de produzir 50% de hem6hse.,

Na reaçio de fixaçio, após incubaçio com saro imune e antígeno, um maior volume de complemento é necessário para hemólise de 50%; na téc­nica de ALBANY os títulos se referem sempre ao complemento que juntado à reaçio, ainda deixa, depois da fixação, uma unidade livre.

Comparando as mudanças produzidas no complemento por várias quanti­dades de antígeno e de sôro-imune e pr.ojetando as curvas hemolíticas ob­tidas, as seguintes relaç6espuderam ReI' achadas:

l°) - A mudança na atividade do complemento (ou a .quantidade de com­plemento fixado) ~ diretamente proporcional l quantidade de antígeno presente, desde que um definido excesso de sô~o-imune e0tPja presente.

2°) - A mudania na atividade do complemento é diretamente pr6porciq­nal l quantidade ~e saro-imune usado, desde que uma quantidade de antí­geno capaz de dar uma r~ação máxima, seje empregada.

3 0 ) - Uma relação constante existe entre a quantidade de antígeno, na presença de um excesso de sôro~imune e a quantidade de sôro-imune na presença de um excesso de antígeno que produzem a mesma mudança na ati-vidade do complemento. '

Essas relações servem de base para as reações quantitativas de fixa­ção de complemento, segundo a técnica de WADSWORTH, MALTANER e MALTANER; as mudanças na atividade do complemento são indicadas em unidades 50%; nos gráficos 1 e 2 êsses valores estão no eixo das ordenadas; em abcis­sas , as quanti~ades de antígeno ou de sSro empregado (em ml ).

Para contrale da reação. dosagens de complemento são feitas em pre-

senç~ de antígeno ou de sôro, para o conhecimento da atividade anticom­ple~entar dêsses elementos. Dosagens de complemento foram praticadas com misturas de sôro e antígeno, determinandoose diretamente a quantidáde necessária para 50% de hemólise. para diferentes diluições de sôro.

O número de unidades de complemento necessárias para hemólise de 50% pr~jetado contra os volumes de sôro empregados de~erminava pontos sôbre uma reta. O conhecimento da relação linear entre sôro e complemento per­mitia calcular qual seria o número de unidades de complemento necessá­rias para 50% de hemólise, com 0,05 ml de sôro.

Uma reaçio com tal técnica seria impraticável em se~vi,os de saúde pública. Se fôsse conhecido o valor médio da constante h da equação que re~wciona hemólise com complemento, bastaria um tubo com hemólise parci­al, para que o número de unidades de complemento necessárias para 50% de hemólise pudesse 'ser calculado. Na prática seria a dosagem de complemen­to, com um único tubo.

Determinaram~se experimentalmente quais as modificações das curvas hemolíticas, por efeito do sôro, antígeno, complexos imunes, temperatura de incubação, periodo de hemólise, para diferentes sistemas de fixação do complemento.

As mudanças ocorridas na forma das curvas hemolíticas traduzidas em valores paramétricos, foram constantes para um mesmo sistema.

O conhecimento das constantes paramétricas da linha de regressão, traçada como uma curva sigmóide transformada, permi tiu o levan't'am'ento de tabelas que tornaram prático o teste qi.úintitativo.

Em trabalho anterior (ALMEIDA, 1950) mostramos, com exemplos, que as curvas sigmóides de resposta, obtidas nas dosagens de complemento, po­diam ser expressas em outros sistemas de coordenadas e mencionamos dois mais comumente usados: o probítico e o logístico.

Na base de concordância dos resultados experimentais com os valores calculados, ambos os sistemas de coordenadas permitem a retificação da curva sigmóide obtida quando se projetam quantidades de complemento con­tra graus de hemólise; é impossível dizer qual dos dois sistemas serve melhor ao uso, nas dosagens de complemento."

Os probitos foram usados por IPSEN(1941) em seus estudos sôbre lisi­nas bacterianas, empregando pesos para melhor seguir a linha de regres­são, de acôrdo co~ a hemólise observada., Na opinião de THOMPSON (1948) o sistema de pesos é usado para casos em que o número de indi1íduos é re­lativamente pequeno (20 ou menos) e toma em consideração somente as su­postas fontes de êrro: a variação biológica na resistência individual ao agente em questão e o êrro da amostra usando êsse número de indivíduos; asse sistema não é apropriado para o caso em que o número de indivíduos é grande, como por exemplo, nos testes de fixação de complemento quanti­tativa, em que o número de hemácias é de cem milhões ou mais em cada tu­bo.

Von KROGH foi o pioneiro no uso de transformação de dados experi­mentais de bio~ensalos. Seu trabalho sôbre hemólise hoje é clássico e utilizado largamente para a determinação da quantidade de complemento necessária para um estipulado grau de hemólise.

No presente trabalho usamos a função logística de von KROm que na sua forma logarítmica.é a seguinte:

log x ~ log K + h log (y/l-y)

onde x complemento e y - hemólise; K e h são parâmetros.

As se fazer . a reação de fixação de complemento, praticamos uma dosa_ o gem de complemento em presença do complexo fixador, depois de um período de incubação preliminar. · Nêsse ç·aso. med-imos hemólises resultantes do complemento residual C sôbre as hemácias sensibilizadas. , A curya hemolí­,tica, nessas condições, · é ainda uma sigmóide e . a funçã'o 10lística é em­prelada .para traduzir os dados experimentais. ' Então podemos con~iderar dois métodos de análise dos resultados obtidos:·

l- aétodo • A curva hemolítica é traçada projetando os dados no 'sistema deorde- '

nadas: 101 x' e 10litoa de y. Os pontos caem numa linha reta na qual ·se pode determinar qual . a quantidade de complemento x' que 'seria necessária a ser , empregada na reação para que a hemólise fôsse de 5~.Por defini­ção x' = K' •

. Essa linha de regressão tem uma inclinação que é ' iaual: .

h. = Ô 1:.c?~L~~ __ -x ~. logito y

. tsse éo método utilizado por WADSWOR7JI* MALTANER, e MALTANER ~m seus estudos sôhre as f~açõ,es qu~ntitativas . de fixação do complement~', onde sem'pre se procura determinar qual cessária a uma det.erhlinada l·eação. UMa unidade fi vre .de compJ emen to.

2° método

seria a quantidade de complemento D&!'.

pará q'ue, 'depois da fixaçio, 'sobrasse . . . '

Depois da ' incubação preliminar onde complem.ento, antígeno e sôro estão presentes, determina~ se a quantidadede , complemen~o deixada liTr~. ­A curva sigmóide , é retificad'a por projeção no ' siàt4l'aa de c~o~denadas: '

,lo,. ' de V, e logitos de hemólise. , V, ~ilnifica volume d'.mistura; a in-clinação da reta é dada pela e~pressão: .

A

Esse é o método ' utilizado ,por MAYER ETAL(19'48) ' e recentemente em-pre,ado por BIER" SIQUEIRA e FUHLANET1O -(1955) em 'seus estudos sôbre a reação quantitativa -entre ' cardiolipina e 's6ro sifilítico. :'

',Em determinadas condições h jpode 'ser igual 1 h,y" r.omo mostraremos ao tratarmos , dos 'f&tores de , conversão para o sistema lepra.

A nomencla.tura uniforme proposta por THOMPSON ET AL. em 194.9, . foi .adotada neste " trabalho, ' tanto para traduzir ,as condições da 'reação,como para nomear os vários elementos do sistema de fixação do comple.ent~. :

As diferentes condições : em que o teste é feit,o, modosdi,er,oa COlllO

'se alinham os elementos da reaçio, ~ornam .nec·essária a ádoçio de símbo­los claramente definidos. : As discussões dos ~esultados poderã~ ' ser ' fei­tas sem a necessidade de .a cada passo definir os conceitq_, que- enFão se repetiriam por tod.o o texto deste trabalho • .-

Introduzimos, ~or necessidade de exposição das condições em que a reação é praticada, alsuns símbolos, definidos como:

K' a,A =

K' quando sôro es t á em excesso na mistura da reaç~o.

K' quando o antígeno está em excesso, em relação . l quanti­dade usada de sôro.

o par~metro h' toma iguais designaç5es:

K' S,A

h' e h' • S,a s.A;

= K' quando sôro e antígeno estão em equivalência; nessas condi ç5es a quantidade de complemento fixada' máxima. Tal valor­corresponde a KS A como definido em STANDARD METHODS (1947). ,

K' S,A

K' S,a

**.

'GRÁFICO 'I,

Relação s&ro-complemento

e

a ./

./ 6

///

. ,é/

./ // Dosagem em presença da dose ótima de antígeno

s8ro em ml 0,005

GRÁFICO 11,

Relação ant(geno-complemento

12 -+-

et I

a t Dosagem em presença de excesso de sôro

l_~~_~_,, ___ ~~_ antígeno em ml 0,05

CAPiTULO 11

PREPARO DE ANT!GENOS DO BACILO DA TUBERCULOSE.' ANTtGENOS AQUOSOS PRECIPITADOS E ANT!GENOS SO­LOVEIS EM PIRIDINA.' PROPRIEDADES GERAIS.·

Os antígenos do bacilo da tuberculose aqui estudados foram prepara­dos por dois métodos: o primeiro faz a extração dos bacilos com água fervente, enquanto o segundo o faz com uma mistura de água-éter-álcool, a frio. O primeiro método é empregado no preparo do antígeno aquoso pre. cipitado: o segundo nos fornece o material que será solubilizado pela pi ri,dina. ANTIGENO AQUOSO PRECIPl.TADO

O antígeno aquoso precipitado é, de acôrdo com PADRON, (1952) prepa-, rado a quente, com a seguinte técnica:

1° Duas gramas de bacilos sêcos, previamente tratados pela acetona, são extraídos com 100 ml de água destilada. Levar à ebulição, mantendo a suspensão em agitação, por meio de um rotor elétrico. Deixar extrair por 90 minutos.

2° Centrifugar a quente a 3.000 rpm. durante 30 minutos, em copos de 250 m l.

3° Colhêr o sobrenadante e ressuspender as células em outros 100 ml de água destilada; repetir o processo de extração, combinando os dois sobrenadantes.

4° Esfriar o extrato, deixando em geladeira por toda a noite. Ajus­tar o pH a 4,0 ! O, l. com ácido acético 5M; levar de novo à geladeira, Se não houver precipitado, juntar 1,0 mZ da solução a 1% de cloreto de s6dio. Deixar precipitar no frio. Centrifugar a 3°C. Desprezar o sobre­nadante.

5° Dissolver o precipitado em 20 ml de água destilada ajustando-se o pH a 7,2 com NaOH N/I. A solução turva encerra todos os antígenos do extrato bruto.

6° Ajustar o pH a 8,5 e juntar 2/3 do seu volume da mistura cloro­f6rmio-butan~1 (5:1), em funil separador de 150 ml (modêlo SQUIBB).; Agitar por 10 minutos. Centrifugar o funil por 40 minutos a 3.000 rpm. (suporte lNTERNATlONAL nO 392). Colhêr a camada aquosa em outro funil e repetir o tratamento com a solução clorof6rmio-butanol, na proporção de 1/5 do seu volume.

7° Combinar as camadas aquosas que contém clorofórmio emulsionado e butanol dissolvido, além de corpos bacilares e material insolúvel. Cen­trifugar a 5.000 rpm. em SERVALL durante 1 hora.Colhêr o sobrenadante.

8° As camadas de clorof6rmio são combinadas; ajustar o pH a 8,5 antes de agitar por 10 minutos com água destilada aJcalinizada ao mesmo pH, em volume igual à metade da solução cl orof6rmica. Centri fugar.' Fazer duas extrações com água, combinando os extratos aquosos que então são concentrados em vácuo, em corrente de C02 • O extrato concentrado é então misturado ao sobrenadanteaquoso, descrito em 7°.

9° As frações aquosas combinadas são dialisadas contra água destila­da por toda a noite, em constante agitação.

10° O antígeno aquoso dialisado é então liofilisado e o p6 resultante é tratado por uma mistura de álcool-éter (1:1); agitar por uma hora, em funil e centrifugar, em tubo.

~1° O pó sêco obtido depois do tratamento álcool-éter é tratado com água destilada a quente. A solução resultante opalescente contém ainda

&. -

·material insolúvel que é retirado por centrifugação. 120 Juntar mertiolato para uma concentração final de 1:10.000. · Aso­

lução é o antígeno aquoso precipitado que reage com s&ro de lepra e de tuberculose (humana)~ mas não com s&ro imune de cavalo.

13° A parte solúvel emálcool~éter, quando tratada pela água e diali­sada, para remoção dos solventes orgânicos dá uma solução também opales­cente que reage com s&ro de cavalo imunisado · ~ tuberculose, mas não fixa .complemento com . s&ro humano de lepra ou d.e tuberculose. ANTlGENOSOL6VEL EM PIRIDINA .

A observação de que os antígenos do bacilo da tuberculose eram solú­veis em piridina se deve a WITEBSKY, KLINGENSTEIN e KUHN (1931), que extrairam os bacilos seCos em álcool etílico a quente; os bacilos eram retomados em piridina em SOXHLET; o extrato piridínico era sêco eo re­síduo dissolvido em benzeno, depois do tratamento com acetona a quente.

A parte insolúvel em acetona e solúvel em benzeno é lecitinada. O antígeno de W.K.K. é evaporado e suspenso em solução fisiológica, logo antes de usar. . ··0

PANGBORN (1954) verificou que ·ao se fazer a suspensão . salina do .an­tígeno de W.K.K • . uma parte ficava insolú~el . e na base do rendimento em antíge~o, selecionou um método para preparar o antígeno solúvel em piri­dina, Esse antígeno, chamado em nosso trabalho de H-A5 é feito de .ac&·rdo com a seguinte técn;r.a:

lO) - Bacilos secos .em acetona, slo extra{dos a frio com uma mis­tura de álcool-água e éter (1:1:0,6), com freqUênte agitação, por uma hora.

20 ) - Centrifugar. Colhêr o sobrenadante. Os bacilos ' são re-extra­{dos, .depois abandonados. O~ sobrenadantes são combinados e concentrados por destilação a vácuo. A solução fortemente opalescente é tratada por pa·rte igual de acetona e solução hipert&nica de ' cloreto de ·só·dio·, para isotonisar.

30 ) - Deixar . em gel adeira por umanoi te • . O precipitado é colhido por centrifugação e lavado várias vêzes em acetona, antes de secar.

4°) - Dissolver o precipitado sêco em água destilada, a quente. cen­trifugar em SERVALL, a 5.000 rpm. por uma hora. Desprezar o sedimento •

. 50) - O sobrenadante é re-precipitado com acetona e cloreto de só­dio, como previamente. Secar o precipitado, lavando-o várias vêzes em acetona. O precipitado sêco é entio extraido com piridina em temperatura ambiente por 24 horas, com .agitação freqUênte.

60 ) . - A parte solúvel . em piridina representa 60% em pêso do precipi­tado e tem toda a atividáde . antigênica do extrato original.

7°) - Evaporar . a piridina por destilação . a vácuo. O pó resultante é dissolvido em água destilada, na propor"ção de 0,1 g para 100 ml de água. Isotonisar com cloreto de . sódio. Esse é o antígeno designado por

'PANGBORN como .HA-5. PROPRIEDADES · GERAlS·'OOS 'ARTlGENOS

O antígeno aquoso precipitado é bastante impuro, iontendo proteínas desnaturadas, ácidos nuclêicos e grande q~antidade de carboidratos as­sociad·os . a fosfolípides. Sua solubilidade em água, a presença constante de polisacári~s, sugerem que :a atividade antigênica e~teja relacionada com êsses compostos, uma vez que a parte lipídica não reagiu com o s&ro humano de tuberculose. Um dos fosfátides que reage com o sôro de cavalo, quando associados ~ lecitina e colesterol, fixa .complemento com s&ro sifilítico, de maneira idêntica _ ~ cardiolipina, da qual não pode ser di­ferenciado sorol ogicamen te (PANGBORN; 1952). :

7

o extrato aquoso preparado pela técnica de PADRON parece conter o antígeno ligado ~ uma cadeia lipídica que lhe confere solubilidade nos solventes org&nicos. Esse complexo pode ser decomposto por tratamento com álcool metílico, mas as tentativas feitas para o isolamento do antí · geno não foram felizes.

Em resumo, o princípio antiggnico do extrato aquoso é resistente ao calor (lOO·C.), insolúvel na acetona e no álcool a 96° G.L., solúvel na piridina, nio precipit'vel pel~ mistura álcool butílico-clorof6rmio; so~ lúvel . ria mistura aquosa, depois do tratamento com álcool-éter, não é dialis'vel. Reação ao carbasol positiva (polisac'rides). Em eletroforese apresenta quatro componentes: o primeiro corresponde a 20% do total com mobilidade igual a 17,5; o segundo, 40% do total, com mobilidade de 8,76; o terceiro, . corresponde a 16% do antígeno total, com mobilidade de 3,75; o quarto componente, 24% da mistura, co~muito baixa mobilidade para ser medida .• A mobilidade é dada em · têrmos de 10-5 cm 2 vol t- 1 seg-1

em 0,1 N de solução fosfatada tampão de pH = 7,7.

o antígen6 solúvel em piridina poude ser fracionado .pelo metanol. A parte solúvel contém prAticamente toda a atividade antigênica do ~~tíge­no de piridina; essa fração contém aproximadamente 1,77% de nitrogênio, 45% de manose e perto de 50% de ácidos graxos. Reação de MOLISH. negati­va, mas d'uma característica c6r marron (da manose) com o carbasol.

Quando .. a solução em metanol é sêca e tratada pel a água, toma um as~ pecto de gelatina incolor, com um leve tom fJuorescente azulado, sob a luz de WOOD. Quando se junta cloreto de ~6dio. aparece uma turvação. porém não precipi~ação.

Essa fração seria um lipopolisac'ride e provAvelmente é o mesmo iso­lado por FAURE em 1940, por métodos diferentes.

Outra fração isolada do extrato solúvel em pir~dina contém 65% de f6sforo e 0,9% de nitrogênio ; é precipitada pelo m~ianol e apresenta-se com grande turvação em solução aquosa; não contém açAçares e é provàvel. mente composta de lípides.

As frações solúveis em piridina t metanol e acetona, apresentam rea~ ção de MOLISH negativa, carbasol positiva com aparêítéia não caracterísw tica. Um dos fosfolípides isolados dessa . mistura reage com sôro sifi­lítico, quando em mistura alco6lica com lecitina e colesterol. Outro componente encontrado muito se assemelha a uma c~ra. inativa sorólbgi­camen te. (PANGBORN e ALMEIDA, .1955) • .

***

.8..

I

C A P I T U L O 111

OS ELEUEN~0S DA REA910 DE FIXA910 DE COMPLEMENTO. DE CARNEIRO. HEMOLISINA. COMPLEMENTO.

HEMÁCIAS DE CARNEIRO

I HEMACIAS

Selecionar carnei=DA que apresentem índice de fragilidade globular normal. ° sangue é colhido em solução citratada e glucosada de ALSEVER. segundo BUKANTS. REIN e KENT (1946) e mantido por uma semana em ~eladeiQ ra" para a estabilizaçio da resiHL~ncia globular.

Na ocasião de der usado. o sangue é centrifugado; desprezar o sobre­nadante e ressuspender o sedimento em solu~ão fisíojógic~. Centrif~gar de novo e repetir o processo de lavagem até que o sobrenadante apresente-se isento de albumina.

Utilizar, para a reação. pelo menos tr~s diferentes sangues; mistu­rar os sedimentos depois de lavados, evitando-se a sensibilização de he­má'cias por iso-aglutininas.

Preparar a suspensão a 5% juntando ao sedimento de hemácias a quan­tidade necessár.ia de solução salina. Aferir a suspensão em fotômetro, ~nda de 545 mp. (filtro verdeaamarelo) (ALMEIDA. 1950); a solução de 0,1 ml da stispensão em 1.4 ml de água destilada deve ter uma densidade ótica igual a Op50 ~ 0,01.

HEMOLISINA

Inocular coelhos selecionados (por possuirem amboceptores naturais anti~carneiro) com hemácias e sôro de carneiro, seiundo o método de UL­RICH-MACAR71IUR (1942).

Ao sBro do coelho imunisado juntar parte igual de glicerina quimica­mente pu~a. Neste trabalho, hemolisina significa sSro-hemolítico glice­rinado.

Para sua dosagem~ a hemolisina é diJuida e as soluções sio experi­mentadas na sensibilização de hemácias padronizadas que então são incu­badas a 37°C por '15 minutos, em banho-maria, em presença de quantidade constant~, de complemento.

A quantidade de complemento utilizada deve conte~ 1 unidade 50% (aprQximad~mente 0,3 ml da solução ~ 1~200 de sôro de cobai4).

As hem61ises parciais obtidas com hemácias diversamente sensibiliza­das permitem definir nessa dosagem duas zonas bastante nítidas. Na pri­meira.as hemólises crescem com a maior concentração de hemolisina usadai n~sse caso a hemólise obtida dep~nde do grau de sensibilização da hemá­cia; na segunda zona. os graus de hemólise são sensivelmente os mesmos, embora cada tubo contenha hemácias diferentemente sensibilizadas. ° tubo. que é o limite entre a primeira e segunda zon~. indica a concen­tração de hemolisina que produziu a sensibilização máxima dos glóbulos. Outras concentrações mais elevadas de hemolisina não mais influem na he­m611se. Os glóbulos se comportam como se estivessem saturados de hemo­Jisina.

A dose ótima de hemolisina assim determinada é utilizada na sensibi­lização das hemácias para uso na reaçio."Hemácias pr;ticamente saturadas são insensíveis a ulterior acr~3Li~o de amboceptores hemolíticos, como os encontrados freqUêntemente no saro humano. Nesse caso hem'cias btima­mente sensibilizadas func10nam apenas como indicador de complemento li-

9

vre e a hemólise independe da presença de hemolisina. Ora, essa é a con­diç~o bastante e necessária para o indicador he~olítico funcionar para evidenciar complemento, segundo o grati de hemólise obtido.

COMPLEMENTO

Soros de cobaios (em média 30 cobaios), de sangue colhido por punção cardíaca, são centrifugados, numerados e submetidos ~s provas indivi-duais de atividade hemolitica.

A importância prática dessas provas foi demonstrada por GILBERT (1933), liA ZEN e GREENSPA/i (1936),GIORDANO e CARLSON (1939) e BARRIS (1941) em diversos sistemas 'ê t~cnicas de fixação do comple'merttô, quando ao lado da atividade hemol ít'ica'faziam' a prova da reativ-idade do antíge­no em presença do complemento, mas na ausência de anticorpo. Soros defi~ cientes ou muito potentes em atividade hemolítica ou aquêles que se com~ binam com o antigeno, deve~ ser evitados. Os soros de cobaia de ativida~ de normal são então misturados; distribuidos em pequenos volumes e m'lfn';' tidos congelados. ' "

WADSWORTB, MALTANER e MALTANER (1931) definiram as capacidades hemo­lítica e de fixação, como prop~iedades distintas no complemento; não se poderia medir a capacidade de fixação do complemento pela sua atividade hemolitica. Em uni determinadosôro de cobaia a atividade hemolitica pode ser grande enquanto existe pouca fixabilidade. Quando se preserva com­plemento com soluções boratad~s, mantém-se a capacidade hemolitica, mas o complemento vai perdendo sua fixabilidade. O uso da mistura de muitos soros de cobaia resulta da observação de que pode haver unia proporção estatística entre as duas proprie~ades, dando ao complemento um.com~or~ tamento uniforme. Nessas condições pode-se determinar ~ fixação do com~ plemento pelas mudanças o~o~ridas em s~a capacidade hemolítica.

O complemento é dosado em presença de hem'cias ~timamente sensibili­zadas. Complemento, em diluição em salina é distribuido emd{ferentes quantidades (compreendendo de 0,00050 até 0,00250 ml de complemento não diluido) em tubos calibrados de 12 X 75 mm. Completar o volume para 0,3 ml com solução salina e acrescent'ar 0,2 ml de hemácias sensibilizada-s. Após 15 minutos a 37°C, juntar aos tubos 1,0 ml de solução fisiológica gelada, agitar e centrifugar. Ler hemólise no sobrenadante, por meio do colorímetro foto-elétrico.

Em papel logito-Iogarítmo projetar os dados da dosagem: complemento (x) e hemólise (y), respectivamente logaritmos e 10iitos. Pelos pontos traçar uma reta que então determina na intersecção com a abcissa 50% de hemólise um ponto que projetado sôbre o eixo das ordenadas, determina o logarítmo da quantidade de complemento necess'ri& para 50% de hemólise.

A unidade de complemento normalmente vai de 0,00100 a 0,00175 ml, enquanto a inc]inaç~o da linha de regressão de sua dosagem tem um valor em redor de 0,20 t 0,02.

Se o co~plemento testado estiver dentro dêsses limites, soluções são preparadas contendo uma, duas, três, seis, nove e doze unidades em 0,1 ml. Feitas as soluções, faz-se o teste de prova com cada uma delas, para evidenciar qualquer possivel êrro nas diluições. Manter as soluções em gêlo fundente até usaolas.

As soluções de complemento são preparadas diàriamente, assim como a suspensão de hemácias.

• •• 10

C A P f T II L O IV

REAÇÃO DE FIX teCÃO DO COMPLEMEN'I'O COM SÔRO DI LUIDO. EFEITO DO DILUENTE SOBRE O TíTULO DO SBRO.

AÇ!O DO C'LC10 E MAGN~SIO.

stJRO HUMANO

O sBro humano é empregado d]}uido ou não, na quantidade de 0,05 ml sendo que o volume total da r~açiD. antes de se juntar o indicador hemo­litico, é de 0,3 ml e 0,5 ml depois.

Quando ne~ess'rio, o saro é d!luido. O diluente usado tem variado, sej{undo as técnicas sôro no~m"l tem sido empregado na reação de WASSER­MANN qual'tl ~iJ: j. " WADSWORTH., MALTANER e MALTANER; outros sistemas, como tuberculose emp"egam ';,)]uç;ao sah.na boratada enquanto a escola de BIER recomenda o U',o d,'1 :;ülu-:;io t,~mponada de veronal, com quantidades apropriadas de cálcio e magnésIo.

O sSro humano é inativado por ~quecimento a 56·C durante meia hora. no dia em que a reação é felt~. O saro é mantido estéril, distribuido em volumes de LO m! em g .. lad~ira r)\j em ~ongelador.

Quando o SÓI"') se Itp;'esen' a turvo pela presença de gorduras, costuma-mos filt.rá"lo em SEITZ Elí. (, :;oro limpido é então inativado.

As diluições :,ão feltll.',: em sén.e ar.-Ítmética. sempre a partir' do sôro original, Procuramos trabalha com concent.rações de sSro que se diferen­ciam umas das outras por uma qu~ntid~de constante.

DILUENTE

t quasi sempre n~ce95arlO diluir D saro reagente de lepra, na sua forma lepromato.,;a, umli "'ez que os títuJos são maiores que 10, na maior parte dos casos.'

Saro diluido é entio exp~rimentado ~om diferentes quantidades de an­tígeno e de complemento.

t de inter~~se 5aber qual ~ influ&ncia exercida pelo diluente nas reaç6es de flxaçio de complemento ~m lepra.

Experimentamos como diluente a soluçio fisiol6gica tamponada com borato e também sSro humano normal em seguida. comparamos a soluçio boratada com o tampão de veronal, com metais (c'lcio e magnésio).

O quadro I mOB~r~ 06 r~Gu]~adoB obtidos com solução salina boratada e sSro norma~ usados como dl]uentes do saro de lepra, segundo métodos descritos nos ~apitulos VII e VIII.

As discrepancias m~loreR que 16% definem reaç5es defeituoaas se­gundo o conceito q~otado p~ra ~ av~]iaçio e classificaçio de observa­ç6es em testes de an'hses sequéncü!. (THOMPSON, 1949)"

Em série par.ale}~ de t~stes em duph.:ata THOMPSON e SILYERSTEIN (1953) encon~rAr~m apen~s 1% de observaç6es defeituosas em 300 pares de reações, uti111ando o me amo dlluent.e e o mesmo antígeno.

Os nossos dado. sugerem ser Q diluente responsável pelo maior n6mero • de reaçõ~s defeituosas encontradas; não se observa nenhuma tendência pa­

ra titulos m~LS al~o5. se~undo 0 diluente empregado. Saro humano norma] utiJlz~do nessa série de experi~ncias foi cuida­

dosamente selecionado de crianças, com menos de 5 anos de idade e com prova negativa a ~ubeI·culjnl!.. Todos os 0:'OS foram previamente testados com 3 unid~des de ~Dmplemen~o e com dose 6rima de antígeno. Sbmente

.ll

40ram utilizados soros que em 10 minutos de incubação a 37·C mostraram hemólise total. A incubação preliminar foi de 90 minutos a 37·C.

QUADRO I ,

TITULOS DE SbROS DE LEFRA LEPROMATOSA DETERMINADOS FOR REAQÃO DE FI-XAQÃO DO COMPLEMENTO QUANTITATIVA E DILUIDOS EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA BORATADA OU SORO HUMANO NORMAL,

r------.---.- - --.. _--I Sôro n~ Sol. ' boratada S6ro normal DiscrepSncia achad a

.'

676 24 25 i 4#1% 986 28 28 O % 686 12 14 16# 8%

1019 26 22 16,7% 106 48 48 0'%

If'

"2% 1066 80 86 7, 1200 87 86 6,6% 4966 484 446 2,7%

649 a8 47 21# 2% 499 ,11 12 9# 6%

1008 160 148 7,8% 1061 H~ 16 28#6% !'O65 825 840 4# 6%

576 272 290 6,4% 122'7 420 42.9 d'f %

00 780 710 I 9,4% , i . I

Observa9a.o: antígeno us,do: HA-5 lecit'$nado a 0,005%.' . sero normal: mistura de soros de crian9as ,de 2 a 5 anos de

idade p tuberculino negativas (Mantoux 801:10).'

(A solu9a8 fisioldgica boratada ~ ~reparada diluindo um volume da solU9ão tamp;~ de borato em nove volumes de solu9~0 a 0,85% de oloreto de s&dio.' A solu9ãotampão de boratci ~ preparada tomando 6,2 g de ~oido

b&~ioo em um copo com 52,5 ml de soda normal.' Dissolver e passar para um balão volum~trico de 1 l:lt:troj junta.r 47 # 5 ml de ácido clorídrioo normal.' Completar o volume com água. destilada.' Distribuir e autoolavar por ao minutos a 115 libras de pressão).'

A SOXU9ão salina de veronal foi preparada diluindo 85,0 g de cloreto de s&d10, 5,75 g de ~cido 5-6-dietilbarbitúrioo e a,75 g de 5-5-dietil­barb1turato de s6d10 em 2 litros de água destilada.' Ao usar, diluir uma parte dessa SOlu9ão em 5 partes de água destilada.' Juntar então cloreto de oáloio e cloreto de magn~sio para as concentra9ões respeotivas de 0,00015 M e 0#0005 M.'

J efeito do magnésio em salina tamponada com veronal foi estudado por MAYER ET ALo, (1946) que concluiram dever ser recomendado seu uso nas reações de fixação de complemento. O complemento se apresentava mais ativo com magnésio que com solução fisiológica.

Em uma série de trabalhos LEfINE ET AL 0953, 1954) est~daram o pa­pel desempenhado pelo cálcio ionisado na fixação do complem~nto econ Q

cluiram ser êsse elemento essencial à reação. O cálcio seria necessário A união do complemento ao complexo antí~eno~anticor~o, ao passo que o

12

magnésio agiria, por mecanismo desconhecido, sôbre a ativação da hemó­lise; êsses dois metais seriam indispensáveis ionios nas reações de fi­xação do complemento.

Estudando o efeito da diluição do sôro de lepra com salina-veronal, com cálcio e magnésio, em comparação com a titulaiem feita com diluições em salina boratada~ verificamos pronunciada alteração na reação quanto ~. quantidade de sôro capaz de dar, em presença do antígeno, 50% de hemóli­se com 6 ou 12 unidades de complemento. Os testes foram feitos ao mesmo tempo.

Os protocolos I e 11 mostram que se considerarmos as duas reações com o mesmo valor absoluto da unidade de complemento (em têrmos de sôro de cobaia) os títulos são os mesmos, quer em salina boratada, quer em salina-veronal com metais, pois 1,7 unidades-veronal equival~ram a uma unidade salina·boratada.

As inclinações das linhas de regressão sôro~complemento são iiuais e portanto os títulos por acréscimo são os mesmos. Se aplicarmos o méto­do I ·(~TANDARD METHODS,. 1947) para a titulagem dêsse sôro diluído em sa­lina boratada ou em veronal com cálcio e magn~sio. verificaremos que o título do sôro nio variou, corrigida a unidade de complemento com o con-­trôle do sôro (MALTANER e ALMEIDA, 1948).

Corno cálcio e magnésio são necessários l fixação do complemento e ~ hemólise, a experi~ncia sugere que existe no sôro humano quantidades apropriadas dêsses elementos.

Na técnica quantitativa de W.M.M. a quantidade de sôro é relativa­mente grande em comparação com os outros elementos, pois empregamos 0,05 ml de sôro para um volume total de reaçãõ igual a 0~3 ml. Se a diluição do sôro é feita com sôro humano normal,não haverá razões para suplemen· tar Ca++ e Mg++ o teor dêsses ionios presentes na reação; outras vêz~ êsses metais são supridos pelo próprio sôro de cobaia, usado em concen­tração grande (diluições 1:10 a 1:5), na técnica de WADSWORTH1 MALTANER e MALTANER. Consideramos portanto desnecessário· na técnica gue adota~& o uso da solução tamponada de veronal, com Ca++e Mg~+ pois usamos di­luir o sôro leproso em sôro normal. Os outros elementos da reação são diluidos em salina boratada.

OBSERVAÇÃO

Os protocolos I e 11 mostram reaç5es praticadas com diferentes doses de antígeno. Como veremos mais adiante, os títulos por acréscir.lo não são afetados por excesso de antígeno. A comparação ~os títulos se deve fazer depois de corrigir a unidade para um dos sistemas: veronal-Ca++-Mg++ ou sa l ina bora tada.

t de se esperar que sendo o título dado em número de unidades de complemento o valor achado com veronal seja 1,7 vêzes maior que o deter­minado com salina. Realmente foi essa a reação encontrada: 35,6/21 = 1.~'

* **

PROTOCOLO I .

REAÇÕES" (X)I/ OS ELEIIEN70S DlLUlOOS EM SOLUÇÃO SALINA OORATADA

, (a 1:) ANTIGENO If-AlS LEC I TI NADO A 0,05%

SORO DE LEPRA Ó,020 0,0115 0,010 0,005 0,0~9 0,015 0,010 0,005

lfo 22465 UlfIDADIS DB COVPLIMllfTO

e 12

aI HEM6LlSE "

0,080 O O O O 60 26 86 86 0,020 O O O O 100 100 100 100

0,015 45 10 10 O 0,010 100· 96 ' 86 80 0,008 100 100 100 100

DO ' ABTtGBNO COlj 2 UlfIDADlCS DE '15 . 80 90 96 COKPLIVIlfTO

' .

.,. DAS HIMicIAS DO SORO, ' COJI UlfI-

DADIS DE COKPLBKBNTO DO COMPLEMENTO COV: SlClfSIBILIZADAS

1 U 2 U )3 U 1 U 2 U

4O 90 100 60 100 O

Teaperaturade incubação 37~; , teapo" 90 ainutos; , hea61ise ea 15 ainutos

OBSERVAÇÃO: '

Todos os ele.entoa da reação foraa diluidos coa solução salina bora· tada;o aesao diluente foi utilizado para coapletar o voluae de 1,5 aI necessário ' ll leitura da hea6Zise ea etl.pectrofot8aetroej

PROTOCOLO I I

REAÇÕES COM OS ELEMENTOS DILUlDOS EM SALINA-VERONAL COM Ca++ e Mg++

p

0,05% (m L) ANTIGENO HA-5 LECITINADO A

SÔRO 0,020 0,015 0,010 0,005 0,020 0,015 0,010 0,005 DE LEPRA

Nº 22455 UNIDADES DE COMPLEMENTO

6 12

HEMOLISE %

0,015 O O O O 70 85 10 O 0,010 O O O O 100 QO 90 75 0,008 O O O O 100 100 100 100 0,006 20 80 10 O 0,004 100 100 80 85 0,002 100 100 100 100

r:ONTRÔLES

, DO ANTIí3ENO COM 2 U. DE 80 80 95 95

COMPLEMI::NTO

DO SÔRO, COM UNIDA- DO COMf'LEMEN10 COM: DAS HEMÁCIAS DES DE COMPLEMENTO SENSIBILIZADAS

1 U I 2 U 8 U 1 U I ;3 1J

0% 5 55 85 55 100

Tempe"atura de incubação 37°C; tempo 90 mwutos; hemóLise em 15 minutos.

OBSERVAÇÃO'

Todos os elementos da reação foram dtluidos com soLução salina tam~

ponada de veronal, com magnésio e cálcio; o mesmo diluente foi utilizado para completar o volume de 1,5 ml necessário a: leitura da hemólise em espe~trofotômetro.

15

CÁLCULO DO. Tf.TULO T = ~_~: ~~ ~ . O, 05

De ac8rdo com as hem6li~es paroi~i~ obtidas com 12e 6 unidades de oomplemento" oaloulamos K' SJlIA. para oada dilui9io de antígeno (TABBlLA II)

REAÇÕES COM SALlNA-BORATAOA

. H EM 6 i..i SE %

S O R O 6S0RO ~K' A ,

- ~'s,A TITULO 6 U 12 u·

S,

0,080 50 12 0,015 45 6,2 0,015 5,9 19,8 0,080 25 15,5 0,015 10 8,9 0,015 6,6 22,0 0,080 86 18,6 0,010 85 4,9 0,020 8,0/ 21;9 0,080 85 18,6 0,010 80 6,1 0,020 8,6 21,8

TrrULO M~OIO 21,1 '

REAÇÕES COM VERONAl~Ca++Mg++

0,010 '15 10,8 0,004 86 6,6 0,006 8,8 81,~

0,010 90 9,0 0,004 80 5,1 ' 0,006 8,9 82; 6 0,015 85 18,6 0,,006 ao 6,0/ 0,009 6,9 a8, a 0,010 70 10,6 0,005 20 7,4 0,,004 a,2 40,0

TíTULO M~OIO 86,6

Rela9ão entre unidades de oomplemento determinadas com os dois dilu­entesi , empresen9a de 0,05 ml de s8ro. -

l ' unidade salina = 1,7 unidades veronal

m de se esperar que sendo o título dado em ndmero de unidades de com­plemento que o valor aohado com veronal seja 1;0/ vêzes maior que o dete,t minado oomsalina. : Realmente foi essa a rela9io encontrada :

a5,6/21;1 '~ 1,0/

16

CAPITULO li

CURVAS DE ISOFIXAÇAO COMO M~TODO DE ESTUDO DAS REAÇÕES QUANTITATIVAS DE FIXAÇÃO DO COMPL~MENTO

A REAÇÃO ANTtCENO-ANTlCORPO-COMPLEMENTO Quando estudamos um novo si~tema de fixação do complemento, precisa­

mos c~Khecer o tipo de rea~ão, verificando a exist~ncia de possíveis efeitoszonais por excesso de antígeno. ,

Um m'todo utilizado em todas as t'cnicas de fixação do ~omplemento consiste em fazer reagir diferentes concentraç6es de antígeno com . diver­

'sas diluiç6es de saro, a quantidade de complemento 'sendo mantida cons~ tante.'(Técnica de titulação em bloco, BIER" 1955). '

Em nosso trabalho também utilizamos ~sse m'todo, por'm com dife­rente interpretação, projetando antígeno em abcissas contra saro em or­denadas~As quantidades de um e outro são escolhidas como aquelas que re'agindo, formam complexos antígeno-anticorpo dotados da mesma capaci­dade de fixar complemento. '

Se empregarmos, por exemplo, seis unidades de complemento, escolhe­remos as quantidades de sBro e de antígeno capazes de ~eagir com o com­plemento, fixando 5 unidades. ,O ponto 50% de hem6lise, por ser mais pre­ciso, deve ter prefer~ncia"embora se possa selecionar qualquer outro.'A projeção determina pontos em uma curva 'que denominamos ,curva de;isofi%G-

; çio pois em todos os seus pontos a fixação do compleme~to foi a mesma. ' (ALMEIDA" 1955). ; ,

Podemos levantar outras curvas de isofixação para o sistema em estu­do; o gráfico 111. apresenta duas curvas de isofixação determinadas;.colHi seis e nove unidades de complemento, traduzindo as relaç6es qua~titati­vas entre saro e antígeno ' protocolo 111 e IV).

Dessa forma dizer que a mistura saro-antígeno fixou cinco unidades de complemento quando sei$ estavam presentes não significa o conheci­mento da reatividade do saro ou do antígeno~ pois pode depender signifi­cantemente da quantidade do outro componente presente; podemos dizer que a quantidade de complemento fixado é uma ' função das proporções relativas em que . an t ígeno e an ti corpo es tão p resen tes na. m i s tura. ,

A função de isofixação poderia ter a expressão: '

Q. = f(W,Z)

onde Q, é a quantidade de complemento fixado pelo complexo imune formado pela antígeno W e pelo anticorpo, contido no saro,Z. '

Quando W torna-se muito grande em relação a t, podemos experar que

Q. = f(Z)

Quando Z decresce, Q tende para zero desde que W não seja anticom­plementar ...

Essa condição' encontrada. quando acr éscimossignificantes de antj geno não exigem o decréscimo correspondente da quantidade de saro, para formar um complexo de isofixação. Nesse caso, a fixação do complemento depende da quantidade de anticorpo presente, pois variações nas quanti­dades de antígeno não afetam a reação. ' Assim os pontos de isofixação descrevem uma curva com uma parteassint6tica ao eixo das abcissas. '

Outras curvas de isofixação podem ' ser traçadas empregando diferentes

quantidades de éompleaento. ° ,ráfico IV no. mo.tra •• curva. obtlda. com trh, seis, nove e dou unidade. ~e complemento,' coa s8ro dele)l'a e anti,eno lecitinado HA-5 . Quando a reação 'se f.a COII 0,010.Z de anti_eno ou aaia, a fi~.ção depende da quantidade de"sBro preseate, ?

.. Q. i:: i(Z)

. ~.

São essas as condições necea.árias e auficieates para a deterai.ação do título de um 's8ro, de acSrdo com ois conceito. definidDa no capÍltulo VII .. : .

Outra condição encontra4a aa curva de iaofixação é 1I0atrada pelo 1''''' . vertical d. curva. I. Ne.aa par~e, o a8ro ,(Z) tora.·'., .uito ,rude .e. relação l ' quantidade de .ntigeno' preseate (I) e"então:'

Realaente a qu.ntidade de coapleaeatofixado depeade da quancidadl dealltíieno presente, pois aumentoa conaiderbeia dea8ro pouco ' iafet .. ·t ~eati~idad~ da mi~tura em que ' ~e ~ forma o complex~ imune com anti,eno (W)

·e . anticorpo pre.ente, exprea.o ea t~rmoa de · .&roZ~' " , Ne.te c.so obteao. condições para que o co.pleaento fixado ~penda .

da qu.ntidade de antígeno preaeate, ou e. outra. p.lavr •• , o r~o ver­tical da curva de isofixação indica a. condições aa. quais a doaaie. do antí,eno deve ·.er feita. ' .

O . lr~fico é V no. 1I0stra du.a curva. de i.ofix.ção. ' As quantidade. de anti,eno, . preaentes na re.ção coa exce.ao de a6ro, quando projetada. · c~. tra as unidadea de compleaento fixado, · deacrevea pon·toa s8bre ua. reta~ ' O titulo ' do ~nti8eno pode aer calculado .egundo os conceit~s d~fi~idó~ no c.pítulo VI .. )

A parte da curv. de i.ofix.ção que li,a .a du ••••• intot •• é .aona ea que a quantid.de de .coapleaento fixado depende tanto do antiieao COa0 do ' anticorpo, sendo portanto impo.aivel avaliar a raati.idade de um ou outro em tarmos de complemento fixado. ' E.sa zona mostra 'condições inde-

·aejáYeis .nas reações de fix.ção do complemento"onde deveaoa ter apenaa uaa variáyel para aer determinada. ' .

Na realidade a condiçio ideal de 'se fazer a doaa,ea apen •• de ua do. elementos, antígeno ou anticorpo, nunca é atin,ida, pois os ramos da curva deisofixação não são asaíntotas verd.deiraa, indicando que . a fi­x.ção, ea todos oa pontos, ~epende de a.bo. oa eleaentos, embora pos.a depender ' aais de um quede outro. '

Na prática consideramos que a função

Q.= f(I,Z)

po •• a ser tomada como: ,

Q. = f(W)

OU coa0: '

Q = f(Z)

dependendo da. proporções ea que ~s.es elementos (.ntí,eno ou .81'0) es·

tão presentes na mistura-reação. Devemo~ no entanto,considerar as curvas de isofixação obtidas com

antígenos que apresentam a capacidade de inibir a reação, quando em ex­cesso.t o caso típico da cardiolipina que , apresenta curvas em que ' a as­síntota hoc.izontal passa por uma inflexão. A quantidade , de antígeno que re~e com o mínimo de sBro , indicada por um ponto bastante nítido cor­respondente A· dou de rea tividade aúiaa, segundo WADSWORTH~ MALTANER e MALTANER, " (1938).

Curv~s de : isofixa9~o.no . sist~ma tuberc~lose . serviram para a dete~­minação . da prop9rção e~ . que : saro e : ant~geno aquoso se combinam para for~ mar complexos com definida capacidade fixadora de complemento(WADSWOR17f, : MALTANER e MALTANER, ~ 1938). ; O mét9doconsist~a . e~ det~~mina~ as rela9õe~ lineares entre · sBro e · complemento1assim como as e~contradasentre antí­geno e complemento. : Essas linhas de ' regressão eram comparadas pelo quo­ciente de suas inclinações. '

O quocient~ indicaria ~ capacidade de reação entre antígeno e ' anti ­corpo. ; Testes feitos em diversas ocasiões, demonstraram um quociente constante para cada saro examinado, ' embora complemento e hem'cias fossem diferentes. I Manteve-se con'stante , o antígeno aquoso nessa série de expe­ri8ncias. : Essas relações encontradas na an'li~e , das curvas de ' isofixação iriam permitir a determinação q~antitativa de antígeno ou anticorpo, · por t~cnica de fixação de complemento.

• •••

'GRÁFIro 111.

Curvas de isofixaçiioco!R antígeno lecitinado e s8ro de lepra n 9 , LP . (Pro toco lo 111)

0,0100

0,005

0,005

9

0,010

/IIl de an t ígeno

• 6

9 unidades de complemento

6 unidades decompleaento

0,015 0,020

'GRÁFIro IV

Curva de isofixaçàocoa e:icesso de antígeno.}

' (Protocolo IV)

SISTEMA LEPRA

o

9 U

~~ ______________ ~.L-________________ ~ __ -AO~ ____________________ ~AL-____ • __________ ~a~QL-__ A-o

0,005 o .. cuo 0,015 0.1 (i) 20

,.l de an t ígeno

0,0200

0,0160

• Z. s6.ro nO. 5155

0 , 0100

0,0060

- " 'GRAFICX> Y

Curvas de isofixação ea lepra. ; Ant (geno BA-S lúi tinado a 0,05%

' (Protocolo não apruentadci)

• o

• b

9 unidades de coapleaento

6 unidades de coapleaento

0,006 0,010

al de an t (geno

PROroroLO ' 111,

CURVAS DE, I SOFIXAÇXO . EM LEPRA

(graflco 111)

~.ôRO IP DILUIÇÕES DE ANTÍGENO liA-5 LECITINADO 1---,. -

,

A 0.-006% 1: m l 50 88 25 1'7 :ta 6,'7 5,0 4,0 8,8 2,5

HEMOLISE % COM 9 UNIDADES DE COMPLlIlMEN'Í'O . ._._-._.-I -_.

! i I I 01'0100 .: 8'7 80 12 o O o í O • O O O I j

0 ,,0050 '70 2'7 10 O O O I o o • O o O i O

, O O o 0,0080 Q8 52 8'7 . O , o i

0,0020 100 "

o o I O O O 100 100 '70 45

0,0015 100 100 1 100 100 100 80 5 o O O

0,0010 100 85 60 25 o

~'00~ 100 40 10 0,0008 100 80 25

0,000'7 :100 40

,0008 I ~166 io,0005 -1 . . 100 1.:.5

{ ........ . -_ ... ' .. _- '-'-'-I HEM6LISE % COM 8 UNIDADES DE COMPLEMENTO

fê, 0100 ...... -'t'

I ! 88 85 10 O

I ,0,0050 80 45 20 5 o i 10 ,0080 '75 40 15 10 O

90 080 80 ,10 . O 10 -,0020 t

10,0015 100 ro 85 '. 25 , 5 o I

100 ! o lO , 0010 95 6P 5 .' 0,0009 .1 .... 190 i 80 , 10 O

0,0008 1'100 \

90 J 15 O

0,000'7 100 80 10 O

0,0006 100 50 25 15 o 0,0005 I ' 100 '70 55 15 o ,

100 [0,0004 90 85 60 50 15

! 0~0008 I 100 95 '75 60

lO, 0002 ! I ! I 100 90

CONTRÔLES r ··-'-------D--0-A-N-T~Í-G-E-N-0-C-0-M-2-U-N-I-D-A-D-E-S----------·,...'----

~: ,-~ __ ·.J._8_5_...l__8_5_..\__9_0 _ _'__9_0_L._·'OO_._J.__9_5_....L.._9_0_..J.._Q_5_-L1_9_5_..I...._9_5_1

f~ I

SÔRO ,

COMPLEMENTO COMi DO COM: DAS HEMACIAS

lU 2U lU J. __ . 2U SENSIBILIZADAS ". -

I 15% 90% .

45% 100% 0% ;

___ .. L ____ .... . - _I.-...-

In cubação prelimina r :, 37·C por 90 minutos , .::: '

Incubação de hemólise : .{3i-c por 1.5 minutos

PR01'O(X)LO I _V

BBRO DI -L.PRA 1° 9 __ .1

- 0;,0016 0.0010 0,00015 0;,0008

_ 0,00150 0,0040 0;,0080 0,:0)215 0.1 0020 0.100115 0.1 0010

0~00l5O

: O,OO~

0,0080 0,00215 0.1 0020 0,00115

0,0080 0.1 001510 -0.1 0040 0;,0086 0.1 0080 0,00215

CONTROLES

-CURVAS »1 ~àO.IXAÇJO CÓKIXCI880DIAITrGII0 (graf1co IV)

.1 DI AITrGllO

0,020 0,0115 - O!.~~_ .[ _o,o~~ __ J 0,008 0,001

-- -O o~_:Ulló~t_U:_ Q )~~L_%V!l;Ul-~~~_:_gLºº~~_~~!o~º. 01 -- - "{ó-~

O O O O O 215 815 86 80 815 815 1515 60 - 60 1515 66 150 '70

8 U-IIDAD1II8 DB COI(PLBKIITO

-O O O O O 1515 O -O - O O 15 80 O O O O 215 90 15 15 6 10 28 100 15 -15 15 215 815 100

815 86 86 80 90 100-'70 815 90 100 100 100

•

9 mflDADlIIB DI OOllPLllIlBTO

O O O 10 80 90 O O 10 80 90 - -100 -O 15 U5 80 100- 100 6 10 80 '70 100 100

'70 '70 86 90 100 100 80 80 - 80 go . 100 100-

-la UJIDADIB DI OOIlPLIIOITO

O O O 115 86 100-15 10 10 46 100 100 -

26 2,6 26 40 - 90 100 ISO 1515 _ 156 '715 100 _ o 100 -eo '70 815 90 100 100 815 815 80 100 100 - 100

DO AITÍGBR~ COI( 2 unDADBS DJ:- -CÕ~~~~.!!,.J~C?~ ~=~=- - I I 80 I 861 9_~. I 100 _ -..J_ 10

0

0 .L!0o . __ 1

DO OOIlPLII(BBTO 0011: DO ~ÔRo. _~?1I_ : _. ___ --1 DAS HBl1lÁOIAB 8ÊB~--1

1: 9~~ 15: --- -_·t - -~~~% -·-i- SIBILI;~DA8 - : I

C A P f. T U L O VI .

I ~

LINEARIDADE ENTRE ANTIGENO E COMPLEMENTO. INFLUENCIA DA QUANTIDADE DE SÔRO PRESENTE NA RE~QXO.

Os gráficos 111 e V mostram exemplos típicos de curvas de isofixaç~ onde cada ponto traduz a quantidade de antígeno .e a de anticorpo capazes de fo~mar um complexo imune com determinada afinidade para o complement~ '

Por conveniência de precisão, tomamos o ponto 50% de hemólise como referência. ' Assim, se 3 unidades de complemento são inicialmente junta­das aos tubos contendo diferentes concentrações de antígeno e des8ro, a reação se processa com intensidade bastante diversa, segundo a quantida­de relativa dos elementos que formam o complexo fixador de complemento. ' Muitos tubos mostram hemólise total, outros nenhuma; entre êsses extre­mos encontramos graus de hemólise parcial e diretamente ou por c'lculo, determinamos o ponto 50% d.e hemól ise.

Dessa forma são traçadas curvas de isofixação, para cada quantidade de complemento utilizadas normalmente; podemos então ter uma ou mais curvas e estudar as relações quantitativas entre os elementos da reação de fixação de complemento.

Verificamos nos gráficos 111. e V que as assíntotas verticais das curvas de isofixação in~icam pràticamente a lndependência da fixação do complemento em relação ~quantidade des8ro presente, desde que o 6ltimo se encontre em grande excesso. '

Realmente as quantidades necessárias de complemento para 50% de he­mólise (K'S.a) nessas condições variam linearmente com . a quantidade de antígeno presente na reação. São essas as condições necessárias e sufi­cientes para a avaliação da reatividade do antígeno~ excesso de sBro e determinação das quantidades de antígeno necessárias para formar comple­xos capazes de fixar duas, cinco, oito ou onze unidades de complemento, quando três, seis, nove ou doze unidades estão inicialmente present~s na reação. '

O título do antígeno é dado pela inclinação da linha de regressão encontrada entre complemento e antígeno.

~ no entanto necess~rio fazer um reparo ao tipo de dosagem que pro­cura conhecer a capacidade de re~~ão do antígeno, em condições que per­mitam uma reação máxima. A dosagem indica a concentração do material an­tigênico e os títulos determinados por êsse método servem Iara estudo comparativo entre antígenos de diversas partidas. '

Para a comparação de antígenos empregamos um mesmos&ro, pois, como veremos, os parâmetros da linha antígeno-complemento sofrem alterações , quando as assíntotas verticais das curvas de isofixação não são parale­las, ao eixo do sôro; a posição relativa das linhas de isofixação sofre variações segundo o sôro experimentado.

O método não nos informa sôbre a dose de antígeno a ser empregada na reação; a determinação das doses ótimas ou de máxima reatividade pode ser feita por diferentes métodos, utilizando sôro diluido. ·

A quantidade de sôro presente na dosagem de antígeno nos dá a inc~i­nação da linha de regressão complemento-antígeno, com (ossíveis altera­ções no outro parâmetro que é a intersecção da linha com o eixo do com­plemento (ordenadas). Assim na família de curvas de isofixação do gráfi­co VI, cada uma das quantidades de sôro empregado no teste exige, na zo­na das assíntotas verticais, quantidades de antígeno para 50% de hem6li­se. Essas quantidades de . antígeno quando projetadas con~ra as quantida­des de complemento usadas determinam pontos sôbre umar~ta. Podemos ter

.assim di feren tes linhas de regressão antígeno-compl emen to (gráfico VI), cada uma delas com valores diversos não s6 de sua inclinação como de sua intersecção com o eixo das ordenadas. , No gráfico VI, vemos que das li­nhas traçadas, a que foi levantada com 0,0025 ml de sôro, teve sua ori­gem em 1,0 unidade de "complemento, com uma inclinação de 4800; outras quantidades de ' saro influenciam os parimetros da relação linear entre antígeno e com :plemento, quando as linhas de isofixação não são para-lelas.'

t preciso salientar que a intersecção da linha de regressão comple­mento-antígeno é apenas um ponto geométrico e a sua determinação é feita pát"a permitir o cálculo do título do antígeno (pois é um dos parâmetros da reta), pelo método de WADSWORTH. · MALTANER e MALTANER.

Se, no entanto, considerarmos o título do antígeno como igual à sua inclinação, poderemos comparar antígenos, desde que usemos o mesmosôro. · O títuló , do antígeno seria então: '

Título do antígeno = ~ complemento

.6 antígeno

Êsse conceito foi adotado por RICE (1946) na titulagem de antígenos preparado~ de vacina, em presença desôro de coelho imunisado. '

A relação entre complemento e antígeno pode ser utilizada como mé­todo da medida para a atividade antigênica, depois de conhecidas suas linhas de isofixação.Se ' são paralelas entre si e ao eixo do sôro (orde­nadas) podemos empregar o processo com excesso de sôro, pois procuramos encontrar condições em que a capacidade de fixação do complemento do complexo dependa mais do elemento que está em menor proporção, que é o antígeno. A projeção antígeno-complemento na realidade significa proje-ção de complexo imune em têrmos de antígeno contra complemento necessá­rlO para 50% de hemólise . ·

Se as condições da reação permitirem tal tradução podemos dizer que

K' = . a + b.W S,a

para S em excesso.

Para uma determinada quantidade de ' saro (Z) podemos dizer, que (se as relações entre saro e antígeno estiverem ~ iparte vertical da curva de isofixação) a quantidade de complemento fixado é diretamente propor­cional à quantidade de antígeno (W) presente. '

.-

GRÁFICO VI

6 .

8

1

Rélaçãocoapleaento-antígeno ea presença de d(versas quantidades de s8ro de Zepra n e 5155 (da parte vertical do gr6fico V).

0,05

.• / 0,005 ./

______ I. __ .. __ . ________ ---!:..-... ____ _

0,001 0,002

.Z de antígeno HA-5 lecitinado a 0,05%

I

C A P I , T U L O VII

LINEARIDADE ENTRE SÔRO E COMPLEMENTO.' INFLUÊNCIA DA QUANTIDADE DE ANT1GENO PRESENTE NÀ REAQ~O.

Podemos verificar w ,analisando o ~ráfico IV p que já com 0,010 ml de antígeno~ as curvas de isofixaçio de tr~s l seis, nove e doze unidades de complemento, ficam paralelas ao eixo do antígeno (abcissas).No caso presente, maiores quantidades de antígeno não afetam" sensivelmente as quantidades des6ro necessárias para a formaçio de complexos capazes de fixar duas. cinco, oito ou onze unidades de complemento, quando tr~s, seis, nove e doze estão inicialmente presentes. Nessas condiç5es,a quaO tidade de complemento fixado dependerá da quantidade de sôro presente, nas reações com 0,010 ml ou mais de antígeno. ,

Essa é a condiçio ideal para a dosagem de soros, e então podemos dizer que a fixação é função da quantidade de s8ro presente. ;

No entanto, somos obrigados aqui a fazer o mesmo reparo em relaçio a essa condiçio de dependência, uma vez que na realidade, a formaçiodo complexo fixador de complemento depende sempre do antí~eno.iAs linhas de isofixaçio do gr'fico IV são aparentement, assíntotas, mas se estender­mos em maior amplitude a concentração do antígeno, podemos fàcilmente verificar que elas se 'aproximam da abcissa~ medida que a concentração de antígeno aumenta0 ' Outras v~zes,a linha de isofixação sofre a influên­cia da ação anticomplementar que então se faz senttrcom as maiores do­ses de antígeno. Podemos dizer que condiç6es devem ser procuradas para a reação de fixação do complemento, de forma a se obter uma proporcion~i. dade entre complemento fixado e a quantidade de anticorpo (em t~rmos de s8ro) ~r~sente. , degde que antígeno esteja em concentração suficiente~ Na verdade as assíntotas indicam uma relativa independ~ncia entre sôro e antí~eno, em uma zona que se estende desde 0,010 ml. ' até 0,020 mIo ' de antígeno (gráfico IV). '

Projetando as quantidades de complemento necessárias para 50% de he­m6lise contra as quantidades de ' sôro usadas, determinamos pontos s8bre Uma reta. ' Essa linha de regressão permite o cálculo do título do sôro em t~rmos de sua inclinação.

Evitamos. de propósito, distinguir qual a quantidade de antígeno que deve ~er usada na titulagem do s6ro.'Nos trabalhos de fixação do comple­mento, ~nfase é dada } propriedade que certos antígenos possuem, de ini­bir a reação, quando em excesso; um exemplo é dado pel~ cardiolipina e s8ro sifilítico (ver gráfico X).

Neste caso a dQse de antígeno a ser usada deve - ser relativa ~ in­tensidade da reação esperada, que por sua'vez, depende da quantidade de anticorpos presentes nosôro em exame. i

Nos antíEenos preparados de bacilós da tuberculose podemos encontrar ~sse efeito zonal, com maior ou menor intensidade, não s6 na reação com s8r~ ~elepra. como tambem nos contr61es da ação anticomplementar do an­tígeno. '

Ad~terminaçio da quantidade de antígeno necessária para produzir uma reaçio maX1ma é feita experimentando-se diferentes diluições de an­tígeno com outras de sBro, complemento sendo constante. "A quantidade de antígeno capaz de evidenciar a menor quantidade de sôro reagente é toma­da como dose de máxima reatividadeo :

A dose de máxima reatividade varia para cada quantidade de comple~ mento usada no teste.'Em técnicas que empregam quatro diferentes concen-

28

'GRÁFUx) VII.

"R~ lação a6ro-coap leaen to em presença de excesso de an t ígeno. '(Protocolo IV e 'Gráfico I .V).

Antígeno HA·5 diluido a 1:6;67 '(= 0,015 al).

K' A a,

12

9

6

8

I

, , ,

8 18 88 88

0~020

0,010

'GRÁFICXJ VIII

Curvas de i SQfixação 'com antígeno HA-S e sôro de lep r a nO : 124, ' com quatro quantidades de complemento. (Protocolo V, , página 31)

: : • . • • •

.l

12 '

: 9 •

6 .. • 8 •

0,010 0,020

de an t {geno HA-S

PROTOroLO . v ,

WRVAS DE ISOFIXAÇ%O COM . EXCESSO DE' ANTIGENO

SBRO DE LEPRA ml DE ANTíGENO HA-5 LECITINADO A 0,05% N~ 124 0,020 0,010 0.008 0.006 O 004 0,002 0,0016 0,0012

0,0010 0,0008

0,0080 0,0060 0,0080 0,0020

_ . ...

r-----.----...

0,0100 0,0080 0,0060 0,0060 0,0040

0,0600 0,0800 0,0200 0,0100 0,0080 0,0060 0,0060 0,0040

CONTRÔLES

-

-

HBlVÓLISE % COM 8 UNIDADES DE COMPLEMENTO

10 10 10 20 46 60 66 60

C01l 6 UNIDADES

O O O O

O O O O O O 20 26

46 65 80 86

._--_ .. - _ .. _- ._ ...• -- ---- . ... .. .

O O

O

O 10

'--.-

O O O O O O

80 70

............ -._.

- "- '

O O

O

8S 65

COM

COM

9

O O O

86 70

12

~-~ O O O O O 16

65 76 90 100

100 , 100 i

.,.

UNIDADES

O O

16 60 95

UNIDADES

O O

O O

25 80

100 100

. . .. , _ ._ .. _ ,_ I .. -~ , . , .... , .. -

26 40 60 66 65 65

. 0 O O

16 40 70 66 86 100 90 100 100

O O -f

80 O 85 I 80

20 90 100 66 100 100

100 100 100

O O O O O 10 O. O 20 O '·ro 100

ao 100 100 86 100 100

100 100 100 100 100 100

I .. ~~~r~o D) AB.::.1 :V 2 UNIDADES D' COKPLBKmO

.-I

PLEMENTO COM: DAS HEMACIAS

2U SENSIBILIZADAS

90 0% . . - - .... _._.-. .

50 70

10 86

100 100

90 100 . . 100 100 100

20 66 86

100 100 100 100 100

100

'GRÁFICO IX

Re lação sGro· comp lelAen to. : Influlncia da quan tidade de antígeno sGbre os par8aetros da linha de regressão. :

K's,A

12 ~ ! I ,

OBSERVAÇÃO:

,"' \, ,.-..:d

í

.t.~""" ,.,. __ ..... :o.;>

V

A _

O parametro a da,equaçao K'S A = a + b.Z e a dls­tân~ia entre o ponto ax e a inters2ção da linha de regressao com o eixo das ordenadas.

0,,02 IIIl de antígeno

=-f~ - - -à O" 004 .l de an tígeno

0,006 0,010

ml de sGro

traç5es de complemento, ' como a de W.M.M. : existem quatro ' doses de reati­vidade máxima determinadas para o mesmo antígeno.

Um fato corrente é a verificaçio que a dose de reatividade m'xima pode diferir segundo o s~ro testado. , As doses de m'xima reatividade os­cila·m em redor de uma média que 'seriauaa dose de antígeno suficiente para a maioria dos soros em um sistema. '

A técnica de W.M.M.obriga ao uso de várias diluiç5es de antígeno para cada quantidade de complemento usadô e todas as reaç5es obtidas 'sio comparadas para sempre se poder determinar a reação aáxiaa. ;

Dessa forma, quando podemos evitar o efei to zonal do -_ antígeno e con­seqHêntemente a determinação de uma dose de máxima reatividade, simpli­ficamos a técnica com di~~uição do trabalho envolvido. , Nesse caso uma únicadiluiçio de antígeno poderia servir às reaç5es praticadas com qua­tro concentraç5es de complemento. ' Tal é o caso exemplificado no gr'fico IX , onde 0,02 ml de antígeno foram suficientes para as reaç5es com tr~ seis, nove e doze unidades de complemento. '

O efeito do antígeno sôbre as reaç5es quantitativas com 'sôro de le­pra é il ustrado no protocolo li e gráfico VIII, onde as linhas horizon­'tais de isofixação mostram que maiores concentraç5es de antígeno têm pouco efeito sôbre a reação.'

As porç5es horizontais das curvas de isofixaçio do gráfico VIII , tendem a se mostrar assintóticas ao eixo das abcissas; no entanto pode­mos verificar que, embora as linhas tenham essa tendência,preenche as condiç5es necessárias para a dosagem do sôro, elas na realidade so­frem em todos os pontos a influênci~ da quantidade de antígeno presente na reação (protocolo V). ' .

Se considerarmos que na porção horizontal ,as curvas de isofixa~io mostram pontos que mais dependem da quantidade de:' sôro presente, as con­diç5es requeridas de que

Q = f(Z)

são pr~ticamente atingidas. ' Nesse caso a projeção de compl~ment~ neces­sária para 50% de hemólise contra sôro, determina pontos sôbre uma reta. '

O título do sôro é calculado, pelo método dos acréscimos proporcio­nais.Verificamos qual o a~réscimo de K' A p~oduzido po~acréscimo cor~ respondente de sôro.'Calculamos entã:; por proporçio, qual seria a quantidade de complemento para 0,05 de sôro. '

Título do sôro = ~ K' s,A 0,06

~Z

Essa relação no~ vai permitir calcular os títulos de um sôro, para diferentes quantidades de antígeno.

Quando . as curvas de isofixação são paralelas. o efeito do antígeno é nulo sôbre a diferença entre K's Ai nesse caso a dose de antígeno a ser empregada numa reação poderá ter ~rande amplitude de variação. "

A linha de regressão sôro-complemento intercepta o eixo de K's,A em

um ponto que nos trabalhos de fixação de complemento de w.v.v.'é chamado de C'.'Essa denominação é bastante infeliz, uma vez que C, tem sido em­pregado para significar complementoo ' Seria mais lógico chamar êsse ponte) de a pois nada mais que um dos parâmetros da reta: .... - .. ~::~=--_.~;'''~.,

K A - bZ A" ... :~)- . . ':;'- F"u 's, _ . • + • ~ <I ':)'"'- ___ ......... , .... ..;:

cujo estudo será feito nos capítulos VI!I e IX. ' ( UNdERSmAôi Di SAO Pi.~ .a.a.

CAPITULO VIII.

I

INFLUtNCIA DA CONCENTRAÇIO DE ANTIGBNO SOBRE OS PAR1METROS DA LINHA DE REGRBSSXO SORO-COMPLEMENTO

A relação entre -sôro (Z) e complemento necessário para 50% de hem6-

lise, nas condi~ões do teste descrito nos capítulos anteriores é d, da pela reta: ·

K' ,A = a + b. Z

No Kráfico IX podemos ver que o ponto foi determinado por projefWão sSbre o eixo do complemento, da reta tr.~ada entre tr~s e doze unidades. ­Vamos estudar o significado de a, utilizando os dados das linhas de iso­fixafWão do iráfico VIII, protocolo v e projetando sôro contra complemen­to, para duas concentrações de antíieno: - 0,020 e 0,004 .1 (iráfico. IX). ­Os dados são os seKuintes:

QUADRO 11

Relações quantitativas entre antígeno, s8ro· e co.ple.ento

ANTIGENO nd DE'SôRO NO 1.24 PARA IGUAL ~ VALOR DE a .1 a 6 9 12

0,020 0,001 0,002 0,00B5 0,0047 1, o 0,004 0,001 0,0028 0,0052 0,00'78 1,5

A projeção de K' contra sSro determina uma reta quando 0,020 .1 de antíieno estão presentes, a tendo um valor de 1,0~ ' quando porém; menor quantidade de antíieno é usada, como 0,004 .1 os pontos não ficam sôbre uma reta, mas descrevem uma curva. A intersecção da linha traçada entre tr~s e seis unidades de complemento tem _um valor de a = 1,5.

Essa observação su~ere s~r o ponto' dependente da ~uantidade de an­tí,eno presente na reação. Quando as curvas de isofixação tornam-se pa­ralelas entre sí, há proporcionalidade entre complemento necessário para 50% dehemólise e'a quantidade de -sSTo presente, antí,eno sendo constan­te em todos os tubos da reação. - As quantidades de sôro projetadas em abcissas e complemento em ordenadas são os dados de que a técnica de W. M.M.se utiliza para a determinação do título do sôro, pelo proloniamen­to da reta, até determinar nas ordenadas o número de unidades de comple­mento necessário para 50% de hemólise, quando 0,05 .1 de sôro é tomado como refer~ncia. '

Para haver proporcionalidade entre sôro e complemento não há nece~ sidade das linhas de isofixação serem paralelas ao eixo do antí,eno; basta que sejam paralelas entre sí.

Esse fato é bastante evidente quando se trafWam curvas de isofixação com antí,enos Que apresentam o fenômeno de zona. ·Um exemplo pode ser da­do com a card~olipina que apresenta nitidamente uma dose de máxima rea. tividade para tr~s unidades e outra para seis unidade~ de complemento <aráfico X).

o quadro 111 mostra OB dados colhidos numa experi$ricia d2sse tipo.;

QUADRO 111

PAR~METRO DAS L )NHAS DE REGRESSÃO SORO-COMPL~MENTO. PARA DIVERSAS CONCENTRAÇÔES DE CARDIOL)P1N~.

.-ANTIGENO CARO 10-LIP1NA

0,0013 0,00\5 0,0010" O,0020~·

0,0060 0,0100 0,0.200

m1 Df S6RO 81Ft!:.

PARA K' 18

0,0034 '0 p 0034 0,00B4

0,0064 0,00'70 0,00'74

Dose do m'xima reatividade Doso de m~ximB r"atividBde

_" I Ti CO

UAL A~

1

"'

para 8

para 6

NECESSÁRIOS

-S

0»0090 0,0080

0,0060 0,0090 0,0096 0,O100

unidades de unidades de

PARtMETROS DA

LINHA DE RE-GRESSAO SOR9= COMPLEMENTO.

a b

.,. 1;2 536

... 0,7 662

- 0,9 1154

- 49° 1154

- 4,9 1154

- 5,4 1154 -----,

complemento;: complemento •.

..... ~. __ , ... ...,..-. . _____ .,, __ .... -=--.. __ "' ..... -=~_..,._~=_<~'"'_-__ ~. _=--==~r. __

As linhas de ~egressão traçadas possuem diferentes parâmetros;( os valores de ~ Indo de positivo a negativo~ de ac8rdo com a quantidade de antígeno presente (gráfico XI).'Observamos no entanto que a partir de 0,0020 ml de antígeno as línhas de regressão ficaram paraleJas entre sí (o mesmo vala de b) e se o título do saro far calculado como

D... K' s A.' 0,05 Título e=: <~--,--,,-~.~-~

~Z encDntraremos o valo~ de 57,8, constante para reações feitas com diver­sas coneentrBç6 p s de antígeno.'

A experi~ncia ~ bastante ilustrativa e mostra os seguintes pontos:: 1°) o A d08~: de ~ntígeno de máxima reatividade deve ser empregada

quando se queK' ewidencial' quantidades pequenas de anticorposw por exemo plo. nas reaçóes qualitativas de fixação do complemento. 1

2a ) - Nio h' necessidade. nem obrigatoriedade de se usar doses d~ 1T'eatifIJidadre ",á:ldIllUl pacrlil titular soros reagentes~' quando se emprega o mé o

todo dos acré~cimo8 proporcionaiso-3()) g A expeJripncia acumulada em reações de fixação de complemmto

mostra que a dose de rCBtividade m'xima do antígeno é uma quantidade de antígeno qu~ produz o m'ximo de reação com a maioria dos soros em um de­terminr()jdo $i$t~ma.'Ê uma quantidade estatisticamente determinada e isso quer d1zer que a dose de m'xima reatividade não é a mesma para todos os soros.,Para um d~t~rminado saro~ a-fim de se obterem reações máximas, somos obrigados a empregar diluiç6es de antígeno, em redor da dose média conhecida e suposta 6tima.'O uso de antígeno mais diluido afeta a pro­porciDnalidad~ entrp complemento e sBro, sendo particularmente evidentes as mudanças ocorridas nos valores de b, que é a inclinação da linha de regressão saro-complemento.,

35

· ° uso de doses maiores de ant1eenoafeta, apenas o valor do parimetro a e aS81m os títulos por acréscimo não são alterados.

4e ) - A importância prática d~sse achado deve aqui ser salientada, pois o conceito de dosar antíienos, para se encontrar a dose de m'~ima reatividade para cada concentração de complemento, deve ser aplicado apenas às reações qualitativas. Para as reações quantitativas i' não procuramos a quantidade de antíieno que satisfaz a maioria dos soros em um sistema, mas apenas necessitamos de conhecer qual a dose de antíeeno que produz reações paralelas com tr~s, seis, nove e doze unidades de comp I emen to. '

A dose deve compreender u.a zona de diluições de antíeeno, na qual a condição de paralelismo das curvas de isofixação é satisfeita.

No exemplo dado no gráfico X podemos escolher a dose de 0,0100 de cardiolipina para reações com tr~s e seis unidades de complemento; as doses de máxima reatividade são respectivamente 0,00075 e 0,00150, se­iundo MALTANER e MALT.4NER, para cardiolipina 72, experimentada. ' No en­tanto, no sôro examinado, as doses de máxima reatividade foram de 0,0010 e 0,()020 aZ de antíieno, respectivamente para tr~s e seis unidades de compl emento •. Se a reação tivesse sido fei ta com, as suposl.as doses 6timas de cardiolipina, a linha de reiressão sôro-complemento'(ver gráfico XI) teria os se~uintes par~metros: a = 0, b = 730, c~m ,rande alteração~ título do sô~o, pois, como se pode verificar nOiráfieo X, essas doses de antíeeno se localizam exatamente na zona em que a curva de isofixação depende iiualmente tanto do sôro como do antí"eno.'Convém lembrar que a titulaiem do sôro se procura fazer na zona em que a curva de iaofixação depende primeiramente do sôro.

No iráfico XI podease verificar que quando se computam 'os valores de sôro e de complemento nas reações praticadas com as ~erdadeiras d~ses 6ti.as de antígeno, os valores dos parâmetros são: : a = - 0,9 e b = 1154. , O valor de b é o mesmo que os achados com doses ma i ores - de antí"eno e sendo o título função de b, vemos que, depois da concentração 6tima, as determinações dão o mesmo título. independente da c~ncentraçio de antí· i eno •

se) o Dessa forma, a dose de antígeno a ser .mpreeada numa titulação de sôro deve ser aquela que não afeta o relativo paralelismo das curvas de isofixaç~o.As doses de máxima reatividade satisfazem essa condição, imprimindo ~ reação o máximo de sensibilidade. ' N~sse caso reações preli a

minares para evidenciar soros rea~entes, devem- ser feitas com dose de antíieno de reatividade máxima; a dosaiem, no entanto, do sôro reagente deve ser feita com doses de antíeeno de reatividade paral.Za.

Essa noção, quando aplicada, em muito simplifica o método quantita­tivo de W.f,f.M •• , pois passamos a usar uma única dose de antígeno para três. seis, nóve ou doze unidades de complementoo ° método tem a vantaiem de não se prender a uma dose crítica de an· tíieno. pois variações consideráveis da dose de reatividade paralela não afetam o valor de II K's.A~ não alterando portanto o título do sôro.

Trabalhando comantí"eno em excesso, alteramos a reação, m~snao seu paralelismo, m~smo quando o antíeeno apresenta intensos fenômenosde inibição.'

As doses de r'eatividade paralela afetam o valor de a. màs não as de b. da relacão sBro-complemento. r

Até a~ora estudamos a inclinação da linha de re~ressão sôro-comple­mento e concluimos que condições para a titulaiem do sBro são encontra-

36

das quando as linhas de re~ressão citadas apresentam o mesmo valor de b.' O outro parâmetro da linha de reiressão éa sua intersecção com o

eixo do compl emen to. ' Ve ri ficamos que 'seu valor é irandemen te aI terado por efeito da quantidade de antíieno presente, porém o seu si~nificado deve ser procurado, pois é de inter~sse prático e teórico.'

L~iicamente, se antíieno e sôro não são anticomplementares, as li­nhas de reiressão devem sair de 1.0 n~idade de com~lemento~ no ei~o das ordenadas, pojé quando sô~o é iiual a zero, deve ser necessário' apenas uma unidade de complemento para 50% de hemóli,se. por definição.,

Na projeção da linhasôro-comple.ento sôbre o eixo das ordenadas, vemos que o par~metro a pode ser de irandeza muito variável, como ponto extrapolado e não representa um dado experimental. O ponto a deve ser o contrôle do antí~eno, qd~ com uma unidade deverá~ na aus&ncia de sô~o, dar hemól ise próxima de 50%.;

Se fizermos as reações com menores quantidades de 'sôro que aquela que reage com tr~s unidades de complemento, podemos traçar toda a curva que relaciona sôro com complemento e determinar experimentalmente o ponto em que a curva se inicia. no eixo das ordenadas. O quadro IV nos dá os valores encontrados experimentalmente.

Os dados da experi~ncia foram projetados no gráfico XII .. ' Verificamos que o valor de a decresce 1 medida que aumenta a concentração de antíge­no empregado na reação.'

Valores negativos de a significam que a reação de fixação do comple­mento se inicia depois de certa quantidade de sôro.'Assim, por exemplo, quando antígeno está presente na concentração de 0,0100 ml, a fixação de complementlll começa de!rois de 0,006 ml de sôro; ' a razão dêsse fenôme.­no parece depender diretamente da quantidade de antígeno presente.'Qu~n. do este está em excesso, o complexo antígeno-anticorpo formado se dis­solveria no antígeno. até uma certa concentração, depois da qual já'não haveria suficiente antígeno para produzir ~sse efeito. ReaJ~te~ menor quantidade de antígeno (por exemplo 0,0033), já mostra fixação do com­plemento com 0,003 ml de sero.

QUADRO IV

RELAQÃO ENTRE SeRO E COMPLEMENTO .,' EM FIXAQ'OES COM EXCESSO DE ANTÍGENO (Exemplo: oardiolipina e sSro sifilítioo)

ANTIGENO SÔRO K's,A PARÂMETROS TÍTULOS DO SORO ml ml a b (por aorésoimo)

0,0100 0,01'70 g,O -25,5 1.500 '75 0,0100 0,0150 6,0 0,0100 0,0180 8,0 0,0100 0,0105 2,0 0,0100 0,0080 1,4 0,0100 0,0060 1,2 0,0100 0,0040 1,1 0,0100 0,0020 1,1 0,0100 sa.lina. 1,1 0,0088 0,0106 g,O - 6, O 1.500 '75 0,0088 0,0086 6,0 0,.0088 0,0066 8~ O 0,0088 0,0055 2, O 0,0088 0,0040 1,8 0,0088 0,0080 ~, 2 0,0088 0,0020 1,1 0,0088 salina 1,1

O valor negativo de a pode ser interpretado como efeito do antígeno sôbre o complexo antígenooanticorpo formado.

Quando a quantidade de antígeno se aproxima do ótimo de proporções

oom o s8ro, o valor de a tende para 1,0; nessas condiç5es a fixaç~o do complemento se 1niol& com ~antidades mínimas de sBro' e d&! a maior sen­sibilidade da reação. '

Valores positivos de a podem ser considerados !ndice de falta de an­tígeno para atingir a zDna de reatividade paralela. Ltnearidade entre sBro e complemento pode ser alcançada~ por~m a inclinação não ~ a mesma e o ponto a, determinado geom~tricamente, sempre' maior que 1,0 (gr~­fioo XI). '

O m~todo q~antitat ivo de fixação do complemen t o aqui discutido e es­tudado para o s i stema lepra, ' avalia a reatividade do s8ro em t~rmos de complemento nece3B~rio para 50% de hem6lise para um acr'scimo de 0,05 ml de s8ro.'

Difere a a t 'cnica de WADSWORTH, MALTANER e MALT~NER poi s o título do sBro , aval iado em têrmos da inclinação que a l i nha de regressão sôro­complemento possui, para um valor determinado de sôro, arbitràriamente tomad~ como 0,05 ml. ' O método dos acréscimos proporcionais foi utilizado por RICE (194?) que encontrou concord~ncia entre títulos de fixação de complemento e valores obtidos por testes de precip itação no sistema pneumococos. '

•••

GMFICXJX

Curvas de isofixaçãocoa antígeno apresentando inibição quando ea excesso · (t(po cardio Z ipinti). j . (ALMEIDA, ( 1955)

Curvas co. 3 e 6 un i dades decoaple"'ento. }

0,000 t

..... •

0,010

Doses de .axtaa reatividade . (ou doses 6ti.as)

0,010

- aI de antígeno

0,020

'GRÁFIOO XI . Linhas de regressao traçadas no siste.~: i s8ro-coapleaento" quando di feren tes concen trações de an t ígeno são usadas."fDados do Quadro 111.)

8

8 , / , , ,'/

, ,'/ - /// 1:1/::

, " / , , / O / //

, ,'/ , , / CARDIOLIPINA / // al de an t ígeno , / , / -' " , / ---- 0,0010 e 0,0020 . , /

--~_. ~ 0,0015 /,'/ -8 , ---_ .. - * 0,0018 , , / ,

'/ --------9 0,0080 , ------- O · 0,0100 , / , . --- 0,0200 ,/ • /

-6

0,0050 0,0100 .l de s8ro

GRÁFICO 'XII

Efeito da concentração do antígeno s8bre os pa­rS.etros da linha de regressão s8ro-complemento. ;

9

8

K' A 8,

a

,

r" I o ~, :/

-1,4 r I I

I I

I "

I " ( -8,0

, I

I

I

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I

I I ,

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/ /

/

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/

/ /

/

ANTtGENO USADO (cardiolipina)

-e?~-QQ- Doses 6timas -.0.:-_-&,,& - O, O O a a ....... - ...... _ 0,0100

0,020

J ml de sBro sifilítico

I

C A P I , T U L O IX ,

ANT IGENOS AQUOSOS DO BACI LO DA TUBERCULOSE. ' EFE I TOS SÔBRE O COMP LEMEN TO. ' ANTÍGENOS A­QUOSOS LECITINADOS. '

Antígenos aquosos preparados do bacilo da tuberculose, como descri­tos no capítulo 11" ou preparados por simples ebulição de bacilos em água destilada , apresentam um efeito anticomplementar zonal, de grande intensidade • .

O protocolo VI nos mostra que tal efeito é observado não s6 quando se emprega o ' complemen t o liofilisado , preparado de grande número de -soros de cobaia, como quando complementos individualmente testados são utili­zados. , Cabe aqui um reparo sôbre a impropriedade de tal teste, se pra­ticado com uma única diluição de antígeno, pois dará resultados comple­tamente falsos, como se poderá constatar no protocolo VI. '

Os testes de an t icomplementariedade ou reatividade inespecífica entre complemento e antígeno, praticados com 8 diferentes misturas de comple­mento, dariam inform~Gões erradas se realizados com uma única dose de antígeno, pois poderiam indicar ausência de ação não específica, perfei­tamente evidenciável com outras diluições de antígeno. ,

A presença de sôro humano normal na reação diminui o efei t o zonal e o desloca (protocolo VII.), porém não o evita. '

O sôro humano usado na experiência provinha de crianças , entre 2 e5 anos de idade, com reação negativa à tuberculina (MANTOUX G 1:10)

O protocolo VIII ilustra uma experiência feita ~ om o antígeno aquoso precipitado. Verificamos nítida ação zonal em contrôles do antígeno; en­quanto antígenos concentrados não se mostram anticomplementares (dilui­ções a 1:5 e 1:10), quando diluidos são capazes de fixar mais de duas unidades de complemento, ' na ausência de ' sôro. ' Essa observação traz como corolário a necessidade de ' se controlar a ação anticomplementar, com vá­rias diluições do antígeno. ' Efeito zonal semelhante é observad~ nos tu~ b o s d e r e a ç ã o , o n de d i I u i ç õ e s d e a n t í g e n o mos t r a m a t i v i da d e m áx i ma. , f. então necessário indagar se o efeito zonal observado ' nos tubos de reação não é mais a-' reprodução do mesmo efei t o ocorrido nos tubos contrôles do antígeno (protocolo VIII e gráfico XI.V).

O efeito da lecitina sôbre o antígeno aquoso se faz sentir, não só na reação em que sôro de lepra está presente, como ' também nos p~6prios con­trôles do antígeno. , O protocolo IX, mostra uma titulagem feita no mesmo sôro de lepra n- 8954 com antígeno aquoso (OE) lecitinado a 0,05%.

A junção da lecitina fa~ desaparecer o efeito zonal e a linha de re­gressão sôro-complemento intercepta o eixo das ordenadas (complemento) em um ponto mais próximo do valor ideal que é 1,0 (gráfico XV). '

A quantidade de lecitina usada foi de 0,05% e o método para sua mis­tura com o antígeno consistiu e m juntar a quan t idade necessária da solu­ção alcoólica de lecitina ao antígeno não diluido para a desejada con­centração final de 0;05%. '

Voltaremos ao estudo do antígeno aquoso lecitin.do no capítulo X onde fare mos um estudo comparativo entre an t ígenos solúveis em piridina e an­tígenos aquosos. '

•••

PROTOCOLO vI.

A,ão antíco.ple.entczl' do czntígeno CZqUO"BO não lecitinczdo.· e. pre­.engo ;11 •• olugão.czlincz borcatczdez.·

AITtGBNO 28 (OB)

DILlJtQro JX> COMPLEMENTOS LIOPILISADOS; PARTIDAS NUMERADAS

NO 1 1° 2 1° 8 1° 4 :6.1'r1<1110 .,0

RBMÓLISE % COM UMA~ DUAS OU TRls URIDADES . . aa(OB) . 1 2 8 1- 2 a 1 2 8 1 2 8

1:5 20 90 100 #5 90 100 25 95 100 25 90 100 1: 10 16 80 100 ~15 80 100 25 80 96 20 90 100 1:20 16 '70 86 16 80 '70 15 65 80 16 80 95 1:40 10 40 55 15 80 55 16 86 66 15 85 · 56 1:68~'7 o ao 66 10 ao 86 o 80 66 16 a6 80 1:100 o 25 '70 10 25 85 O 80 '76 10 85 '75 1:16'7 O 80 85 O 50 100 O 80 90 o 40 95 la88a

. . O· 65 100 o '10 100 o '70 100 o 80 100

1: 600' o '76 100 16 '76 100 o '70 100 10 96 100

NO 6 ° 6 1° '7 NO 8 "

1:6 , . 20 95 100 15 90 100 26 90 100 40 96 100 1~10 .' ao 96 100 16 '76 100 20 80 66 86 80 95" , 1:20 ' . 20 85 95 o 85 40 16 80 86 20 ao .66 1:40 20 80 '715· O 16 26 10 16 25 10 16 26 1:66,'7 1lS 46 ~6 o 10 40 O 20 85 o o 85 1:100 10 46 ~6 · 0 16 46 o 15 45 O 15 60 1:18'7 o 60 100 O 26 '76 o 26 80 o 26 96 lz888 O 90 100 o 66 96 o '70 100 o 80 . 100 1: 600 o 90 100 O 60 100 o 80 100 10 90 100

COMPLEMENTOS LIOll'ILISADOS EIl: COITROLB DO COMPLlIllENTO

1 U 2 U .11° 1· 28.9.51 415% 100% ,0 .~ 20.4.151

' . .0 &~ 2'7.4.61 DAS HEldcIAS SBISIBILIZADAS 1° 4 10.1.62 1° fi 8.10.52 1° 6 26.9.52 .ô% 1° '7 . 4. "5.5\ NO 8 e.ja.i58

IncubGçãQ.18 horá-"cz 3-6-C,parezevitar a deteriorcagão doco.ple.ento . ,(1 vnidcaJ') pelo çG~or.:HI!.6li.e e. 15 .inrltos a 37-C.

PROTOroLO VII .

Ação antícompleaentar do antígeno aquoso não lecitinado ea presença de s8ro humano negativo. ;

DILUIQÃO REAÇÕES , EM PRESENÇA DE 0,05 aI DE SORO E UMA, ' DUAS E DO ANTIGENO TR~S UNIDADES DE COMPLEMENTO

SÔRO l ' SORO 2 r . SORO 8 SORO 4 SALÍ NA 1: ! 1 2 8 1 2 8 1 2 8 1 2 8 1 2

5 85 90 100 85 00 100 85 100 100 20 85 95 85 100 10 15 80 90 25 90 100 15 70 100 16 70 100 80 90 20 O 65 90 20 85 100 o 40 100 25 75 95 25 66 40 O 80 100 20 80 100 0 - 60 100 20 80 100 16 25 66,7 10 90 100 25 85 100 O 60 100 20 75 100 O 20 100 15 90 100 25 90 100 O 86 100 26 80 100 O 20 125 15 100 100 26 90 100 10 86 100 20 80 100 O 26 167 20 100 100 20 100 100 16 90 100 26 86 100 O 86 250 25 100 100 80 85 100 25 100 100 26 M 100 10 50 a8a ao 90 100 80 85 100 25 100 100 25 90 100 10 66 600 ao 90 100 85 96 100 80 100 100 85 100 100 16 80

CONTROLE DO COMPLEMENTO 50 . 100

Incubação: 1.8 horas a 3-6·C. H.eaólise ea f5 ainu to. a 37·C.

Os soros ' (1-2-3 e ~) são de crianças tuberculino~negativas

PROroroLO VIII .' (Gráfí co XIII.)

Reações com antígeno aquoso sem lecitina 28(OB) e s8ro de lepra n· . 8954

, SÔRO 8954 DILUIDO A: CONTROLE ANTIGENO

125 I 41~7 26 16,17 , DILUIDO . UNIDADES DE COMPLEMENTO DO ANTIGENO

a 8 8 9 12 1 2 8

1 :' 6 90 100 90 90 85 25 96 100 1:10 85 100 40 65 60 25 85' 90 1:20 5 95 10 25 40 20 25 85 1 : 40 O 75 10 25 86 O 10 25 1 : 66,7 O 55 10 80 40 O O 25 1 : 100 O 76 15 85 66 O 10 55 1 : 125 O 80 20 40 60 O 25 80 1 : 167 5 100 85 45 60 O 25 90 1:250 10 100 85 50 75 O 45 90 1:888 ao 100 50 65 90 O 60 95 1 : 500 85 100 55 90 90 O 75 100 1:667 45 100 75 96 100 10 86 100 1:1000 60 100 80 100 100 15 90 100 -

w (JJ

. ..J o ~ w xl? w o

a:: « (J) (J)

w o w z

o ~ z 6 w ~ w .... c.. ~ o o w o

'GRÁFUXJXll .

'Rea~ão entre s8ro de lepra e antígeno aquoso '(28(OB» sell 1 úi tina.

ro 10 5 ,--1.'....-__ ....I1_., __ -oItl--_____ ,,,_

log das diluições de an t ígeno 28 '(OB)

.... 9 s$ro nO 8954 diluido a. 1:16,0/ 1\ sero nO 8954 diluido !lo 1:25

li .....D. sBro O> 8954 diluido 1:41~7

li> n a.

o sBro nO 8954 diluido a. 1:125

w CJ)

..J 'O ~ W :I:

W o ~ O l!:1

« Q: « a.. CJ)

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w o w z O I-Z w ::!: ·w ..J a.. ::!: o o w o CJ) W Q « o z: ;:')

'GRÁFICO XIV

Reação entre s8ro de lepra e antígeno aquoso'(28(OB}) com 0,05% de lecitina. )

12

~O O

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6

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~ .. o ~ 8 -~.

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O O

-.( .6

0 0

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667 500 888 250 18'7 125 100 f.J6( '7 1 20 10 5 __ 1 I I __ L _ _ L_L .... L_~ ___ --' ___ .... 1 _-____ ~I _~..J...I. __ _

Log da, diluições de antígeno

s$ro nO 89154 diluido a. 1: 16,7

sOro nO 89154 diluido a. 1: 2fi,O

s~ro nO 89154 diluido a. 1:41,'7 _f'_____ s6ro nO 8954 diluido a 1: 125

PR01000LO IX (Gráfico XI .V)

Reações co. antígeno aquo.o 28(OB) Zúitinado a 0.05% . (Método 11) e s8ro de lepra n- . 8954.

iHLUfÇÃO SÔRO 8954 CONTROLE DO DO 1:125 I 1: 4L '1 I 1:26 1:16,,'1 , , . ANTIGENO

ANTIGENO UNIDADES DE COMPLEllENTO 8 6 8 6 6 9 9 12 . 1 2 8

6 26 100 O 70 20 '15 80 '70 85 80 100 10 25 100 O '70 20 '15 ao '70 85 80 100 20 25 100 O 70 20 '75 80 '70 40 '75 100 40 26 100 o 70 16 75 a6 76 a5 '70 100 66,,'1 26 100 O 70 20 80 85 '75 25 '76 100 100 26 100 o 80 25 85 45 80 . 20 80 100 126 80 100 o 85 25 85 40 80 80 90 100

lEl7 40 100 o 86 86 90 45 85 40 100 100 250 60 100 o 90 50 100 50 96 45 100 100 aa8 70 100 10 100 55 100 '70 100 40 100 100 600 85 100 25 100 '15 100 80 100 40 100 100

667 90 100 85 100 85 100 90 100 85 100 100 1000 100 100 50 100 90 1.00 100 100 86 100 100

CONTROLE . DO COllPLEllENTO 25 96 100

Incubação 90 minutos . a 37-C. H.e.óZise 15 .inuto. a 37-C.

GRÁFlOO XV

Linearidade entre .8ro e antígeno. com ou sem Zécitina.

-< • -~

12

6

a

9 12 20

6 SEM LECITINA

• COll LBlCITINA

ao

CAPiTULO X

EFEITO DA LECI TINA SOBRE OS ANTrGENOS SOLtlVEIS EM PIRIDINA' IN FLu RN elA DO MODO DE SE MISTURAR A LECITINA I DE SUA DOSE· ::',ú,{P ARACÃO DE ANTí GENOS. '

:'" é:'Hdr ) 'li obsenr a ç ã o de STA TINÉANU e DAMELOPOLU (1909), a 1 eci tina 'fi ~s como .nt{geo o na s re~ ç ~es de fix.ç~o de complemento com s8-

r v ct ( l~pro6o ou com l iqu i do c ~ fa l o-r . queano.

A I~ " I~. j un t ada a o s ext r ato s ~ J co 6 ) ico s de bacilos d. t.bercuJose .u ~~l l l a~~ ~ 2o t~ncia de 80 • 160 vi zes em p r ovas de fix.ç~o de comple--, <:- :, ,,~ . , s C'o g t1,ndo DIENES e SCHIFF (1926) ,

E l!'1 ,L93 1 , WJTEB.SK f. , KLINGENSTEIN ~ KUHN descre'leum o antígeno solúTel ~m pi~idi n. ~ us ~ r am l e cit ina nas doses de 0,03 a 0,06%.

E:\! 19·B EICHBAUM c onfirmou os a ch ados de STATINÉA.NU , DAMELOPOL(f. ~-i!; ! .~d0 ~ ~ F pen s 5e s salinas de le c i ti na come rci ~l i observo. e.tio que h~Y I ~ di fB ~ n ç a de comportamento da le c itina d e ma r ca para marca. Ob­te v~ 0~ % J p0 ~ i t iy idade em reaç5es de fixa ç i c do complemento praticadas em 229 ~ O~ 0& J ~p~ DS OS.

A ]~~ i tiD~ do c Dm~rcio é uma mistura de is8meros , com outras impure­. I~ : Qrn o : efa l i n a . A ce falina possue aç~o refo r çado r a sabre extrato. b a ~~~i anos n a s 8~o ·diagnose da leprose. O antígeno com cefaliaa teria lide 'a?~z d e eYi d~nciar c asos de lepra iniciais, enquanto o meamo antí u

geno ~e m c e fB!i na mast r ava cse desprovido de açio fixadora, aegundo ICJIIA TA 0 940 L

o ~{ :,'..;, '.-.r;, é 0:"', qu ~ us aram leci tina ·comercial (SACHS e KLOPsroa (1925), OFt!;::; ;,,\.1/\ (;c;~' 5 )) ob t iveram so r os imunes em coelhos ; entretanto aqtolelaa q\'\ t e',liQ 'e g6l Tam l eei tine. puri fícada (LEYENE. LANDSTEINER e YAN DER SCHEER d9:: i L PLlWT e RUDY (1932). WADSWORTH, MALTANERe MALTANER (1934) não c0n5e gui~ am D b ~ e ~ soros imunes em coelhos nem e vi denciar qualquer reaçio d e fl ~a~ i0 do ~ omplemen to entre os soros preparados e a lecitina comer-

~; " (~ :, di c . ;. ,TiB. dQ. confirmaram as observaç5es anteriores .ôbre leciti " '.;.'i1 ,,">~ .i!'i. .!,. :)<:",'(,:;; :: Tt'-par ados com lecitina comercial não reagiam com

', :;;i \" p\\!.' i. U. ~ a da. 0 _ . J e pBr ~dos purifi c ados poderiam ter difícil dispersio em a.lina e

i, :;;," " ~'.; ,; ,,, i.'~ " i.H ' i n<: Íp '3.l c au s a de sua não re a ti vi dade, como sugeriram WEIL , 5'F::;S· ::B:J;~<r..:; I;! <is a h i p6tes e não foi confirmada por WADSWOR1H. MALTA~

''ItH .~ i.'1itL LC:_i (' ,'-'J( (1 934) qu e não obse r varam di f ~ renças na diapersão da le,. l h~ 0~~ ! da po r p r e c ipitação c om cloreto de c'd~io ~m comp.r.~io

':' ~'. ; ,: '. ,; , :ê iT.l. ê, Jt.jERCK (l e c i tina de ovos). , i ' · :1 ;:;" :AND.;"!'EINER ,:. VAN DER SCHEER (1927) sugerem q\le a 8Iolbs t6nc i a

"c; ": , (; ',';;:ç ao d.i! ,1n>: i, COrpos não é a lecitina, ' lIlas aLguMa outra suós -edn ~.a p ~ e 3 e n !e n0 3 preparados de lecitina cOlllercial.

É d", idlte 1: e ue assinala r que MALTANER e MALTANER (1945), na padroni­, açio ~e, ~n ti genos de c a r d i oJipina. expe r imentaram suspens5ea de leci~

t i n. p u~ ifi~ada de c or aç ão de boi ~ c om s oros negativos e soros fortemen ­te pD 8 1t i v o ~ pa ~ a a sí fi l is e nio obse r ; aram i nibiçio de hem61ise em 3 6 ~~ nio re agen t e, ma s nD t a r am moderado grau de reação com um dos 15 so­roa 3 i filiticos. Conclu lr am que a le c itina po r si 56 nio , é .ntig~nica JUS qu.e •• Ci!rtclS condiçõ 6til p o derá. ru'gir co. «eter.in.dos 60roso ,: Ante o

d. or,: m~n t ~ ., ': 'lm ] ec i ti na pur ifi c ada de fígado WÁDSWORTH. MALTANER e MAL­r~'ÍNER C;,934 } e n ''-on~. Ta;::,a m 5 "-' e aç5e s positi vas em 83 soros sifi] íticoa. E.: "3':-1! n ,,:·i. d ên c;. : :" :c. ã,) e::; '·: á ) '~!i; 6€ da pe :cc en t agem encontrada (8%) por EICH~ B///M Li C3 I : ,r " (; ,'.1. d j. ,~ Õ i~ ;, f:;i: .~ ! han t e$ .

48

Em 11 mistura8 de soros de lepra lepromatosa, com títulos maiores que 12 com o antígeno HA-S, observamos apenas duas reações de títulos meno­res que 6; um dos soros reagia com cardiolipina e com título lOO. ' Era uma mistura de soros de leprosos, com sorologia para sífilis positiva e com hiat6ria de infecção luética. '

DISPERSÃO DA LECI,TINA O modo como a lecitina é dispersa em solução do antígeno poderia ter

efeito não a6 na ação do antígeno sôbre o complemento como também sôbre a reação.'

E~perimentamos oa seguintes métodos de dispersão: ' Método 1, - A aolução do antígeno em benzeno é evaporada e o resíduo

auapenao em aalina. ' A lecitina é juntada A solução benzênica. f o método utilizado por WITEBSKY. ,KLINGENSTEIN e KUHN. ;

O inconveniente d8sae método é a suspensão em salina, de um resíduo de difícil aolubilidade; o grau de dispersão poderá variar. '

Método 11 - A aolução alc06lica de lecitina é pipetada em um copo e ,a aolução saJina do antígeno é vertida sôbre a lecitina. ' A mistura é feita pa8sando a aU8penaão de um a outro copo, várias v~zes. ' Esse método é fã­ci'lmente reprodutível, e se 'ssseme) ha ao empregado em cardiolipina. '

Mltodo 111, - A miatura preparada pel o mét~do 11 foi precipi tada com acetona (i,ual volume); o precipitado é lavado em acetona e sêco. Juntar água deatilada e aquecer para melhor solução. ' Isotonisar com NaCI. '

O antígeno HA-5 80lúvel em piridina e lecitinado pelos métodos I, 11 e III apre8entou reapectivamente as seguintes turvações, I idas em KLET, com ' 'filtro azul: ' 259, 230 e 2791..

08 antígeno. foram experimentados em saro de lepra, filtrados ou não. ' A filtração foi au,erida para remover certos aglomerados insolúveis. Os resul tadoa' conatam doa protocoloa X" XI , e XII e gr áfi cosXVI, ' XVII , e XVIII ,. ;

Oa reaultado. moatram a auperioridade do método II. ' A comparação en­tre antígeno. lecitinadoa pelo método 11, antea e depoia de filtradoa, indica que a filtração em papel faz baixar o poder antigênico, quer em do.agen. de .8ro quer em titulagena de antígeno (protocolo XII. , gráfico XYIII). '

"'110 'DA QVANTIDAD"'DB LICI,TINA Do •• a variévei. d. lecitina foram juntadaa ao a~tígeno aolúvel em

piridina HA-S, pelo método 11. ' Para comparação foi também empregado o antígeno '.'.J. : com 0,05'de lecitina, porém lecitinado pelo método I. '

' O. r .. ultado. obtido. conetam do protocolo XII ,; o gráfico XYIII , moa­tra que a. do ••• de 0,025 e 0,050% de lecitina aão nitidamente aupe­riore •• quantidade de 0,075', aegundo a reação, de maior inclinação da linha de regre.aio .&ro-complemento. ,O antígeno de r.K.K. ; deu título me­nor ao .8ro. '

A com,araçlo entre o. dois antígenol, HA-S e r.K.K. ; lecitinadoa pelo método 11, indicou que o antígeno HA-S tinha maior capacidade de reação. ' Julgadoa pelo meamo critério, oa títuloa foram 6<ro e ,3241 respectivame* para oa antígenoa HA-5 e W.K.K. j (protocolo XIII, gráfico XIX). '

Quantidades maiores que 0,05% de lecitina diminuíram a inte!1sidalle ua reação. ' O protocolo XI ,V e grUico XX m08tram a titulagem de um aaro de lepra (Ne 111) com um meamo antígeno (HA-5) lecitínado pelo método 11, a O.OSS. o. lOS e O. 1 SI. '

Os títulos encontrados foram respecti vamente: ' 118, 75 e 49. ' Com outro sS~o a influ~ncia da quantidade de lecitina sSbre o título

nio foi tio marcada, embora se pudesse verificar que a dose 6tima de le­citina estava em redor de O,05%. (protoco~9 XV e gráfico XXI). '

, O gráfico XXI. traduz uma dosagem de ab tígeno, diversamente lecitina­do. ' Observar o alto valor dea que depende da quantidade de ' sBro pre~en­te, como vimos anteriormente ao tratarmos do ramo vertical das curvas de isofixaçio em lepra.

OOMPARAÇÃO DE ANTfGENOS

No , protocolo XVI _ apresen tamos reações fei tas com 5 preparados an tig~­nicos. ; Observamos nítido efeito zonal com -, o~s antígenos aquoSOSj os an­tígenos preparados por extraçio com água, á1cool e éter ou pelo método de W~J.K~ : não ntostraram o efeito de zona. ' O antígeno ' de WI ,TEBSKf. não só é menos anticomplementar com~ mais antig~nico. ' O antígeno 'aquoso extr~'­do pela mistura água, álcool e éter (HMC-27) possui a mesma atividade que o antígeno aquoso preparado por extração , a quente do bacil~ da tu­berculose. ' ,. , .

O método de extração parece ser responsavel pelo compo~tamento dos diversos antígenos, pois foram todos preparados do mesmo lote de

' bacilos. ' O protocolo XVII , mostra uma ser1e paralela de reações. , O antígeno W. ;

K.X. ,: foi preparado segundo o método de WI ,TEBSKY ET AL, porém a extração dos bacilos foi feita ' com a mistura álcool-éter-água. ' Fraca atividade antigi~ica indica o método desaconselhável, pois pr~~as anteriores (pro­tocolo XVI) indicaram ser o antígeno W.K.K. i preparados de bacilos do 10-teTB 48189, bastante ativo '~ ' O _ antígeno aquoso HA .. 5AA preparado por pre';' cipitaçãoácida em acetona, era ativo mas anticomplementar. ' Marcada di­ferença em comportamento foi observada tratando o antígeno aq'uoso 28 (OB), preparado ~or ebulição dos , bac ilos em água destilada, pela piridi­na. ' A parte sol6vel em piridina possuia atividadeantig~nica comparável aO antígéno W.K.K. ; porém a parte inso16vel nãos6 era desprovida de açio antiginica, como mostrava o efeito zona~ da propriedade anticomple-mentar. t , "

Diferente proporção entre água, 'lcool e éter, rrão afeta o comporta­mento do antígeno (antígeno BWA, protocolo :.xVIII)j a mistura dos solven­tes era ainda capaz de extrair os princípios antiginicos de bacilos pr~­viamente extraídos com água ferventej sua atividade antigênica era prA­ticamente a mesma que a dos antígenos preparados de células simplesmente tratadas pela acetonaj no entanto sua atividade anti~omplement~r era me­nor, nio apresentando o efeito zonal. '

Quando no entanto extraimos bacilos com álcool-água-éter, ' as células já nio são material rico de antígenos , mesmo quando se emprega o métodó de WITEBSKY (protocolo XVII). ;

•••

PROroroLO 'X

Infllilnda produzida pe lo aodo de se jun tar lüi tina ' ea antígenos não fi 1 trados. (Grtlfico 'XVI.)

.l de ant~genoHA~6 x 10~8 COKPLIlKENTO 20 I 16 12 I 10 I . 8 6 I 4

ARTtaBRO 'LBCITIRADO PBLO KjTODO I

8 U 86 40 40 40 40 46 46 6 U 60 46 60 46 ,.,0 66 60 9 U ,66 65 60 65 ,.,0 90 . 95

12 U 55 '75 85 90 96 100 100

2 ' U 85 ao 50 65 60 ,.,0 80 8 U '7.6 95 96 100 100 100 100

ARTtaERO LBCITIRADO PELOViTODOII .,

a U 20 15 10 15 15 10 . 10 6 U 10 10 10 10 10 10 15 9 U 20 20 20 20 25 20 40

12 U 25 20 25 25 25 80 90

2U ,.,0 ,.,0 "'5 ,.,0 r75 ,.,0 .80 8 U 75 I. ,.,0 70 75 86 80 90

ANTtauo ' LECITIlUDO PELO KjTODOIII

8 U ,.,0 60 60 65 ,50 50 ' 85 6 U 85 ,.,0 76 80 76 76 80 9 U 100 85 90 85 95 100 100

12 U 100 90 95 100 100 ' 100 100 '

2 U '75 , 55 65 ,.,0 ,.,0 ,.,0 80 a U 96 100 100 100 100 100 ' 100

(1)N7'1f(jLES

DO COKPLBKBNTO COK: DO SORO (111254) COK:

1 U 2 U 8 U l'U 2 U 8 U

15 70 95 45 100 100

OBSERVAÇÃO:

a I 2 I l '

a6 20 ,50 65 80 100 100 100 100 100 100 ' 100

80 85 85 100 100 ' 100

15 15 55 20 80 100 85 100 100 100 100 100

,.,5 86 '75 96 100 ' 100

40 46 50 85 90 100 100 100 100 100 100 100

85 '75 80 100 100 100

DAS HEKJ.OIAS SBRSIBILIZADAS

0%

As quantidades de s8ro e.pregadas nas reações ' COIII '3"6,, ge 12 unidades de 'co.pleaento, ''foraa respectiva.ente de 0,0015--0 .. 0030 0,0040 e O,OO55,, 'corrupondentes'lu diluições de 1:·.J3,'J · - 1:116,'1 1:112,' 5 e 1:9.

51

'GllÁFICO XVI ,

Influ2nda do ",odo de se juntar lecitina ao antígeno solúvelea piridina"nãofiltrado" s8bre a reação de ' fi%ação do :coapleaento

' coa s8ro de lepra ' (Protocolo 'X). ;

9

< -CII -~ MÉTODO

b.K'i.A USADO T = 6 S Â sôro

I • • 2150 II

A A 8200

III '~ 1450

8

15 80 40 55

PR01OaJLOXI.

iN~LÜ~NCIA DO MODO DE. SE JUNTAR L~CITINA , ANTfsENOS SOLGVEIS EM P1RIDINA E EM BENZOL E FILTRADOS EM PAPEL ('Gráfico XVII)

ANlfaENO HA-5 FILtRADO ml x 10-&.

Ca.1PI!.ÉMEN TO I

L E CI iT 'I N A O O PELO MÉTODO I ANTIGENO

20 le 12 10 8 e 4 .a 2

a u 80 80 80 76 75 76 70 76 80

e u 100 100 100 100 100 100 100 100 100

9 U 100 100 100' 100 100 100 100 100 100

12 U 100 100 100 100 100 100 100 100 100

2 U 80 75 80 86 90 90 86 90 90

ANTrGENO LÉCITINADO PELb M~TODO ri

8 U 26 26 ao 25 26 ao 40 ·40 40

6 U 80 ""5 40 40 55 60 80 85 100

9 U 50 56 60 65 '75 100 100 100 100

12 U 60 55 55 70 75 ~ 90 100 100 100

2 U 75 75 75 80 75 65 75 80 90

ANTrSENO LÉCITINADO PELb M~TDDO rrl

8 U 70 80 65 75 75 80 70 70 75

6 U 100 100 100 100 100 100 100 100 100

9 U 100 100 100 100 100 100 100 100 100

12 U 100 100 100 100 100 100 100 100 100

2 U 90 90 85 80 95 90 90 95 100

aJNT~LES

1

80 100 100 100

90

70 100 100 100

90

80 100 100 100

100

DO COMPLÉMENTO COM~ DO SÔRO COM: DAS HEMÁOIAS

1 U 2 U 8 U 1 U 2 U 8 U SENSIBILIZADAS

15 80 100 45 100 100 o';

OBSERVAÇÃO:! foram usadas as mesmas di luições do s8ro 111254, I do protocoloX.

'As condições da experi2ricia foram as mesmas que des­'cri tas no protocoloXe

Os resu I tados das ti tu lagens . (pro toco los X e XI) são apresentados no gráfico XVII.

20

15

12

<;( .. 9 cn

::.::

e

8

'GRÁFICO XVII . Coaparação en tre an t ígenos fi 1 trados e não fi l tradoB, , Zúi tinados pelo IUtodo lI. \ a O.05%. / (Protocolos 'X e ·XI).

=/1 Antígeno Título do saro !J.

.Fil trado ·9 e 2150 Não fi1 trado .. .3200

15 80 ' 40 55

ml de ~ero 111254 % 10~4

K,' s I A A soro

PltO.TOCOLO. 'XI I.

'Efeito de diferentes doses de lecitina s8bre a reaçõo defi%ação do co.pIe.ento 'coa .8ro de lepra ne 111254 (Gráfico XVIII).,

.1 DE AN 'ríoENO HA~5 % 1er8

COMPLÉMENTO 20 18 12 10 ' li! 8 4 8 2 l '

Ant {geno Zeci t i nado a 0,025% (altodo 11) 8 O 86 40 ·85 85 85 85 50 45 50 80 8 O ·80 ·80 ' aO 56 .66 80 80 80 '100 ' 100 ' 9 O 50 .50 80 .66 80 '70 ' 95 96 ' 100 ' 100

12 O 45 .55 55 80 '70 '70 100 100 100 ' 100

2 ' 0 60 80 .55 60 60 45 .55 '70 80' 80

Ant (,-eno hei tinado a 0,050% JaltodÓ 11) ·8 O 86 80 80 86 80 40 ' 45 45 50 80 8 O ,150 50 80 50 85 80 90 100 100 100 9 O 60 .60 '70 '70 '75 80 96 100 100 100

12 O 60 65 80 80 85 '76 100 100 ' 100 ' 100

2 O 86 80 85 86 85 40 50 .65 60 66

Ant {geno lüi tinado a 0,075% (altodo 11)

8 U 86 80 40 40 86 40 40 46 .56 80 8 O 66 80 '70 '70 86 80 ' 96 100 100 100 9 O "5 "5 "5 85 85 90 95 100 100 100 '

12 U "5 "0 80 ,.,6 85 90 100 100 100 100

2 O 86 80 80 40 ·86 85 40 45 45 66

Ant {Ileno W.I • ., • . + O 05% de leci tina (altodo 11.)

8 O 45 45 .60 50 55 60 "0 80 80 85 8 O '70 85 90 86 100 100 100 100 100 100 9 O 90 100 ' 100 100 100 ' 100 ' 100 100 ' 100 ' 100

12 O QO ' 100 100 100 100 ' 100 100 100 100 ' tllO

2 O 40 ~'5 45 50 4.5 50 • .(6 80 65 5.15

CONTR~LES

DO CO ~PLEMENTO COM: DO SORO COM: DAS HEM'CIAS 1 ' 0 2 U 8 U 1 ' 0 2 U 8 O SENSI81tiZADAS

115 60 100 45 100 100 0%

O . • lro 11125410i diluído a 1:'33- 1:16,7 ' - 1:12,' 5 'e 1:9 para as rea-­ções :eo.'3,.6, 9 e 12 unidades de :co.pIeaento, respectivaaente •

. 55

'GRÁFlro 'XVIII.

Efe i to da quantidade de lécitina ea antígenos solúvei. ea piridina ea reações coa à8ro de lepra '(Protocolo XII.)

12

..

6

a

I

I í

I

I

16 ao 40

Antígeno leoitinado

WlnTODOII

0,025%, • 0,060% • 0,0'75% n

1I'.x. x • . M

55

. a

u

aZ de ~8ro 111254 % 10~.

Título do sôro

TS = !:l ~

K's.A

A soro

2a26

2175

1825

1475

PJr)1OroLO XIII

COlAparação de dosagens de an t ígeno$ ! eci tinado. pe lo método 11.' (rdr~ C() y" X)

......----._~_r ,,_ ...... _~ ___ ~.~ ___ ,,~ -

POMPLEMENTO m{ de 1l.1l.t!geno x 10-4 (HA-f' 1- OpOp::l'l:" 1e01 Una)

20 16 12 10 8 (3 4 a 2 ._~-~.-t-~-

a u O O o O o O O O O

6 U O o o o O O 10 25 55

9 U O O O 15 25 55 85 100 100

12 U 15 20 35 '75 100 100 100 100 100

2 U 65 60 55 45 50 50 60 65 56

a u 100 100 100 100 100 100 100 100 100 "~""--_C'" _ •

• ANTIGENO W.K.K. + 0~05% DE LECITINA

Il U O o o o o o o o o 6 U o o o o o 15 a5 55 85

9A1 ;l5 25 56 65 100 100 100 100 100

12 U r..; ..... ' 100 100 100 100 100 100 100 100

2 U 85 35 45 40 40 40 45 45 55

a U 85 80 80 95 90 100 100 100 100 -

roNTRÔLES

_.

1

20 100 100

-100

5~

100

25 100 100 100

515 100

DO COMPLEMENTO COM. DO S6RO COM: DAS REMACIAS -

1 U 2 U 8 U i -, >5 .- 55 ~_v_ 2 ti SENSIBILIZADAS

15 85 100 100 ~ ___ 1..-_____

Antígeno diluído em salina bo~atada. Reação feita elA presença de 0,05 ml de s8ro de Lepra 111254 não diLuido.

Incubação prelimina;r;. 90 minutos a 37·C

Incubação de he1ll6h se ~ 15 .inu to!: a 37"C

0%

~

12

9

'G ~R' Á FI:C OXI.'X DOSAGEM DE ANTíGENOS 'LÉCITINADOS A O;Q5% EM PRESENÇA DE. sORo DE LÉPRA (PROTOCOLO Xl;') .

;; ~ 1/ 'TíTULO DEFINIDO COMO . 6 ~ .6 K'

TA = . S,A

6 ANTíaeNo

8-.15 = eooo 1J.~.x.= 8U1 .

8 I-

10

.1 % ier' ,de antígeno

00

12

9

<

'G.:R'Á F TC O 'X Xo I . o (protocolo 'XV)

:: L 1/ ,

ABTI<D:IO BA-5 . LBlCITIlUDO

0,0$ • 0,1.0% " 8 0,1$ .

10

.Z de an t !geno " lcr4

, Titulo do , anti geno

J\K' TA = =- o SI A

6ANTíaENo

• 11.-000

I 9.(XjO

Li ".~

.-J

21) '

. PRO'I'()(1)W ·XIV

Efeito da lecitina sObre os títulos de sOro de lepra n·111 ((;rrí/i;o XX)

ml DE ANTrGENO X 10-8

COMPLEMENTO 20 16 12 10 8 6· 4 3 2 1

HA-5 +- 0,05% DE LECITINA

8 U 35 85 85 80 80 35 35 5E EO 60

6 U 40 40 85 50 50 50 60 '70 90 100

9 U 85 40 40 40 55 '70 80 100 100 100

12 U 80 85 80 80 80 85 40 60 90 100

2 U 45 40 86 85 85 30 õ5 85 40 50

HA-5 +- 0,10% DE LECITINA

8 U 85 35 80 80 85 80 40 40 45 55

6 U '70 '70 '75 '75 BO ElO Ç)fi 100 100 100

9 U 80 '75 90 90 9~ 95 95 100 100 100

12 U 85 90 85 85 ~_OO 100 :1,00 100 100 100

2 U 30 85 40 40 85 85 85 40 80 85 .--1

HA-5 + 0 ~ 15% DE LECITINA

8 U 50 35 85 80 85 85 85 45 50 50

; 6 U 85 85 90 85 90 95 1 00 100 100 100

9 U 90 100 100 100 100 100 100 100 100 100

12 U 100 100 100 10u 100 100 10'0 100 100 100

2 U 50 35 80 85 85 85 45 50 50 50

CONTR8LES

....... -DO COMPLEMENTO COM : DO S~RO COM : DAS HEMÁCIAS

1 U 2 U 8 U 1 U 2 U 3 U SENSIBILIZADAS

10 '75 100 40 100 100 0%

OBSERVAÇÃO;,as quantidades·de sOro n e. 111 utilizadas nas reações . coa tr8s, · seis, . ~ove · e doze unidades .de coapleaento

foram 0,OO15,· OD()()30, 0,0040 e.0,OO55 ml • . i

PROroroLO XV

Influência da quantidade de l«:.d.tina na dosage • . do antígeno HA-5. , em presença de s8ro de lepra 1112.

ml DE ANTíGENO X iO-4

16 12 10 8 6 4 a 2 1 0,5

HA-5 + 0,05% DE LECITINA

a U o o o o o o o o 15 50

6 U o o o o o 10 50 70 90 100

9 U O O O 20 50 80 100 100 100 100 12 U 15 20 85 65 100 100 100 100 100 100

2 U a5 ao 25 40 40 40 a5 85 40 ao

HA-5 + 0,10% de lecitina

, a U O O O O O O O O O ao 6 U O O O O O ao 50 80 100 100 9 U O O 15 a5 70 90 100 100 100 100

12 U 15 25 50 65 . 80 . 90 100 100 100 100

2 U 20 25 25 20 25 ao a5 80 ao 85

. HA-5 + 0,15% de lecitina ,

a U O O O O O O O O O 10

6 U O O 5 15 25 40 55 70 90 90

9 U 20 ao a5 55 70 85 . 90 100 100 100

12 U ao 45 60 75 90 100 100 100 100 100

2 U 20 25 ao a5 ao ao ao a5 a5 85

CONTRÓLES

DO COMPLEMENTO COM: DO SORO COM: DAS HEMÁCIAS l ' U 2 U a U 1 U 2 U a U SENSIBILizADAS

10 75 100 40 100 100 0%

No gráfico XXI . são projetadas as quantidades de antígeno necessan.as para 50% de hem6lise qaando s8ro não diluido . está presente com três. , seis. , nove e doze unidades de . complemento. ;

'GRÁFICO. 'XX

Efeito da 'concentração de- lecitina no antígenos8bre o título do .8ro· (p,.o toco lo XIV). j

12

9

< .. IIJ

, 6 ANTlsENr:>' TITULO DO SORO

HA"5 ü-D. K! 8 IA ClllNADO TS =

% ~ saro

0,05 • • a325 0,10 ' O e 1625 0,15 • o 1825

I

15

ml x 10-4

PROTOroLOXYI.

ANTfcENOS

HMC;..2 7 W.K . K • . •• 11 lf . K.J[ .. · + 28 ~6B) 28 (OB) DIL • . leci'\ina leoitina total repreoh) • .

lTli'IPAD~S DE COt.fPLi:I,{i:NTO

2 B 6 2 8 e ~ 8 6 2 8 6 2 8 6

1 o o o ~5 ~~ o 55 ~5 o o 40 ~5 lO 80 60

1 oP e" o ~O o BO a5 o ~5 ~o o o ~~ ~o 85 815 215 15,,9 HS ~O o ~6 ~o o 65 100 o ,25 s.e 1.0 eo 100 o 10 15 215 o 65 80 o 6/5 100 o 40 "5 o 60 100 o 16,'7 15 50 o 46 80 o 60 100 o 45 ~5 20 60 100 O 150 .0 100 ~oo 60 100 "0 eo 100 20 "5 100 100 el5 100 100 100 "5 100 ~OO '70 100 100 eo 100 415 '715 100 100 el5 100 100 H5'1 '70 100 ~OO ~O 100 100 60 100 85 80 100 100 "0 100 100 500 80 ~OO 1100 ~5 100 100 ~/5 . 100 100 90 100 ~OO "0 100 100

DO OOVPLJ:)(IllfTO 00)( : DO sOa0 COVt DAS H.VÃOIAS 1 U 2 U 8 U 1 U 2 U 8 t1 SBlfSIBILIZADA8

15 80 100 155 100 100. 0%

An t (geno. e.peri.en todos : I

HMC-'11 = E.tra,ão co •• istura 6gua (10)" 6lcool (5) ti lte,. (3) ; preci­pitação p.la ccetona. l O pp • . 1 diluido e. cfpa. r,,-precipi.tado p.la ac. tOlla • Nce1. ; Euc pr.cipi tação I V-tlp. tida w6ri ta •••••• . O antígeno I então diluído •• cfpa • centrifagado a 5. 000 rp •• : por 1 hora. ; I.otoni.ar. ;

28(OB) = t ° antígeno aqu,o,o , · e.traCdo por ebulição •• 6gua a (total) 100·C" d. baci lo. pr~.ia.ent. tratado. p.lo . ac.tona. ; ' o •• tra·

~ to total" co.o d •• cri to e. cap Crulo lI .. ,i !8(OB) = t o antígeno 28(OB) repr.cipitado e purificado coa0 (rtl'p) du,·

crito e. capítulo 11 • . : r.J.K. ; := t o an t (geno d. WI.TEBSKY, · KLINGENSTIIN • IUHN. pr.parado d ••

•••• as célula. (lote Tb 48189). ;

OBSERYAÇÃO: '

o. tubo. co. 2 " 3 unidade. d.e co.ple •• nto .ão o. contrr8h, do ... tC~ seno. ; O tubo reação I fei to coa 6 un i dade, d. co.ph .... to. j

;.,'

,62

PR07000LO XVII.

Comparação de antígenos em testes co. 6 unidades decomplellento

ANT í GENOS

O IL W~K"K.~AP HA-5 ~AA 28 (OB)-8 28 (OB)~l

UNIDADES DE COMPLEMENTO

1: 2 a 6 2 8 6 2 a 6 2 8 6

1 o O 16 o 10 O 36 95 O 85 100 100

1,67 O 15 20 o 10 O 36 86 O 86 100 100 6,0 26 70 30 O 10 O 30 85 O 75 100 80 10 30 90 20 O 15 O 35 96 O 80 80 55 HI,7 25 90 15 O 15 O 35 10e 30 60 100 86 50 35 100 15 15 55 o 40 100 100 45 100 100 100 45 100 90 25 100 20 50 10e 100 60 100 100 187 36 100 100 25 100 20 50 toe 100 60 100 100 500 80 JOO 100 aO 100 100

,

CONTRÔLES

- -

DO COMPLEMENTO COM: DO SÔRO 322 OIL, A 1:5 EM DAS HEMÁCIAS St\RO N'ClA1IV..Q.. - SENSIBILIZADAS

1 U 2 U 3 U 1 U 2 U -_. -

15 80 100 45 100 0% _. __ . Os tubos com 2 e 3 unidades contlm complemento e antígeno e corres­

pondem ao contr8le do poder anticomplementar do ant(geno.

ANTíGENOS EXPERIMENTADOS:

HA- 5-AA

28 (OB)

28(OBj-1

f o antfgeno WoK.K. preparado com material obtido ap'ós a

extração dos bactlos com a mistura álcool-éter-água.

É o antígeno aquoso precipitado por acetona em meio ác:do. Bacilos extraídos com a mistura álcooL,. éter,. água.'

É o extrato aquoso obtIdo por extração em água fervente. Prectpitado pela acetona e (I precipitado tratado pela piridina.;A parte solivel é 28(OB)-S.

É o antígeno como preparado anteriormente, porém é a parte insolivel em Plridina.

Todos os antígenos foram lec~ tinados a 0,05 p.do método lI •. ;

PlmOOXiJ'XVIII

Comparação de antígenos em testes com 6 unidades de complemen.to

"'"""-"--~->-..,...

ANTfeENOS

DIL: BWA-28 HA5-WA WKK-A WKK-P UNIDADES DE COMPLEMENTO

1: 2 3 6 2 3 6 2 3 6 2 3 6

1 20 '70 O O 80 O O O O O 10 O

1;8'7 20 80 O O 80 O O O O O 15 O

5,0 20 '75 O O 80 O 25 60 O 20 65 O

10 80 80 O O 20 O BO '70 O ,20 '75 O

16~7 BO 85 O 15 40 O 80 95 O BO 90 O

50 45 90 O 85 95 O '70 100 O 65 100 O

100 50 100 15 50 100 '75 65 100 85 40 100 55

16'7 60 100 100 85 100 100 60 100 100 45 100 100

500 '70 100 100 '75 100 100 60 100 100 60 100 100

OONTROLES

DO S6RO 322 D Il.! ~ A 1:5 EM DAS HE:MÁCIAS DO COMPLEMENTO COM: S()RO NEGATIVO SENSIBILIZADAS

1 U 2 U 3 U 1 U 2 U .~.

10 85 100 55 100 0% - ---

o antígeno foi diluido em solução salina boratada.

I ANTt8ENOS EXPERIMENTADOS

BWA-28 '2 o extrato com água., ál:coo l., éter debaci los pt~'IJ~amen te ex· traídos duas v2zes com água fervente por uma hora.

HA5-WA 'l um extrato semelhante preparado de bacilos. antes da fervura com água.

WKK-A WKK-P

t o an tígeno de WITEBSKY. sem l eci tina

t a parte soliveI em piridina, mas reprecipitada várias v~zes pela acetona e cloreto de s6dio.

O s8ro de lepra n·322 foi empregado na quantidade de 0,05 ml da diluiR ção a 1i6 em ~8ro humano negativo.

Os tubos com 2 e3 unidades de complemento correspondem ao contr8le da ação anticomplementar do antígeno"

64

C 'A P f. r U L o XI"

FATORES DE CONVERS~O PARA O SISTEMA L~PRA.DEFINIÇ~O DE h DA RELAÇ~O LOGíSTICA DE VON KRoaH~ DEPEND~NCiA

DA PERCENTAaEM DE COMPLEMENTO ,FIXADO.

Quando um novo sistema é padronizado pela técnica quantitativa de fi­xação do complemento de WADSWOR77I. ,MALTANER ' e 'MALTANER. , é nece •• bio ter o conhecimento do comportamento de grande nÚàero de 'soros coa o .ntileoo estudado, em relação não s6 1 capacidade fixadora mas t .. béa e. ~el, .ção ao modo como a reação 'se processa. '

Os protocolos apresentados ea nossa experi3ncia , acumulad~ .ugere~ ser possível o emprGgo de uma dose única de ' antígeno , (do.e :d. ' reati.i­

:dade paralela) para , reações com três, seis, noye e doze unid.des de coa. pl emento. '

As curv~s de isofixaçio sendo prlticamenteassíntotas ao eixo do ao! tígeno. permite o uso de uma dose não crítica de antígeno, mesmo em excesso. ' Essa quantidade de 'antígeno produzirá reações ' .áxi .... ',co. as doses de complemento empregadas, desde que 'sSro 'seja diluido conyeni­entemente. '

Se 'então tomarmos antígeno es8ro nas quantidades capazes de dar um. reação máxima e variarmos as quantidades de complemento presente inici­.lmente na re.ção, . as hem6lises resultantes traçarão uma curya aiga6ide característica. quando se projeta complemento contra he.6Iiae. '

Easa curva 'sigm6ide de resposta p'oderá ser retifi 'cada em papel 10lito de hem6lise-Iogarítmo de complemento: ' a linha de regressão assim traç~d. pbderá ser estudada para :a determinação dos 'seus parametros. '

, Se x é o número de unidades de ,complemento e. ua determinado tubo de reação e y o grau de hem6lise observada, a relação entre x e y é dada pela relação' de 110n KROGII, (1916):'

log ~ = log K + h. ' log (y/l-y)

onde h e K são parametro •• '

Quando ,a hem6lise é de 50% (y :: 0,5). x = I, isto é: 1 K representa o número de unidades de complemento necessárias para 50% de 'hem61ise e to~ ma designações diferentes segundo ' as condições em que o teste é feito. ' Assimna ,dosagem de complemento em presença de ' solução 'salina e sem in­cubação preliminar a quantidade de complemento necessária para 50~ ~e hem61 ise é considerada uaa un i,dade de çoap leaen to e desi snada por lo; segundo a nomenclatura proposta por 771011P::vN ET ALo j (1949). ,

O número de unidades de complemento necessárias para 5~ de hem6liae em presença de antígeno e anticorpo e depoi~ de incubação preliminar' designada por K'~;A' K's,A ou K'S.a conforme as proporções relatiya. entre ' sSro e antígeno. ' I

A outra constante paramétrica da linha de regressão é a sua incliná­çio h que é dete~minada com o quociente: '

L:l. log x h =

~ logito y

Num mesmo sistema, as linhas de regressão traçadas para diferente. quantidades de complexo antígeno-anticorpo, podem ser paralelas ou não. '

Se ' são ~aralelas, um único valor de h seryirá para o cálculo d. qU8D~',

65

tidade de complemento necessária para 50% de hem6lise, sen40 conhecido o núMero de unidades de comp-lement,o inicialmente presente e a hem6lise re­sul t"lDte.' ,

Em outros sistemas (sífilis e tuberculose) não existe paralelismo en­tre as linhas de regressão. sendo que as suas inclinações dependem d. quantidade de complemento . I

h '= I(l t )

A determinação de K' poderá ser feita grlficamente se conhecermo. dois pontos: i

e

obtidos 'experimentalmente , quando 'sujeitamos o mesmo complexo fixador l duas quantidades ,de complemento, xi e x2" '

Os dois pontos estarão sSbre uma reta que cortará a ' abcissa ~ de hem6lise, determinando no eixo das ordenadas o log~ ' de K'. '

Para qu~a t6cnica de fixação do complemento possa s~r praticada em grande , número de '80ros é necessário que a determinação de K' posaa ae fazer por um único 'ponto dehem6lise parcial, flcilmente' ob,tido co. pou­cas :diluições de ' sSro.'Nessas ,condições é nelessário 'se 'ter o conheci­mento do valor de h fara o sistema em ' teste. 'Esse valor deh seria. mé­dia dos valores obtidos em umaséri~ ' de titulagens naa quais ae manti­nhamconstantes todas as condições (volume • . temperatura, concentração de antígeno, número de unidades de complemento) variando apenas o 88ro. ' '

Se ,a reação fOT feita com x unidades de complemento, 'o conhecimento de h nos permitiria resolver o seg~inte problema: '

Se coa % unidades de coapleaento. , a hea61ise foi de 1. ' quantos unida­des serão ne'cesslÍrias p'ara 50% dehea61ise?

Conhecido o valor de h', para estipul adas condições e para ua .es.o sistema de fixação do complemento, ,é possível a construção de ' tabela. que noa dão direta'mente .a ' quantidade de complemento necessária para 5~ de ' hem61 ise • .

A determinação 'dêsses ' fator •• de conversiose faz sujeitando o mea.o complexo antígeno-anticorpo 1 diferentes 'quantidades de complemento. O complemento que 'sobra da fixação havida produzirá certo grau de hem61i­se. ' As hemólises ' obtidas descrevem uma linha sigm6ide de resposta, que retificada por projeção logito-Iogarítmo, ,nos permite o cálculo do valor de h . para o 'sistema em experiência. '

Os valores de h "variam de 'sistema para sistema e no mesmo sistema, segundo 'as condições da incubação préliminar, a quantidade de complemen­to inicialmente presente e também do tempo durante o qual a hem6liae ae processa." Dessa forma ' torna-se necessário ,levantar tabelas de fatorea de , conversão para cada uma das ~uantidade. de complemento utililadas~ a partir de valores médios de h obtidos em uma série de dos~~ens feita. exatamente nas mesmas condições, com s~ros diferentes. '

Esta é , a part~ mais ~rabalhosa da técnica de '.11.11. ," exigindo nuaero­sas dosagens e grande cuidado no' cSmputo dos dados obtidosl ' No ' entanto, uma vez preparadas as tabelas para um determinado sistema, o trabalho necessário para se fazer uma reação é pequeno, pois a adição de hemáciaa sensibilizadas diretamente ao tubo de reação permite conhecer" pela he­m6lise resultante, ' qual a quantidade de complemento que seria nece.sária

66 ,

para 50% de hem6lise, calculando-se o título com o dado obtido. Como a quantidade de complemento é sempre calculada por extrapolação,

por meio da função logística de von KROGH, o conhecimento de h para cada um dos sistemas de fixação do complemento (sífilis, tuberculose, lepra etc.) assume importância capital na determinação do título do sôro pela técnica quantitativa de WADSWORTH, MALTANER e MALTANER~

A técnica quantitativa de fixação do complemento proposta por MAYER, OSLER, BIER e HEIDELBERGER (1948) exige a dosagem do complemento depois da incubação preliminar, para a determinação da quantidade de complemen­to livre. A quantidade de complemento empregada por êsses autores é em excesso relativo à concentração do complexo antígeno-anticorpo a ser formado. As curvas de dosagem do complemento livre mostram um valor de h em redor de 0,20 para diferentes sistemas investigados. O uso de uma única tabela de fatores de conversão, contribuiria para a simplificação e padronização da técnica quantitativa de fixação do complemento.

A diferença entre a técnica de W.M.M. e a de MAYER ET AL. é essenci­almente a seguinte: na técnica de W.II.M., a fixação do complemento vai de 48% à 93,5% respectivamente com 3 e 12 unid~des de complemento; na de MAYER ET AL. a fixação é de 50% do complemento inicialmente pre­sente. Enquanto na técnica de ALBANY (técnica de W.II.M.) se exige q~e uma unidade de complemento seja deixada livre para hem6lise de 50%, no método de MAYER qualquer quantidade pode sobra~, pois a titulagem do complemento evidenciará por diferença, a quantidade de complemento fixado •.

No capítulo I, definimos h segundo as duas escolas de fixação de com­plementoo Para W.M.M. h se refere à inclinação da linha de regressão lo­garítmo de.co.ple.ento inicial.ente presente contra logito de hem6lise; para MAYER ET AL., h toma o significado original dado por von KROGH (1916), como a inclinação de uma linha de regressão obtida projetando voluae. de mistura sSro, antígeno e complemento, contra logitos de hem6-lise.

Enquanto a primeira faz a dosagem do complemento em presença de quan­tidade const6nte de complexo fixador do complemento, a segunda faz a do­sagem de complemento, diluindo uma mistura de complexo fixador com com­plemento.

Quando quantidades variáveis de complemento reagem com um mesmo com­plexo antígeno-anticorpo, as hem6lises produzidas pelo complemento deix§ do livre descrevem uma linha sigm6ide, que retificada nos deu os seguin­tes valores: h= 0,08 e K's,A = 10,0 (Protocolo XIX).

Se no entanto em tubos duplicados e em volumes maiores, em vez de adicionarmos hemácias sensibilizadas diretamente ao tubo reação, fizer­mos a dosagem do complemento residual (técnica de MAYER ET AL.), obtere­mos diversas curvas hemolíticas das quais podem ser calculados os valo­res de h e da quantidade de complemento fixado. O quadro V mostra os va­lores encontrados, utilizando sôro de lepra e antígeno HA-5 lecitinado a 0,05%.

Verificamos que em cada tubo de reação contendo a mesma quantidade de complexo antígeno-anticorpo, a fixação do complemento se processa de acSrdo com a quantidade de complemento inicialmente presente. Com maio­res quantidades de complemento, a fixação é maior em número de unidades, porém a proporção entre complemento fixado e o presente é cada vez menor (no quadro V, observar que foi de 93% para 76%, respectivamente quando

8~8 e 12,2 unidades de complemento estavam inicialmente presentes). '

QUADRO V

Valores de h ea fi%ação de coapleaento no sisteaa lepra, quando o aesao coap le%o iaune reage coa diferen t,es quan­tidades de coapZeaento • . ;

UNIDADES DE COMPLEMENTO T U B O

HV PRESENTES LIVRES FIXADAS FIXAÇ~O %

1 12 .. 2 8 .. 0 9,2 '76 0,24 2 11,4 2,8 9 1 1 80 0 1 2'7

8 10,'7 1 .. 9 8,8 82 0,28 4 10 .. 0 1 1 8 8 1 '7 8'7 0,29 6 9,8 0,94 8,4 90 0,8'7 6 8,8 0 .. 61 8,2 9? 0 .. 40

° complemento residual poudeser dosado e as curvas hemolíticas mos­traram inclinações bastante aiferentes, de 0,24 .a 0,40. ' Pela técnica de MALTANER o valor deh foi de 0,08. ' .

Os dados sugerem que para menorpercenta*em defixaçio o valor de h tende para o normal de 0.20,! 0,02. , ° complexo fixador alteraria quali e quantitativamente o , complemento prese.nte' e essa al teraçio é tanto maior qu'ando mais complemento é fixa­do. ' Quando h' excesso relativo de compl emento, . a al teraçio qual i tati va, embora presente, nio seria suficiente para alterar o valor de hV' até uma fixaçio em redor de 50%. ' Quando h' maior fixaçio, mesmo aplicando a técaica de MAYER ET AL.; · a alteraçio de hV é evidente. '

Quando se sujeita o mesmo complexo fixador 1 v'rias quantidades de complemento ese mede a hem61ise ' produzida pelo complemento residual, diretamente acrescentando hemácia's sensibilizadas 1 mistura-reaçio, ape­nas estamos fa~endo a determinaçio de um ponto em uma curva hemolític. ° quadro VI. mostra as hem6lises parciais obtidas em uma série de 4 tubos (protocolo XIX). ,

...

Q U A D R O VI.

VaZoresde h% e hV ea presença da aesaa quantidade de coaple%o fi%ador e coa diferentes concentraç3es de coapleaento. j

U B O HEMdUSE% UNIDADES DE COMPLEMENTO

NQ PRESENTES LIVRES FJXADAS Hx HV

8 90 10 .. '7 1 1 9 8,8 0 1 08 0 .. 28 4 70 10,0 1,8 8,7 0 .. 29 6 46 9,8 0,94 8,4 0,87 6 20 8,8 0,61 8 .. 2- ' 0 .. 40

. ,

A rqla9ã o ent~e os dois valores de hx e hV pode melhor ser apreciada (no grafíco XXII) ao estudar.os o protocolo XIX, descrito com todos os detalhes .. em vista da aparente complexidade do assunto. '

68

A ' e"perilncia destina-se ' a aostrar nos aesaos ' tubos" ao ae.ao teapo, o significado de hx e de hV~ ' coa0 definidos rupectiv""ente por ·'.!l.,. ; e por MAYER ET AL. i

PROroroLOXIX

Ea tubos de 15 " 150, aa'for"" aiBturad08:'

Antígeno HA-5 1~!l.0 SSro 8954 dil. a 1:25 Complemento (*) Solução salina

i,o ai 0,5 ai 1,0 aI 0,5 aI

(-) For"" aontados 6tubQs" co~ as s,pint.s quantidades de coapleaento ea unidades por 0,1 aI:, 12,2, , 11,4,,10,~, 10,0"9,3 e 8,80

For"" aantidas . as aesaasproporçõuu ti Zhadas na tlcnica de r.,.,.;, assia coa0 o voZuae relativo de cada uados .lea.ntos pr~viaaente ' testa';' dos ' ea prova preliainar. ,

O complexo antígeno-anticorpo formado nas pr~porçSes indicadas tinha­sido capaz de fixar 10 unidades quando 12 estavam presentes. ' Depois da incubação .preliminar de 90 .. inutosa 37·C, e.banho-marià, . pipetamos ' di­versos volumes até um 'mbimo de 0,3 ml em túbos de 12x75 ... j::ompletado o volume para 0,3 .1 com salina, 0,2 ai de hemácias sensibilizadas foram ' juntadas.' Depois de 15 minutos de hem6lise, a 37-C, os tubos receberam 1,0.1 de 'salina gelada e foram lidos em fot8metro, ' depois de centrifug, dos. ' '

O quadro VII mostra os resul tados obti,dos.' O tubo contendo 0,3.Z ~a mis~ura corresponde exatamente :lquele mon­

tado para a determinação dos fatores de conyersãopela técnica de '.'o.oj e ao mesmo tempo faz parte de uaa curva hellolitica que mede o comp,lemen­to livre (técnica de MAYER ET AL.)o j

A curva hemolítica dos fator~s de conversão é formada pelas hem6lises parciais obtidas com .cada um dos tubos contendo 0,3 aI da' mistura (cur­va A do gráfico XXII.). , Convém lembrar que assestub,osse diferenciam apenas pela quantidade de complemento inicialmente presente; ' cada um dê~ les, por sua vez, faz parte de umacurva .da qual Ileé o tu-bo que contém mais complemento livr'e, por ter o maior volume (0,3 aO." Cada uma des­

'sas curvas de dosagem do complemento , residualest~'repreaentadà nográ-fico XXII , (curvas B, C, O, E, F e G).,

As curvas hemolíticas de B a G (gráfico' XXII ,) obtidas pela projeção de logarítmos de volume da inistura antigeno, ' anticorpo e complemento,­contralogitos de hem6lise, possuem inclifiaçSes (hV> de valores difer~n­tes, _tanto maiores quanto maior éa percentasem de fixação de complemen­to.'Quando as condições da reação permitem 'sobrar ' complemento auficientÉ! para toda a curva hemo}-ítica, a determinação da quantidade de complemen­to livre pode ser feita diretamente (curvasB. ,C,!O e ' F); outras vlzes necessita ser calculada pO'J' extrapolação sráfica (curvasFe G). ,

Como acabamos de ver, não 'se pode comp~rarhx com hV pois são para­metros de curvas traçadas em diferentes condições; hx tem come numerado~ 610g de compl~mento inicialmente presente; hV tem como numerado,rAlog do volume da mistura da reação que contém ainda complemento livre. ' Ambos os quocientes têm o mesmo denominador que é Alosito de hem6liae.' .

Em determinadas condições hx = hV. ' Ness. caaoo observador tem que

dar condições para que a fixaç ão do compl emen to não vá aI ém de 50 a 60%. Dizer que a técnica de MAYER, · OSLER,·J}IEReHEIDELBERGER (1948) se

utiliza de uma grande quantidade de complemento é não dar ~nfase . ao ' seu car~ter de exigir uma fixação de complemento em proporção que não altere a constanteh~ ·do . complemento • .: t realmente . ~s8e ponto que BIER, · SIf1.lElRA e FURLANET'IO \1955) definem quando dizemClalim ·disso,. condições fora. es­tabe lecidas para a sallU tenção de us valor cona tan te para0 expoen te i/n na equaç io de 1I0n 'KROGH~ , assim persi tindo O · uso ' de uma ún ica ' tabe la de fatf>res de conttersão para o cálculo da atividade hemol'Ctica de C'." J' na técnica de W.'oM. ; outras condições são estabelecidas ' par~ dei­xarsempre livre uma unidade de complem.entoj como a técnica .de W .. " .,. emprega maiores quantidades de complemento que a técnica de MAYER ET AL. a fixação tem que ser levada a efeito em graus variados, de :acôrdo com o número de unidades. de complemento inicialmente presentes; ' assim quando a reação é feita com 12 unidades de complemento, afixação tem de ser le­vada a efeito até consumir 11, ou seja c~rca de 92%. ' Os valores de hx são portanto alterados e os fatores de conversão pela técnica de W.M.M. são construidos para diferentes concentrações de complemento e para os diversos sistemas estudados. '

FA'IORESDE CONVERSA0 PARA LEPRA

'Utilizando a técnica desaita por '.11.11 •. ; Oga8) e calculando os dados obtidos pelo' método de lffOMPSQN e MALTANER" 19~"determinamos os fato­res de conversão para o ' sistema lepra. ,

A tabela 11. nos dá diretamente o valor de K~s A quando se conhec~m o número ' de unidades de complemento inicialmente' pr~sente e .a hem6lise re­sul tante. ' ° gráfico XXII. ilustra umnomograma construido segundo THOMPSON e MAL TANER (1940). '

Quando fazemos a determinação de hx para obtermos valores médios a serem utiliiados no cômputo dos fatores ·de conversão é 'de grande utili­dade .emnregar uma ·.série de diluições 'de complemento, formando uma série geométri ca de concentrações. '. Na . técnica de '. '.JI.II. ;j emprega-se o fa tor 0,9, isto é - cada tubo contém {tubo na ordem ascendente» tomando o mais concentrado como n e 1)0,9 do compledlento contido no tubo anterior. ' ° c'lculo de .hx pode ser feito por método gr'fico, mas é preferível empregar o método dos quadrados mínimos. '

Êsse método pode ser aplicado com o mínimo de comp:u,tações e cálculo, empregando ~ tabela construida para :a determinação de hx quando :a pro­'gressão 0,9 de complemento é usada. '

Para o cálculo não precisamos mais que observações seriadas. , A posi­ção do tubo na série geométrica nos informa 's8bre a 'c-oncentração do com­plemento, mas para efeito da determinação de hX1 sua posição não tem in­fluência pois as diferenças entre os logarítmos das concentrações 'são iguais • .

OBSERVAÇÃO:' a técni c;l original empregada por"ADS'ORlff~ ·'MALTANER 'E MAL­TANER para o preparo de soluções de coapleaento, , foi substi tuida por ou tTa que faz -as so luções A parti T do comp lemen to não di luido. i isse "itodo tem a van tagem in tr'(n8e-'i:a~: . de não propagar geos~tri casen te er­ros de pipetages proveniente de tubos anteriores. i No exesplo do qua­dro VII .; , as so luções de comp lemen to ' empregadas foram preparadas man­tendo-se porés a progressão geosétrica de razão 0,9. ' Exemplo:

10

Q U A D R O VIII

, DETERMI NAÇÃO DE HX' EMPREGANDO A TABELA I NUMERO DO TUBO

DE COMPLEMENTO HEM6LISE % x'v' V'

V (T A B E L A I )

1 65 545 545 2 55 962 481 3 25 846 282 4 15 . 740 + 185 +

N = 4 ENTÃO a = -80,8 b = 2,5 3093 1493

Aplicando a f6rmula: ·

h = L X'Y' · ..i.I: y'

h = -80,S

-----------= 0,126 3093 2,5(1493)

Q UA D R O VII ,

VOLUIlBlS DA' lU S-H~VÓLIS~ - ~ liOS TUBOS COIrT •• OO: COIlPLDBIrTO:

, 12 .. 2 I 11,4 10,'7 10,0 I 9,8 B,8 TURA ANTIGENO, ' ANTICORPO Ji: COM CURVAS N~S

~LBlIl.NTO B C D E F G

0,0'7 22-28 0,08 82-81 0,09 42-45 0,10 ,51-52 2'7-2'7 15-18

_0,11 62-62 88-86 0,12 '70-'72 45-45 2'7-24 0,18 77-'78 52-49 0,14 88-85 ,5'7-58 86-8'7 0,15 87-8'7 66-64 0,16 '70-'70 47-47 28-28

0,18 '78-9 O 80-80 82-80 0,20 85-85 69-8'7 40-40 24-21 8-8

0,22 '78-'74 46-48 2'7-27 11-12

0,24 80-80 57-66 80-;.82 18-16

0,26 88-84 61 8'7 14

0,28 8'7-8'7 66-6t5 40 20

0,80 88-90 '70-72 44-~ 2~21

'" A I

OBSERVAÇÃO: I

A curva A é obtida pela projeção dos logi tos -de hea6lise obseruada -nos tubos contendo-O,3 al da aistura, · contra os logar(taos do coapZeaen­

to inicialaente pruente (fler gráfico XXII). :

f XIII GRA FI CO

1 o Cft

\ \ J

\ \

\ o CD

\

~ \

o ... ..J

\ )-

e

\ o

t- CQ W

&&.I

\ o

D::: \ o --- - li')

w o )- t-e o ~ .. C!t

o -'

11.1 11.1

o o o Jf)

e e o o

z o z (\01

o o '11.1 'w ... ...

J o -li) N !l .9 4D

---.x '9 O 1 -·'10" '9 O 1

73

T AB E L 'AI.

Cálculo de 'X.'f,' e f.' quando % vana eM série georiétrica q = 0,9

x' (Nº 00 TUBO EM

1 ~ -~ 8 4

y% Y'

10 114 114 228 842 465

15 185 185 8'70 . 555 '740

20 288 288 4'76 '714 952

25 282 282 564 846 1128

80 821 821 642 968 1284

85 855 855 '710 1065 1420 40 8~8 888 '7'76 1164 1552

45 419 419 888 125'7 16'76 50 450 450 900 1850 1800

55 481 481 962 1448 1924

60 512 512 1024 1586 2048

65 545 545 1090 1686 2180 70 5'79 5'79 1158 178'7 2816

'75 618 618 12~6 1854 24'72

80 662 662 1824 1986 2648

85 '715 '715 1480 2145 2860

90 '786 '786 15'72 2858 8144

X' é o número do tubo menos uma cons· tante arbitrAria de · modo que os Vi lores de , X' são simplesmente nÓme­ros de uma seqüência natural. '

Y' = 851,,90516'7'7(li278'7586+1og(y;'1-y»

! ;;' .I: X,2 - r C x' )2/N.--16,,10

~=L:X'/N

N = número de observações (tubos)

5

X'Y'

5'70 925 1190 1410 1605 1'7'75 1940 2095 2250 2405 2560 2'725 2895 8090 8810 85'75 8980

SEQÜ~NCIA NATURAL)

N

8 4

5 6

'7 8 9

10

6

684 1110 14 28 1692 1926 2180 2828 2514 2'700 2886 80'72 82'70 84'74 8'708 89'72 4290 4'716

'7 8

'798 912 1295 1480 1666 l Ç'0 4

19'74 2256 224'7 2568 2485 2840 2'716 8104 2988 8852 8150 8600 886'7 8848 8584 4096 8815 4860 4058 4682 4826 4944 4684 5296 5005 ,5'720

5502 6288

..... 82,2 ·

-80,5 -161,0 -281, '75 -450,8

-6'76,2 -966,0

-1828,25

9

1026 1665 2142 2588 2889 8195 8492 8'7'71 4050 4829 4608 4905 5211 5562

.5958

6485 '70'74

2,0 2,5 8,0 8,5 4,0

4,,5 ,5,0

5,5

10

1140 1850 2880 2820 8210 8550 8880 4190 4500 4810 5120

.5450 5'790 6180 6620 '7150 7860

20

12

9

6

2

0,5

N

NOMOGRAMA DA FUNCAO SISTEMA LEPR )

L O G. K = L OG. X - F(KLLOG(Y/I-Y)

~

~

I'--.........

r---

r---

10

\ ~

'" ~ ~ :----i"--

'-..... "'- ......... i'---~

.......... i'--. r---t'-- r--.. r-r--r--... r--.. r---

......... i'--.

~ r--- ............

'" r--r---

r--....... l"- r--. r---. t--.. ........ r-- r---. r- r-- I--r--r--

r----... r-... i'--. I'-- r---. r-- -r-- r---. r---.. r- r-.. r-- t--. ~ ~ r-. I'-- t- t- I'--

r-- r---. l"-r--.......

f"--~

~ r----... r-......... r--.. I'-...

~ ..........

......... ........

i'-t'...

.......... ~

"-.. ~

"~

2 O 30 40 5 O 60 70 80

LOGIIO De; x

"\

90

-~ t------;

. (!)

o -'

, GpoS t SO XV,,'

T A B E L A {I.

Unidades de coaplemento (K's,A) necessárias para 50% de hea6lise, indicadas pelo graQ de hea6Zise obtido quando se eaprega. as seguia tes quan tidades de comp leaen to: I

CQ"'TP RÔLE 00 SORO REA.QXO COll SORO E A.NT!GENO

IRBlWÓLISE % 1 2 8 6 9 12

10 1,42 2,66 8,96 8,9 19,0 29,0 16 1,82 ~, 62 8,'70 '7,9 18,9 21,0

20.' ;... . 1,26 2,42 8,61 '7,4 12,1 le,O 26 1,21 2,a4 8,40 '7,0 11,2 15,5 80 1,15 2,24 8,80 6,'7 10,5 14,8 85 1,10 2,20 a,20 6,5 10,0 18,6 40 1,0'7 2,14 8,14 6,8 9,8 18,0 45 1,04 2,08 8,08 e,2 9,4 12,5 50 1,00 2,00 8,00 6,0 9,0 12,0 55 0,96 1,94 2;94 5,8 8,'7 11,'7 60 0,92 1,88 2,86 5,'7 8,4 11,8 65 0,88 1,88 2,.80 5,5 8,2 10,9 '70 0,84 1,'76 2,'72 5,4 '7,9 10,6 '75 0,'79 1,'70 2,64 5,2 '7,6 10,8 80 0,'78 1,aa 2,66 5,1 '7,8 9,9 86 0,66 1,58 2,42 4,9 '7,0 9,6 90 0,5'7 1,42 2,26 4,'7 6,6 9,0

OBSERVAÇÃO: '

O. "aloru de h" aidios para 1, . . 2, . 3~ 6,.9. e 12 !:'ni'dadu de co.ple­

.,nto sOo respecti"a.ent' 0,176-0,130-0.126-0,124-0,146 e 0,180. :0. dois pri •• iro. :foraa deterainado. coa0 contraZ,. do ent·Cs.no • . :

•

C A P f T li L O XII

, ESTUDO COMF' 'IRt, r I \lO Clt: ANT! Gi-'NOS, M~JODO f)E ANÁL! SE

S~QU~NCIAL PfRA o SIST~MA LEPRA.

o antígeno depois de preparado deve ser afe~ido com outro tomado co­mo padrio. A reproduçio do antígeno é uma exig~ncia para que resultados de reações de fixaçio de complemento possam ser reproduzidos e ~ompara­dos.

O antígeno soJ6veJ em piridina c em benzo] possue, como vimos a~

teriormente, certas ca~açter{s~iças que pe~mitem tom'-lo como um antíge­no padrãoo

Para melhor estandardizHC~o do sis~emd. seria de toda a conveni~ncia

conservar soros de pacienteb cuidadosamente estudados. Os soros poderiam ser mantidos, Jiofilisados, distribuidos em pequenos volumes~

Outros antígenos serlanl comparado.:; com o antígena 'padrio; devem mos­trar igual comportamento com os soros testados, sendo permitida no en­tanto pequena discrep~ncia, nio maior que 16%. O prablema consiste em fazer essa comparaçio ~om o menor n6mero de reações e enfrentando peque­no e conhecido risco de DDroYa~ ou rejeitar um antigeno, injustamente.

THOMPSON (948) e MALTANER e TlfOMPSON (l948) desenvolveram métodos para serem aplicados no exame soroló~ico de antígenos à base de cardioQ lipina. O método, no entanto, pode ser aplicado com igual benef{cio a outros bio-ensaios, desde que sejam estipuladas as condições necess'rias para a rejeiçio ou a aprovação de um antígeno e sejam construidas as ta­belas apropriadas para o cômputo dos dados colhidos. Neste capítulo a­p=esentamos o método que estamos usando na comparaçio de antígenos pre­p 3 rados de bacilo da tuberculose.

O método de an'lise se baseia no processo chamado de inferancia esta­+f~tl~a. no qual nio existe necessidade de planejamento inicial quanto ao n6mero de observações a ser.em feitas; o método também não exige o co­nhecimento da forma dp distribuiçio da freqU~ncia dos acontecimentos e dai ser chamado de método nio paramétrico ou de distribuiçio livre (THOMPSON. 1949).

A decisio a ser tomada pejo observador depende em cada fase. dos re­~ultados acumulados de observacões pr~viamente feitas; entio decidir' se necessita de mais dados ou se, om os que possui. poder' tomar uma de­risão, aceitando ou rejeitando um determinado antígeno. Sua decisão en~ ,olve sempre um certo f'isco que então foi tomadr) em ._onsideraçio pel:-),' matem'tico na construçio das tabelas de an'lise seqU~ncia] e que Indicam o n~mero de observações nec~D~árlas.

Um dos W07'it~~ do método de an'lise seqU~n la] aplicado para compro­VJ~ uma cert~ condição é exigir de um n6mero substancialmente menor de observações que o n~ressário para a mesma decisio com métodos basea c

d0$ em um n~mero pr~-determlnaJo de observações.

DEFINIÇÕES E CONCEITOS

Denomina-se obBer~accio um par de resuJ~ados d? reações. Lma ~e~ção é fel!B com o antígeno padrio, a outra com o antígeno em prova. Todas as ~undlções são mantidas cons'antes. O resultado pode ser dado em t~rmos

de hem6lise parCIal, em títulos ou em graus de reatiwidBde. Uma determi­nada observação devp ser inequivocamente classificada em:

Observação defeituJ a, qua~do a dls~rcp;nciB entre os re~ult2dos é

mal.or que 0,16. ' ( ~ G >0,070). ·

Observação nao defeituosa quando a discrepância entre os resultados é menor que 0,16 ( ~ G < 0,070). '

Observação . inad.iss!vfll quando uma decisilo não pode ser feita ou por atipia da reação ou por evidente êrro técnico. '

. ~~ .

FREQfJENCIA DE OBSEIWAÇÕES NAO DEFEITUOSAS

Sendo n o número de observações (total), a defeituosas e b não defei-' tuosas (n=a+b), a freqUênci a d~ b é b/n. :: Podemos considerar que o total de n observações feitas sejam ' parte de um universo U de observações e então definimos a relativa freqliência das observações nã'o defeituosas de U por ,f>. que ' é na real idade um limi te de b/n, quando n tende para o in fi­nito .. '

Um valor determinado para ~ é porém desconhecido; sefasse conhecido, bastaria se ter um valor p estipulado e somente apróv~riamos um antígeno se ~ fSsse mairir que p; em caso contrário o antígeno seria rejeitado. '

~sse critério, no entanto, não pode ser usado porque o verdadeiro va­lor de p é desconhecido.MALTANERe THOMPSON (1948), estipularam porém dois valores p' = p " e aceitam o antígeno quando não há mais que 2% de risco que p seja menor que p' e o rejeitam se o risco não ~ maior que 2% de se ter ~ maior que p". '

A tabela ' IVindica os valo'res de p' = 0,75 e p" = 0,85; . assim acei­tamos um antígeno quando não há mais de 2% de risco de que ~ seja menor que 75%e o rejeitamos se não há mais que 2% de risco de . achar-se ~ maior que 85%. ' Se com o número de observações {eitas não pudermos deci­dir, continuaremos a acumular mais observações. ,

A tabela IV nos dá -a primeira oportunidade de alcançar uma decisão; a. rejeição doant l genoé final, mas a aprovação depende do número de ob­servações a serem feitas e dep~m de dos valores es~ipulados para p' e p". : Para p ' e p" respectivamente iguais a 0,75 e 0,85, o número de observa­ções ,deve ser no máximo de 267 (gráfico XXIV); quando p' e p"são iguais a 0;975' e 0,995 respectivame~te, o número máximo de observações a serem fei tas é de 536 (gráfico ~';,XV). '

Os ' gráficos XXIV e XXV nos mos;t:ram qual éo limite de n;é então sem­pre possível estipular o limite de observações a serem feitas pois as duas linhas que ' separam as zonas de rejeição, . aceitação e indecisão, tendem a se aproximar uma' da outra quando n c·resce. 10 I imite <lessa apro­ximação é igual .a um, porque é ~sse o valor mínimo possível entre n'a e n"~ (Tabelas 111 e IV).

Para que um antígeno possa ser aprovado, na comparação com um . antíge­nQ padrão, o nÚmero de observações deve ser .s.uficiente para permitir que a freqliência ~ seja na realidade um dado significativo no a~tígeno em prova. ·Quandoos dados caem na zona de indecisão, continuamos a acumular observações até se ob t er ~ma decisão, sempre considerando . que a rejeição é final, mas a aceitação condicionada por um número mínimo de observa­ções. '

TESTE PARA REAÇÕES NÃO ESPECÍFICAS

Cada sôro é tes:-tado com dois antígenos: ' um chamado .Ar ou antígeno de referência ou padrão e outro At ou antígeno em prova. A reaç~o é feita em presença de 6 unidades de complemento e com a dose de antígeno achada de máxima reatividade para o antígeno Ar. · Os elementoS da reação são pie. petados nas quantidades e na mesma ordem como citados na tabela V. '

As reações corr, l"~n(); de 100% de hemólise são lidas co~n fot~meJro, co­:>:.: indicado no capítulo 111. Os tubos com mais de 90% com antígeno Ar lfld}'.am soros não reagentes; pares de testes feitos romo acima indicado, -~ paralelo com os antígenos Ar e At e que dão mais de 90% de hemólise '.um Ar são considerados observações adme ss ÍêJe; 3. Uma oL'SP'CV:l<; ão é consi-' ti.·rada defei tuosa se o gI'au de hemólise obtida com o antígeno A t é igual ou n.l'nor' que 80%: de outro modo é cl assi fieada como observação não de-/~: "'uC)::;a.

Cons~deremos n o námero de observações admissíveis das quais a é o Lúrnf,ro das observações defeituosas. A péImeIra decisão possível é feita 10 Hc~rdo com a tabela 111; após n observações com a defeituosas, acei­',,!'nos o antígeno At se n não é menor que n'a e o rejeitamos de vez, se n nio ~ maior que n"a; se não pudermos decidir, ~ontinuarpmos nossas ob­·.>rvações, até que os dados acumulados permitam uma decisão em um ou ou­t ':0 ~'p.ntido.

o ~rop6sito desse teste' ev:tar antfgenos com exce~s~va reatlvidade r.":o especrfica. Para nos guardar contra a infl·.ênria de eff'ltos de cor­>,lnção, pelo QSO dos mesmos rea~entcs, é recomendado que se façam ~ru­~0S de reaç5es, em dias diferentes. A experiencia acumulada nos estudos !~ cardioliplna mostra Que com 8sse teste poucos antígenos evidenciam .31quer observaçlo defeituosa nOs primeiros '55 pares de obnervações.

N0ssa experiência com sôro de lepra e antígenos preparados de bacilos Ja tuberculose mostra, no entanto, que muitos antígenos falham ao serem .uhmctidos a êsse teste. Assim consideramos necessária sua ap]icaç~o

r 0 1S temos tido ocasião de verificar que antígenos feitos pelo mesmo mé­~odo. podem mostrar reatividade diversa, segundo a amostra do bacilo ultivado ou as condições em que a cultura é feita. N~sse teste, os soros humanos devem ser cuidadosamente selecionados,

;j ,da a grande prevalência de tuberculose-infecção na população. Nosso ontrSle foi constituido de 651 soros de crianças entre 2 e 5 anos de

'dade, tuberculino negativas e colhidos para o contrSle da vacinação ,ntí~poliomielite de SALK. Nesse grupo obtivemos 22% de soros reagentes, d .) '"i q U a i s O, 6 % c o m t í t U los e n t r e 6 e 10 • O s i g n i f i c a d (\ dos t í t u los '.,·nc::es que 6 não poude ser a rurado, mas sugere reatividade não especí­'" J f"n t re aI guns soros humanos normai s e an t ígeno prepa rado de baci 1 o i~ tuberculose, quando três unidades de complemento sio empregadas. Os

d",rlo;; apresentados evidenciam a necpssidade de se empregar 6 unidades de 'mpJemento no teste de reatividade não específica (tabela V).

S~ros de leprosos, em forma lepromatosa, foram diluidos em saro huma­llO não reagente, de acôrdo com a tabela VI. Em tubos de 12x75mm, 0,05 ml d','ada diluição foram distribuidos e a reação Jt'ita ,om 6 unidades de ~~p!0rnento e 0,1 ml da solução de antígeno (de acôrdo com a dose indi­lU) pela curva de isofixaçãol; o volume é completado para 0,3ml com II na bora tada.

As reações são feitas em paraJelo, usnndo '!oJis antígenos, como ante­!ormcnte, Ar e At. Depois de 90 minutos de Incubação a 37-C, foram jun­ado~ 0,2 ml de hem'cias sensibilizadas; os tubos são lncubados a 37-C

~or 15 minutos; 1.0 ml de salina gelada ~ juntado a cada tubo mostrando ""I1!(Jli.;e parcial. A leit.ura é feita no sobr .. nadhnte dos tubos centri­'lg,l(j~.s por 5 minutos.

ü~ resultados das reações saa dados em t~rmos de G ou grau d~ reaç~o, d .. ' ",-ôrdo com a tabela VII, onde "a') 'd~uladas as dl1uiçõe::- ào sôro e as h.m6Jlses parCIaIS.

G para dadosôro é o valor máximo achado,. desde que não difira de ou­tro valor de 'G mais que 0,110. ' Se uma determinada reação não nos dá ne­nhum valor de 'C (como no caso de 100% de heIR6lise em todos os tubos, ou de hemól is~ igual a zero em todos os tubos, ' 0 '\1. zero num tub~ e no próxi­mo 100%) é então classificada como inadmissível. O quadro IX nos dá um exemplo do cálculo deG. j

Assim cada sBro nos fornecerá dois valores deG, um obtido com antí­geno Ar e então seráCr e outro com antígeno At e então é chamado de Gt~ , . . Os d01s valores de G formam um par ,de resultados ou .uaa observaçãoad-mi ssíveZ. ' Uma observação ad~issível é considerada defeituosa se

caso conttário é considerada não defeituosa. ;

O uso deC foi proposto por ALMEIDA ET AL. ; (1955) como equivalente ao uso de T, definido como: :

T = D . (K' - 1) s ,A

A relação entre T eG no sistema lepra é

log T = 'G + 0,568

Sendo R a discrep~ncia observ~da. Q,070 é o logarítmo do quociente en tre os dois t í tul os Tt e Tr ou en tre Ct ou 'Gr • .

A relação entre 'G e R pode ser expressa .aproximadamente por: 1

R :: 2,303 (Gt -Gr)

A substituição de T por 'Cí como proposta, tem a vantagem de simplifi­car a ' avaliação das discrepâncias entre as re'8.tividadesencontradas e dependentes de dois antígenos em prova. '

O propósito d~sse teste é verifi~ar comparativamente diferentes antí­genos, pois é indesejável ter maior ou menor sensibilidade quanto 1 rea­ti vidade específica no · ant'ígeno em tE','ste A t. i

A tabelaIY nos dá a primeira oportunidade de poder tomar uma decisão" quando conhecemos o número de observações defei tuas as ti no total":ode R observações .admissíveis; aceitamos o antígeno, quanto à rearividade es­pecífica comparativa se R não é menor que n'a; rejeitamos o antígeno de uma vez, ' se' n não' é niãior ' que R"a; caso contrário continuamos a fazer novas observações, até ser'possível tomar uma decisão.

Para evitar correlações pelo uso dos mesmos elementos na reação. fa­zemos cada dia um pequeno número de reações, geralmente de 6 a 8; para que o antígeno seja' aprovadon terá que ser igualou maior ' que 20 e para rejeitá-lo a deverá ser igual ou maior que 8.

Um exemplo da aplicação do teste de comparação de reatividade especí a

fica é dado no quadro X. ; O quadro XI nos mostra o comportamento de diversas pa:rtidas em testes

.de análise s~qU~ncial, para antígenos solúveis em benzol e piridina. ~ necessário notar a grande diferença existente no método por nós

proposto para a comparação de antígenos preparados de bacilos da tuber­culose, quando usamosuaa dose de antígeno suficiente para se obter uaa reação paralela em vez de uma diluição considerada ótima para ~ antígeno padrãoe ' . .ao

DECIS~ES NO TESTE SEQO~NCIAL DE PROBABILIDADE DIRETA PARA REATIVIDADE , . NÃO ESPECI~ICA, . INDIOANDO A PRIMEIRA OPORTUNIDADE PARA ACEITAR OU RE~EI-TAR UM ANTlGENO.

NÚME~O DE OBSERV~- • , ACEITAR SE O NUMERO REPROVAR SE O NUMERO

ÇÕES DEFEITUOSAS. DE OBSERVAÇÕES, n, ~. DE OBSERVAÇÕES, n, ~ IGUAL OU MAIOR QUE: IGUAL OU MENOR QUE:

. (ti) . (ri'~) (n"~)

. 0 11515 ----i 281 4

2 299 48

a a62 114

4 4.?1 204

5 4'79 80'7

6 586 419 ,., --- 588

o risco de uaa decisão errada. ea ua e outro sentido, é de 2% e a

percentagea de concord8ncia está entre. 97, 5%. e 99,5%. ;

. (De "CardioZipin antigens" WHO, · 1951). '

T A B E L A IV

- DEOIS~ES NO TESTE SfQU~NCIAL DE PROBABILIDADE DIRETA NA PROVA DE REATI­VIDADE COMPARATIVA PARA ESPECIFICI~ADE,. INDICANDO A PRIMEIRA OPORTUNIDA­DE PARA ACEITAR OU REPROVAR UM ANrl~ENO.

- , n" - , n" . , n" ,a na a a n a a a n a a

O 14 - 18 111 rr2 88 195 irrO

1. 21 .

19 115 rrrr arr 200 1rr6 --2 28 -- 20 120 a8 88 204 181

a 84 4 21 125 88 89 209 18rr 4 89 rr 22 180 98 40 213 198 6 46 11 28 184 99 41 218 198 6 50 16 24 189 104 42 222 204 rr 56 19 26 144 109 48 286 210 8 61 24 28 149 116 44 281 .g15 9 68 28 i 2", 168 120 46 2'86 221

10 rr1 88 28 168 126 48 .~40 22rr 11 rr8 8rr 2~_ 163 ts1 47 246 , 288

i.? 81 42 80 1M 13rr 48 249 288· ia 86 4rr 81 1rr2 142 49 29 4 244 14 91 62 "Bp 1rrrr 148 60 268 260 15 96 5rr 88 181 158 51 - 288 258 18 101 62 84 186 159 52 28rr 261 17 108 M 85 190 164 58 --- 26rr

Depois de n observações, anota.os o número de defeituosas o e deçidimos: ' aceitar o antígeno ~a pro~a 'de t~dtividade coaparativa se n nao i menor que ~'o e o rejeitamos inteiramente se ~ nao . i maior que n"o. ;

Se u.a decisao nao puder ser fei ta, ' con tinuamos a acumular observa­ções. j O risco de uaa dec1.saoerrada .é de 2% .em um ou outro sentido e a concord8nciao das observações está num inter~(llo entre 75% e 85%. j

(De "Ca rdio 1 ip in. an ti gens ". W. H. O. ' 1951). '

TABELA V

TESTE COM 6 U.N I DA D ES DE COMPLEMENTO . '

SORO HUMANO INATlVADO 0,06 0,05 . ANT í GENO Ar (DfLUIDO) 0,10 ----ANTíGENO At (DILUIDO) ~--- 0,10

COMPLEMENTO (6 UNIDADES) 0,10 0,10 SOLUÇÃO SALINA O, O S. 0,06

--

90 MINUTOS A 8rroC • . JUNTAR ENTÃO:

HetS!ÁCIAS SENSIBILIZADAS 0,20 0,20 .

15 MINUTOS A 8rroC. LER HEM6LISE % 82

T A B E L A VI.

Diluições do s8ro rea~ente

-FATOR DE DILUIÇÃO SÔRO REAGENTE SÔRO NEGATIVO

1,0 - --1,8 0,20 0,06 1,8 · 0,15 0,12

2,4 0,10 0,14 8,2 0,10 0,22

4,2 0,05 0,16 5;e 0,05 0,28 rr,5 0,04 0,26

10,0 0,04 0,86 18,0 0,04 0;48 18,0 0,04 0,68 24,0 0,04 0,92

Q U A D R O IX

Exe.plo da avaliação de '(;

TUBO . O N- DILUIÇÃO HEM6LISE % 'G (T A B E LA V I I )

2 1,8 5% ---8 1,8 80% 0,448

4 2,4 80% 0 .. 426

5 8,2 100% ---

Para o cálculo tOllar o valor lIIaxt'.o de 'G que é 0 .,443. O outro valor de 'G, . 0,425, · dife r e de 0,443 de menos de O, t10. Assia acei ta.os 0,443 coa0 ·G, · dentro das especificações de toler8ncia de discrep&ncia.

T A B E L A VII

. GRAUS DE REATIVIDADE COM SEIS UNIDADES DE COMPL~MENI0

D(FATOR D.E DILUiÇÃO DO SÔRO)

y% 1,0 1,3 1,8 2,4 3,2 4,2 5,6

10 0 ',880 0,444 O, ~85 0,'710 0,885 0,958 1,0'78

1.6 0 ·,2'71 0,885 0,526 0,651 0,'7'76 0,894 1 ; 029

20 0,288 0,852 0,498 0,618 0,'748 0,861 0,986

25 0,2.10 0,324 0,465 0,590 0,'715 0,883 0,958 .' .

80 0,188 0,802 0,448 0,568 0,693 0,811 0,986

85 0,1'72 0,286 0,42'7 0,552 0,6'7'7 0,'795 0,920

. 40 0,156 0,2'70 0,411 0,586 0,661 0,'7'79 0,904

45 0,148 0,262 0,408 0,528 0,658 0,'7'71 0,896

60 0,181 0,246 0,886 0,511 0,686 0,'754 0,879

65 0,118 0,22'7 0,868 0,498 0,618 0,'786 0,861

60 0,104 0,218 O,§.59 0,484 0,609 ,0,727 0,~52

66 ; ~,080' .0,194 ;0,885 .0,460 .0,68,.i5 .0,708 .0-,828

. 70 .0,075 .0,179 ;0,880 ;0,465 .0,680 0,698 .0,828

. 76 0,065 .0,169 0,810 , 0,486 0,660 0,678 0,808

.80 0,045 0,159 0,300 .0,425 0,650 0~668 0,798 .

.85 0,028 . 0,13'7 0,278 0,403 0,528 0,·646 0,771

90 0,000 0,11.4 0,256 0,880 0,506 0,628 0,748

OBSERVAÇÃO

o grau de reatividade é calculado como

'G = log D(K' A-I) - 0,568 s,

Para diluiç5es maiores ou igual a 10, calcula-se G" juntando-se 1,0 ao valor correspondente na tabela VII. j Assim parti!! = 13 e he"ólise = 30%, ,'C= 1,302. j

84

7,5

1,215

1,156

1,113

1,085

1,063

1,04'7

1, 0 81

1,028

1,006 .

0,988

0,9'79

.6,956

0,950

0,930

' 0,920

0,898

0,875

SÔRO

QU A D 'R OX

, COMPARAÇÃO DA REATIVIDADE DE DUAS PARTIDAS DE ANTlGENO HA-j

EM TESTEi COM 6 UNIDADES DE COMPLEMENTO E COM DOSE DE ANTIGE­NO IGUAL (1:50 em salina boratada)

DE DILUIÇ~O HEM6LISE % REATIVIDADE CLASSIFICAÇÃO

LEPRA NQ 1: Ar At 'Gr 'Gt DA OBSERVAÇÃO

86 1,8 80 26 0,802 0,824 não defei tuosa 1,9 65 ,.,6 0,886 0,810

95 10 20 80 1,288 1,188 não defei tuosa 18 45 40 1,262 1,2,.,0

80,., 1/ 6 15 20 1,156 1,11a não defei tuosa 10 65 ,.,0 1,080 1,0"'6

896 10 25 80 1,210 1,188 não defei tuosa 18 46 40 1,262 1,2,.,0

188 4,2 10 16 0,968 0,894

~~ 6 90 86 0,748 0,771 inadlfliss íveZ

808 7,6 80 85 1,068 1,047 nãodefei tuosa 10 90 80 1,000 1,046

246 a,2 10 26 0,8a6 0,715 defeituosa 4,2 65 90 0,786 0,628

OBSERVAÇÃO: I o sero 188 mostra uma reação classificada como inadlflissível, pois h' mais que 0,110 de diferen9a entre os valores de 'G, para um mesmo antígeno. ' Rea9ões atípioas podem ooorrer por aplioação da tabela de fatores de oonversão, quando o s~ro imprime diferente inolinação ' (h) à. curva hemol!tica, que a encontrada na maioria dos soros em um determlnadoslstema

, (.tLMEI DA e FREI,TAS" 1953)

85

QUADRO Xl

, I COMPARAÇÃO DE ANTIGENOS SOLUVEIS EM PIR!UINA E L E C I TI NA DOS A O J> 05%; O A N"d G E N O P A D R A o É HA ~ 5 (~)

------------ --~"'---""'"----"' .. "-->-~""·--"""·" .. ··"r· '""""-"'''''''~~-'''''' i""'''' -", ""'"""""'''''''"''-'''-''-''''~~-. ,. ~..~.. ~ ~

ANTIGENO NUMERO DE OBSERVAÇOES DECI8AO llTULO lO AN1'18ENO _.,---'~--' ".-..._"''''''''--_.----........ ".",

..... _ ....... _F_r· .. '~ ___ Wg __ ...-'

L\I<'S ,,(~ant a n • 11.

----,,.---.._-',, -"'-----"""-~ ....... ~---_. ...,_" ~ __ .. ~-~'x_.,,_ .. ~~-~.," ~·,_".' __ -h~.·.'n." .~-- .'-'. ... ~- -,""',---

W.K.I<. (1) 3 36 aceito 4000

W.K.K. (2 ) 1 23 aceito 3000

28-0BQS 2 30 aceito 2500

W.K.K. AP 11 14 reprovado < 1000

W.K.K. P 1 22 aceito 2000

HA-5 (2 ) 4 42 aceit.o 7500

HAu5 (3) 1 22 aceito 7000

HAQ5 (4) 1 23 acel'to 6500

OBSERVAÇÃO: (

Os antígenos W.K.K.'~or&m preparados de seBrdo com as espocificap5en originais de WITEBSKY, KLINGENBTEIN e KUHN (1931) du lotes de bacilos nO 48189.'08 nÜm?l"OFl tmtre l)aY~ntes!,s servem para di3í.inguir!lo prJ.

meira da segund~ psrtida.' W.K.K."AP & o antígeno de W.K.K.'preparado de bBc:los pl~viamentB ex­traídos com a mistura 'gua. 'la001, Iter.' W.K.K.'P , o antígeno W.K.K. (1) prealpltado por acetona em presença

de oloreto de .&dlo.' HA-5. (~),(8)e(4) t~ompreendem a segunda, t",r(~e:l.rfl. I' q1:iarta, partida (i,o

anttgeuo HA-5, preparado de Bc8rdo aom as esp0cL1ireç5p3 dadas no capítulo lI.'

86

Em teste semelhante aplicado à antígenos de cardiol,i<piQa, ,a dose de antígeno é u'sada como se fôsse igual . à encontrada para o antígeno de re­fer~ncia. , Ne8se caso o teste não s6 nos dá meios de comparar o comporta­mento dos antígenos, como também sua própria concentração. Assim se to­marmos um mesmo antígeno de ca'rdiol ipina mas em diferentes concentrações (co.o por exe.plo o antígeno 'original e outro preparado diluindo-o u.a vez em &lcool), o teste de análise seqU~ncial forçosamente o rejeitará. ' Se no entanto utilisarmos a dose de reatividade paralela, o antígeno se­rá acei~o; o método dará a noção da concentração relatiTa do material

. antig~nico • . O método a,resenta grande contraste com aquêle utilizado po~ .PADRON

(1952) quando comparou os antígenos aquosos precipitados por método quantitativo, considerando tít.ulo do,.antígeno igual à D{K'S a - 0)= ' 00 ·

O Talor o se refere ao primitivo C' descrito por f","," · O .quadro XII. mostra os títulos assim determinados em diversas parti­

das de antígenos. aquosos precipitados. !

Q. U A D R O XII " ,

TITULOS DE ANTIGENOS DETERMINADOS POR ME~ODO . QUANTITATIVO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO (PABRON, 1952)

, , ANTI GENO PRECIPITADO BRUTO ANTIGENOS TRATADOS PELO BUTANOL

.. . I

Nº I

Nº- TITULO " TITULO

48189-A 1280 48189-1li' 8000 48189-B 780 H87-1l8 2600 48189-F 1860 H87-1414 8500 48189-G 900 BCG-1 800 H8'7-D 1000 H8'7-E 1190 BCQ-1 500

Os antígenos não foram examinados .em teste de comparatibilidade de reaçãe. ' Dessa forma apenas tivemos noção da relativa concentração dos extratos .aquosos, ' não de seu comportamento com soros de lepra ou de tu­berculose humana. ,

Geralmente o antíge~p era .então .experiDientado .com soros de reconheci­da positividade, . lepra ou tuberculos'e, em núl1Iero suficiente para dar informações sôbre o co~portamento do antígeno de nova partida. !

REPRODUTIBILIDADE Quando se aplica o teste de comparação em análise seqüêncial poderá

se obter uma observação defeituosa por ~rro técnico ineren~e ao método, pois é de se esperar que em um determinado tubo os erros de pipetagem se acumulem em um mesmo sentido. · N~~se caso, . poderiamos ser levados a re­provar um antígeno injustamente 1

Uma pesquisa foi recentemente levada a efeito por ALMEIDA e THOMPSON (19iS) co~parando um determinado .antígeno com ~le mesmo. , A experi~ncia

87

compreendeu 314 pares de observaç6es, com 15 inadmissíveis e as restan~ tes 299 com 139 mostrando diferenças em G menores de 0,018: 232 pares com diferenças menores que 0,035 e 286 com diferenças menores qu,e 0,070. , As 13 restantes, eram observaç6es defeituosas (com 'G igualou maior que 0,070). I'

Ae~periGncia indica que se pode esperar 4,3% de observaç5es defei­tuosas por erros técnicos: a incidência é muito mais baixa que a estipu­I ada por MALTANER e THOMPSON (1948) para pares de reações feitas ao mes­mo tempo.

'REATIVIDADE EM soros NORMAIS E SOROS DE LEPRA E WBERQJLOSE

° hapteno isolado do bacilo da tuberculose (antígeno HA~5) foi espe­rimentado com soros de pessoas noraai.o ! Êsse grupo compreendeu indiví­duos adultos não selecionados e crianças cuidadosamente controladas. ' ° grupo adul to nor.al compunha-se de soros WASSERMANN nega ti vos, de pessoas não reconhecidamente'doentes. IEram soros que vinham à exame para exame pré-nupcial e dados clínicos não puderam ser obtid~s.:

, Os soros de crianças foram ~b'tidos por intermédio da National Founda­tion for infan ti 1 e Paralysi s e compreendiam um grupo bem seI ecionado.: ~s crianças, entre 2 e 5 anos de idade, tuberculino negativas, e sangradas antes de inoculadas com a vacina de SALK. ' O grupo de crianças compunha-se de 651 pacientes... -

Soros de tuberculosos, obtidos através o NEW YORKSTATE DEPARTMENT OF HEALTH. , compreeriJum um grupo de 177 pacientes, _ ~m diversos e~tadios da infecçã~, ' muito~ ' dêles com afta ~ontrolada.' , ' ,

Os soros de lepra lepromatosa, provieram de pacientes do Sanat6rio Padre Bento e Colonia de Santo Angelo ambos do Departamento de Profila -xia da Lepra do Estado de São PauZo. j

Todos êsses soros foram testado~ com o antígeno HA-5 lecitinado a 0,05% em provas de fixação do complemento quantitativa. ' Os resultados constam do quadro'XII!. j

Maior reatividade foi observada com saro' de lepra: soros de tubercu­lose mostraram apenas 3% de resultados negativos. '

Reações de baixos títulos foram observadas em todos os grupos, com exceção de lepra; tais resultados urgem uma investigação para0 conheci­mento do significado de tai~ títulos, obtidos mesmo em grupos onde tu­berculose poude ser excluida. ' Um fato no entanto é evidenciadó::o signi­ficado de títulos altos em diversos grupos. , Realmente, se tomarmos 08 título~ m~i9-r,~" que , seis. _verificaremos o~égular comportamento dos gru­pos es~ud~dos. ' Adultos mostraram 22% de soros com títulos maiores que 6 mas apenas 1% com títulos maiores que 12.,0 significado d~sses títulos não poude ser conhecido, por fal~a de informaç6es clínicas. 1 Estudos es­tão em progresso entre universitários, com exame clínico e testes para tuberculose fei tos sob a direç ão do professor Dr. j 'RAFAEL DE PAULA SOUZA da Faculdade de Higiene e Saúde Pública. ; Dessa forma, o quadro XIII, nos dá apenas um esquema do comportamento do antígeno por nós estudado, sem pretender conhecer o exato significado de tais achados. , No entanto os resultados obtidos com sôro de lepra, indicam a reatividade maior obser­vada nesses grupos de soros experimentados.'

88

Q U A D R O XIII

, REATIVIDADE DO ANTIGENO HA-5, LECITINADO A 0,05%, EM DIVERSOS GRUPOS. DE PACIENTES. '

• G R U P O S

T f T U L O S CRIANÇAS ADULTOS ~

NORMAIS(*) NORMAIS TUBERCUl.OSOS LEPROSOS

<3,0 78% 46,4% 3% 0%

3,1 - 6,0 21,4% 31 p 4% 28% 0%

6,1 - 12,0 0,6% 21,2% 30% 0%

12,1 • 20,0 · 0% 1% 12% 0%

)20,0 0% 0% 27% 100%

TOTAL 651 597 , 177 112

(*) Tuberculino-negativas

89

Cf)

« Cf)

o :::> l-w ~ w o Cf) W 50

10 O" «

~ > O o::

W Cf)

m 30 O w O 2-0 O ct: W ~

lO '::::>

Z n d

" " TESTE SEQUENCIAL DE PROBABILIDADE DIRETA

"L ... PARA UM ERRO = 2% NA DECISAO TOMADA

p' = 0.75 p" = 0.85

REJEITAR

ACEITAR

10 O 200

N NUNCA EXCEDERÁ 26 7

, ,.., N = NUMERO TOTAL DE OBSERVACOES ,

N

t

G> :::o ~ .. "'T1

o o

x x <

30

Cf)

"« Cf)

o ::> ..... L1J LL.. W o

10

Cf)

L1J lO

CJ 0.5

~ a:: L1J Cf)

m O

L1J o O a:: UI 2:

... ::> z .. d

" "-TESTE SEQUENCIAL DE PROBABILIDADE DIRETA

PARA UM ÊRRO L 2% NA DECISÃO TOMADA

• p' = 0,975 p" = 0,995

REJEITAR

CONTINUAR

ACEITAR

100 200 300 400 N N UNe A E X C E O E R Á 536

N = NÚMERO TOT AL DE OBSERVAÇÕES

500 N

t

Ci)

;o l>, "TI

o O

x x <

600

'RESUMO 'GERAL E OONCLUSÕES

1~ • A reação de fixação do complemento em sôro de lepra com antígenos preparados de bacilos da tuberculose se deve .h atividade haptBnica dos fosfatídeos ácidos complexos ligados à carboidratos e solúveis em piri­dina. '

2- - O efeito anticomplementar dos antígenos solú~eis em piridina , corrigido pela lecitina; efeito semelhante se observa nos antígenos aquosos do bacilo da tuberculose. '

3- - As reaç3es entre antígeno, anticorpo : e complemento, podem ser me­lhor estudadas por meio das ncurvas de isofixa~io" obtidas por projeção de antígeno contra sôro, o camplemento sendo mantido constante o:

4- Q A curva de isofixação em seu ramo vertical permite determinar as condiç3es necessárias para a titulagem de antígenos e também a influen­cia da quantidade de saro presente na reação sabre os par&metros da li· nha de regressãci: ( antígeno-complemento. ,

5- - O ramo horizontal da curva de isofixação indica as condiç3es nas quais se deve processar a titulagem do sôro. ' A influ~ncia da dose de antígeno empregada sabre os par&metros da linha de regressão sôro-com­plemento poude ser apreciada e dada uma correta interpretação.'

6 n • A dose de antígeno a ser usada numa titulagemde saro é aquela que não afeta o relativo paralelismo das curvas de isofixação" .Então, complemento fixado será função linear da quantidade de sôro presente.'

7- - A parte da curva de isofixação que liga os dois ramos assint6ti­cos, traduz a supl~ncia observada entre saro e antígeno e indica as con­dições em que a fixação do complemento depende tanto da quantidade de sôro presente, como da quantidade de antígeno usado. :Ne8secaso a titu­lagem de qualquer um dBsses elementos não poderá ser feita. '

8- • Para atitulagem de soros, por método simplificado, fatores de conversão são utilizados. : ~sses fatores foram determinados para o siste­ma lepra onde os valore~ de h sofrem marcada influ~ncia da quantidade de complemento necessário para 50% de hem61ise, pois há estreita dependên­cia entre a percentagem de complemento fixado ea inclinação da linha de regressão logaritmo de complemento contra logitos de hem61ise. '

, 9- - A padrohização da reação de fixação do complemento exige a repro· dutibilidade das partidas de antígenos. ' Métodos de análise seqU~ncial foram então adotados' para o sistema lepra e tabelas construidas para maior facilidade de uso e precisão de resultados, com o menor nú~ero possível de observações. '

10- • A reprodutibilidade dos antígenos solú~eis em piridina é maior que a observada com 0& antígenos aquosos; sua estabilidade é também su­perior e não se observou, em um ano, ' qualquer alteração de suas proprie­dades. '

11-· O estudo da reação entre sôro de lepra e antígenos solúveis em pi­rídina sugere a aplicação da re~ção de fixação do complemento quantita­tiva para contrôle soro16gico da leprose, não s6 como meio diagn6stico auxiliar, como também para avaliar sorol~gicamente o efeito das drogas modernamente utilizadas para seu tratamento.

A

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Página .. Linha

IV 13a ·a contar de baixo

V

VI

VI

VII

VIII

x

XI

XI

XI

1

4

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8

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13

13

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13.

13

8a a contar de baixo

23a a contar de baixo

.. 3a a contar de baixo

a:>8. a contar de baixo

26a a contar de baixo

9a a contar de baixo

22a a contar de baixo

11 a a contar de baixo

8/l a contar de bai:-xo

6a

17a

17a

22a

9a a contar de baixo

ERRATÁ

Onde se lê Leia-se

salina sol uç ão sal ina

com 57% em 57%

confi nnavam confi nnaram

o reação a reação

no na

chaulmc5grico chaulmúgrico

na atividade para a atividade

. ano que ano em que

à espécie a espécie

com tuberculose contra tuberculose

negligível negl i genci ável

As se fazer !vJ se fazer

SfANDAID ME1lI)[S(l947):' WAIS\OOIH(l947 )

poude pôde

salina sol uç ão sal ina

análises análise

salina sol uç ão sal ina

salina sol uç ão sal ina

(sr~ ME1lID3, 1947) (WAUSYDRIH. 1947 )

salina sol uç ão salilla

existe existem

suplementar ea++ suplementar com Ca++

salina sol uç ão salina

100

Página Linha Onde se lê Leiaose

13 4a a contar de salina sol u~ ão sal ina baixo

13 la a contar d~ s alina sol uç ão salina baixo

32 Sa ponto ~ ponto O

34 la depois do detennina uma detennina pontos ().ladro II sôbre uma

36 8 a a contar de afetilll o ·valor afetam sensivelmente baixo o valor

77 9a a contar de exigir de um exigir um baixo

88 8a a contar de poude pôde baixo

92 3a ligados ,

ligados a a

92 18a poude pôde

101