Embed Size (px)
Citation preview
i
MONALISA NOGUEIRA COSTA
EFEITOS AGUDOS DA SINVASTATINA SOBRE CÉLULAS-TRONCO
NEOPLÁSICAS EM MODELO MURINO DE CARCINOMA MAMÁRIO
INVASIVO INDUZIDO POR 7,12-DIMETIL-BENZ(A)ANTRACENO
(DMBA)
CAMPINAS
2015
ii
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
MONALISA NOGUEIRA COSTA
EFEITOS AGUDOS DA SINVASTATINA SOBRE CÉLULAS-TRONCO
NEOPLÁSICAS EM MODELO MURINO DE CARCINOMA MAMÁRIO
INVASIVO INDUZIDO POR 7,12-DIMETIL-BENZ(A)ANTRACENO
(DMBA)
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
ORIENTADOR: ANDRÉ ALMEIDA SCHENKA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA MONALISA NOGUEIRA COSTA, E ORIENTADA PELO
PROF. DR. ANDRE ALMEIDA SCHENKA
___________________________________
Assinatura do Orientador
CAMPINAS
2015
iv
v
vi
vii
RESUMO
A sinvastatina pertence à classe das estatinas, drogas capazes de inibir a enzima
3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A redutase (HMG-CoA redutase), interferindo
desse modo com a síntese intracelular e os níveis plasmáticos de colesterol no
organismo. Embora tradicionalmente utilizadas na prevenção primária e
secundária de doenças cardiovasculares, as estatinas vêm sendo testadas nas
últimas décadas como possíveis drogas antineoplásicas em estudos
experimentais pré-clínicos. Parte da ação antineoplásica demonstrada até o
momento parecer estar relacionada a um efeito inibitório sobre as chamadas
células-tronco neoplásicas (CTNs), que representam uma pequena subpopulação
celular emleucemias e tumores sólidossendo consistentemente associadasa(1)
potencial metastático, (2) à resistência a quimio- e radioterapias, e (3) a pior
prognóstico. Estudos realizados por este grupo de pesquisa confirmam os efeitos
antitumorais e anti-CTN da sinvastatina quando esta é administrada cronicamente,
em dosesrelativamente baixas (i.e., comparáveis às doses antidislipidêmicas, em
humanos). Contudo, até o presente momento, não há registros na literatura sobre
a existência de efeitos antineoplásicos ou anti-CTN agudos, utilizando-se o
referido fármaco em doses altas. Em outras palavras, não existem evidências de
que a sinvastatina poderia ser utilizada com sucesso em um esquema posológico
intermitente de alta dosagem (quimioterapia clássica em ciclos). Assim sendo, o
objetivo principal do presente trabalho foi confirmar e caracterizar a ocorrência de
efeitos antineoplásicos e anti-CTN com o uso de sinvastatina em regime agudo e
de alta dosagem. Para tanto, ratas Sprague-Dawley portadoras de carcinomas
mamários invasivos induzidos por 7,12-dimetil-benz-(a)- antraceno (DMBA) foram
tratadas com uma dose única intragástrica de sinvastatina (250mg/kg; n=6) ou de
seu diluente (óleo de soja; n=6), sendo os efeitos sobre a morte celular, atividade
proliferativa e expressão imunoistoquímica de marcadores CTN clássicos
avaliados 24h depois. Observou-se que o tratamento com sinvastatina promoveu
agudamente uma redução do índice de proliferação celular (de cerca de 54%;
viii
p=0.037), associada a uma diminuição nas expressões de algunsmarcadores
CTN, tais como ALDH1 (74%, p=0.004) e OCT3/4 (72%; p=0.036). Em
contrapartida, não observamos alterações na frequência de células CD44+,
CD133+, EPCAM+, CD24-/CD44+ ou CD133+/EPCAM+ (p>0.05), tão pouco no
número de células em apoptose (células positivas para caspase 3).
Paradoxalmente, encontramos um aumento na frequência relativa de células
CD24+ de cerca de 17X (p=0.010). Em conclusão, pode-se afirmar que a
sinvastatina em dose alta apresenta precocemente (agudamente): (1) ação
antineoplásica do tipo citostática (já que reduz a proliferação celular, sem causar
morte) e (2) anti-CTN limitada (isto é, restrita a células que expressam ALDH1 e
OCT3/4).
Palavras-chave*: Sinvastatina, Células-Tronco, Câncer de Mama, DMBA,Imuno-
Histoquímica.
* Extraídas de vocabulário controlado da área, isto é, do DeCS (Descritores em
Ciências da Saúde), disponível emhttp://decs.bvs.br (última consulta: 01/12/2014).
A grafia (incluindo uso de maiúsculas/minúsculas) segue a recomendação do
DeCS.
ix
ABSTRACT
Simvastatin belongs to a group of pharmacological agents called statins – drugs
that inhibit 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase (HMG-CoA
reductase), thus interfering with the intracellular synthesis and serum levels of
cholesterol in the organism. Although traditionally used in primary and secondary
prevention of cardiovascular diseases, statins have been tested in the last decades
as putative antineoplastic drugs, in pre-clinical (experimental) studies. Part of the
antineoplastic action so far demonstrated seems to be related to an inhibitory effect
on the so-called cancer stem cells (CSCs), a small cell subpopulation of leukemias
and solid tumors, which are consistently associated to (1) metastatic potential, (2)
chemo- and radiotherapy resistance, and (3) worse prognosis. Accumulated
evidence provided by this group confirm the anti-tumoral and anti-CSC effects of
simvastatin, when it is given chronicallyand in relatively low doses (i.e., similar to
antidyslipidemic doses, in humans). However, up to the present moment, there are
no records in the literature describing the existence of acute antineoplastic or anti-
CSC effects using the mentioned drug in high doses. In other words, there is no
evidence that simvastatin could be used successfully in an intermittent high-
dosage schedule (classic cyclic chemotherapy). Therefore, the main goal of the
present study was to confirm and characterize the antineoplastic and anti-CSC
effects of an intermittent single high-dosage schedule of simvastatin.In order to do
so, female Sprague-Dawley rats bearing invasive carcinomas previously induced
by 7,12-dimethyl-benz-(a)- anthracene (DMBA) were treated with a single
intragastric doseof simvastatin (250mg/kg; n=6) orofits diluent (soy oil; n=6), and
the effects oncell death, proliferation activity and immunoexpression of classic CSC
markers were assessed 24h later. Treatment with simvastatin resulted, acutely, in
a reduction of proliferation index (of approximately 54%, p=0.037), associated to a
decrease in the expression of some of the CSC markers, such as ALDH1 (74%,
p=0.004) and OCT3/4 (72%; p=0.036). On the other hand, there were no
significant alterations in the frequency of CD44+, CD133+, EPCAM+, CD24-
x
/CD44+ or CD133+/EPCAM+ cells (p>0.05), nor in the number of apoptotic cells
(caspase 3+ cells). Paradoxically, we found a 17-fold increase in the frequency of
CD24+ cells (p=0.010). In conclusion, high-dose simvastatin presents acutely
(early) with: (1) a cytostatic antineoplastic action (since it reduces cell proliferation
but not cell death) and (2) a limited anti-CSCeffect (i.e., restricted to ALDH1+and
OCT3/4+ cells).
Keywords*: Simvastatin, Stem Cells, Breast Cancer, DMBA, Imunohistochemistry.
* According to DeCS (“Descritores em Ciências da Saúde”), available
athttp://decs.bvs.br (last access: 12/01/2014).
xi
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA xiii
AGRADECIMENTOS xv
LISTA DE FIGURAS xvii
LISTA DE TABELAS xix
LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E SIGLAS xxi
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. Sinvastatina 1
1.2. Células-tronco neoplásicas e carcinoma mamário 10
1.3. Estatinas e células-tronco neoplásicas mamárias 18
1.4. Justificativas 20
2. OBJETIVOS 21
3. MATERIAL & MÉTODOS 23
3.1. Aspectos éticos 23
3.2. Locais de realização do trabalho 23
3.3. Animais 24
3.4. Delineamento experimental 1: estabelecimento da dose-teste de
sinvastatina
24
3.5. Delineamento experimental 2: efeitos antineoplásicos e anti-CTN
agudos da dose teste de sinvastatina
27
xii
3.6. Análise estatística 45
4. RESULTADOS 47
4.1. Escolha da dose-teste: resultados da avaliação bioquímica 47
4.2. Efeitos agudos da sinvastatina na dose-teste selecionada
(250mg/Kg)
5. DISCUSSÃO 78
5.1. Primeira parte: efeitos farmacológicos agudos no animal Sprague-
Dawley normal e seleção da dose-teste ideal
78
5.2. Segunda parte: ação antineoplásica e anti-CTN da sinvastatina 84
6. SÍNTESE DE RESULTADOS E CONCLUSÕES 90
7. REFERÊNCIAS 92
8. ANEXOS 102
xiii
DEDICATÓRIA
Aos animais
“Foste um instrumento de nosso aprendizado?
Foste apenas um objeto de experiência?
Não!
Foste para nós, vítimas solicitadas pela ciência, para benefício da
Humanidade, porém, apesar do teu olhar mudo e de não teres permissão
da palavra , isso não nós impedirá de dizer-te sempre:muito obrigado.”
(Autor Desconhecido)
Dedico este trabalho...
…a toda a minha família por terem me dado o dom da vida e o carinho
incondicional para seguir em frente sempre.
xiv
xv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ser a Inteligência Suprema e a Causa Inicial de tudo.
Agradeço aos meus guias espirituais por estarem sempre ao meu auxílio quando
preciso.
Agradeço ao professor André Almeida Schenka pela oportunidade e pela
orientação.
Agradeço ao meu amigo André Rennó sem o qual eu não teria conseguido realizar
meu projeto.
Agradeço aos amigos do laboratório Valéria e Philipi pela inestimável ajuda.
Agradeço a toda a Equipe do Hospital A. C. Camargo pelo auxílio na confecção
dos TMAs e no escaneamento das lâminas de imunoistoquímica
xvi
xvii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Biossíntese do colesterol, ação enzimática da HMG-CoA
redutase e ação inibitória das estatinas.
3
Figura 2. Estruturas químicas dos inibidores da 3-hidroxi-3-metil-glutaril
coenzima A redutase (HMG-CoA redutase).
4
Figura 3: Fotomicrografias ilustrativas dos padrões de imunomarcação
previstos na classificação da positividade para o produto do oncogene
HER2/neu.
41
Figura 4. Perfil lipídico. 49
Figura 5. Perfil hepático. 52
Figura 6. Fotomicrografias representativas de tecido hepático (zona 3
acinar) de animais sem tratamento farmacológico (A) ou tratados com
sinvastatina nas doses de 125mg/Kg (B), 250mg/Kg (C) e 500mg/Kg.
Figura 7.Fotomicrografias representativas de tecido hepático (espaço
porta) de animais sem tratamento farmacológico (A) ou tratados com
sinvastatina na dose de 125mg/Kg (B), 250 mg/Kg (C) e 500 mg/Kg.
53
Figura 8. Dosagem de creatina quinase sérica (miotoxicidade). 55
Figura 9. Fotomicrografias representativas de tecido muscular
esquelético estriado (músculo masseter) de animais sem tratamento
farmacológico (A) ou tratados com sinvastatina nas doses de 125mg/Kg
(B), 250mg/Kg (C) e 500mg/Kg.
56
Figura 10. Crescimento volumétrico tumoral em 24h. 1
Figura 11. Incremento volumétrico tumoral em 24h (Volume final – 59
xviii
Volume inicial).
Figura 12. Número de tumores por animal. 60
Figura 13. Características morfológicas indicativas de resposta
terapêutica.
62
Figura 14. Marcadores imunoistoquímicos indicativos de resposta
terapêutica.
64
Figura 15. Gráficos ilustrativos das diferenças entre grupo controle (sem
tratamento) e experimental (tratamento com sinvastatina), com relação à
expressão imunoistoquímica dos marcadores de células-tronco
neoplásicas (CTN).
67
Figura 16. Gráficos ilustrativos das diferenças entre grupo controle (sem
tratamento) e experimental (tratamento com sinvastatina), com relação à
expressão imunoistoquímica dos marcadores de células-tronco
neoplásicas (CTN) ALDH1 (A) e OCT3/4 (B).
68
Figura 17. Fotomicrografias ilustrativas das principais imunocolorações
realizadas no trabalho.
69
Figura 18. Gráficos representativos da percentagem de células
expressando receptores hormonais nos grupos controle e experimental.
72
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Propriedades farmacocinéticas de diferentes estatinas. 7
Tabela 2. Principais marcadores imunofenotípicos de CTN, em
diferentes neoplasias malignas.
14
Tabela 3. Monomarcadores (single markers) de células-tronco e suas
principais características.
33
Tabela 4. Marcadores de CTN para estudos de dupla marcação (perfil
CTN) e suas características principais.
35
Tabela 5. Monomarcadores (single markers) de prognóstico e resposta
terapêutica e suas principais características.
37
Tabela 6. Classificação “alternativa” dos carcinomas da mama em
subtipos moleculares intrínsecos.
38
Tabela 7.Status de positividade para receptor de estrógeno em animais
controle e experimentais.
73
Tabela 8.Status de positividade para receptor de progesterona em
animais controle e experimentais.
74
Tabela 9.Status de positividade para a superexpressão do oncogene
HER2/neu em animais controle e experimentais.
75
Tabela 10. Subtipagem molecular alternativa simplificada (agrupada)
em animais controle e experimentais.
76
xx
xxi
LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E SIGLAS
ALDH1- aldeído desidrogenase 1 (Aldehydedehydrogenase 1)
ALT- Alanina transaminase
AST-Aspartato transaminase
CK- Creatinina quinase
CGA-Campo de grande aumento
CMA- Campo de médio aumento
CP- Célula progenitora
CPs- Células progenitoras
CPA- Campo de pequeno aumento
CT- Célula-tronco
CTs- Células-tronco
CTN- Célula-tronco neoplásica
CTNs- Células-tronco neoplásica
DMBA- Dimetilbenz-(a)-antraceno
DAB-diaminobenzidina
EPCAM/ESA- Antígeno epitelial específico (Ephitelial specific antigen)
HDL- Lipoproteína de alta densidade (High density lipoprotein)
HER-2 –Human epidermanl growth factor receptor 2
HMG-CoA - 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A
INCA- Instituto Nacional do Câncer
LDL- Lipoproteína de baixa densidade (Low density lipoprotein)
MNU- n-metil-n-nitrosourea
OCT-4– Octâmero de ligação do fator de transcrição 3/4
OMS- Organização Mundial da Saúde
VLDL- Lipoproteína de baixíssima densidade(Very low density lipoprotein)
xxii
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Sinvastatina
A sinvastatina é parte de uma classe de fármacos chamados de estatinas
ou vastatinas. As estatinas inibem a enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A
redutase (HMG-CoA redutase), a qual é responsável pela etapa limitante da
biossíntese do colesterol, ou seja, pela conversão de 3-hidroxi-3-metil-glutaril
coenzima A (HMG-CoA) em ácido mevalônico/mevalonato(Figura
1)(SCHACHTER, 2004; MAGALHÃES, 2010; BERSOT, 2012).A HMG-CoA
redutase é encontrada principalmente em hepatócitos. Além do tecido hepático,
outros tecidos periféricos como adrenais, gônadas, coração, vasos sanguíneos,
cérebro e mama também contém a enzima (GIBBONS & PULLINGER, 1983;
BORGQUIST et al., 2008; EISA-BEYGI et al., 2014).
Os vários tipos de estatinas possuem afinidade pelo mesmo sítio ativo da
enzima HMG-CoA redutase, agindo como inibidores competitivos (MAGALHÃES,
2010; BERSOT, 2012).A inibição da HMG-CoA redutase é dada pelo grupo
farmacofórico, um anel aromático hidrofóbico capaz de se ligar de maneira
reversível com o sítio ativo da enzima HMG-CoA (Figura 2) (SCHACHTER, 2004).
O efeito imediato da inibição da HMG-CoA redutase no hepatócito é a redução dos
níveis intracelulares de colesterol. Em resposta a essa redução, ocorre um
aumento na transcrição de receptores de LDL-colesterol. Este aumento na
transcrição (e na incorporação de receptores de LDL à membrana do
2
hepatócito)resulta, por sua vez,em um aumento da captação do LDL-colesterol
circulante pelo hepatócito e, consequentemente, na redução nos níveis séricos de
LDL (MAGALHÃES, 2010; BERSOT, 2012).
3
Figura 1.Biossíntese do colesterol, ação enzimática da HMG-CoA redutase e ação
inibitória das estatinas (modificado de SCHACHTER, 2004).
4
Figura 2. Estruturas químicas dos inibidores da 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima
A redutase (HMG-CoA redutase). Circulado encontra-se o grupo farmacofórico
responsável pela inibição da ação enzimática que possui semelhança estrutural
com a HMG-CoA(modificado de SCHACHTER, 2004).
5
O LDL-colesterol corresponde a fração do colesterol sérico ligada a
lipoproteína de baixa densidade, sendo também conhecido como colesterol “ruim”,
devido a sua associação positiva com risco cardiovascular. Em função deste
último efeito, esta classe de drogas é utilizada com frequência na prevenção e no
tratamento de doenças cardiovasculares associadas a dislipidemias
(MAGALHÃES, 2010; BERSOT, 2012).
As estatinas podem ser agrupadas emdrogas lipofílicas(representadas pela
sinvastatina, mevastatina, lovastatina, fluvastatina, atorvastatina e pitavastatina)
ouhidrofílicas(que incluem a rosuvastatina e a pravastatina)(JAKOBISIAK&
GOLAB, 2010). A mevastatina e a lovastatina são compostos naturais (derivados
de fungos); a sinvastatina e pravastatina são moléculas semi-sintéticas, ao passo
que a demais (fluvastatina, atorvastatina, rosuvastatatina, e pitavastatina) são
sintéticas (CHAN et al., 2003; SCHACHTER, 2004; GAUTHAMAN et al., 2009ª).
Essas drogas também se diferenciam quanto às propriedades farmacocinéticas,
conforme pode ser verificado na Tabela 1(CHAN et al., 2003; SIRTORI, 2014).
Apesar das diferenças químicas (em particular de lipofilicidade), de origem
e farmacocinéticas, não se evidenciam grandes diferenças farmacológicas entre
esses compostos, seja do ponto de vista quali- ou quantitativo(NAKAHARAet al.,
1998; GAUTHAMAN et al., 2009ª).Duas exceções dignas de nota ocorrem,
todavia, no plano da toxicidade: fármacos lipofílicos parecem causar efeitos
adversos mais abrangentes (envolvendo principalmente disfunções hepáticas e da
musculatura esquelética estriada) enquanto as drogas hidrofílicas estão mais
6
frequentemente implicadas em nefrotoxicidade(NAKAHARAet al., 1998;
GAUTHAMAN et al., 2009ª).
7
Tabela 1. Propriedades farmacocinéticasde diferentes estatinas.
IC50a(
nM)
Absorção
Oral (%)
Biodisponi-
bilidade(%
)
Ligação a
proteína
(%)
T1/2b
(h)
Vdc
(L/Kg)
Metabolismo:
isoenzima
CYP450
Pravastatina 4 35 18 50 1-3 0,46 3A4
Lovastatina 2-4 30 5 >98 2-5 - 3A4
Sinvastatina 1-2 60-65 <5 >95 2-5 - 3A4
Fluvastatina 3-10 98 30 >98 1-3 0,42 2C9
Atorvastatina 1,16 30 12 >98 7-20 5,4 3A4
Rosuvastatina 0,16 50 20 90 20 1,7 2C9
Pitavastatina 0,1 80 60 96 10-13 0,70 2C9
a Concentração capaz de inibir 50% da atividade da HMGCoA redutasedo ensaio.
b Meia-vida de eliminação.
c Volume de distribuição.
Adaptado de: SIRTORI, 2014.
8
De uma forma geral, as estatinas são consideradas como drogas seguras,
já que as reações adversas são pouco frequentes(SCHACHTER, 2004). Entre as
reações adversas mais frequentemente observadas encontram-se: (1) a
miotoxicidade (que pode variar desde fadiga e dor muscular leves até quadros de
rabdomiólise, associados ou não com nefrotoxicidade secundária a
mioglobinúria);(2) disfunção hepática (caracterizada por aumentos de
transaminases) e (3) nefrotoxicidade direta(nefrite túbulo-intersticial) (SCHIMIDTet
al., 2001; SCHACHTER, 2004;SIRTORI, 2014). Em função deste perfil de
toxicidade, é prática comum a coleta de exames laboratoriais (i.e., perfil hepático,
perfil renal e enzimas musculares) antes do início da terapêutica, para
acompanhamento do paciente e diagnóstico precoce de efeitos colaterais. As três
formas mais comuns de toxicidade (muscular, hepática e renal) são consideradas
como efeitos de classe farmacológica, sendo em geral dose-dependentes e
responsíveis à suspensão do medicamento na fase de instalação dos efeitos
adversos (daí a importância do diagnóstico precoce da toxicidade) (SCHIMIDTet
al., 2001; SCHACHTER, 2004;BERSOT, 2012; SIRTORI, 2014).
Além da açãoantidislipidêmica, as estatinas podem exercer outros efeitos
farmacológicos, entre os quais se destacam: efeitos imunomodulatórios, anti-
inflamatórios, anti-oxidativos e anti-neoplásicos (KWAK et al., 2001; SCHIMIDTet
al., 2001; GAUTHAMAN et al., 2009ª). Estes últimosparecem envolver tanto um
efeito preventivo de diversos processos tumorais, como regressivo de neoplasias
já instaladas (BLAIS et al., 2001; KWAK et al., 2001; SASSANO et al., 2008).
9
Estudos recentes têm demonstrado que o uso crônico de estatinaspode
diminuir o risco de câncer mais de 20% (BLAIS et al., 2001; GRAAF et al., 2004;
BOUDREAU et al., 2004). Em recente estudo de revisão da literatura, sugere-se
que o efeito anti-tumoral das estatinas possa ocorrer não apenas mediante uso
combinado com outros fármacos antitumorais, mas também com o simples uso
crônico isolado(JAKOBISIAK& GOLAB, 2010).
Dentre os prováveis mecanismos de ação que explicariam os efeitos
antineoplásicos das estatinas demonstrados até o momento, destacam-se: a
inibição da proliferação celular, a promoção de morte celular por apoptose, a
inibição da angiogênese e do potencialmetastatizante(SASSANO et al., 2008;
GAUTHAMAN et al.; 2009a). Tais efeitos poderiam estar diretamente relacionados
à inibição da síntese do mevalonato ou a efeitos farmacológicos paralelos, como
por exemplo alterações dos níveis de transcrição de oncogenes. Contudo,
osmecanismos exatosenvolvidos na ação antineoplásica pelas estatinas ainda não
foram totalmente esclarecidos (GOSH-CHOUDHURY, 2010).
Embora existam evidências de que tanto as estatinas lipofílicas como as
hidrofílicas tenham propriedades antineoplásicas, segundo alguns autores, as
drogas lipofílicas seriam as mais efetivas (HINDLER et al., 2006; GAUTHAMAN
et al.; 2009b). Tanto as leucemias como as malignidades sólidas parecem ser
sensíveis às estatinas. Cumpre ressaltar que, dentre os tumores sólidos mais
sensíveis à ação das estatinas, destacam-se o glioblastoma, os carcinomas da
região colorretal e as neoplasias malignas de mama(BOUDREAU et al., 2004;
SASSANO et al., 2008),sendo estas objeto de estudo no presente trabalho.
10
1.2. Células-tronco neoplásicas e carcinoma mamário
As células tronco (CT) podem ser definidas como células capazes de (1)
auto-renovação e de (2) originar diferentes linhagens celulares (potencial multi-
linhagem)(KLONISCHet al., 2008). Em geral, são classificadas segundo o tecido
de origem em: embrionárias, fetais, umbilicais e adultas (GAUTHAMANet al.,
2009a). As CTs podem proliferar através de divisões simétricas ou assimétricas,
originando, no primeiro caso, duas células-tronco filhas, ou uma nova célula-tronco
e uma célula progenitora, que posteriormente produzirá células maduras (AL-HAJI
& CLARKE, 2004; LI & ROSEN, 2005; KAKARALA & WICHA, 2009).
Em conjunto, a capacidade de autorrenovação e o potencial multilinhagem
conferem às CT um papel fundamental tanto em processos fisiológicos (tais como
a formação de órgãos durante a embriogênese, a renovação natural de epitélios e
a reparação/cicatrização de tecidos lesados), quanto patológicos. Dentre os
processos patológicos, destacam-se: inúmeras condições inflamatórias,
degenerativas, alterações metabólicas e processos neoplásicos (em particular,
neoplasias malignas) (KLONISCHet al., 2008). Em várias neoplasias malignas
(incluindo leucemias e alguns tumores sólidos), evidências científicas recentes
indicam que a célula alvo de mutações cumulativas responsáveis pelo
desenvolvimento e manutenção do fenótipo canceroso seja uma célula normal
com características fenotípicas de CT adulta (LI & ROSEN, 2005).
Independentemente da origem da neoplasia (se em célula
madura/diferenciada ou em CT), é possível constatar in vitro e in vivo, em um
11
grande número de tumores malignos, uma subpopulação de células
indiferenciadas, com características fenotípicas de célula tronco, que em geral
correspondem a menos de 2% da neoplasia (KLONISCHet al., 2008). Essas
células são designadas na maioria dos estudos como “células tronco cancerosas
(CTC) ou neoplásicas (CTNs)”. Com frequência, especula-se que as CTNs
poderiam ser responsáveis pela heterogeneidade morfológica e molecular de
algumas neoplasias (como os carcinomas mamários e ovarianos) (KAKARALA &
WICHA, 2008; LI & ROSEN, 2005).
Embora representem, geralmente, uma pequena parcela da neoplasia total,
as CTNs têm sido associadas em inúmeros estudos à capacidade de algumas
malignidades de resistir às principais modalidades terapêuticas anti-neoplásicas –
especialmente, a quimio-, radio- e imunoterapias (KLONISCHet al., 2008;
KAKARALA&WICHA, 2008). Essas abordagens terapêuticas parecem atuar de
forma eficaz apenas sobre as células diferenciadas da neoplasia (principalmente,
as que estão em ciclo celular e que apresentam elevados índices de proliferação),
reduzindo essa subpopulação, sem comprometer significantemente as CTNs. A
preservação, mesmo que parcial, de CTNs por sua vez poderia contribuir de forma
decisiva para recidivas neoplásicas locais e à distância, em médio ou longo prazo
(KAKARALA & WICHA, 2008; LI & ROSEN, 2005).
A razão pela qual as CTNs seriam mais resistentes às modalidades
terapêuticas anti-neoplásicas parece residir no fato das CTNs apresentarem
baixos índices proliferativos (sendo que a maioria das estratégias terapêuticas são
mais efetivas em células em ciclo) e expressarem moléculas transportadoras de
12
xenobióticos (transportadores de efluxo), que impedem o acúmulo citosólico de
fármacos anti-neoplásicos, exercendo papel fundamental na chamada resistência
neoplásica a múltiplas drogas (KLONISCHet al., 2008). Dentre essas moléculas
transportadoras de efluxo, destacam-se a glicoproteína P (Pgp), produto do gene
MDR1 (“multidrug resistance gene 1” ou ABCG1), bem como a proteína codificada
pelo gene ABCG2 (ATP-binding cassette sub-family G member 2). A proliferação
lenta das CTNs também explicaria a participação destas células principalmente
nas recidivas tumorais após 5 anos de remissão, uma situação observada com
certa freqüência em carcinomas (como o mamário) e sarcomas (como
osteossarcoma e o sarcoma sinovial) (HARBECK, 2008).
Do ponto de vista imunofenotípico, as CTNs se caracterizam por um padrão
ou perfil de expressão de moléculas - em sua maioria glicoproteínas de superfície,
proteínas citosólicas ou nucleares. Esse perfil é definido tanto pela expressão
típica de algumas moléculas (e.g., CD133, C-kit/CD157, p63, ESA, Oct-4, Sca-1,
etc. – vide Tabela 2 abaixo) quanto pela ausência de outras moléculas (e.g.,
CD24). O perfil imunofenotípico característico de CTN pode variar: (1) de
neoplasia para neoplasia, segundo a histogênese ou o tipo histológico das
mesmas (ou seja, neoplasias originadas em tecidos ou linhagens celulares
diferentes podem apresentar perfis imunofenotípicos distintos); (2) entre espécies
animais diferentes (e, portanto, entre modelos experimentais de neoplasia
distintos); e (3) dentro de um mesmo tumor, sugerindo a coexistência de diferentes
clones de CTN ou a presença de subclasses funcionais distintas (KLONISCHet
al., 2008). Além disso, nem sempre o perfil imunofenotípico de determinada CTN
13
coincide perfeitamente com o perfil da CT normal correspondente, o que indica
que algumas destas moléculas possam ter um papel importante para a
manutenção do próprio fenótipo neoplásico ou maligno (KLONISCHet al., 2008).
Vale lembrar que a existência de perfis imunofenotípicos típicos de CTNs permite
a detecção dessas células (in vitro e in vivo), o que por sua vez favorece e agiliza
enormemente a realização de estudos sobre CTNs, voltados para o entendimento
de aspectos fisiopatológicos e para o desenvolvimento de aplicações clínicas (e.g.,
testes diagnósticos, ferramentas de avaliação prognóstica/preditiva de resposta
terapêutica e estratégias de tratamento, em particular, farmacológicas)
(KLONISCHet al., 2008; WOODWARD & SULMAN, 2008).
14
Tabela 2. Principais marcadores imunofenotípicos de CTN, em diferentes
neoplasias malignas.
Marcador Sinonímia Órgão/tecido
CD24 Heat stable antigen Mama (CT [murina] e CTN)
CD29 Integrina beta-1 Mama (CT [murina] e CTN)
EPCAM ESA/Antígeno epitelial-
específico
Mama e pâncreas (CTN)
CD44 - Mama e próstata (CTN)
CD49f Integrina alfa-6 Próstata (CTN)
CD133 Prominina-1 Mama e próstata (CTN)
p63 - Mama e próstata (CT e CTN)
OCT3/4 - Mama, próstata, músculo, MO (CT e CTN)
NCAM CD56 Intestino (CTN); fígado e pâncreas (CT)
CD34 - Intestino (CTN); fígado e pâncreas (CT)
ALDH1 Aldeído-lactato desidrogenase
1
Mama, Intestino (CTN); fígado e pâncreas
(CT)
c-Kit CD117 Intestino (CTN); fígado e pâncreas (CT)
Flt-3 CD135 Intestino (CTN); fígado e pâncreas (CT)
Adaptado de: KLONISCHet al. 2008.Abrev.: CT= célula tronco normal,
CTN= célula tronco neoplásica, MO= medula óssea (séries hemopoiéticas).
15
Além de estarem implicadas em resistência terapêutica, a presença e a
proporção de CTNs em uma neoplasia maligna podem estar associadas a
comportamento biológico mais agressivo (e.g., maior capacidade de
invasão/metastatização) e, por conseguinte, pior prognóstico (KAKARALA &
WICHA, 2008). A relação entre CTN e parâmetros de valor prognóstico/preditivo
de resposta terapêutica em malignidades torna este fenótipo celular um alvo
essencial em pesquisas sobre fisiopatologia do câncer e farmacologia de
antineoplásicos, direcionadas para o aprimoramento das estratégias atuais de
tratamento do câncer. Grande parte da literatura neste tema se desenvolveu há
menos de 10 anos, inicialmente envolvendo neoplasias hematológicas (em
particular, leucemias) e, posteriormente, neoplasias sólidas, com destaque para a
pesquisa relacionada ao câncer de mama (WOODWARD & SULMAN, 2008).
O grande interesse no estudo dos carcinomas mamários se deve, pelo
menos em parte, ao fato destas neoplasias representarem em conjunto a forma
mais prevalente de neoplasia maligna e a principal causa de óbito, dentre as
malignidades do sexo feminino, no mundo todo (KLONISCHet al., 2008;
SHIBATAet al., 2004). Estimam-se mais de 1.2 milhões de novos casos por ano,
no Mundo (BACCHI et al., 2010).
No câncer de mama, a presença de CTNs foi estabelecida em linhagens
celulares, modelos experimentais murinos e em tecido humano, através de
diferentes técnicas. A maioria destes métodos baseia-se na identificação de
características indicativas de maior tumorigenicidade (sobrevivência e
desenvolvimento de células neoplásicas após heteroenxertia) e resistência a
16
múltiplas drogas – dois padrões fortemente associados ao fenótipo CTN. Dentre
as principais representantes dessas técnicas, destacam-se: o teste de efluxo do
corante Hoechst, a formação de mamosferas em cultura de suspensão e o teste
de tumorigenicidade em camundongos imunodeficientes (STINGL, 2009).
A escolha do melhor método de identificação de CTN no carcinoma
mamário ainda é controversa e envolve não apenas questões de especificidade
diagnóstica, mas também de factibilidade, incluindo grau de dificuldade técnica,
reprodutibilidade e custos (WOODWARD et al., 2005; DONTU, 2008). Em geral,
as técnicas supracitadas são trabalhosas, onerosas e limitadas quanto ao tipo de
amostra biológica passível de análise; por exemplo, não são aplicáveis a
espécimes fixados em formalina e incluídos em parafina - principal forma de
arquivamento de espécimes anatomopatológicos seja em contexto experimental
ou assistencial.
Outra abordagem de detecção de CTNs mamárias envolve a pesquisa de
moléculas tipicamente associadas ao fenótipo de células tronco/progenitora,
através de técnicas imunólogicas (a saber, citometria de fluxo e
imunoistoquímica). Esta abordagem baseia-se na premissa de que as CTNs
devem conservar pelo menos parcialmente a expressão de antígenos
característicos da célula de origem (seja uma CT ou progenitora normais) – um
conceito amplamente demonstrado em estudos recentes (JAMIESONet al., 2004;
KELLYet al., 2002). Dentre os marcadores mais fidedignos de CTN mamária e
mais utilizados na literatura, encontram-se: ALDH1, CD133, ESA e a combinação
CD44/CD24 (sendo o perfil CD44+/CD24- indicativo de CTN) (LIUet al., 2009;
17
WRIGHT et al., 2008; MORIMOTO, 2009). Em favor dos métodos de detecção de
CTNs baseados em imunofenotipagem, temos o fato de serem mais factíveis
(menos complexos/laboriosos) e envolverem menor custo (com reagentes,
equipamentos e profissionais), sendo, portanto mais facilmente adaptáveis a
diferentes tecidos/modelos, bem como à rotina de laboratórios de pesquisa e,
futuramente, de serviços assistenciais. Nesse sentido, as técnicas
imunoistoquímicas, em particular, apresentariam ainda a vantagem de permitir o
estudo in situ (i.e., contextualizado) das CTN, com correlação morfológica,
arquitetural e topográfica (uma vez que as células são observadas em seu
contexto histológico habitual). Dado que nenhum marcador é isolado e
absolutamente específico para o fenótipo CTN, essa correlação
citoarquitetural/topográfica poderia não só reduzir as chances de falsos positivos
(reação cruzada com elementos tissulares normais – difícil de ser avaliada por
citometria de fluxo, por exemplo), como poderia fornecer insights a respeito do
papel biológico específico das CTN em várias neoplasias.
Assim, a identificação de CTN por métodos imunológicos tem permitido,
recentemente, estudos visando não só confirmar no câncer de mama o valor
prognóstico dessas células, como também avaliar fármacos que atuem
especificamente sobre CTN, sem acarretar danos às CT normais (KAKARALA &
WICHA, 2008).
18
1.3. Estatinas e células-tronco neoplásicas mamárias
Recentemente, GUATHAMAN et al. (2009b), em estudo in vitro, sugeriram
de forma inédita que parte do efeito antineoplásico observado com o uso de
estatinas poderia estar relacionado a uma ação específica sobre células-tronco
neoplásicas (CTNs), i.e., poupando células-tronco normais. Apesar de bastante
promissor, este trabalho teve como principais limitações: o fato de apresentar
apenas evidências in vitro, envolver apenas o uso de estatinas lipofílicas e não
caracterizar os subtipos de CTN, com base nos perfis de imunoexpressão de
marcadores clássicos.
Em contrapartida, o efeito descrito pelo grupo de Gauthaman foi confirmado
por nosso grupo (RENNÓ et al., 2014ª; RENNÓ et al., 2014b), utilizando um
modelo in vivo clássico de carcinogênese mamária quimicamente-induzida (o
modelo do DMBA) e um esquema posológico de administração crônica e contínua
de sinvastatina em baixa dose (isto é, que muito se aproxima aos esquemas
antidislipidêmicos protocolados em seres humanos). Neste trabalho, reforçarmos o
conceito de que as estatinas lipofílicas são mais eficientes, dado que os efeitos
antineoplásico e anti-CTN ocorreram com a sinvastatina (protótipo de estatina
lipofílica), mas não com a pravastatina (estatina hidrofílica). Além disso,
demonstramos que o efeito anti-CTN cobre a maioria dos subtipos de CTN
comumente identificados nos estudos de câncer de mama, sendo extensível a
células neoplásicas não-progenitoras, mas não a células-tronco normais do tecido
mamário adjacente(RENNÓ et al., 2014ª; RENNÓ et al., 2014b).
19
Em conjunto, esses dados tornam as estatinas lipofílicas (e em particular a
sinvastatina) agentes farmacológicos de grande potencial antineoplásico e anti-
CTN que merecem maior detalhamento farmacológico, especialmente no que diz
respeito à melhor forma de administração (tratamento crônico contínuo de baixa
dosagem vs. tratamento intermitente cíclico de alta dose).
20
1.4. Justificativas
As CTNs representam um paradigma inovador e bastante promissor para
estudos de fisiopatologia do câncer e de desenvolvimento de novas estratégias
farmacológicas antineoplásicas, já que parecem estar implicadas na falha
terapêutica em longo prazo. Frente ao impacto epidemiológico mundial do câncer
de mama (neoplasia mais prevalente e principal causa de óbito por câncer, entre
as mulheres), é necessário o desenvolvimento de estratégias terapêuticas
farmacológicas que incorporem novos paradigmas de carcinogênese.
Em nosso laboratório, os efeitos in vivo da sinvastatina sobre células tronco
tumorais estão em avaliação, sendo os dados preliminares em tratamento crônico
com doses baixas promissores. Até o momento, contudo, o efeito deste fármaco
sobre CTNs em esquema agudo de administração (envolvendo doses altas) ainda
não foi testado, nem contrastado com os tratamentos crônicos em termos de
vantagens ou limitações.
Cumpre lembrar que a verificação da existência de efeitos antineoplásicos e
anti-CTN frente a dose elevada única de sinvastatina, antes de um estudo
aprofundado de esquema posológico intermitente/cíclico, é uma etapa importante
e necessária do ponto de vista ético, já que evita a eutanásia de grande número
animais (frequentemente associada a este último tipo delineamento experimental)
e o consumo desnecessário de reagentes onerosos.
21
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Descrever os efeitos agudos de uma dose elevada de sinvastatina, por via
intragástrica (IG), sobre expressão de marcadores de células-tronco neoplásicas
(CTN),a proliferação celular e apoptose no carcinoma ductal invasivo (CDI)
induzido por dimetil-benz-(a)-antraceno (DMBA).
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Estabelecer a dose-teste de sinvastatina (“dose elevada”) através de
experimentos de eficácia terapêutica e toxicidade conhecidas; a saber:
1.1. Dosagem de colesterol total e fração LDL-colesterol (efeito terapêutico
padrão);
1.2. Dosagem de enzimas hepáticas (ALT e AST) e muscular (CK).
2. Descrever quali- e quantitativamente os efeitos agudos da dose-teste sobre:
2.1. A expressão dos marcadores CTN: CD24, CD44, CD133, EPCAM, ALDH1
e OCT3/4;
2.2. A frequência relativa (%) de células neoplásicas com o perfil CD24-/CD44+
ou CD133+/EPCAM+;
2.3. O índice de proliferação celular (IPC) determinado pela frequência de
células expressando Ki67;
22
2.4. O índice de apoptose (IA) determinado pela frequência de células que
expressam caspase 3;
2.5. A expressão de receptores de estrógeno (RE) e progesterona (RP);
2.6. A expressão do produto do oncogene C-erbB-2 (HER2/neu).
23
3. MATERIAL & MÉTODOS
3.1. Aspectos éticos
O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da
Universidade Estadual de Campinas (CEUA-IB-UNICAMP), protocolo no. 2522-1.
3.2. Locais de realização do trabalho
A pesquisa foi realizada primariamente no Laboratório de Histomorfometria
e Patologia Molecular Aplicadas do Departamento de Farmacologia (LHIAP)/FCM
(UNICAMP) e em colaboração com o Laboratório de Patologia Experimental e
Molecular do Hospital do Câncer A.C Camargo/Fundação Antônio Prudente. No
primeiro laboratório, foram conduzidos os experimentos com animais, parte das
colorações imunoistoquímicas e todas as análises histométricas. No laboratório
colaborador, foram realizados o restante das imunocolorações e os
escaneamentos de lâmina total para obtenções das lâminas virtuais (fonte das
imagens utilizadas nas quantificações imunoistoquímicas).
24
3.3. Animais
Foram utilizadas ratas fêmeas virgens Sprague-Dawley, provenientes do
CEMIB-UNICAMP, pesando entre 200-300g e com a idade de 12 semanas.Os
animais foram mantidos em caixas coletivas (5 animais/ gaiola) sob condições
controladas de temperatura (22 +2 0C) em foto período de 12h claro e 12h escuro.
Após adaptação às condições do biotério, os animais foram divididos em
dois delineamentos experimentais: (1) o primeiro envolve animais controle (não
expostos ao DMBA) e tem como finalidade a padronização da dose-teste de
sinvastatina através de experimentos de eficácia e toxicidade; (2) o segundo visa
cumprir o objetivo principal do trabalho (verificação dos efeitos antineoplásicos e
anti-CTN agudos mediante administração de uma dose-teste elevada de
sinvastatina).
3.4. Delineamento experimental 1: estabelecimento da dose-teste
de sinvastatina
-Grupo Controle 1 (“controle”, n =10): animais não induzidos com DMBA,
tratados IG (por gavagem) com a solução diluente das estatinas (1mL de óleo de
soja) e eutanasiados24 horas após o tratamento.Esse grupo representou o
controle histológico normal (referente a mamas e órgãos/tecidos alvo de toxicidade
por estatinas – tecido muscular estriado esquelético, tecido hepático e tecido
renal).
25
- Grupo Controle 2 (“S125”, n=10): animais não induzidos com DMBA e
tratados com sinvastina diluída em 1ml de óleo de soja na dose de 125mg/kg.
Essesanimais foram eutanasiados 24 horas após a ingestão dessa solução. A
análise deS125(em comparação aos demais grupos) teve por objetivo expor a
toxicidade agudada sinvastatina na dose 1 (mais baixa*).
- Grupo Controle 2 (“S250”, n= 10): animais não induzidos com DMBA,
tratados IG (por gavagem) com sinvastatina na dose de 250 mg/Kgdiluída em 1mL
de óleo de soja e24 horas após o tratamento. A análise deS250(em comparação
aos demais grupos) teve por objetivo expor a toxicidade agudada sinvastatina na
dose 2 (intermediária*).
- Grupo Controle 4 (“S500”, n= 10): animais não induzidos com DMBA e
tratados IG (por gavagem) com sinvastatina diluída em 1mL de óleo de soja, na
dose de 500 mg/kg. Esses animais foram eutanasiados 24 horas após a ingestão
dessa solução.A análise deS500(em comparação aos demais grupos) teve por
objetivo expor a toxicidade agudada sinvastatina na dose 3 (mais alta*).
*OBS.:Vale lembrar que as designações “dose baixa”, “dose intermediária”
e “dose alta” refletem apenas diferenças quantitativas entre si (i.e., dose baixa <
intermediária < alta) e não o real impacto de cada dose no organismo animal.
Todas as doses utilizadas nesta etapa do trabalho podem ser consideradas “altas”
do ponto de vista de efeitos sistêmicos esperados, caso fossem administradas no
esquema posológico clássico (ou seja, uso diário, contínuo).
26
3.4.1. Métodos e variáveis do delineamento 1: avaliação bioquímica
Instantes antes da eutanásia, procedeu-se à coleta de amostras de sangue
destes (já anestesiados), através de punção cardíaca. O sangue foi depositado em
tubos Eppendorf de plástico e logo centrifugado a 12.000 g por 10 min em
temperatura ambiente para a obtenção do plasma (centrifuga modelo 5415 R,
Eppendorf, Alemanha). O sobrenadante foi separado e armazenado a 4ºC até a
realização dos testes bioquímicos.
Os parâmetros bioquímicos foram analisados através de kits comerciais
para testes colorimétricos (BioClin®, Brasil), seguindo as instruções do fabricante.
Foram analisados marcadores de eficácia terapêutica (i.e., aumento de HDL-
colesterol e redução das demais frações) e de toxicidade (aumento de enzimas
hepática, musculares e de parâmetros do perfil renal); a saber:
- Marcadores bioquímicos de eficácia terapêutica:VLDL-c, HDL-c,
LDL-c, colesterol total e triacilglicerol total;
-Marcadores bioquímicos de toxicidade: (1) enzimas hepáticas
(alanina aminotransferase [ALT] e aspartato transaminase [AST]) e(2)
enzimas musculares (creatina quinase [CK]).
Para a quantificação de todos os marcadores analisados, utilizou-se
o espectrofotômetro DU 800 (Beckman Coulter, EUA).
27
3.5. Delineamento experimental 2: efeitos antineoplásicos e anti-
CTN agudos da dose-teste de sinvastatina
- Grupo controle (“controle”,n=6):animais induzidos com DMBA (i.e.,
portadores de neoplasias mamárias), tratados com óleo de soja 1ml (diluente de
sinvastina) e eutanasiados 24 horas após o tratamento.
- Grupo Experimental (“sinvastatina”, n=6):animais induzidos com DMBA
(i.e., portadores de neoplasias mamárias), tratados com sinvastatina na dose-teste
selecionada (250 mg/Kg – vide resultados e discussão para melhor entendimento
acerca da escolha desta dose em particular), diluída em 1ml de óleo de soja e
eutanasiados 24 horas após o tratamento.
3.5.1. Métodos e variáveis do delineamento 2
Indução tumoral e tratamento farmacológico no delineamento 2. O protocolo
de indução química do carcinoma mamário consistiu na administração de uma
dose única de DMBA (100mg/Kg de animal, diluída em 1mL de óleo de soja)
intragastricamente por gavagem (conforme o esquema de BARROSet al., 2004,
modificado por RENNÓ et al., 2014b). Durante todo o tratamento os animais foram
acompanhados semanalmente (e diariamente após o desenvolvimento da
neoplasia), sendo realizados exames físicos visando à identificação dos tumores e
de possíveis síndromes decorrentes do desenvolvimento da neoplasia.Utilizando
esse protocolo, 100% dos animais desenvolvem tumores macroscopicamente
identificáveis após 13 semanas, contudo, com grande variação, em termos de
28
tamanho e número. Além disso, após 13 semanas de indução, uma proporção
variável dos animais se encontra em estado de caquexia, sendo a taxa de
morbimortalidadegeral pela neoplasia alta e a resistência do animal aos
tratamentos farmacológicos propostos baixa(BARROS et al., 2004; SOUZA et al.,
20013). Assim, para uniformizar a amostra em termos de carga tumoral total
(tumor burden), o início dos tratamentos foi padronizado pelo volume tumoral
(1cm3) e não pelotempo de indução. Os tumores foram mensurados utilizando
paquímetro digital, sendo a eutanásia efetuada por aprofundamento anestésico e
deslocamento cervical 24h depois do tratamento experimental (dose única de
sinvastatina ou de seu diluente).
Eutanásia,exérese detumores e necropsia. 24h depois dos tratamentos
experimentais, os animais foram anestesiados em câmara de isoflurano a 100% e
eutanasiados por aprofundamento anestésico e deslocamento cervical. Ambas as
linhas mamárias (contendo ou não tumores experimentais) foram ressecadas
cirurgicamente imediatamente após a eutanásia. Foram retirados também em
procedimento necroscópico, todos os órgãos do animal para avaliação de possível
doença metastática, outras neoplasias primáriassincrônicas e outras
comorbidades (secundárias às neoplasias induzidas ou aos efeitos tóxicos
decorrentes do tratamento).
Avaliação anatomopatológica.O produto das ressecções mamárias e da
necropsia foi encaminhado para exame macroscópico, com especial atenção à
determinação das dimensões, volume e peso das peças,bem como eventuais
alterações patológicas de cor ou consistência. Avaliação clínica combinada a
29
avaliação macroscópica permitiu a criação das seguintes variáveis morfológicas
macroscópicas:
(1) Volume tumoral total (VTT) ou “tumor burden”: somatório dos
volumes de todos os tumores presentes em um mesmo animal,
mensurado em dois momentos – antes da administração do tratamento
experimental e ao fim do protocolo (i.e., após a eutanásia).
(2) Volume do maior tumor (VMT): volume do maior tumor presente no
animal, mensurado em dois momentos – antes da administração do
tratamento experimental e ao fim do protocolo (i.e., após a eutanásia).
(3) Incremento volumétrico tumoral: volume tumoral total final – inicial.
(4) Incremento volumétrico do maior tumor: volume do maior tumor final
– inicial.
(5) Número de tumores: número de tumores de fácil individualização
macroscópica por animal.
Após a avaliação macroscópica,os espécimes foram fixados em formalina 10%
tamponada e processados em equipamento automatizado (“histotécnico”) para
desidratação e embebimento em parafina.Ao fim deste procedimento, os
espécimes foram incluídos em parafina, para obtenção dos blocos. Cortes
histológicos de 4m foram realizados em micrótomo, sendo então depositados em
lâminas de vidro.Em seguida, as lâminas histológicas foram desparafinizadas em
banhos de xilol, reidratadas em álcool etílico (nas concentrações decrescentes de
100%, 80% e 50%), lavadas com água corrente e destilada e corados com
hematoxilina-eosina. Utilizando um fotomicroscópio de luz (Leica DM 5000 B),
30
essas lâminas histológicas foram avaliadas por dois observadores independentes
(MNC e AAS) com o objetivo de caracterizar as seguintes variáveis morfológicas
microscópicas:
(1) % média de necrose (estimada em 6 campos de pequeno aumento);
(2) Número de mitoses (estimada em 10 campos de grande aumento).
(3) Histologia dos órgãos (avaliação subjetiva de toda a superfície de
corte, realizada de forma independente e às cegas em relação aos tratamentos,
por dois observadores experientes [AAS e ALR]; casos de opinião discrepante
foram discutido em sessões de consenso ao co-observador, envolvendo um
terceiro observador - PCS).
Confecção dos “tissue microarrays” dos tumores e análise
imunoistoquímica. Após a realização da avaliação morfológica dos tumores
foram identificadas e marcadas 5 áreas de cerca de 2 mm de diâmetro em cada
lâmina histológica corada em HE, referente ao bloco de parafina escolhido de
cada animal (neste trabalho, selecionamos sempre o maior tumor). As áreas
selecionadas deveriam conter a maior percentagem possível de tecido puramente
tumoral.A partir da sobreposição da lâmina com o bloco, as duas áreas marcadas
na lâmina foram identificadas também nos blocos doadores escolhidos, dos quais
foram obtidos cilindros de 2 mm de diâmetro e transferidos para o bloco receptor
(TMA). Desse modo, o bloco receptor recebeu 5 cilindros de cada um dos 12
casos selecionados. Para a confecção do bloco de TMA, foi utilizado o
equipamento Tissue MicroArray Builder modelo 20010.2 (Histopathology Ltd,
31
Hungria), em colaboração com o Serviço de Anatomia Patológica do Hospital A. C.
Camargo.A partir do bloco de TMA, foram confeccionados vinte cortes de 4m de
espessura cada, os quais foram distendidos sobre 20 lâminas, sendo 2
histológicas comuns (posteriormente coradas em HE para avaliação e confirmação
da presença de áreas morfológicas representativas das lesões originais) e as
demais, polarizadas (para realização de reações imunoistoquímicas). Duas
amostras de tecido placentário normal foram inseridas no bloco de TMA para a
orientação do mesmo, sendo, em seguida, gerado um mapeamento de todos os
casos.
As lâminas obtidas a partir do bloco de TMA dos tumores foram desparafinizadas
em banhos de xilol, hidratadas em álcool etílico nas concentrações decrescentes
de 100%, 80% e 50% e lavadas em água corrente e destilada. A atividade da
peroxidase endógena foi bloqueada por meio de três banhos de água oxigenada a
10 volumes cada um, com duração de cinco minutos, seguidos de lavagens em
PBS. Para recuperação antigênica, foi utilizada uma panela a vapor T-Fall. No
interior dessa, as lâminas foram imersas em tampão citrato de sódio, em pH 6,0,
durante 30 minutos a 95 graus Celsius e, a seguir, lavadas em água corrente.
Foram realizadas reações imunoistoquímicas de monomarcação (um marcador
por lâmina) e de dupla-marcação (dois marcadores por corte histológico) utilizando
os anticorpos listados nas Tabelas 3 a 5.
Nas reações de monomarcação, foram utilizados, como anticorpos primários
únicos, anticorpos desenvolvidos contra os marcadores especificados nas
Tabelas 3 a5. Nessas reações, o anticorpo primário foi gotejado sobre os cortes
32
de TMA na diluição adequada (previamente padronizada em estudos pilotos de
titulação) e incubado durante o dia (“overday”), por 2 horas, a temperatura
ambiente (24ºC). Após a incubação, as lâminas foram lavadas três vezes em PBS,
sob agitação, secadas e incubadas com o sistema de revelação baseado em
polímero Advance® (DAKOCYTOMATION, Carpenteria, Califórnia, Estados
Unidos da América), por uma hora, a 37º C. Terminada a incubação, foram
realizadas três lavagens em PBS, sob agitação. Para a revelação da reação, foi
utilizado um substrato cromogênico - a solução DAB (tetraidrocloreto de 3-3'-
diaminobenzidina, Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO, Estados Unidos da
América) na proporção de 0,06g para 100mL de PBS-, 500ml de água oxigenada
a 20 volumes e 1mL de DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Estados
Unidos da América), por cinco minutos a 37º C. O material foi, então, lavado em
água corrente e contracorado com hematoxilina de Mayer durante 30 a 60
segundos. Em seguida, as lâminas foram desidratadas e montadas em lamínulas
e resina Entellan (Merck, Dermstad, Alemanha). Secções seriadas de cada tumor,
não incubadas com o anticorpo primário, foram utilizadas como controles
negativos. Além disso, foram utilizados controles positivos adequados para cada
marcador, montados em lâminas separadas, a cada bateria de coloração
realizada.
33
Tabela 3. Monomarcadores (single markers) de células-tronco e suas principais
características.
Marcador Clonalidade Diluição Animal
de
origem
Fabricante Controle
(+)
CD24 Monoclonal 1:50 coelho Abcam [San
Francisco,
CA, EUA]
Mama
normal
humana
CD44 Monoclonal 1:50 coelho Abcam [San
Francisco,
CA, EUA]
Mama
normal
humana
CD133 Monoclonal 1:50 coelho Abcam [San
Francisco,
CA, EUA]
Mama
normal
humana
EPCAM Monoclonal 1:50 coelho Abcam [San
Francisco,
CA, EUA]
Mama
normal
humana
OCT-3/4
(POU5F1)
Policlonal 1:100 coelho Abcam [San
Francisco,
CA, EUA]
Seminoma
testicular
ALDH-1 Monoclonal 1:100 coelho Abcam [San
Francisco,
CA, EUA]
Mama
normal
humana
34
Nas reações de dupla marcação, padronizamos, como primeiro anticorpo primário,
os anticorpos anti-CD44 e anti-EPCAM e, como segundo anticorpo, anti-CD24 e
anti-CD133. A revelação das duplas-marcações foi realizada utilizando protocolo
de múltipla marcação com kits VECTASTAIN ou ImmPRESS (ambos fornecidos
por Vector Labs, Burlingame, CA, EUA). Os primeiros anticorpos primários foram
identificados com um substrato de peroxidase (DAB), gerando cromógeno
precipitado marron e os segundos anticorpos primários com um substrato de
fosfatase alcalina (Vector red) – cromógeno vermelho rosado. Nas demais etapas
do procedimento, foram seguidos os mesmos passos padronizados para a reação
de monomarcação (incluindo: os bloqueios, a recuperação antigênica, a
montagem das lâminas).
35
Tabela 4. Marcadores de CTN para estudos de dupla marcação (perfil CTN) e
suas características principais.
Dupla Marcador Clonalida-
de
Animal de
origem
Dilui-
ção
Fabricante Controle (+)
CD44/
CD24
CD44 Mono coelho 1:40 Abcam
[San
Francisco,
CA, EUA]
Vasos em
mama normal
humana
CD24 Mono camundongo 1:50 Abcam
[San
Francisco,
CA, EUA]
Mama normal
humana
CD133/
ESA
CD133 Mono coelho 1:100 Abcam
[San
Francisco,
CA, EUA]
Mama normal
humana
ESA Mono camundongo 1:50 Abcam
[San
Francisco,
CA, EUA]
Mama normal
humana
36
Ainda, foram repetidas as reações imunoistoquímicas para marcadores
prognósticos e preditivos de resposta terapêutica (Tabela 5) no bloco de TMA,
visando (1) a classificação dos carcinomas mamários de acordo com os subtipos
moleculares intrínsecos da “Classificação Alternativa” (de acordo com o
recomendado por BECKet al., 2013; Tabela 6) e (2) a avaliação da resposta à
sinvastatina.
37
Tabela 5. Monomarcadores (single markers) de prognóstico e resposta terapêutica
e suas principais características.
Marcador Clonalidade Diluição Animal de
origem
Fabricante Controle (+)
RE (Receptor de
estrógeno)
Monoclonal 1:50 Coelho Abcam [San
Francisco, CA,
EUA]
Mama
normal
humana
RP (Receptor de
progeste-rona)
Monoclonal 1:50 Coelho Abcam [San
Francisco, CA,
EUA]
Mama
normal
humana
HER2/neu
(Produto do
gene C-erb-B2)
Monoclonal 1:50 Coelho Abcam [San
Francisco, CA,
EUA]
Tumor
mamário
humano
score 3+
Ki67 Policlonal 1:200 Coelho Abcam
[San
Francisco, CA,
EUA]
Tumor
mamário
humano(+)
Caspase 3 Policlonal 1:50 Coelho Rheabiotech Tumor
mamário
humano (+)
38
Tabela 6. Classificação “alternativa” dos carcinomas da mama em subtipos
moleculares intrínsecos.
Subtipo
molecular
Receptores
hormonais C-erb-B2 Ki67 Outros
Luminal A RE+ e/ou RP+ (-) < 14% (-)
Luminal B1 RE+ e/ou RP+ (-) > 14% (-)
Luminal B2 RE+ e/ou RP+ (+) qualquer (-)
HER-2 RE(-) e RP(-) (+) qualquer (-)
Triplo negativo RE(-) e RP(-) (-) qualquer (-)
Basal-símile RE(-) e RP (-) (-) qualquer CK 5/6+ e/ou
EGFR +
aAdaptado de BECKet al., 2013.
39
Após digitalização completa de cada lâmina de TMA (portanto, de cada marcador
imunoistoquímico) no scanner de lâminas ScanScope XT (Aperio Techonologies
Inc., EUA), foram obtidas das lâminas virtuais, para cada tumor/marcador, 6
imagens TIFF (i.e., sem compressão) aleatórias, de médio aumento (200X). Todas
as imagens TIFF (ilustrativas ou de análise) foram geradas no programa Aperio
ImageScope, versão 12.1.0.5029 (Aperio Techonologies Inc., EUA). Todas as
imagens TIFF de análise foram submetidas a procedimentos de imuno-histometria
(quantiticação de células positivas) no programa ImageJ versão1.43 (programa de
domínio público, fornecido pelo NIH, EUA, através do site:
http/imagej.nih.gov/ij/download; último acesso em: 12/12/14). Neste programa, as
imagens foram analisadas manualmente por 2 observadores (MNC e AAS) cegos
às intervenções, sendo o valor de resumo de cada caso/variável quantitativa
expresso como média dos dois observadores.
Os resultados de positividade foram expressos inicialmente através de variável
numérica (frequência percentualmédia de células tumorais positivas) e,
posteriormente, no caso das variáveis RE (receptor de estrógeno) e RP (receptor
de progesterona) convertidos em variável categórica (positividade do caso),
utilizando o valor de corte >1% de células positivas (sendo qualquer intensidade
de positividade), segundo a recomendação da Organização Mundial da Saúde
(LAKHANI et al., 2012). Desse modo, os casos foram classificados como
"positivos" quando pelo menos 1% das células tumorais expressou de forma
indubitável, a imunomarcação para o receptor hormonal em questão.
40
Em relação à localização subcelular da imunomarcação, foram considerados
positivos os seguintes padrões:
- Reações para marcadores CTN em mono- ou dupla marcação: CD24,
CD44, CD133, EPCAM, ALDH-1, Oct-3/4 = marcação em membrana/citoplasma
(por DAB= marrom). Não estabelecemos ponto de corte para intensidade de
positividade.
- Reações para marcadores CTN em dupla-marcação: CD24/CD44 e
CD133/ESA= marcação de membrana/citoplasma pelo DAB (marrom) e/ou Vector
Red (vermelho) no mesmo corte histológico (co-localização tissular). Nos
preparados de dupla-marcação, foram considerados como positivos os seguintes
perfis: CD24-/CD44+ (perfil CTN1) e CD133+/ESA+ (perfil CTN2).Não
estabelecemos ponto de corte para intensidade de positividade.
- Reações para marcadores prognósticos e preditivos de resposta
terapêutica (monomarcação): receptores hormonais (estrógeno e progesterona) e
Ki67 = marcação nuclear pelo DAB (marrom). A positividade para o produto do
gene Cerb-B2 (HER2/neu) foi avaliada pela intensidade de imunomarcação da
membrana citoplasmática pelo DAB (marrom), sendo classificados como negativos
os scores 0 e 1+, positivo o score 3+ e indeterminado o score 2+, conforme figura
1 a seguir:
41
Figura 3: Fotomicrografias ilustrativas dos padrões de imunomarcação previstos
na classificação da positividade para o produto do oncogene HER2/neu.
Interpretação dos resultados: escores 0 (imunomarcação totalmente negativa) e
1+ (imunomarcação de membrana citoplasmática fraca e incompleta) = HER2/neu
negativo. Escore 2+ (imunomarcação de membrana citoplasmática completa,
porém de intensidade fraca) = HER2/neu indeterminado. Escore 3+
(imunomarcação de membrana citoplasmática completa e de forte intensidade) =
HER2/neu positivo.
(Adaptado de LAKHANI et al., 2012).
42
Conforme a combinação de positividade para marcadores prognósticos e
preditivos de resposta terapêutica, os tumores foram classificados em subtipos
moleculares intrínsecos (conforme descrito sucintamente em tópico anterior):
-Luminais: tumores com positividade para receptores hormonais
(estrógeno e/ou progesterona), sendo subcategorizados em luminal 'A' os tumores
com Ki67 positivo em menos de 14% das células (e negatividade para C-erbB-2),
em luminal 'B1' os tumores com Ki67 iguais ou superiores a 14% das células
(também C-erbB-2 negativos) e em luminal 'B2' os tumores com expressão de C-
erbB-2 (produto do gene HER-2/neu) e qualquer positividade para Ki67. São os
tumores responsivos à hormonioterapia (Tamoxifeno, inibidores de aromatase,
etc).
-HER-2+: tumores com negatividade para receptores hormonais (estrógeno
e progesterona) e superexpressão do oncogene HER2/neu, com qualquer Ki67.
São os tumores responsivos ao anticorpo monoclonal terapêutico trastuzumab
(Herceptina).
-Triplo-negativos: tumores com negatividade para receptores hormonais
(estrógeno e progesterona) e negatividade para HER-2/neu.
43
Resumo das variáveis imunoistoquímicas quantitativas e categóricas (e suas
definições)
- CD24: frequência percentual média de células expressando o marcador CTN
CD24 (em reação de monomarcação), em 6 campos de médio aumento (200X)
aleatórios.
- CD44:frequência percentual média de células expressando o marcador CTN
CD44 (em reação de monomarcação), em 6 campos de médio aumento (200X)
aleatórios..
- CD133:frequência percentual média de células expressando o marcador CTN
CD133 (em reação de monomarcação), em 6 campos de médio aumento (200X)
aleatórios.
- EPCAM:frequência percentual média de células expressando o marcador CTN
ESA/EPCAM (em reação de monomarcação), em 6 campos de médio aumento
(200X) aleatórios.
- ALDH1: frequência percentual média de células expressando o marcador CTN
ALDH1 (em reação de monomarcação), em 6 campos de médio aumento (200X)
aleatórios.
- OCT3/4:frequência percentual média de células expressando o marcador CTN
OCT3/4 (em reação de monomarcação), em 6 campos de médio aumento (200X)
aleatórios.
44
- CD24-/CD44+:frequência percentual média de células apresentando o perfil CTN
CD24 negativo/CD44 positivo (em reação de dupla marcação), em 6 campos de
médio aumento (200X) aleatórios.
- CD133+/EPCAM+: frequência percentual média de células apresentando o perfil
CTN CD133 positivo/EPCAM positivo (em reação de dupla marcação), em 6
campos de médio aumento (200X) aleatórios.
- Ki67: frequência percentual média de células expressando o marcador de
proliferação celular, Ki67 (em reação de monomarcação), em 6 campos de médio
aumento (200X) aleatórios.
- Caspase 3: frequência percentual média de células expressando o marcador de
apoptose, caspase 3 (em reação de monomarcação), em 6 campos de médio
aumento (200X) aleatórios.
- REquantitativo: frequência percentual média de células expressando o receptor
de estrógeno (em reação de monomarcação), em 6 campos de médio aumento
(200X) aleatórios.
- RE qualitativo: status de positividade para receptor de estrógeno, conferido a
casos em que pelo menos 1% das células expressam o receptor (seja qual for a
intensidade da coloração).
- RPquantitativo: frequência percentual média de células expressando o receptor
de progesterona (em reação de monomarcação), em 6 campos de médio aumento
(200X) aleatórios.
45
- RPqualitativo: status de positividade para receptor de progesterona, conferido a
casos em que pelo menos 1% das células expressam o receptor (seja qual for a
intensidade da coloração).
- C-erbB-2 (HER2/neu): status de positividade para o produto do oncogene C-
erbB-2 (HER2/neu), conferido para casos com escore 3+.
- Subtipo molecular:classificação alternativa (i.e., baseada em critérios
imunoistoquímicos) dos casos de carcinoma mamário invasivo em luminal (A, B1
ou B2), HER2+ e Triplo negativo. Posteriormente, para otimizar a análise
estatística, os casos foram agrupados em luminal vs. não-luminal.
3.6. Análise Estatística
Os resultados foram expressos em gráficos de barras ou do tipo “boxplot”,
na dependência da análise estatística realizada: se paramétrica – gráfico de
barras (representando média +desvio padrão), se não-paramétrica – “boxplot” ou
digrama de caixa (representando mediana, quartis e outliers).
Para a análise de diferenças entre 3 ou mais grupos envolvendo variáveis
quantitativas (delineamento tipo 1) com distribuição normal de valores, foi utilizada
a ANOVA (análise de variância), seguida do teste post hocde Bonferroni. Para a
análise de diferenças entre 2 grupos envolvendo variáveis quantitativas
(delineamento 2) com distribuição normal, foi utilizadoo teste t de Student (se
46
distribuição não gaussiana, utilizamos o teste U de Mann-Whitney). Para variáveis
categóricas (delineamento 2), foi utilizado o teste exato de Fisher.
Valores de p inferiores a 0.05 foram considerados como estaticamente
significativos. Osprogramasestatísticos SPSS para Windows (versão 20.0) e
Graphpad Prism 6 foram utilizados tanto na estatística descritiva (i.e., na geração
de gráficos e tabelas), como na inferencial (realização de testes estatísticos).
47
4. RESULTADOS
4.1. Escolha da dose-teste: resultados da avaliação bioquímica
4.1.1. Perfil lipídico (parâmetros de eficácia terapêutica)
Os resultados referentes ao perfil lipídico (dosagem de lípides séricos)
encontram-se esquematizados na Figura 4. Como se pode observar a partir desta
figura, as doses intermediária (250mg/Kg) e alta (500mg/Kg) são efetivas em
todos os parâmetros do perfil lipídico, com exceção do HDL-colesterol (onde não
se diferenciam significantemente do controle não tratado). Em contraposição, a
dose baixa (125mg/Kg) é efetiva no HDL-colesterol e nos parâmetros relacionados
a triglicérides (i.e., triglicerídeos totais e VLDL), mas não em relação ao colesterol
total e LDL-colesterol. Esses resultados desfavorecem a escolha da dose baixa
como dose referência, uma vez que esta é eficaz em um número menor de
parâmetros e não interfere agudamente com a variável mais consistentemente
relacionada a risco cardiovascular – o LDL-colesterol. Em outras palavras, esses
resultados mostram que a chamada “dose baixa” não evidencia, agudamente, as
propriedades mais típicas da classe de fármacos a qual pertence a sinvastatina.
Vale lembrar que as designações “dose baixa”, “dose intermediária” e “dose
alta” refletem apenas diferenças quantitativas entre si (i.e., dose baixa <
intermediária < alta) e não o real impacto de cada dose no organismo animal.
Conforme mencionado em “Material e Métodos”, todas as doses utilizadas nesta
etapa do trabalho podem ser consideradas “altas” do ponto de vista de efeitos
48
sistêmicos esperados, caso fossem administradas no esquema posológico
clássico (ou seja, uso diário, contínuo).
49
Figura 4. Perfil lipídico. Painel de gráficos ilustrando as diferenças entre os grupos
controle do delineamento 1 (C= controle não tratado, S125= controle tratado com
sinvastatina 125mg/Kg, S250= com sinvastatina 250mg/Kg, S500= com
sinvastatina 500mg/Kg) quanto aos níveis séricos (em mg/dL) de: colesterol total
(A), triglicerídeos (B), VLDL-colesterol (C), LDL-colesterol (D) e HDL-colesterol (E).
50
As barras representam a média + desvio padrão (barra branca= controle não
tratado; barras pretas= demais controles em ordem crescente de dose de
sinvastatina); *p<0.05, **p<0.01 (ANOVA + Bonferroni; N=40/n=10).
51
4.1.2. Perfil hepático (parâmetros de toxicidade I)
Os resultados referentes ao perfil hepático (dosagem das transaminases
AST e ALT) encontram-se representados na Figura 5. Em princípio, parece haver
uma elevação de enzimas hepática proporcional à dose de sinvastatina (ou seja,
maior quanto maior a dose). Contudo, essa tendência não foi confirmada pelos
testes estatísticos. Assim, pode-se dizer apenas que nenhuma das doses de
sinvastatina testadas foi capaz de promover hepatoxicidade em nível bioquímico,
neste estudo. Em outras palavras, nenhuma dose pode ser descartada frente aos
achados de perfil hepático.
Também do ponto de vista histológico, não observamos alterações
qualitativamente significantes (Figura 6-7).
52
Figura 5. Perfil hepático. Painel de gráficos ilustrando ausência de diferenças
entre os grupos controle do delineamento 1 (C= controle não tratado, S125=
controle tratado com sinvastatina 125mg/Kg, S250= com sinvastatina 250mg/Kg,
S500= com sinvastatina 500mg/Kg) quanto aos níveis séricos (em U/mL) de:
aspartato aminotransferase (AST) (A) e alanina aminotransferase (ALT) (B). As
barras representam a média + desvio padrão (barra branca= controle não tratado;
barras pretas= demais controles em ordem crescente de dose de sinvastatina);
p>0.05, (ANOVA + Bonferroni; N=40/n=10).
53
Figura 6. Fotomicrografias representativas de tecido hepático (zona 3 acinar) de
animais sem tratamento farmacológico (A) ou tratados com sinvastatina nas doses
de 125mg/Kg (B), 250mg/Kg (C) e 500mg/Kg. Observar ausência de alterações
histológicas dignas de nota. Tricrômico de Masson, 200X (aumento original); barra
de escala= 20m.
54
Figura 7. Fotomicrografias representativas de tecido hepático (espaço porta e
zona acinar 1) de animais sem tratamento farmacológico (A) ou tratados com
sinvastatina nas doses de 125mg/Kg (B), 250 mg/Kg (C) e 500mg/Kg.Observar
ausência de alterações histológicas dignas de nota. Tricrômio de Masson, 200X
(aumento original); barra de escala =20 m.
A
A B
C D
A B
55
4.1.3. Miotoxicidade
Os resultados referentes a miotoxicidade (dosagem da creatina quinase
[CK]) encontram-se representados na Figura 8. Essa figura mostra a ocorrência
de aumento significante de creatina quinase, indicativo de miotoxicidade aguda,
apenas na dose mais alta (500mg/Kg). Esses resultados, portanto desfavorecem o
uso da dose mais alta. Assim, em conjunto com os dados de perfil lipídico, esses
resultados favorecem a dose intermediária (250mg/Kg) como dose-teste ideal.
Isso porque esta dose combina eficácia (redução significante de LDL) com
ausência de toxicidade aguda (ausência de hepatotoxicidade ou miotoxicidade).
A despeito das alterações bioquímicas, não observamos, do ponto de vista
histológico, nenhum indício de toxicidade grave (i.e., rabdomiólise)(Figura 9), o
que sugere que as alterações bioquímicas possam ser reversíveis com a retirada
da droga (por exemplo durante um esquema posológico intermitente/cíclico).
56
Figura 8.Dosagem de creatina quinase sérica (miotoxicidade). Gráfico ilustrando
as diferenças entre os grupos controle do delineamento 1 (C= controle não
tratado, S125= controle tratado com sinvastatina 125mg/Kg, S250= com
sinvastatina 250mg/Kg, S500= com sinvastatina 500mg/Kg) quanto aos níveis
séricos (em U/L) de creatina quinase (CK). As barras representam a média +
desvio padrão (barra branca= controle não tratado; barras pretas= demais
controles em ordem crescente de dose de sinvastatina); *p<0.05 (ANOVA +
Bonferroni; N=40/n=10).
57
Figura 9. Fotomicrografias representativas de tecido muscular esquelético
estriado (músculo masseter) de animais sem tratamento farmacológico (A) ou
tratados com sinvastatina nas doses de 125mg/Kg (B), 250mg/Kg (C) e 500mg/Kg.
Observar ausência de alterações histológicas dignas de nota. HE, 200X (aumento
original); barra de escala= 30m.
58
4.2. Efeitos agudos da sinvastatina na dose-teste selecionada
(250mg/Kg)
4.2.1. Características macroscópicas relacionadas a crescimento tumoral
As Figuras 10-12apresentam a evolução das características morfológicas
macroscópicas dos tumores induzidos pelo DMBA durante o período de
observação (24h pós tratamento experimental).
Resumidamente, ao fim dos protocolos experimentais, os animais
apresentavam uma média de 2,5 tumores por animal (variando de 1 a 3
tumores/animal). Conforme esperado, não foram observadas diferenças
estatisticamente significantes entre o momento de administração do tratamento
experimental e o término do protocolo (24h depois), nem entre os grupos controle
e experimental.
59
Figura 10. Crescimento volumétrico tumoral em 24h. A: volume tumoral total
(somatório dos volumes de todos os tumores presentes em um mesmo animal); B:
volume do maior tumor. Ausência de diferenças estatisticamente significantes
entre grupo controle (sem tratamento farmacológico; traçado preto) e experimental
(animais tratados com sinvastatina 250mg/Kg, traçado vermelho). Teste t de
Student (p>0.05; N=12/n=6).
60
Figura 11. Incremento volumétrico tumoral em 24h (Volume final – Volume inicial).
A: incremento tumoral total (somatório dos incrementos de todos os tumores
presentes em um mesmo animal); B: incremento do maior tumor. Ausência de
diferenças estatisticamente significantes entre grupo controle (sem tratamento
farmacológico; barra branca) e experimental (animais tratados com sinvastatina
250mg/Kg, barra preta). As barras representam média + desvio padrão. Teste t de
Student (p>0.05).
61
Figura 12. Número de tumores por animal. Ausência de diferenças
estatisticamente significantes entre grupo controle (sem tratamento farmacológico;
barra branca/ “DMBA”) e experimental (animais tratados com sinvastatina
250mg/Kg, barra preta/ “DMBA + S250). As barras representam média + desvio
padrão. Teste t de Student (p>0.05).
62
4.2.3. Características microscópicas relacionadas resposta terapêutica
(crescimento e morte celular)
A Figura 13 representa as principais características morfológicas à
microscopia de luz indicativas de resposta ao tratamento com sinvastatina: (a)
índice mitótico (variável indicativa de proliferação celular) e (b) percentagem de
necrose tumoral (indicativa de morte celular). Resumidamente, essa figura mostra
que o tratamento com sinvastina reduziu agudamente a atividade proliferativa,
sem interferir de forma significativa com a taxa de morte celular por necrose.
63
Figura 13. Características morfológicas indicativas de resposta terapêutica. A:
número de mitoses em 10 campos de grande aumento – observar redução
estatisticamente significante com o uso de sinvastatina; B: percentagem média de
necrose – observar ausência de diferenças estatisticamente significantes entre
grupo controle e experimental. As barras representam média + desvio
padrão;*p<0.05 (Teste t de Student).
64
4.2.4. Marcadores imunoistoquímicos relacionados a resposta terapêutica
(crescimento e morte celular)
A Figura 14 apresentaos principais marcadores imunoistoquímicos
indicativos de resposta ao tratamento com sinvastatina, a saber: (a) índice de
proliferação celular determinado através da imunoexpressão de Ki67 (variável
relacionada a crescimento celular) e (b) índice apoptótico determinado através da
imunocoloração pela caspase 3 (variável indicativa de morte celular). Em
concordância com os dados de índice mitótico e percentagem de necrose tumoral,
esta figura mostraque o tratamento com sinvastatina reduziu agudamente
(p=0.037) o número de células em ciclo (células em proliferação) (Figura 14A),
sem aumentar de forma significativa (p= 0.262) com o número de células em
apoptose (Figura 14B) – outra forma de morte celular.
65
Figura 14. Marcadores imunoistoquímicos indicativos de resposta terapêutica. A:
percentagem de células que expressam o marcador de proliferação Ki67 –
observar redução estatisticamente significante com o uso de sinvastatina; B:
percentagem de células que expressam o marcador de apoptose caspase 3 –
observar ausência de diferenças estatisticamente significantes entre grupo
controle e experimental; *p<0.05 (Teste U de Mann-Whitney; N=12/n=6).
66
4.2.5. Marcadores imunoistoquímicos de células-tronco neoplásicas (CTN)
Os resultados referentes à imunoexpressão dos monomarcadores e perfis
CTN encontram-se esquematizados nos gráficos das Figuras 15 e 16.
Resumidamente, essas figuras mostram diferenças agudas e estatisticamente
significantes entre os grupos controle (sem tratamento farmacológico) e
experimental (tratado com sinvastatina) apenas para os marcadores CD24 (Figura
14A), ALDH1 (Figura 15A) e OCT3/4 (Figura 15B). No caso do marcador CD24,
observamos nítido aumento de expressão(da ordem de 17X) com o uso de
sinvastatina. Nos demais marcadores com expressão diferencial entre grupos,
observamos redução estatisticamente significante, isto é, de 74% para o ALDH1 e
72% para o OCT3/4.
A Figura 17 ilustra as imunocolorações dos principais marcadores
utilizados no trabalho.
67
Figura 15. Gráficos ilustrativos das diferenças entre grupo controle (sem
tratamento) e experimental (tratamento com sinvastatina), com relação à
68
expressão imunoistoquímica dos marcadores de células-tronco neoplásicas (CTN)
CD24 (A), CD44 (B), CD133 (C) e EPCAM (D), e aos perfis CTN CD24-/CD44+ (E)
e CD133+/EPCAM+ (F). Observar a ausência de diferenças estatisticamente
significantes entre os grupos para a maioria dos marcadores, salvo para o
marcador CD24 (significantemente aumentado no grupo tratado com
sinvastatina).*p<0.05 (Teste U de Mann-Whitney; N=12/n=6).
69
Figura 16. Gráficos ilustrativos das diferenças entre grupo controle (sem
tratamento) e experimental (tratamento com sinvastatina), com relação à
expressão imunoistoquímica dos marcadores de células-tronco neoplásicas (CTN)
ALDH1 (A) e OCT3/4 (B). Observar a redução na expressão de ambos
marcadores no grupo tratado com sinvastatina;*p<0.05 (Teste U de Mann-
Whitney; N=12/n=6).
70
Figura 17. Fotomicrografias ilustrativas das principais imunocolorações realizadas
no trabalho. Nota: as imagens representam hotspots de positividade em cada
71
caso. Seta preta= células CD24-/CD44+, seta branca= célula CD24+/CD44-, seta
vermelha= CD24+/CD44-. Imunoperoxidase ou Imunoperoxidase + imunofosfatase
alcalina (no caso da dupla marcação), 400X (aumento original). Barra de escala=
100m.
72
4.2.6. Outras variáveis de importância prognóstica/preditiva de resposta
terapêutica
A Figuras 18 e as Tabelas 7-10 informam os resultados obtidos com o
tratamento com sinvastatina em relação a outras variáveis de valor prognóstico e
preditivo de resposta terapêutica como: expressão de receptores hormonais,
superexpressão do oncogene HER2/neu e subtipo molecular definido pela
classificação alternativa (imunoistoquímica). Resumidamente, não foram
observadas modificações agudas nestas variáveis com o uso de sinvastatina em
dose elevada.
73
Figura 18. Gráficos representativos da percentagem de células expressando
receptores hormonais nos grupos controle e experimental. A: receptor de
estrógeno (RE); B: receptor de progesterona (RP). Ausência de diferenças
estatisticamente significantes entre os grupos; p>0.05 (Teste U de Mann-Whitney;
N=12/n=6).
74
Tabela 7.Status de positividade para receptor de estrógeno em animais controle e
experimentais.
75
Tabela 8.Status de positividade para receptor de progesterona em animais
controle e experimentais.
76
Tabela 9.Status de positividade para a superexpressão do oncogene HER2/neu
em animais controle e experimentais.
77
Tabela 10. Subtipagem molecular alternativa simplificada (agrupada) em animais
controle e experimentais.
78
79
5. DISCUSSÃO
O presente trabalho foi realizado com o objetivo primordial de verificar a
existência de efeitos agudos antineoplásicos e anti-CTNs com o uso de
sinvastatina em doses altas, eventualmente caracterizando quali-
/quantitativamente tais efeitos. Essa verificação preliminar de efeitos agudos se
faz necessária, pois funciona como um pré-requisito a ser cumprido antes da
realização de um estudo formal sobre os efeitos da sinvastatina em esquema de
alta-dosagem intermitente/cíclico (i.e., em esquema clássico de quimioterapia).
Sem essa confirmação preliminar de efeitos agudos, o pesquisador farmacologista
pode incorrer em grave erro de conduta ética e em gastos desnecessários de
tempo, recursos humanos e materiais, já que um estudo de adequação de doses
tipicamente consome grande número de animais, reagentes e exige o
envolvimento substancial de indivíduos de alto nível de competência técnica
(FERREIRA, 2010; RIVERA & GILMAN, 2012).Para a realização bem sucedida
deste trabalho, optamos por dividi-lo em duas partes principais.
5.1. Primeira parte: efeitos farmacológicos agudos no animal
Sprague-Dawley normal e seleção da dose-teste ideal
Nesta primeira parte, definimos a dose-teste da sinvastatina, através de
experimentos de eficácia e toxicidade, baseados na avaliação de variáveis
80
bioquímicas (dosagens de enzimas musculares e de substâncias que caracterizam
os perfis lipídico e hepático). Seguindo as normas de boas práticas em
desenvolvimento/caracterização de fármacos, foram selecionadas variáveis
bioquímicas que permitissem verificar os efeitos terapêuticos e adversos
classicamente descritos para a sinvastatina – um fármaco antidislipidêmico do
grupo das estatinas lipofílicas (BERSOT, 2012).
Em princípio, pode parecer estranho o estudo de perfil lipídico na definição
da dose-teste de uma droga com potencial antineoplásico. Contudo, devemos
lembrar que os efeitos antineoplásicos das estatinas permanecem em grande
parte desconhecidos ou mal caracterizados, sendo, portanto, considerados como
efeitos off label(GAUTHAMAN et al., 2009ª/b). Assim, consideramos mais
prudente definir a dose-teste com base nos efeitos típicos(terapêuticos e tóxicos)
da sinvastatina. Cumpre mencionar, entretanto, que a relação entre redução de
colesterol sérico e efeito antineoplásico pela sinvastatina ainda não foi claramente
estabelecida na literatura(BROWN, 2007; GAUTHAMAN et al., 2009ª/b).
Com relação à faixa de doses testadas, tomamos como referência a
literatura baseada em experimentos de uso crônico de sinvastatina, em diferentes
modelos murinos, já que os artigos sobre efeitos agudos da sinvastatina no rato
Sprague-Dawley são praticamente inexistentes (PIERNOet al., 2006;
BUTTERWECKet al., 2009). Revisando os artigos disponíveis, concluímos que a
faixa terapêutica da sinvastatina em ratos inicia-se com a dose de 20mg/Kg e se
superpõe à faixa de toxicidade a partir de 80mg/Kg(PIERNO et al., 2006;
BUTTERWECKet al., 2009). De acordo com a maioria dos estudos, a dose de
81
40mg/Kg VO/dia é a que mais se aproxima do esquema posológico utilizado em
seres humanos(RENNÓ, 2014; RENNÓ et al., 2014). Em contrapartida, doses
superiores a 100mg/Kg são intoleráveis para a maioria dos animais, quando em
esquema de administração contínua, particularmente em períodos de tratamento
superiores a 10 dias(RENNÓ, 2014; RENNÓ et al., 2014). Em função destes
dados e da necessidade de selecionarmos uma dose considerada como “alta”
para os propósitos deste trabalho, optamos por testar doses na faixa entre 125 e
500mg/Kg.
Ainda na primeira parte do trabalho, além de definir a dose-teste de
sinvastatina, acabamos caracterizando paralelamente (e ainda que de forma
superficial) o perfil de efeitos terapêuticos e colaterais agudos desta droga no
animal Sprague-Dawley normal. Vale lembrar que a literatura sobre os efeitos
agudos da sinvastatina neste modelo experimental é bastante escassa e
incompleta. Resumidamente, nesta etapa inicial do trabalho, foi possível
reproduzir agudamente todos os efeitos terapêuticos (i.e., redução de LDL-c,
VLDL-c, colesterol total e triglicerídeos totais, bem como aumento de HDL-c) e
parte dos efeitos adversos (e.g., miotoxicidade) tradicionalmente descritos no uso
crônico de sinvastatinaem seres humanos(BERSOT, 2012).
O perfil farmacológico aqui descrito difere, contudo, do observado em
modelos de animais dislipidêmicos, obesos ou em consumo de dieta
hiperlipidêmica, onde o uso de estatinas diminui os níveis séricos do colesterol em
doses mais baixas (TOWBIN et al., 1979; DIAZ-ZAGOYA et al., 1999; FUNATSU
et al., 2003; PIERNO et al., 2006;). Alguns modelos utilizando ratos
82
normolipidêmicos demonstram apenas diminuição de níveis séricos de VLDL-c e
triacilglicerol, mas não do colesterol total (ROGLANSet al., 2002). Este fato pode
ser justificado em parte pela capacidade da estatina de reduzir a síntese e
concentração do colesterol no fígado, resultando em menor liberação de VLDL-c
e, consequentemente,em diminuição dos níveis de triacilgliceróis totais (lembrando
que na via endógena de transporte de lípides, o VLDL carrega tanto colesterol
com triglicérides)(ROGLANSet al., 2002).
Do ponto de vista qualitativo, houve variação no perfil de efeitos
terapêuticos e adversos conforme a dose do fármaco, o que permitiu a seleção da
dose de 250mg/Kg como dose-teste ideal. Isso porque, nesta dose, os animais
apresentaram todos os efeitos terapêuticos mais relevantes (notadamente, a
redução de LDL-c), sem os efeitos tóxicos inconvenientes de lesão muscular e
hepática. Cumpre reforçar que a descrição de tais resultados agudos é inédita no
modelo experimental em questão.Vale destacar também que a escolha de uma
dose-teste únicafoi proposital;ela conferiu economia de tempo e recursos na
segunda metade do trabalho, permitindo o aprofundamento desta etapa através da
abordagem de um número muito maior de variáveis de análise.
A avaliação de miotoxicidade foi realizada através da quantificação da
enzima creatina quinase total (CK) e de análise histológica. A despeito das
alterações nos níveis séricos de CK, não foram observadas lesões histológicas, o
que difere bastante dos achados de RENNÓ (2014) para tratamento crônico de
sinvastatina no mesmo modelo. Este autor avaliou quatro músculos diferentes,
sendo dois ricos em fibras musculares lentas (masseter superficialis e de
83
paredeabdominal) e outros dois ricos em fibras musculares rápidas
(gastrocnemius e bíceps brachii), encontrando, em todos os tipos,lesões
microscópicas compatíveis com miosite crônica inespecífica.
O caráter lipofílico da sinvastatina parece ser importante na miotoxicidade,
já que facilita a penetração de suas moléculas nas células musculares(PIERNOet
al., 1995). Dentre os possíveis mecanismos de ação toxicológica, destacam-se:
(1) disfunção mitocondrial, (2) diminuição de influxo de cloro nas células e (3)
redução da concentração celular de ubiquinonas (WESTWOODet al., 2008;
SIRTORI, 2014). A ubiquinona é uma molécula sintetizada a partir do ácido
mevalônico(intermediário da via de biossíntese do colesterol, cuja produção é
inibida pelas estatinas) e considerada como essencial para a cadeia de transporte
de elétrons na mitocôndria (MCDONALD et al., 2004). Além disso, as estatinas
podem aumentar a expressão do gene atrogina-1, o qual parecer ser responsável
pela ocorrência de atrofia muscular no tecido (SIRTORI, 2014). A ausência de
miotoxicidade bioquímica na dose-teste (e histológica, em qualquer dose)
associada a ausência de hepatotoxicidade (em qualquer dose – vide abaixo) são
pontos favoráveis para o uso intermitente da droga em altas dosagens, em
comparação com o uso crônico/contínuo tradicional.
O perfil hepático foi avaliado pela quantificação das enzimas ALT e AST
além da análise microscópica das três zonas do tecido. Neste trabalho, em
contraposição aos achados de RENNÓ (2014)em modelo crônico, nem mesmo a
dose mais alta (500mg/Kg) foi capaz de produzir hepatotoxicidade, sugerindo que
este efeito colateral seja possível apenas em tratamentos crônicos ou
84
intermitentes (com pequeno intervalo de descanso entre as doses). Segundo
RENNÓ (2014) e MCDONALD et al. (2004), o uso crônico de sinvastina em
animais Sprague-Dawley leva ao aparecimento de alterações hepáticas doses-
dependentes, semelhantes à esteato-hepatite crônica não-alcoólica (NASH). Em
humanos, há relatosde farmacovigilância relacionando hepatotoxicidade ao uso
das estatinas (SIRTORI, 2014).
Modelos in vivo utilizando ratos, camundongos, coelhos e cães, indicam
que o uso crônico das estatinas causa lesões no fígado e que este dano pode ser
revertido com a administração de ácido mevalônico (MCDONALD et al., 2004).
Isto parece indicar que parte da lesão hepática poderia ser devida à própria ação
farmacológica de inibição da enzima HMG-CoA redutase. Nestes modelos citados,
foram reportados aumento das enzimas transaminases e alterações morfológicas,
resultados idênticos aos obtidos por nosso grupo em outro trabalho (RENNÓ,
2014). Já em testes in vitrocom estatinas e células hepáticas, demonstrou-se que
estes fármacos podem reduzir a coenzima Q10 nas mitocôndrias dos hepatócitos,
aumentando os danos oxidativos no DNA, reduzindo a síntese de ATP e elevando
o índice apoptótico(TAVINTHARAN et al., 2007).
Não avaliamos a função renal dos animais neste estudo, por limitações de
tempo, recursos e porque a nefrotoxicidade da sinvastatina (geralmente associada
a uma nefrite túbulo-intersticial) é um evento bastante raro e geralmente vinculado
a tratamentos crônicos (BERSOT, 2012).
85
Em resumo, os resultados obtidos nesta primeira etapa do trabalho
permitiram a seleção de uma dose-teste satisfatória (i.e., com eficácia típica e
toxicidade mínima) – pré-requisito fundamental para a realização do objetivo
principal do trabalho (na segunda etapa). Além disso, tais resultados tornam
bastante promissores para a continuação do trabalho em direção ao teste formal
da sinvastatina em esquema posológico intermitente/cíclico (i.e., em esquema
tradicional de quimioterapia antineoplásicas).
5.2. Segunda parte: ação antineoplásica e anti-CTN da
sinvastatina
Entre as mulheres, os carcinomas mamários representam a neoplasia
maligna mais prevalente e a principal causa óbito por câncer(KEYSAR &JIMENO,
2010; LORICO & RAPPA, 2011; KUBATKA et al., 2011). Nas duas últimas
décadas, evidências cumulativas indicam que o câncer de mama e outras tumores
malignos sólidosseriam tecidos heterogêneos, isto é, constituídos por múltiplas
subpopulações celulares organizadas de forma hierárquica. Tais neoplasias
seriam originadas a partir de um pequeno grupo de células neoplásicas primitivas
e dotadas de propriedades progenitoras (auto-renovação e potencial
multilinhagem), chamadas de células-tronco neoplásicas (CTN)(GOKMEN-POLAR
et al., 2011; LORICO & RAPPA, 2011;MANELLO, 2013). Além da importância
fisiopatológica, estas células parecem ter papel prognóstico e preditivo de
resposta terapêutica, atuando como biomarcadores de pior evolução e resistência
86
terapêutica. Dessa forma, as CTNs têm se tornado importantes alvos no
desenvolvimento de novosagentes farmacológicos antineoplásicos ou de novas
aplicações para fármacos conhecidos (RENNÓ et al., 2014).
Entre os fármacos promissores devido à provável atividade anti-CTN,
destacam-se as estatinas. As estatinas e as células-tronco neoplásicas têm sido
importante objeto de estudo em nosso grupo de pesquisa nos últimos três anos
(RENNÓ, 2014; RENNÓ et al., 2014; MARCOS, 2013, VISMARI, 2014). Nesses
trabalhos, demonstramos a importância clínica dos marcadores CTN no câncer de
mama (VISMARI, 2014), descrevemos a presença de marcadores de diferentes
subtipos de CTN no modelo de carcinogênese mamária do DMBA (RENNÓ, 2014;
RENNÓ et al., 2014; MARCOS, 2013) e, ainda neste modelo, relatamos de forma
inédita a redução in vivo da expressão de inúmeros marcadores CTN com o uso
crônico de sinvastatina (RENNÓ, 2014; RENNÓ et al., 2014). Este último trabalho,
nos motivou a investigar em maior pormenor a ocorrência do efeito anti-CTN em
regime de tratamento agudo com altas doses de sinvastatina – principal tópico a
ser discutido nesta parte do trabalho.
De forma sucinta, os resultados do presente trabalho indicam a existência
de efeitos antineoplásicos e anti-CTNs agudos, isto é, 24h após a administração
de sinvastatina na dose-teste selecionada de 250mg/Kg.A ação antineoplásica
aguda da sinvastatina resulta em uma redução dos índices mitótico e proliferativo
(i.e., e inibição do crescimento celular) da ordem de 70%, mas não inclui qualquer
efeito sobre a morte celular (seja por necrose ou por apoptose), o que nos permite
classificar esta ação como citostática (e não citotóxica). É importante mencionar
87
que o efeito inibitório sobre o crescimento celular não afeta apenas as CTNs, mas
também as células neoplásicas mais bem diferenciadas, já que a redução na
proliferação é da ordem de 50%, enquanto que as CTNs correspondem a uma
parcela bastante pequena da massa tumoral total. Essasobservações são muito
semelhantes às obtidas com o tratamento crônico (RENNÓ, 2014; RENNÓ et al.,
2014).Entretanto, em contraposição ao trabalho de RENNÓ(2014), não
evidenciamos quaisquer modificações em nível volumétrico, o que era esperado,
uma vez que reduções tumorais macroscópicas após lesão terapêutica podem
demorar bem mais que 24h para ocorrer.
Raros estudos in vivo discutem os efeitos antineoplásicos das estatinas, em
particular das lipofílicas (KOCHUPARAMBIL et al., 2011;KANGet al., 2009). Dois
trabalhos recentes demonstraram que a sinvastatina tem significantes efeitos
antineoplásicos em modelos de carcinogênese mamária por indução química.
KUBATKAet al. (2011) demonstrou uma redução profilática do número de animais
desenvolvendo câncer de mama quando tratadas com sinvastatina ou
atorvastatina. Igualmente, LUBETet al.,(2009) descreveu a redução da
carcinogênese mamária de ratas tratadas com atorvastatina ou lovastatina. Nestes
trabalhos in vivo, as estatinas foram administradas antes e durante o
desenvolvimento da neoplasia, sendo,portanto, estudos de quimioprevenção. É
importante enfatizar que em nosso modelo experimental, as estatinas foram
administradas após a formação do tumor, ou seja são estudos de tratamento
antineoplásico. Devido a essa diferença crucial de delineamento experimental, fica
88
difícil estabelecer paralelos entre a escassa literatura pertinente disponível e
nossos resultados, os quais se impõem como achados inéditos.
Em relação à expressão de marcadores CTN, nossos dados indicam que
nem todos os subtipos de CTN sofrem agudamente com a administração de
sinvastatina em dose alta. Neste trabalho, foi detectada redução aguda apenas
nos níveis de expressão de ALDH1 e OCT3/4. Nos demais marcadores, ou não
houve diminuição estatisticamente significante (CD44, EPCAM e CD133) ou houve
aumento (CD24).Esses dados diferem significantemente dos dados de RENNÓ et
al. (2014) em modelo de tratamento crônico os quais evidenciam redução
significante nos níveis tissulares de CD24, CD44 e CD133, sem alterações
significantes em outros marcadores.
Em conjunto, esses achados sugerem que as CTN de um mesmo tipo de
neoplasia poderiam diferir em sensibilidade frente a esquemas posológicos
distintos de uma mesma droga. Sabemos que ainda é cedo para esse tipo de
especulação; antes de mais nada é preciso caracterizar o efeito cumulativo de
doses agudas em esquema intermitente/cíclico(continuação deste trabalho) e
descartar a possibilidade dos demais marcadores estarem decaindo de forma
mais tardia (e.g., 48 ou 72h depois da aplicação do fármaco). Também seria
interessante verificar a duração do efeito anti-CTN após a extinção da droga no
organismo.
Todavia, se confirmadas, essas observações poderiam fornecer
embasamento teórico para importantes modificaçõesna forma como as
89
quimioterapias antineoplásicas são planejadas, principalmente, em termos de
posologia. Dito de outra maneira, futuramente, com base em um conhecimento
mais completo acerca da heterogeneidade das neoplasias e da coexistência de
CTNs com sensibilidades diferenciadas a esquemas posológicos distintos, seria
possível propor estudos clínicos para investigar a melhor forma planejar a
administração de drogas antineoplásicas, intercalando ou mesclando esquemas
posológicos diferentes, segundo a composição da neoplasia.
Ainda com relação aos marcadores CTN, chama a atenção o aumento
paradoxal de CD24. Antes mesmo de especularmos se esse aumento poderia ser
um obstáculo terapêutico, isto é, uma maneira da neoplasia adquirir resistência
terapêutica neste tipo de esquema posológico, há que se considerar o caráter
controverso deste marcador. Embora tradicionalmente considerado como um
marcador de pior prognóstico e de CTNs da mama humana (HOSONAGA et al.,
2014), originalmente, essa molécula foi descrita como um marcador de
diferenciação luminal ou seja um marcador de célula bem diferenciada(DOS
SANTOS et al., 2013). Infelizmente, o presente trabalho não apresenta elementos
que permitam resolver este dilema.
Em resumo, este é o primeiro estudo que confirma a existência de efeito
antineoplásico e anti-CTNsmamárias agudo por parte da sinvastatina em altas
doses eem contexto in vivo (modelo do DMBA). Este efeito é do tipo citostático
(i.e., não envolve morte celular) e restrito a apenas alguns tipos de CTNs, a saber:
a ALDH1 e a OCT3/4+. Em conjunto, esses resultados apontam para a
necessidade se investigar com maior profundidade o uso de sinvastatina em
90
esquemas terapêuticos antineoplásicos com posologia clássica, isto envolvendo
altas doses intermitentes (cíclicas).
91
6. SÍNTESE DE RESULTADOS E CONCLUSÕES
Em paralelo com os objetivos do trabalho, apresentamos a seguinte síntese
de resultados/conclusões:
1- O uso de sinvastatina em dose elevada única resulta em efeitos terapêuticos (
de: triglicérides, colesterol total, VLDL-c e LDL-c, e de: HDL) e tóxicos ( de:
CK).
2- O perfil farmacológico da sinvastina (efeitos terapêuticos/ adversos) depende
da dose.
3- A dose de sinvastatina a 250mg/Kg foi definida como dose-teste, neste
trabalho, pois resultou no principal efeito terapêutico desejado ( de LDL-c)
sem causar efeitos adversos.
4- Na dose-teste, em administração única, a sinvastatina resulta em efeito
antineoplásico do tipo citostático (uma vez que reduz os índices proliferativo e
mitótico, sem induzir necrose ou apoptose).
5- Na dose-teste, em administração única, a sinvastatina resulta em efeito anti-
CTN específico/restrito, caracterizado pela redução na expressão
imunoistoquímica dos antígenos CTN ALDH1 E OCT3/4.
6- Na dose-teste, em administração única, a sinvastatina resulta aumento na
expressão imunoistoquímica do antígeno CD24.
92
7- Na dose-teste, em administração única, a sinvastatina não resulta em
modificações volumétricas, no número de tumores por animal, na expressão de
receptores hormonais, nem na classificação da neoplasia segundo o subtipo
molecular.
93
7. REFERÊNCIAS
1. AL-HAJJ M, Clarke MF. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncegene.
2004; 23: 7274-7282.
2. ALVES-JUNIOR MJ. Angiogênese, células-tronco neoplásicas CD34+ e
sinvastatina em modelo de carcinogênese mamária induzida quimicamente.
Campinas: Unicamp, 2013. 90f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) -
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Faculdade de Ciências
Médicas, Universidade Estadual de campinas, São Paulo, 2013.
3. BACCHI CE, Prisco F, Carvalho FM, Ojopi EB, Saad EV. Potential economic
impacto f the 21-gene expression assay on the treatment of breast cancer in
Brazil. Rev. Assoc. Med. Bras. 2010; 26:
4. BECK AH, Knoblauch NW, Hefti MM, Kaplan J, Schnitt SJ, Culhane AC,
Schroeder MS, Risch T, Quackenbush J, Haibe-Kains B. Significance analysis
of prognostic signatures. PLoS Comput Biol. 2013;9(1):e1002875. doi:
10.1371/journal.pcbi.1002875. Epub 2013 Jan 24. PubMed PMID: 23365551;
PubMed Central PMCID: PMC3554539.
5. BERSOT TP. Terapia farmacológica para hipercolesterolemia e dislipidemia.
In: As bases farmacológicas da terapêutica de Goodman & Gilman. Brunton
LL, Chabner BA, Knollman BC (Eds.). pp 877-908. Porto Alegre: AMGH, 2012.
94
6. BLAIS L, Desgagne A, Lelorier J. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A
reductase inhibitors and the risk of cancer: a nested case-control study.
Archives of Internal Medicine. 2000; 160: 2363-2368.
7. BORGQUIST S, Jögi A, Pontén F, Ryden L, Brennan DJ, Jirström. Prognostic
impact of tumour-specific HMG-CoA reductase expression in primary breast
cancer. Breast Cancer Research. 2008; 1-11.
8. BOUDREAU DM, Gardner JS, Malone KE. The association between 3-
hydroxy-3-methylglutary coenzyme A inhibitor use and breast carcinoma risk
among post menopausal women: a case control study. Cancer. 2004; 100:
2308-2316.
9. BROWN AJ. Cholesterol, statins and cancer. Clin Exp Pharmacol Physiol.
2007Mar;34(3):135-41.
10. BUTTERWECK V, Zdrojewski I, Galloway C, Frye R, Derendorf H.
Toxicological and pharmacokinetic evaluation of concomitant intake of
grapefruit juice and simvastatin in rats after repeated treatment over 28 days.
Planta Med. 2009; 75: 1196-1202.
11. CHAN KKW, Oza AM, Siu LL. The statins as anticancer agents. Clinical
Cancer Research. 2003; 9:10-19.
12. DE SOUZA, PC. Carcinogênese mamária experimental induzida pelo 7, 12,
dimetilbenz (A) antraceno (DMBA): caracterização histopatológica comparada
e identificação imunoistoquímica de células-tronco neoplásicas (CTNs).
Campinas: Unicamp, 2013. 119f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) -
95
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Faculdade de Ciências
Médicas, Universidade Estadual de campinas, São Paulo, 2013.
13. DIAZ-ZAGOYA JC, Asenjo-Barrón JC, Cárdenas-Vázquez R, Martinez F,
Juárez-Oropeza. Comparative toxicity of high doses of vastatins currently
used by clinicians, in CD-1 male mice fed with a hypercholesterolemic diet.
Life Sciences. 1999; 9: 947-956.
14. DONTU G. Breast cancer stem cell markers – the rocky road to clinical
applications. Breast Cancer Research. 2008; 10: 110-111.
15. DOS SANTOS CO, Rebbeck C, Rozhkova E, Valentine A, Samuels A, Kadiri
LR, OstenP, Harris EY, Uren PJ, Smith AD, Hannon GJ. Molecular hierarchy
of mammarydifferentiation yields refined markers of mammary stem cells. Proc
Natl Acad Sci U S A. 2013 30;110(18):7123-30. doi:
10.1073/pnas.1303919110.
16. EISA-BEYGI S, Ekker M, Moon TW, Macdonald RL, Wen XY. Developmental
processes regulated by the 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase
(HMGCR) pathway: highlights from animal studies. 2014; 1-29.
17. FERREIRA EI. Como nascem e se desenvolvem os medicamentos. In:
Farmacologia. Silva, P (Ed.). pp 675-681. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2010.
18. FUNATSU T, Kakuta H, Takasu T, Noguchi M, Suzuki M, Miyata K.
Experimental model of prostprandial hypertriglyceridemia in sucrose-fed rats
and effectiveness of atorvastatin model. Metabolism. 2003; 52: 609-615.
96
19. GAUTHAMAN K, Fong CY, Bongso. Statins, stem cells, and cancer. J. of
Cellular Biochemistry. 2009a; 106: 975-983.
20. GAUTHAMAN K, Manasi N, Bongso A. Statins inhibit the growth of variant
human embryonic stem cells and cancer cells in vitro but not normal human
embryonic stem cells. Br J Pharmacol. 2009b;157: 962-73.
21. GIBBONS GF, Pullinger R. Regulation of cholesterol synthesis in the liver and
mammary gland of the lactating rat. Biochemical Journal. 1983; 212: 843-848.
22. GOKMEN-POLAR Y, Nakshatri H, Badve S. Biomarkers for breast cancer
stem cells: the challenges ahead. Biomarkers Med.2011;5: 661–671.
23. GOSH-CHOUDHURY N, Mandal CC, Gosh-Choudhury N, Gosh-Choudhury
G. Simvastatin induces derepression of PTEN expression via NFkB to inhibit
breast cancer cell growth. Cellular Signaling. 2010; 22:749-758.
24. GRAAF MR, Beiderbeck AB, Egberts AC et al. The risk of cancer in users of
statins. J. Clin. Oncol. 2004; 22: 2388-2394.
25. HARBECK N. Never too late: reducing late breast cancer relapse risk. Curr.
Med. Res. Opin. 2008; 24: 3295-305.
26. HINDLER K, Cleeland CS, Rivera E, Collard CD. The role of statins in cancer
therapy. The Oncologist Prevention. 2006; 11: 306-315.
27. HOSONAGA M, Arima Y, Sugihara E, Kohno N, Saya H. Expression of CD24
isassociated with HER2 expression and supports HER2-Akt signaling in
HER2-positive breast cancer cells. Cancer Sci. 2014 Jul;105(7):779-87. doi:
10.1111/cas.12427.
97
28. JAKOBISIAK M, Golab J. Statins can modulate effectiveness of antitumor
therapeutic modalities. Medical Research Reviews. 2010; 30: 102-135.
29. JAMIESON CH, Weissman IL, Passagué E. Chronic versus acute
myelogenous leukemia: a question of self-renewal. Cancer Cell. 2004; 6: 587-
596.
30. KAKARALA M e Wicha MS. Implications of the cancer stem-cell hypothesis
for breast cancer prevetions and therapy. 2008; 17: 2813-2820.
31. KANG S., Kim ES., Moon A. Simvastatin and lovastatin inhibit breast cell
invasion induced by H-Ras. Oncology Reports. 2009; 21: 1317-1322.
32. KELLY LM, Kutok JL, Williams IR, Boulton CL, Amaral SM, Curley DP, Ley
TJ, Gilliand DG. PML/RARalpha and FLT3-ITD induce an APL-like disease in
a mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 8283-8288.
33. KEYSAR SB., Jimeno A. More than markers: biological significance of cancer
stem cell-defining molecules. Molecular Cancer Therapeutics. 2010; 9: 2450-
2457.
34. KLONISCH T, Wiechec E, Hombach-Klonisch S et al. Cancer stem cell
markers in common cancers – therapeutic implications. Trends in Molecular
Medicine. 2008; 14: 450-460.
35. KOCHUPARAMBIL ST, Al-Husein B, Goc A, Soliman S, Somanath PR.
Anticancer efficacy of simvastatin on prostate cancer cells and tumor
xenografts is associated with inhibition of akt and reduced prostate-specific
antigen expression. The Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics. 2011; 336: 496-505.
98
36. KUBATKA P, Žihlavnikova K, Kajo K, Peč M, Stollarova N, Bojkova B,
Kassayova M, Orendaš P. Antineoplastic Effects of Simvastatin in
Experimental Breast Cancer. Klin Onkol.2011; 24: 41–45.
37. KWAK B, Mulhaupt F, Myit S, Mach F. Statins as a newly recognized type of
immunomodulator. Nature Medicine. 2000; 6: 1399-1402.
38. LAKHANI SR, Ellis IO, Schnitt SJ, Tan PH, Van de Vijver MJ. WHO
Classification of tumours of the breast. Lyon: International Agency for
Research on Cancer (IARC), 2012.
39. LI Y e Rosen JM. Stem/Progenitor cells in mouse mammary gland
development and breast cancer. Journal of Mammary Gland Biology and
Neoplasia. 2005; 10: 17-24.
40. LIU Q, Li JG, Zheng XY, Jin F, Dong HT. Expression of CD133, PAX2, ESA,
and GPR30 in invasive ductal breast carcinomas. Chin Med J (Engl). 2009
20;122(22):2763-9.
41. LORICO A., Rappa G. Phenotypic heterogeneity of breast cancer stem cells.
Journal of Oncology. 2011; http://dx.doi.org/10.1155/2011/135039.
42. LUBETRA., Boring D., Steele VE., Ruppert JM., Juliana MM., Grubbs C. Lack
of efficacy of the statins atorvastatin and lovastatin in rodent mammary
carcinogenesis. Cancer Prevention Research 2009; 2: 161-167.
43. MAGALHÃES LBNC. Drogas para uso em dislipidemias. In: Farmacologia.
Silva, P (Ed.). pp 675-681. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010.
44. MANNELLO F. Understanding breast cancer stem cell heterogeneity: time to
move on to a new research paradigm. BMC Medicine 2013; 169: 1-5.
99
45. MCDONALD JS, Halleck M. The toxicology of HMG-CoA reductase inhibitors:
prediction of human risk. Toxicologic Pathology. 2004; 32: 26-41.
46. MORIMOTO K, Kim SJ, Tanei T, Shimazu K, Tanji Y, Taguchi T, Tamaki Y,
Terada N, Noguchi S. Stem cell marker aldehyde dehydrogenase 1-positive
breast cancers are characterized by negative estrogen receptor, positive
human epidermal growth factor receptor type 2, and high Ki67 expression.
Cancer Sci. 2009;100(6):1062-8.
47. NAKAHARA K, Kuriyama M, Sonoda Y, Yoshidome H, Nakagawa H,
Fujiyama J, Higuchi I, Osame M. Myopathy induced by HMG-CoA reductase
inhibitors in rabbtis: a pathological, electrophysiological, and biochemical
study. Tox. And Applied Pharmacology. 1998; 152:99-106.
48. OLIVEIRA RV. Estudo da expressão de antígenos de células-tronco por
imunoistoquímica em neoplasias malignas da mama humana: caracterização
e possíveis aplicações clínicas. Campinas: Unicamp, 2014. 100f. Dissertação
(Mestrado em Fisiopatologia) - Programa de Pós-Graduação em
Fisiopatologia Médica, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade
Estadual de campinas, São Paulo, 2014.
49. PIERNO S, Didonna MP, Cippone V, De Luca A, Pisoni M, Frigeri A, Nicchia
GP, Svelto M, Chiesa G, Sirtori C et al. Effects of chronic treatment with
statins and fenofibrate on rat skeletal muscle: a biochemical, histological and
electrophysiological study. British J. of Pharmacology. 2006; 149:909-919.
50. RENNÓ AL, Alves-Júnior MJ, Rocha RM, De Souza PC, de Souza VB,
Jampietro J,Vassallo J, Hyslop S, Anhê GF, de Moraes Schenka NG, Soares
100
FA, Schenka AA.Decreased Expression of Stem Cell Markers by Simvastatin
in7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)-induced Breast Cancer. Toxicol
Pathol. 2014Oct 23. pii: 0192623314544707.
51. RENNÓ AL. Efeitos das estatinas sobre células-tronco neoplásicas em
modelo murino de carcinogênese mamária por indução química. Campinas:
Unicamp, 2014. 111 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Programa de
Pós-Graduação em Farmacologia, Faculdade de Ciências Médicas,
Universidade Estadual de campinas, São Paulo, 2014.
52. RIVERA SM, GILMAN AG. A invenção de fármacos e a indústria
farmacêutica. In: As bases farmacológicas da terapêutica de Goodman &
Gilman. Brunton LL, Chabner BA, Knollman BC (Eds.). pp 877-908. Porto
Alegre: AMGH, 2012.
53. ROGLANS N, Verd JC, Peris C, Alegret M, Vázquez M, Adzet T, Díaz C,
Hernández G, Laguna JC, Sánchez. High doses of atorvastatin and
simvastatin induce key enzymes involved in VLDL production. Lipids. 2002;
37: 445-454.
54. SASSANO A., Platanias LC. Statins in tumor suppression. Cancer Lett. 2008;
260: 11-19.
55. SCHACHTER M. Chemical, pharmacokinetic and pharmacodynamic
properties of statins: an update. Fundamental and Clinical Pharmacology.
2004; 19: 117-125.
101
56. SCHIMIDT F, Groscurth P, Kermer M, Dichgans J, Weller M. Lovastatin and
phenylacetate induce apoptosis, but not differentiation, in human malignant
glioma cells. Acta Neuropathol. 2001; 101:217-224.
57. SHIBATA MA, Ito Y, Morimoto J, Otsuki Y. Lovastatin inhibits tumor growth
and lung metastasis in mouse mammary carcinoma model: p53-independent
mitochondrial-mediated apoptotic mechanism. Carcinogenes. 2004; 25: 1887-
1898.
58. SIRTORI CR. The pharmacology of statins. Pharmacological Research. 2014;
1-9.
59. STINGL J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. Journal of
Pathology. 2009; 217: 229-241.
60. TAVINTHARAN S, Ong CN, Jeyaseelan K, Sivakumar M, Lin SC, Sum FC.
Reduce mitochondrial coenzyme Q10 levels in HepG2 cells treated with hig-
dose simvastatin: a possible role in statin-induced hepatotoxicity? Toxicology
and Applied Pharmacology. 2007; 223: 173-179.
61. TOWBIN H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacralamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some
applications. Proc. Natl. Acad. Sci. 1979; 76:4350-4354.
62. WESTWOOD FR, Scott RC, Mardsen AM, Bigley A, Randall K. Rosuvastatin:
characterization of induced myopathy in the rat. Toxicol. Pathol. 2008; 36:345-
352.
63. WOODWARD WA e Sulman EP. Cancer stem cells: markers or biomarkers?
Cancer Metastasis Review. 2008; 27: 459-470.
102
64. WRIGHT MH, Calcagno AM, Salcido CD, Carlson MD, Ambudkar SV,
Varticovski L. Brca1 breast tumors contain distinct CD44+/CD24– and
CD133+ cells with cancer stem cell characteristics. Breast Cancer Res 2008;
10: R10.
103
104
