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TRANSGÊNICOS NA AGROPECUÁRIA

M.V.Dra.FabianaFernandesBressanFZEA/USP2016

Novasbiotecnologiasdareprodução,aplicaçõesbiomédicaseagropecuárias

Transgenia na agropecuária • Animais transgênicos

•  Tecnologia do DNA recombinante • Metodologias/técnicas de produção de animais

transgênicos • Estudos na FZEA/ USP • Prós e contras

• Vegetais transgênicos •  Foco na alimentação animal

DNA

Animais ou vegetais transgênicos

Organismos diferenciados

Produtos farmacêuticos Informação

vetor

Engenharia genética

Aspectos positivos Aspectos negativos

-  Transgenia -  Tecnologia transgênica

DNA recombinante •  1972/1973 – Universidade de Stanford •  1a utilização da tecnologia: insulina humana pelas empresas

Genentech e Eli Lilly (1982).

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DNA recombinante •  Fármacos e vacinas

•  Insulina, fator de coagulação, hormônio de crescimento, vacinas de raiva e hepatite, etc…

•  Bactérias e células animais - biorreatores

Animais transgênicos •  1982��Palmiteretal.

•  microinjeçãodeDNAexógenoempronúcleosdezigotos

•  Camundongos

•  1985��Hammeretal.•  microinjeçãodeDNAexógenoempronúcleosdezigotos

•  ovinos,suínosecoelhos

1) Produtos farmacológicos (animais biorreatores)

Por que produzir animais transgênicos? Animais biorreatores • Produção de proteínas ativas biologicamente humanas:

hormônios, enzimas, imunomoduladores, anticorpos, etc. • Microorganismos (bactérias): incapazes de modificações pós-traducionais em proteínas eucarióticas complexas.

• Células animais: caro! (1 biorreator = U$100 milhões) e manutenção instável.

¡  Ovelhas transgênicas para ofator IX de coagulação(SCHNIEKEetal.,1997).

Polly (Fator IX de coagulação)

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Pampa Mansa (hGH)

Portenha (BST)

Patagônia (pró-insulina humana)

Alfa-1-antitripsina

Vantagens da produção de proteínas recombinantes no leite

•  Fácil/seguro de purificar •  Sangue de doadores: pouca quantidade e risco de doenças.

• Grandes quantidades •  Fonte renovável

• Promotores específicos de glândula mamária •  β-caseína

BioSteelTM goat

• Nexia Biotechnologies •  No mínimo 6 vezes mais resistente que o aço. •  Pode esticar 20 x. •  Resistente a temperaturas extremas: -20 – 330oC. •  Não reconhecido pelo sistema imune.

•  40 animais

Webster e Pete – �silk milk�

- Armadura p/ exército (a prova de balas) - Fios de sutura - Linha de pesca - Tendões e ligamentos artificiais

Nephila clavipes “aranha da teia dourada”

Factor VIII de coagulação humano

120 g 2 vacas 10 - 25 ovelhas

Alfa - 1 - antitripsina 5.000 kg 33.000 ovelhas 42.000 cabras

Factor IX de coagulação humano

2 kg 13 ovelhas 22 suínos

Albumina sérica 1000 kg 300 vacas 8.300 cabras

Requerimentos mundiais de proteínas humanas e número de animais transgênicos necessários

Insulina: 25 vacas supre a necessidade da Argentina, que possui 1,5 milhões de diabéticos

São necessários poucos animais biorreatores!

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ATryn – 1º remédio vindo de transgênico

•  3L /dia

•  3 Kg de proteína

purificada /ano

•  Aprovado pelo FDA

•  Antitrombina recombinante humana

(profilaxia do tromboembolismo)

•  GTC Biotherapeutics

•  Artigo em 1991 •  Aprovação pelo FDA em 2009

Ruconest • Angioedema hereditário • Pharming • Artigo em 2005 • Aprovação FDA em 2014

Proteínas recombinantes produzidas em animais biorreatores em testes clínicos ou pré-clínicos

Proteína uso empresa teste

Alfa 1 antitripsina

Enfisema hereditário Fibrose cística

Bayer e outras

I-T

Alfa fetoproteína

Esclerose múltipla, miastenia gravis, artrite reumatóide

GTC

Fase II

Antitrombina III (Atryn)

Embolias, tromboses GTC Fase III (aprovação comercial)

Butirilcolinesterase (Protexia)

�antídoto� para agentes neurotóxicos

Nexia

Pré-clínico

calcitonina osteoporose PPI I-T

colágeno Artrite reumatóide Pharming Pré-clínico prolactina Aumento da imunidade GTC I-T

Proteína uso empresa teste

Fator VIII Hemofilia A Pharming Pré-clínico

Fator IX Hemofilia, desordens de coagulação GTC, Pharming

Pré-clínico

Fibrinogênio Tecidos �in vitro� Pharming Pré-clínico

G-CSF Leucopenia Avigenics Pré-clínico

hCG Síndrome de Turner, problemas de desenvolvimento

GTC I-T

insulina Diabetes GTC I-T

Spider steel (Biosteel)

Desenvolvimento de materiais Nexia Pré-clínico

Fator ativador de plasminogênio tecidual

Falências cardíacas (infartos), dissolução de coágulos

Genzyme I-T

www.clinicaltrials.gov

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Por que produzir animais transgênicos? 2) Características de produção animal

– Proteção contra doenças

Proteção contra mastite: Resistência ao Staphylococcus aureus

Wall et al., 2005 Nature Biotechnology

Produção de lisostafina: Glandulas mamarias infundidas com a bactéria - 14% infectadas nos animais transgênicos - 71% infectadas nos animais controles

2) Características de produção animal – Proteção contra doenças – Aumento de crescimento, fertilidade

GH α-lactalbumina 70% a mais de leite 500g a mais em 21d de lactação

2) Características de produção animal – Proteção contra doenças – Aumento de crescimento, fertilidade – Alteração da composição de carne, leite, ovos, etc.

Lisozima humana no leite Daisy: leite sem β-lactalbumina (hipoalergênico)

3) Produção de modelos genéticos de estudos (doenças humanas)

Por que produzir animais transgênicos?

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3) Produção de modelos genéticos de estudos (doenças humanas)

Lai et al., Science 295:1089-1092, 2002.

Xenotransplante: modelo para não rejeição de órgãos

-  Falta (knockout) da enzima α-1,3-galactosyltransferase

Suínos como modelos experimentais Similaridades fisiológicas e anatômicas aos humanos – suínos são modelos biomédicos

•  Sistema cardiovascular •  Sistema urinário •  Sistema tegumentar •  Sistema digestivo

Modelos animais -  Tamanho/

metabolismo -  Tempo de vida -  Organização do

genoma

Suínos como modelos experimentais Similaridades fisiológicas e anatômicas aos humanos – suínos são modelos biomédicos

•  Sistema cardiovascular •  Sistema urinário •  Sistema tegumentar •  Sistema digestivo

Estratégias de produção

• Ganho de função (Knock-in) • Expressão gênica aumentada • Expressão de um gene novo

• Perda de função (Knock-out)

• Silenciamento gênico – alteração do gene endógeno

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Estratégias de produção • Ganho de função (Knock-in)

5´ 3´

Exemplo: hormônio do crescimento (GH)

•  aprox. 25000 genes •  1 cópia a mais do GH : 100% a

mais de crescimento

Promotor GH

1982: � Super mice��

Salmão: 3Kg x 1,3Kg em 1,5 anos

Estratégias de produção • Perda de função (Knock-out)

• Recombinação homóloga

-Knockout da miostatina

Belgian blue

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Tecnologias para produção de animais transgênicos

3. Transferência de DNA mediada por espermatozoides

4. Transferência nuclear de célula somática (clonagem)

2. Microinjeção pronuclear de DNA

5. Polimorfismos direcionados

1. Injeção de células-tronco embrionárias em embriões

Isolamento da MCI

Comprometimento e desenvolvimento celular

Cultivo in vitro

Comprometimento e diferenciação celular

Auto renovação

Células-tronco embrionárias

Expressão dos genes OCT4, SOX2, NANOG

(pluripotência)

•  gene targeting •  knockout

•  Camundongo

Injeção de células embrionárias previamente modificadas em blastoceles (agregação) CTEs em animais domésticos: stem-like cells

Pant and Keefer, Cloning and Stem Cells .11(3), 2009.

Jin et al., 2012 Cytotechnology

CTEs humanas

CTEs �like� bovinas

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•  1. Fertilização

•  2. Visualização dos pro-núcleos e microinjeção do DNA

Microinjeção pronuclear de DNA exógeno em zigotos Primeiro animal de

produção transgênico no Brasil

2007

•  Microinjeção •  Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) •  Prof. Vicente de Freitas (Ceará), colaboração

com grupo russo.

24 doadoras Saanen

SO e lavagem uterina

129 zigotos c/ pro- núcleo

3/6 embriões

em 27 receptoras

10 prenhes, 12 cabritos,

1 transgênico

Transferência de DNA mediada por espermatozóides

oócito oócito

Transferência de DNA mediada por espermatozóides

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ICSI – Injeção intracitoplasmática de espermatozóide

1.  Inseminação laparoscópica

2. Fertilização in vitro (FIV) 3. ICSI

0% tg 0% tg >90% tg

Pereyra-Bonet et al., J. Reprod. Dev. 2011.

Ovinos Transgenia – desvantagens e riscos

1. Inserção aleatória do transgene no genoma hospedeiro

•  expressão transgênica imprevisível

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2. Tempo para formação de rebanhos muito alto em animais de produção

• Camundongos: ciclo de 5 dias, gestação de 21 dias, desmame 21 dias, vários filhotes: 2-3 meses para a obtenção dos animais fundadores

• Bovinos: 280 dias de gestação, meses de lactação, puberdade em ~ 2 anos, 1 animal nascido por vez: > 3 anos

Transgenia – desvantagens e riscos Transgenia – desvantagens e riscos

•  3) Baixa eficiência.

• Microinjeção:

•  2800 zigotos microinjetados •  2500 zigotos após microinjeção •  250 embriões transferidos •  50 prenhezes •  1 bezerro transgênico

•  Produção de animais geneticamente modificados

Clonagem por transferência de núcleo

Célula da pele

Oócito reconstruído

Embrião blastocisto

Oócito (gameta feminino)

Núcleo

Retira-se o núcleo (material

genético)

Clonagem por transferência de núcleo

Dolly (1996)

¡  Ovelhas transgênicas para ofator IX de coagulação(SCHNIEKEetal.,1997).

Polly (Fator IX de coagulação)

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Modificação gênica da célula

Vetor proteína verde

Atualidade: Edição gênica de precisão •  Inserção aleatória x inserção dirigida (específica)

•  Reparo direcionado por homologia

Atualidade: Edição gênica de precisão •  Inserção aleatória x inserção dirigida (específica)

•  Reparo direcionado por homologia

Atualidade: Edição gênica de precisão •  - Endonucleases capazes de introduzir pequenas inserções ou

deleções (poucos pares de base - indels) em locais específicos do genoma.

-  Zinc fingers (ZNFs)

-  Talens (Tal effector nucleases)

-  CRISPR/cas 9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)

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CRISPR / Cas9 - Edição gênica de precisão

• Nuclease guiada por RNA

• Precisa somente de

um RNA guia e da proteína Cas9

•  Isolada de bactérias •  Funcional para

todas as sequencias!

O exemplo da musculatura dupla...

Piemontês

Belgian Blue

Whippet

Miostatina (GDF8)

•  �introgressão de variações genéticas�

controle

mutação • Mutação na miostatina •  TALENS

•  Bovinos (Nelore) e ovinos - Proudfoot et al., 2015 • CRISPR/Cas9

•  Ovinos– Crispo et al., 2015

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Chifre • Alelo Polled

-  China: humanos - Câncer agressivo de pulmão - Knock out gene PD-1: genes do sistema imune podem combater o cancer

CélulasexpressandoogenerepórterGFP(GreenFluorescentProtein)

Promotor de ubiquitina

Gene da Proteína Fluorescente Verde

Ub eGFP 5´ 3´

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2008

Ex.: Nascimento de dois animais – F IX • Bovinos expressando fator de coagulação IX humano no

leite (promotor de β-caseína)

Promotor de β-caseína

Gene do fator humano de

coagulação IX (hFIX)

β-cas hFIX 5´ 3´

Células da glândula mamária

clonagem

21 vacas receptoras 2 animais nascidos

Animal 1 Animal 2

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Gluca: produzirá glucocerebrosidase (para tratamento da Síndrome de Gaucher)

O “lado negro” da tecnologia transgênica

• Animais biorreatores:

•  alta expressão de proteína recombinante = indícios de fisiologia mamária comprometida!

•  Lactaçãocomcomeçotardio,piconormaletérminoprecoce•  SecreçãolipídicacompromeYda•  Menorexpressãodecaseínas

•  Foconasproteínasquenãopodemserproduzidasemmicro-organismosoucélulas!

• Produção animal: Animais maiores: alterações fisiológicas

•  Problemas nas articulações •  Anormalidades ósseas •  Metabolismo alterado (elevado) •  Úlceras gástricas •  Infertilidade Efeitos foram mimetizados em animais normais através do tratamento

prolongado com altas doses de GH

Pursel et al., 1989; Nancarrow et al., 1991

transgênico controle

O “lado negro” da tecnologia transgênica Vegetais / alimentos transgênicos •  1996: tomate Flavr Savr (Calgene-Monsanto)

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Transgênicos na alimentação animal •  2010: 10% da plantação mundial é de OGMs.

Porcentagem transgênicos x

convencionais - 2012

Soja Milho Algodão Canola

Transgenia vegetal – Para quê?

•  * Aumentar a produção alimentos e reduzir os custos de produção; •  40% da produção de lavouras não transgênicas – não é

aproveitada

•  * Produção de alimentos de maior qualidade nutricional e menor perecibilidade;

• Produção de anticorpos em plantas transgênicas e sua distribuição em massa.

Aumentar a produção alimentos e reduzir os custos de produção

•  Resistência a insetos: utilização de inibidores de proteinase de plantas, ou a partir de toxinas bacterianas (Bacillus thuringiensis), o gene Bt. Ex.: milho, algodão, batata e soja transgênicas (a toxina é inseticida).

Aumentar a produção alimentos e reduzir os custos de produção

•  Tolerância a herbicidas: engloba o maior número de plantas transgênicas, tolerantes a uma série de herbicidas. Ex.: milho, eucalipto, cana-de-açúcar, soja (soja ‘roundup ready’ – resistente ao glifosato).

• Soja roundup ready (RR) Monsanto

• Resistência ao glifosato

• Soja Intacta RR2 pro (dupla resistência)

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Dupla resistência - Cana-de-açúcar Monsanto Brasil

Aumentar a produção alimentos e reduzir os custos de produção

•  Resistência a vírus: silenciamento de gene ou proteção mediada pelo RNA (Ácido Ribonucléico). Ex.: mamão com resistência ao vírus da mancha anelar do mamoeiro (PRSV), desenvolvido pela EMBRAPA-CNPMF e a Universidade de Cornell; batata transgênica resistente ao vírus do mosaico da batata (PVY), pela EMBRAPA-CNPH/CENARGEN.

Agrobacterium tumefaciens

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Brasil - aprovações comerciais - vegetais • Resistência a insetos, tolerante a herbicidas ou ambos

•  Algodão Bollgard II, Roundup Ready, Widestrike; 12 variedades.

•  Milho Bt, milho Roundup Ready; 21 variedades.

•  Soja Roundup Ready, Liberty Link; 5 variedades.

•  Feijão resistente ao vírus do mosaico

•  Eucalipto

•  Outros países (EUA principalmente): canola, ameixa, etc...

Transgênicos na alimentação animal

- 100 bilhões de animais: sem efeito na saúde, produtividade e perfil nutricional dos produtos derivados

Alimentos transgênicos

• Saúde humana •  Alergias (proteínas novas na

planta) •  Resíduos de agrotóxicos

(plantas com resistência aos efeitos dos agrotóxicos, ex: soja roundup ready).

• Meio ambiente •  Impacto sobre biodiversidade

(uniformidade genética = maior vulnerabilidade)

•  Outros...??

Vantagens Desvantagens • Aumento da produção

• Maior resistência e durabilidade

• Melhoria do conteúdo nutricional/ alimentos terapêuticos

fabianabressan@usp.br