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IMUNO ENSAIOS USANDO
CONJUGADOS
REAES USANDO REAGENTES MARCADOS
Conjugado: molcula constituda por duas substncias ligadas covalentemente e que mantm as propriedades funcionais de ambas
Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada com
isotiocianato de fluorescena (FITC)
HRP: enzima peroxidase
IMUNO ENSAIOS UTILIZANDO
CONJUGADOS
Antgenos usados nos imuno ensaios: patgeno inteiro, molculas derivadas de patgenos, hormnios
Anticorpos usados: policlonais ou monoclonais
Ensaios manuais e automatizados
TCNICAS
1 TCNICAS QUE USAM FLUORESCNCIA
Fluorescncia: emisso de luz de uma cor aps
irradiao com luz de cor diferente:
FITC: absoro mxima (490-495 nm), emisso
mxima (517 nm)
Tcnicas: imunofluorescncia, citometria de fluxo
Alguns fluorocromos
FITC: isotiocianato de fluorescena
PE: ficoeritrina
Rodamina
IMUNOFLUORESCNCIA
Lmina de imunofluorescncia
Antgeno usado: pode-se usar Ag comercial ou
pesquisar Ag (micrbio) num material coletado do
paciente (ex: secreo)
Exemplo: IMUNOCRUZI: Ag de Trypanosoma cruzi
liofilizado obtido por cultivo em meio de LIT
CONJUGADO E MONTAGEM DA LMINA
Antissoro (anti IgG ou anti IgM): gama globulina
obtida em espcie heterloga (carneiro, cabra)
purificada e conjugada marcada - com substncia fluorescente (fluorocromo)
Intensidade da luz emitida depende do pH (ao final,
lmina coberta com glicerina de alcalina e lamnula
KIT COMPLETO PARA
IMUNOFLUORESCNCIA
REAO DE
IMUNOFLUORESCNCIA
I - Reao de imunofluorescncia direta
(RIFD)
pesquisa do Ag em clulas ou tecidos
elevada sensibilidade e especificidade
Usa um conjugado para cada sistema
Reao de imunofluorescncia
II - Reao de imunofluorescncia
indireta (RIFI)
amplificao do sinal aumento da
sensibilidade em relao RIFD
A - pesquisa de antgeno
mais sensvel, uso de um nico
conjugado para diferentes sistemas
Reao de imunofluorescncia
Reao de imunofluorescncia
indireta (RIFI)
B - pesquisa de anticorpo contra um agente infeccioso
Ag do agente infeccioso (lmina) + soro do paciente Ag-Ac
LAVAR
Ag-Ac + conjugado anti-IgG ou anti IgM microscpio
RIFI PARA PESQUISA DE ANTICORPO ANTI
TOXOPLASMA GONDII NO SORO DO PACIENTE
RIFI PARA ANTICORPO SRICO ANTI
LEISHMANIA
DETERMINAO DA CLASSE DO AC
Uso de conjugado contra a classe de Ig que se quer determinar:
Ex. de conjugado: globulina de carneiro anti IgG humana marcada pelo FITC
DETERMINAO DO TTULO DE ANTICORPO
Como o resultado liberado:
Toxoplasmose IgG (imunofluorescncia):
Resultado: reagente (ou positivo at) 1:8.192
INTERFERENTES NA PESQUISA
DE IgM POR RIFI
Presena de fator reumatide (FR) falso-
positivo:
o Competio com IgG falso-negativo
Para eliminar falso positivo e falso negativo:
Usar o Removedor IgG/FR: soro do paciente + soro
com anti IgG humano seguido de centrifugao usar sobrenadante para dosagem de IgM
KIT PARA IMUNOFLUORESCNCIA PARA AC
ANTI TRYPANOSOMA CRUZI
Desvantagens da RIFI:
Mais demorada, maior nmero de reagentes
Limitaes da reao de imunofluorescncia
Necessidade de microscpio de fluorescncia,
subjetividade, no automao
AUTOMAO NA IMUNOFLUORESCNCIA (E
ELISA)
REAES DE
ENZIMAIMUNOENSAIO
Reao Ag-Ac monitorada por medida da
atividade enzimtica
Alta sensibilidade, reagentes estveis,
leitura visual ou fotomtrica, substratos
coloridos ou luminescentes
CLASSIFICAO DOS ENZIMA-
IMUNOENSAIOS
Ensaios homogneos: atividade da enzima alterada como parte da atividade imunolgica, no precisa de lavagem entre as etapas
Ensaios heterogneos: atividade da enzima no alterada, precisa de lavagem entre as etapas
ENZIMA IMUNOENSAIO HOMOGNEO
SLFIA (substrate-labelled fluorescent immunoassay)
A atividade da enzima alterada pela ligao do Ac ao substrato fluorognico
ENSAIOS HETEROGNEOS I - ELISA (enzyme linked immunosorbent
assay)
Uso de peptdeos sintticos ou recombinantes e de anticorpos monoclonais
Fase slida: placas de poliestireno
Material da placa tem afinidade por protena
Interao protena-placa no covalente
PLACAS E TIRAS PARA ELISA
ETAPAS DO ELISA
sensibilizao (ou cobertura) da fase slida: adio de Ag do agente infeccioso (ou de Ac contra o que se quer pesquisar)
Bloqueio: adio de protena inerte: soro fetal bovino, leite desnatado
lavagens
ETAPAS DO ELISA
adio da amostra do paciente (soro) na qual se deseja pesquisar Ag ou Ac em diluente *
adio do conjugado: anticorpo marcado com enzima (ex: peroxidase)
lavagens
ETAPAS DO ELISA
o Adio do substrato cromognico:
peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD
(ortofenilenodiamina) ou ABTS (cido 5-amino
saliclico) (cromgenos)
ETAPAS DO ELISA
Interrupo da reao: adio de SDS ou H2SO4
Leitura do resultado
Leitor de ELISA: Fotmetro multicanal para tiras ou placas
Filtros: 405, 450, 490, 630 nm
Leitura monocromtica: uso do comprimento de onda no qual o produto da reao tem maior absorbncia
Leitura bicromtica ou diferencial: uso de 2 filtros: o primrio e o diferencial
Elimina imperfeies do plstico
Leitura feita usando os 2 filtros, o aparelho libera a diferena das 2 absorbncias
EXPRESSO DOS RESULTADOS
limiar de reatividade (cut-off): ponto de corte de
um teste sorolgico; pode-se trabalhar com maior
especificidade ou sensibilidade dependendo do
objetivo do teste (ex: seleo de doadores num
banco de sangue)
Cut-off (limiar de reatividade)
Corrigir: b: mxima sensibilidade e especificidade
g: mxima especificidade
Leitor de ELISA
Reao de ELISA
Lavadora de
placas
Pipeta
multicanal
ELISA: ENSAIOS PARA ANTICORPOS
ELISA: ENSAIOS PARA ANTGENOS
II - Western Blot
Pesquisa de antgenos e anticorpos
Exemplos:
- Caracterizar reatividade srica de paciente suspeito de infeco pelo HIV (teste confirmatrio para infeco pelo HIV)
II - WESTERN BLOT
Western blot para pesquisa de Ac anti HIV:
Fracionamento das protenas do HIV: separao de acordo
com peso molecular
Transferncia das protenas para membrana de nitrocelulose
Em seguida, etapas semelhantes ao ELISA: nesse caso pesquisa-se quais protenas do HIV o soro reconhece
Cromgeno usado deve originar produto insolvel
Western blot
Western Blot
ONDE ESTUDAR
Imunoensaios Fundamentos e Aplicaes. VAZ, TAKEI, BUENO, 1 edio, 2007
OU
Diagnstico Laboratorial das Principais Doenas
Infecciosas e Auto-Imunes FERREIRA & VILA, 2a edio, 2001.
OU
Imunologia Mdica - PARSLOW, 10a edio, 2004.
OU
Imunologia Clnica na Prtica Mdica VOLTARELLI, DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI,
1 edio, 2008.