ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DO EPITÉLIO NASAL E COMPONENTES

DO SANGUE EM RATOS EXPOSTOS CRONICAMENTE AO HERBICIDA ÁCIDO

DICLOROFENÓXIACÉTICO (2,4-D)

GABRIELA VIDOTTO CAVALLIERI

Projeto de pesquisa submetido ao programa

de Mestrado em Ciências da Saúde da

Universidade do Oeste Paulista.

Orientadora: Profª. Dra. Renata Calciolari Rossi e Silva

Co-Orientador: Prof Dr Danillo Roberto Pereira

Presidente Prudente – SP2017

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃOPROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIAS DA

SAÚDE

RESUMO

O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, e também o maior consumidor de agrotóxicos, por ser um método econômico e de alto rendimento. Um dos meios mais utilizados para a aplicação de agrotóxicos é a pulverização aérea, apesar dos riscos já conhecidos que essa técnica pode trazer, sobretudo devido à existência da deriva técnica. Os agrotóxicos podem causar intoxicações agudas, subagudas e crônicas. O herbicida Ácido 2,4-diclorofenoxiacético, com nome popular de 2,4-D, é um dos mais antigos do mundo e um dos mais utilizados até hoje, no controle de várias ervas daninhas, em plantações de cereais, cana-de-açúcar, controle florestal e pomares, sendo classificado como herbicida de Classe I, ou seja, extremamente tóxico. A saúde respiratória está diretamente ligada com a qualidade do ar, isso devido à grande área de contato existente entre a superfície do sistema respiratório e o meio ambiente, onde os poluentes podem alcançar a circulação sistêmica pelos pulmões e assim, causar efeitos nocivos em diversos órgãos e sistemas. O presente estudo tem como objetivo avaliar o epitélio nasal e componente do sangue de modelos experimentais submetidos à pulverização crônica do herbicida 2,4-D. Serão utilizados 40 ratos wistar adultos machos e fêmeas, divididos em 4 grupos. O Protocolo de exposição será através de 2 caixas ligadas a 2 dois nebulizadores ultrassônicos, que farão a “pulverização” do herbicida em diferentes concentrações durante 4 meses. Em seguida será feita a coleta de amostra de sangue e coleta e análise do epitélio nasal, após a eutanásia dos animais. Os resultados serão analisados utilizando-se o programa Sigma Stat®versão 2.0. Será utilizada a análise de variância nos casos de distribuição normal, seguida pelo Turkey, se necessário. Caso contrário, serão utilizados testes não paramétricos, como o de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn quando necessário. As diferenças serão consideradas estatisticamente significantes quando p for menor que 5% (p <0,05).

Palavras-chave: cana-de-açúcar, herbicida, intoxicação, modelos experimentais.

1 INTRODUÇÃO

Pontal do Paranapanema e cana-de-açúcarO Brasil ocupa o primeiro lugar no ranking mundial da produção de cana-de-

açúcar, sendo as regiões de concentração de cultivo o Sudeste, Centro-Oeste, Sul e

Nordeste. A previsão da produção nacional divulgada em setembro de 2016 foi de

733.526.410 milhões de toneladas, sendo 20.623.097 milhões de toneladas de produção

de açúcar e 13.770.018 de etanol na região centro/sul. E no Estado de São Paulo,

responsável pela produção de 60% de toda a cana no país, a estimativa de produção foi

de 400.790.755 milhões de toneladas.1,2,3

No Sudeste, uma área que se destaca na produção de cana-de-açúcar é a região

denominada Pontal do Paranapanema. O Pontal do Paranapanema é uma região

localizada no extremo oeste do Estado de São Paulo, tem como divisas os Estados de

Mato Grosso do Sul e Paraná, onde é banhado pelos rios Paraná e Paranapanema,

justificando seu nome. Apesar de pertencer a um dos Estados com maior economia, o

Pontal, que faz parte da 10ª Região Administrativa do estado de São Paulo, não é

considerado com grande desenvolvimento, sendo uma das regiões mais carentes do

Estado de São Paulo e que se caracteriza por cenários de conflitos sociais entre disputas

de terras. Essa expansão recente das áreas de cultura de cana-de-açúcar na região se

deve entre outras coisas, à implantação de diversas usinas sucroalcooleiras.1,4

De acordo com o Sistema de Informações Territoriais, a economia regional se

baseia na atividade agropecuária, destacando-se a expressiva produção de cana-de-

açúcar e pecuária bovina. O aumento da produção do agronegócio canavieiro na região

deve-se principalmente a criação do Programa Nacional do Álcool (PROALCOOL), em

1970, em virtude da crise mundial do petróleo, visando à produção de álcool para

abastecimento do mercado interno e por conseqüência, criar incentivos para a classe

produtora canavieira. 5,6

Pulverização aéreaO cultivo de cana-de-açúcar requer a utilização de elementos para o controle de

plantas daninhas, fator limitante à sua produção e que pode comprometer até 85% da

produtividade quando não tratados corretamente, para isso são necessárias medidas

químicas, mecânicas, biológicas, entre outras, porém o uso de herbicidas continua em

destaque por ser um método econômico e de alto rendimento.1

Se por um lado a utilização desses produtos aumenta e diversifica a produção,

por outro podem ser os responsáveis pela ocorrência de vários impactos negativos em

relação à saúde e à segurança dos que estão diretamente ligados e dos organismos vivos

presentes no ambiente, além disso, também podem alcançar uma grande parte da

população através da pulverização, consumo de alimentos e água contaminada.7

Atualmente, o Brasil é o maior consumidor mundial de agrotóxicos, ultrapassando

até mesmo os Estados Unidos. Essa posição no ranking mundial é muito preocupante,

sendo que o uso abusivo dessas substâncias provocam diversos problemas de saúde nos

profissionais que trabalham diretamente com o produto (agricultores), nos consumidores

dos alimentos produzidos por meio dessa prática e nos moradores da região de cultivo

das plantações que são pulverizadas, além disso, os agrotóxicos também apresentam

grande impacto no meio ambiente, podendo destruí-lo e desequilibrar a fauna e a flora.8,9

Apesar dos já conhecidos impactos para o meio ambiente e para a saúde

humana, uma das formas de aplicação de agrotóxicos no Brasil é a aérea, conhecida

como pulverização aérea. A técnica de pulverização aérea tem por objetivo aplicar a

quantidade correta do composto no alvo desejado, com extrema eficácia e de modo

econômico, sem haver contaminação do meio ambiente.10,11

De acordo com o Ministério da Saúde, essa técnica vem sendo extensivamente

discutida no país pelos danos já conhecidos e pelo fato da possibilidade de deriva. A

deriva técnica pode ultrapassar os 80% na pulverização e assim atingir localidades

distantes, por causa do deslocamento da calda do produto fora do local desejado,

podendo ser influenciada pelo vento, temperatura do ar, umidade relativa do ar, distância

do alvo, velocidade de aplicação e tamanho das gotas. Estima-se que 32% dos

agrotóxicos pulverizados ficam retidos nas plantas, outros 19% atingem áreas adjacentes

da aplicação, 49% atingem o solo. 9,10

Há uma estimativa da Organização Internacional do Trabalho/Organização

Mundial da Saúde (OIT/OMS) de que o uso de agrotóxicos em países em

desenvolvimento causem anualmente 70 mil intoxicações agudas e crônicas que evoluem

para óbito e no mínimo 7 milhões de doenças agudas e crônicas não-fatais.8,11

No Brasil, é crescente a preocupação com a atividade de pulverização aérea de

agrotóxicos, principalmente do setor da saúde em relação aos potenciais impactos à

saúde humana. De acordo com o Dôssie ABRASCO (Associação Brasileira de Saúde

Coletiva), a pulverização é mais perigosa e contaminante do que outras formas de

aplicação, devendo ser proibida. Recentemente o Ministério da Saúde demonstrou ser

favorável à proposta de proibição da pulverização aérea no Brasil, como resposta à

consulta sobre o PLS nº 541/2015.8,12

Toxicidade aguda e crônicaA classificação dos agrotóxicos é feita através de sua composição e finalidade,

são eles: araricidas, bactericidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas, nematicidas,

rodenticidas e moluscicidas, no qual os herbicidas representam 45% do valor total de

agrotóxicos comercializados no país.13

Os agrotóxicos também podem ser classificados quanto aos perigos que eles

podem representar aos seres humanos, essa classificação é estabelecida através de

estudos realizados em laboratório que visam quantificar a dosagem letal 50% (DL50), ou

seja, a quantidade necessária para matar 50% da população de ratos ou de outro animal

teste utilizados nos experimentos, expressa em miligrama da substância por quilograma

da massa corporal (Quadro 1).13

Quadro 1. Classificação dos defensivos agrícolas de acordo com os efeitos causados à

saúde humana.

Fonte: (Braibante, Zappe; 2012).

Os efeitos dos agrotóxicos podem ser divididos em: agudos, subagudo e crônico,

onde os efeitos agudos surgem logo em seguida do contato com uma única dose do

agrotóxico, causando náuseas, vômitos, desmaios, dificuldades respiratórias, espasmos

musculares. O efeito subagudo acontece por exposição moderada ou pequena a

substâncias altamente ou mediamente tóxicas, provocando sintomas subjetivos como dor

de cabeça, fraqueza, sonolência, dor de estômago. O efeito crônico é provocado por

pequenas exposições de uma substância altamente perigosa por um longo período de

tempo, podendo ser observados em semanas, meses e até anos, dificilmente

diagnosticados e relacionados com o agente causador.14

De acordo com o Ministério da Saúde, a intoxicação crônica dificilmente é

estabelecida por apresentar quadros clínicos indefinidos e muitas vezes irreversíveis, o

que leva a não existir registros oficiais sobre os efeitos crônicos causados pelo contato

com os agrotóxicos. Os efeitos podem manifestar-se através de várias patologias e

alcançar vários órgãos e sistemas, principalmente com problemas imunológicos,

hepáticos, neurológicos, hematológicos, malformações congênitas e tumores.14,15,16

Herbicida Ácido 2,4-diclorofenoxiacéticoO primeiro herbicida registrado no Brasil foi o ácido 2,4-diclorofenoxiacético,

conhecido como 2,4-D, sendo introduzido em 1946 e desde então se transformou em um

dos herbicidas mais amplamente usados em todo o mundo. No princípio, suas

propriedades fitotóxicas foram utilizadas com propósitos militares durante a Guerra do

Vietnã, juntamente com o ácido 2,4,5- triclorofenoxiacético (2,4,5- T) e o pentaclorofenol

formaram o “agente laranja” com função de desfolhante e após a guerra, funcionaram

como substitutos da capina manual, reduzindo mão-de-obra e aumentando a

produtividade agrícola.17

O 2,4-D vem sendo utilizado no controle de várias ervas daninhas, em plantações

de cereais, cana-de-açúcar, controle florestal e pomares. É classificado pela Agência

Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) como Classe I, ou seja, Extremamente Tóxico,

de acordo com os efeitos agudos que a substância é capaz de produzir após uma única

exposição em animais de laboratório.18,19

Características do Sistema Respiratório e sua relação com a poluição ambiental

A função primária do sistema respiratório é a troca de gases, o oxigênio presente

no ambiente externo é levado para a corrente sanguínea e o dióxido de carbono é

eliminado para o exterior, isso acontece a cada respiração, onde o ar passa através da

laringe e da traquéia e em seguida se divide em dois brônquios, que por sua vez se

bifurcam em dois ramos menores formando tubos bronquiais, esses tubos formam

inúmeras vias dentro do pulmão e se encerram com uma conexão com pequenos sacos

chamados alvéolos.20

O sistema pode ser dividido quanto a forma estrutural, em sistema respiratório

superior, que inclui nariz, cavidades nasais, seios paranasais e nasofaringe, e também o

sistema respiratório inferior, englobando a laringe, traquéia, brônquios e pulmões.21

Além disso, o sistema respiratório pode ser dividido quanto ao seu aspecto

funcional, dividindo-se em porção condutora, responsável por limpar, umedecer e aquecer

o ar inspirado, e assim proteger o revestimento dos alvéolos pulmonares. Essa porção

abrange as fossas nasais, nasofaringe, laringe, traquéia, brônquios e bronquíolos. Existe

também a porção respiratória, formada pelas porções terminais da árvore brônquica, local

onde acontecem as trocas gasosas (alvéolos).22

A mucosa da área respiratória é constituída por um epitélio respiratório ou de

revestimento do tipo pseudo estratificado colunar ciliado, sendo formados por seis tipos

diferentes de células: células colunares ciliadas, caliciformes, serosas, em escova, basais

e granulares.23

Em camundongos, a cavidade nasal é composta de narinas, concha nasal,

concha maxilar, concha etmoidal, faringe (nasofaringe, orofaringe, epiglote e

laringofaringe) e laringe, diferencem dos humanos pelo fato do septo nasal não separar

totalmente as metades das cavidades nasais, permitindo comunicação direta entre os

componentes e servindo de caminho para fluxos de ar e muco. O epitélio é constituído por

estratificado pavimentoso na parte anterior e na parte posterior por respiratório e depois

olfatório.24,25

A saúde respiratória está diretamente ligada com a qualidade do ar, isso devido à

grande área de contato existente entre a superfície do sistema respiratório e o meio

ambiente. Uma grande quantidade de poluentes inalados pode atingir a circulação

sistêmica pelos pulmões e assim, causar efeitos nocivos em diversos órgãos e sistemas.26

A utilização dos herbicidas a tempos vem causando a percepção e preocupação

quanto aos agravos sofridos à saúde por meio de sua exposição, tais efeitos podem

acometer o sistema respiratório, causando desde asma à fibrose dos pulmões e até

hepatopatias tóxicas crônicas.27

Um dos herbicidas que se incluem nesse contexto é o 2,4-D, muito utilizado na

cultura de cana-de-açúcar, que contribuem para agravos na saúde humana, como

demonstram estudos que relacionam a exposição a esse herbicida à toxicidade no

sistema reprodutor, câncer, irritação ocular e dérmica, desregulação endócrina, além de

efeitos neurotóxicos.17, 28

As vias inalatórias e dérmica são as mais comuns de exposição, em se tratando

das consequências dos poluentes aéreos para o sistema respiratório, eles são

responsáveis pelo desencadeamento de uma resposta inflamatória com a liberação de

células e mediadores inflamatórios (citocinas, quimiocinas).7, 26

As consequências à saúde relacionada ao uso de agrotóxicos são muito bem

exploradas por meio de estudos há algum tempo, porém, no Brasil, não se encontra

muitas informações na literatura sobre os efeitos causados pela exposição crônica a

essas substâncias, necessitando de uma maior atenção.

A hipótese deste estudo é que a exposição do herbicida 2,4-D nos modelos

experimentais, através de pulverização aérea em diferentes intervalos de tempo e tipos de

concentrações, provoque o aparecimento de infiltrado inflamatório nas vias aéreas.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral: Analisar o epitélio nasal e componentes do sangue de modelos

experimentais submetidos à pulverização crônica do herbicida 2,4-D.

2.2 Objetivos Específicos:

Analisar histopatologicamente o epitélio nasal de modelos experimentais

submetidos à pulverização crônica do herbicida 2,4-D, utilizando-se da coloração de

hematoxilina eosina;

Quantificar os componentes do sangue de modelos experimentais submetidos à pulverização do herbicida 2,4-D, utilizando-se o analisador hematológico.

3 METODOLOGIA

3.1 Aspectos de Natureza Ética

O estudo será submetido ao Comitê de Ética em animais da Universidade do

Oeste Paulista (UNOESTE) para possível aprovação para sua execução e será

realizado de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do

Instituto Nacional de Saúde (USA). Este trabalho faz parte de outro projeto já submetido

ao comitê de ética intitulado “"EXPOSIÇÃO CRÔNICA VIA INALATÓRIA E VIA ORAL

AO HERBICIDA ÁCIDO 2,4-DICLOROFENÓXIACÉTICO (2,4-D) - AVALIAÇÃO DO

POSSÍVEL EFEITO MUTAGÊNICO" sob o protocolo número 3761.

3.2 Protocolo animalPara a realização dos experimentos, serão utilizados 40 ratos Wistar adultos

machos e fêmeas 20 machos e 20 fêmeas (400g), fornecidos pelo Biotério Central da

UNOESTE, alocados em gaiolas plásticas individuais, medindo 30x16x19 centímetros, a

temperatura média de 22 ± 2ºC, com ciclos de 12 horas de luminosidade, sendo das

07:00 às 19:00 horas (período claro) e 19:00 às 07:00 horas (período escuro).

Os animais serão divididos aleatoriamente em quatro grupos:

GCI - grupo controle inalatório (n=10): expostos à nebulização com

solução de cloreto de sódio (NaCl) por aproximadamente 15 minutos,

de segunda à sexta-feira;

GBCI - grupo de baixa concentração inalatório (n=10): expostos à

nebulização do pesticida com 3,71 x 10-3 gramas de ingrediente ativo

por hectare (g.i.a/ha), durante 15 minutos, de segunda à sexta-feira;

GMCI - grupo de média concentração inalatório (n=10): expostos à

nebulização do pesticida com 6,19 x 10-3 gramas de ingrediente ativo

por hectare (g.i.a/ha), durante 15 minutos, de segunda à sexta-feira;

GACI - grupo de alta concentração inalatório (n=10): expostos à

nebulização do pesticida com 9,28 x 10-3 gramas de ingrediente ativo

por hectare (g.i.a/ha), durante 15 minutos, de segunda à sexta-feira;

3.3 Protocolo de exposição ao herbicida 2,4-D

O protocolo de experimentação contará com duas caixas (32x 24x 32 cm) cada

uma ligada a um nebulizador ultrassônico da marca Pulmosonic Star®29(Figura 4). O

tempo de exposição será de aproximadamente 15 minutos, para os animais, tempo este

necessário para que toda a solução seja nebulizada.

Figura 4 - Caixa de inalação.

Fonte: próprio autor.

Os animais expostos por via inalatória serão nebulizados todos os dias da

semana exceto aos sábados e domingos. A ração dos animais de todos os grupos será

pesada a cada troca para a avaliação da quantidade de ingestão.

Todos os animais serão expostos durante 4 meses e após este período serão

eutanasiados. A anestesia e eutanásia serão realizadas com Tiopental sódico (Syntec,

EUA), nas doses de 40 mg/Kg e 100 mg/Kg de peso, respectivamente, administrado na

cavidade peritoneal. Os indicativos de morte serão a ausência de movimentos

respiratórios, batimentos cardíacos e perda dos reflexos.30

3.4 Coleta das amostras de sangue

A coleta da amostra de sangue de cada animal será de 2 mL através da punção

intracardíaca, para a confecção do hemograma. Tanto as plaquetas, quanto as séries

vermelha e branca serão processadas em analisador hematológico modelo POCH-100iV

DIFF (Sysmex do Brasil Indústria e Comércio LTDA®, Curitiba/PR-Brasil).

5.5 Coleta e análise do epitélio nasal

Após a eutanásia dos animais, o focinho de cada camundongo será retirado para

a realização da análise histológica, posteriormente, fixados em formaldeído a 10% e em

seguida emblocados em parafina. Os blocos serão cortados em micrótomo eletrônico na

espessura de 5µm e corados por Hematoxilina-Eosina (HE) para a quantificação dos

leucócitos totais, onde as células coram-se de roxo e o citoplasma em rosa. Para a

quantificação dos mastócitos, será utilizada a coloração de Azul de toluidina, corando as

células na cor azul.

Após a confecção das lâminas, serão capturadas imagens em microscópio com

câmera acoplada (Leica ICC50 HD) para que sejam analisadas morfometricamente as

imagens obtidas. Será utilizado o software Image Pro Plus para quantificar os mastócitos

que estarão na lâmina própria, em toda extensão do corte. Para a avaliação do infiltrado

inflamatório e do muco será utilizado o método semiquantitativo proposto por Carnieli et

al. (2011).31 Este sistema classifica o infiltrado inflamatório em score de 1 a 3, sendo: 1

(áreas de inflamação ocasionais); 2 (inflamação em maioria das áreas, cercadas por uma

camada fina de células) e 3 (maioria das áreas inflamadas circundadas por uma camada

grossa de células). As lâminas contendo os cortes histológicos serão cegadas para que

os examinadores não saibam o grupo analisado e, desta forma, emitam falsos resultados.

5.6 Análise Estatística

Para a análise estatística será utilizado o programa Sigma Stat® versão 2.0.

Para análise de normalidade será utilizado o pacote estatístico Shapiro-Wilk

disponível no programa R (versão 3.2.3) Os casos em que os dados apresentarem

as distribuições normais e homocedásticas serão analisados utilizando-se de testes

paramétricos como o teste "t" de Student e a análise de variância (ANOVA) seguido

pelo teste de Tukey quando necessário. Caso contrário, serão utilizados testes não

paramétricos, o de Mann-Whitney, e o de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn

quando necessário. As proporções serão comparadas pelo teste do qui quadrado,

ou teste exato de Fisher. As diferenças serão consideradas estatisticamente

significantes quando p for menor que 5% (p<0,05).

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Campos BF, Azania CAM, Chaves, ARCS, Azania APM, Siqueira ME, Boneti JE, Jerônimo CHC. Seletividade de herbicidas para cana-de-açúcar cultivada em plantio convencional, mudas pré-brotadas IAC e plene PB. In: Anais do XXX Congresso Brasileiro da Ciência das Plantas Daninhas: Tecnologia a Serviço do Agricultor, 2016; Curitiba. Curitiba: UFSC, v. 1, 2016.

2. Saito EA. Mapeamento de cana-de-açúcar em áreas de assentamento de reforma agrária no município de Mirante do Paranapanema-SP utilizando imagens CCD/CBERS-2B. In: Anais do XIV Simpósio Brasileiro de Sensoriamento Remoto, 2009; Natal. Natal: Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais – INPE, p. 419-26, 2009.

3. IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Sistema IBGE de Recuperação Automática – SIDRA [Internet]. 2017. [acesso em 2017 jun 10]. Disponível em: http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/prevsaf/default.asp?t=1&z=t&o=26&u1=1&u2=1&u3=1&u4=1

4. Firetti R, Capanema LM, Fachini C, Turco PHN, Filho AAV. Análise de variáveis estratégicas para o desenvolvimento da agropecuária da região do Pontal do Paranapanema. Econ. Sociol. Rural. [Internet] 2012 [acesso em 2017 jun 10];50(1): 141-156. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-20032012000100008

5. Brasil. Sistema de Informações Territoriais. Caracterização do Território Pontal Do Paranapanema – SP [Internet]. 2010. [acesso em 2017 jun 14]. Disponível em: http://sit.mda.gov.br/download.php?ac=obterDadosBas&m=3528700

6. Barreto MJ. Territorialização das agroindústrias canavieiras no Pontal do Paranapanema e os desdobramentos para o trabalho [dissertação] [Internet]. Presidente Prudente: Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Programa de Pós-Graduação; 2012. [acesso em 2017 jun 11] Disponível em: http://hdl.handle.net/11449/96702

7. De Oliveira T, Favareto APA, Antunes PA. Agrotóxicos: levantamento dos mais utilizados no oeste paulista e seus efeitos como desreguladores endócrinos. Periódico Eletrônico Fórum Ambiental da Alta Paulista. [Internet] 2013 [acesso em 2017 jun 13];11(5): 375-90. Disponível em: http://amigosdanatureza.org.br/publicacoes/index.php/forum_ambiental/article/view/684

8. Brasil. Ministério da Saúde. Departamento de Vigilância em Saúde Ambiental e Saúde do Trabalhador. Nota informativa contendo esclarecimentos sobre pulverização aérea e o controle de endemias [Internet]. [acesso em 2017 jun 13]. Disponível em: https://cporgsc.files.wordpress.com/2016/06/parecer-pulverizacao-aecc81rea-ministecc81rio-da-saude.pdf

9. ABRASCO. Associação Brasileira de Saúde Coletiva. Nota contra pulverização aérea de inseticidas para controle de vetores [Internet]. 2016. [acesso em 2017 jun 14]. Disponível em: http://www.epsjv.fiocruz.br/sites/default/files/files/ABRASCO.pdf

10. Ferreira MLPC. A pulverização aérea de agrotóxicos no Brasil: cenário atual e desafios. R. Dir. sanit. 2014; 15(3): 18-45.

11. Costa AGF. Effect of nozzles and pressures on spray drift of glyphosate + 2,4-D in field conditions. Revista Brasileira de Herbicidas. 2012; 11(1): 62-70.

12. Carneiro FF, Augusto LGS, Rigotto RM, Friedrich K, Búrigo, AC. Fundação Oswaldo Cruz. Associação Brasileira de Saúde Coletiva – ABRASCO. Dossiê ABRASCO – Um alerta sobre os impactos dos agrotóxicos na saúde. Rio de Janeiro: EPSJV; São Paulo: Expressão Popular, 624 p, 2015.

13. Braibante MEF, Zappe JA. A Química dos Agrotóxicos. Quim. Nova. 2012; 34(1): 10-15.

14. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde - Departamento de Ações Programáticas Estratégicas - Área Técnica de Saúde do Trabalhador. Protocolo de Atenção à Saúde dos Trabalhadores Expostos a agrotóxicos [Internet]. 2006 [acesso em 2017 jun 11]. Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/protocolo_atencao_saude_trab_exp_agrotoxicos.pdf

15. Bombardi LM. Intoxicação e morte por agrotóxicos no Brasil: a nova versão do capitalismo oligopolizado. Boletim DATALUTA [Internet]. São Paulo. 2011 [acesso em 2017 jun 10]. Disponível em: http://www2.fct.unesp.br/nera/artigodomes/9artigodomes_2011.pdf

16. Andrade FC. Percepção de risco do uso de agrotóxicos entre agricultores feirantes e estudantes do curso de gestão ambiental na região do Médio Jequitinhonha [dissertação]. Diamantina: UFVJM, 2016.

17. Junior OPA, Santos TCR, Brito NM, Ribeiro ML. Revisão das propriedades, usos e legislação do ácido 2,4 Diclorofenoxiacético (2,4-D). Cad Pesq. 2002; 13(1): 60-70.

18. Junior OPA, Santos TCR, Nunes GS, Ribeiro ML. Breve revisão de métodos de determinação de resíduos do herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Quim Nova. 2003; 26(2): 223-229.

19. Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA [Internet]. [acesso em 2017 jul 13]. Disponível em: http://portal.anvisa.gov.br/documents/111215/117782/D27%2B%2B24D.pdf/8548d5b3-f306-49df-ac49-4498bc5768d8

20. Tu J, Inthavong K, Ahmadi G. Computational Fluid and Particle Dynamics in the Human Respiratory System. New York: Springer, 2013.

21. Barbosa PMK; De Oliveira Santos, BM. Alterações morfológicas em traqueias de pacientes intubados em função do tempo de intubação. Rev Latino-Am. Enfermagem. [Internet]. 2003 [acesso em 2017 jun 14];11(6): 727-733. Disponível em:

http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0104-11692003000600005&script=sci_abstract&tlng=pt

22. Bertassoli BM, Santos AC, Oliveira FD, Oliveira DM, Neto ACA, Carvalho AF. Morphology of the trachea and larynx of opossums (Didelphis sp.). Ciênc. Anim. [Internet]. 2013 [acesso em 2017 jun 12]; 14(2): 222-229. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1809-68912013000200010

23. Marchesan, IQ. Avaliação e terapia dos problemas da respiração. In: Marchesan IQ. Fundamentos em fonoaudiologia: aspectos clínicos da motricidade oral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998, p. 23-36.

24. Silva LCS, Lessa TB, Santos PRS, Rici REG, Bombonato PP, Ambrósio CE. Arquitetura da árvore brônquica no sagüi-de-tufo-preto: um modelo animal experimental para leões do sistema respiratório. Archives of Veterinary Science. [Internet]. 2012 [acesso em 2017 jun 10]; 17(4): 63-69. Disponível em: http://revistas.ufpr.br/veterinary/article/view/24137/19138

25. Brandão FH. Avaliação histológica do epitélio olfatório de camundongos submetidos ao fumo passivo em tempo e quantidades variáveis [dissertação]. São Paulo: Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo; 2009.

26. Arbex MA, Santos UP, Martins LC, Saldiva PHN, Pereira LAA, Braga ALF. A poluição do ar e o sistema respiratório. J. Bras. Pneumol. [Internet]. 2012 [acesso em 2017 jun 11]; 38(5):643-655. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-37132012000500015

27. Rigotto RM, Silva AMC, Ferreira MJM, Rosa IF, Aguiar ACP. Tendências de agravos crônicos à saúde associados a agrotóxicos em região de fruticultura no Ceará, Brasil. Rev Bras Epidemiol. [Internet]. 2013 [acesso em 2017 jun 13]; 16(3): 763-773. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-790X2013000300763&script=sci_arttext&tlng=pt

28. Friedrich, K. Avaliação dos efeitos tóxicos sobre o sistema reprodutivo, hormonal e câncer para seres humanos após o uso do herbicida 2, 4-D. Parecer técnico. [Internet] 2014 [acesso em 2017 jun 12] 44 f. Rio de Janeiro: Fundação Osvaldo Cruz - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Disponível em: file:///C:/Users/gabi_/Downloads/parecer%20herbicida%2024-D%20Karen%20Friedrich%20(1).pdf

29. Domingues RR; Mesquita GL; Cantarella H; Mattos JD. Suscetibilidade do capim-colonião e de cultivares de milho ao flúor. Bragantia [Internet]. 2011[acesso em 2017 jun 10]; 70 (4): 729-736. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S0006-87052011000400001&lng=pt&nrm=iso

30. Paiva FP, Mafilli VV, Santos ACS. Curso de Manipulação de Animais de Laboratório. [Internet] 2005 [acesso em 2017 jun 14] Rio de Janeiro: Fundação Osvaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Muniz, 2005. Disponível em: http://www.bioteriocentral.ufc.br/arquivos/apostilha_manipulacao.pdf

31. Carnieli DS, Yoshioka E, Silva LF, Lanças T, Arantes FM, Perini A, Martins MA, Saldiva PHN, Dolhnikoff M, Mauad T. Inflammation and remodeling in infantile, juvenile and adult allergic sensitized mice. Pediatr Pulmonol 2011; 46(7): 650-665.