8ª Aula (a) - Mecanismos de Carcinogénese IV, Alterações Epigenéticas - 11-04-2014

8/19/2019 8ª Aula (a) - Mecanismos de Carcinogénese IV, Alterações Epigenéticas - 11-04-2014

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8ª Aula, 1ª parte – Mecanismos de carcinogénese IV: alteraçõesepigenéticas INota : O capítulo da 8ª aula já contempla o resumo do 14º artigo, apresentado na bibliografia

complementar;

Epigenética e seus mecanismos de regulaçãoInicialmente Conrad Waddington

definiu a epigenética como o mecanismocapaz de regular a expressão fenotípica,através da interação entre o genoma e oambiente, por exemplo. Existem outrasdefinições avançadas por outraspersonalidades científicas, mas de umamaneira geral predomina a ideia dainteração entre o ambiente e o materialgenético, sob a forma de um “(…) códigoquímico e físico encriptado, escrito sobre aprópria sequência nucleotídica do DNA .”(s. 3, Jane Qiu, 2006). Quer-se com isto dizer que, para além do que está escrito na sequência de DNA,há um outro tipo de informação capaz de regular a nossa expressão genética. A importância dainfluência do ambiente sobre a expressão do nosso material genético é inegável, sobretudo após aconstatação de que gémeos monozigóticos separados à nascença, e por isso submetidos a estímulosambientais diferentes, podem desenvolver fenótipos semelhantes mas facilmente distinguíveis(imagem em cima, retirada do Alberts – Molecular Biology of the Cell ). No s. 8 é apresentado mais um

exemplo de discordância fenotípica entre gémeos monozigóticos.

Um outro exemplo simples da importância da regulação epigenética é o da diferenciaçãocelular. Qualquer um dos nossos precursores celulares neuronais, assim como os hepáticos ou até deepitélio respiratório, possuem exatamente a mesma informação genética no seu núcleo , mas aindaassim apresentam fenótipos citológicos claramente distintos. O que determina esse silenciamento deuns genes e ativação de outros, permitindo assim a obtenção de diferenciação celular? A regulaçãoepigenética desempenha um papel importantíssimo na diferenciação de cada um dos nossos tiposcelulares, conjuntamente com outros mecanismos de regulação da expressão de material genético.

Ao contrário das mutações nucleotídicas somáticas, as alterações epigenéticas caraterizam-se

pela sua reversibilidade, assim como pelo padrão genético que persiste durante a divisão mitóticae/ou meiótica, por uma ou mais gerações celulares (no caso da mitose).

Esta informação epigenética, para além de determinar um diferente fenótipo de fisionomiaem gémeos monozigóticos, também se manifesta pela discordância fenotípica na propensão paradoenças mentais , por exemplo, ou até mesmo o cancro .

De uma forma genérica podemos dividir material genómico nuclear em eucromatina eheterocromatina. A cromatina corresponde ao DNA associado às suas proteínas de suporte, como é ocaso das histonas. A eucromatina é a porção da cromatina que é acessível à maquinaria de transcrição,e por isso codifica para os genes ditos “ativos” em cada célula ( eu vem de “verdadeiro”, em Grego).

Ao resto da cromatina, mantida num grau de condensação mais elevado e por isso com um aspetomais eletrodenso em microscopia eletrónica, designamos por heterocromatina. O maior grau de


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condensação reflete a sua “inatividade” em termos trancricionais, ou seja, não está a ser utilizada paratranscrever nenhum gene.

A heterocromatina pode ainda ser dividida em dois tipos principais (1ª aula teórica da unidadecurricular de Genética Médica, 2013/2014):

Heterocromatina constitutivao Contém centrómeros, telómeros e outras sequências repetitivas. Estas

sequências estão consistentemente condensadas (logo, inativas) em todas célulasdo organismo;

Heterocromatina facultativa (s. 7)o A eucromatina que foi epigeneticamente silenciada, como acontece na normal

diferenciação de um enterócito (p. ex.), é organizada sob a forma deheterocromatina. Ao contrário da heterocromatina constitutiva, esta poderá ser“recrutada” pela al teração epigenética, pelo que é expectável que, dentro domesmo organismo, algumas células contenham genes em heterocromatina

facultativa, enquanto outras apresentam esses mesmos genes sob a forma deeucromatina;

Os fenómenos de imprinting , diferenciação tecidular e inativação do cromossoma X (o mesmoque “lionização”) resultam no aparecimento de heterocromatina facultativa, a partir de fenómenosde regulação epigenética. A tumorigénese por mecanismos epigenéticos é também capaz de interferircom a quantidade de material nuclear que se encontra organizado em heterocromatina facultativa.

Os principais mecanismos epigenéticos que permitem o controlo epigenético do genoma são(s. 6):

Metilação – Adição de grupos metilo (-CH3) a sequências nucleotídicas ou em histonas; Modificações pós-translacionais das histonas - Quer por acetilação, desacetilação,

metilação, entre outros (desenvolvido mais à frente); RNAs não codificantes – Como é o caso dos micro RNAs (miRNAs); Remodeladores de cromatina ;

Metilação do DNAA metilação dos ácidos desoxirribonucleicos ocorre sempre ao nível das bases azotadas de

citosina, produzindo assim 5-metilcitosina (reação do s. 8). As enzimas responsáveis pela catálisedessa reação são as DNA metiltransferases (DNA MTases). Existem três tipos principais de DNAMTases (s. 12):

DNMT1 DNMT3A DNMT3B

Note-se ainda que, no s. 8, é enunciada a molécula de SAM (S-adenosyl-methionine ) que éconvertida em SAH (S-adenosyl-homocystein ), um passo fundamental na metilação das citosinas poisé esta a fonte dos grupos metilo que são transferidos para as bases azotadas de citosina.

A metilação das citosinas não interfere na sua capacidade de emparelhamento com basesazotadas de guanina, da mesma maneira que a troca de um nucleótido de timina (DNA) por um uracilo(RNA) não interfere na ligação complementar com adeninas.


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As alterações epigenéticas por metilação podem ser herdadas, quer pela mitose, como pelameiose, devido à ação de uma enzima denominada por metiltransferanse de manutenção (maintenance methylase , no esquema em baixo). A metiltransferase de manutenção corresponde àDNMT1 anteriormente referida, sendo a DNMT3A e a DNMT3B responsáveis por metilações de novo(ou seja, em citosinas "novas", sem que haja um padrão hereditário prévio). Conforme se podeobservar pelo esquema, a enzima é capaz de reconhecer os nucleótidos de 5-metilcitosina na cadeiaparental (ou seja, que serve de molde à replicação semiconservativa do DNA), para depois "metilar"os nucleótidos complementares presentes na cadeia filha. Fica assim explicado como é que umprecursor eritrocitário, por exemplo, é capaz de "lembrar" as suas células-filhas que estas têm de sediferenciar na linhagem celular rubra.

Dinucleótidos CpG (s. 9)

A metilação de DNA tende a ocorrer emcitosinas pertencentes a um dinucleótido do tipo CpG.

No canto inferior direito (s. 8) encontra-sedelineada a azul uma pequena parte de uma sequêncianucleotídica, composta por um nucleótido de guanina eoutro de citosina. De uma maneira genérica estesdinucleótidos são representados pela notação CpG,onde o “p” representa a ligação fosfodiésterestabelecida entre o grupo fosfato (circunferência avermelho no s. 8) e as bases em questão. A utilização da

notação “CpG” serve para o propósito de não seconfundir este tipo de ligação - através de um grupofosfato (imagem de cima, à direita) -, com uma ligaçãocomplementar entre uma citosina de uma cadeianucleotídica e uma guanina de outra cadeia que lhe sejacomplementar (imagem de baixo, à direita).

Cerca de 20% dos dinucleótidos CpGs dogenoma encontram-se agrupados em ilhas CpG . As ilhas CpG correspondem a sequências de cerca de1000 a 2000 pares de bases, com uma grande densidade de dinucleótidos do tipo CpG, quandocomparadas com o resto do genoma.


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À partida seria expectável que os nucleótidos se distribuíssem de forma aleatória, ao longo detodo genoma, pelo que não fará sentido que existam estas ilhas CpG. Na verdade os nucleótidos nãose distribuem de uma forma totalmente aleatória no ser Humano, sobretudo porque as citosinasmetiladas tendem a desaparecer do genoma ao longo de uma escala de tempo evolutiva, isto é, aolongo de toda evolução biológica mais de 75% das citosinas metiladas acabaram por sofrer umamutação por transição 5-C:T (uma 5-metil-citosina “transforma -se” numa timina).

Uma base de citosina não-metilada pode, acidentalmente, ser desaminada e converter-se emuracilo. Estas mutações não surtem grande efeito porque a enzima uracilo DNA glicosilase é capaz dereconhecer esse nucleótido e proceder à sua excisão, para que posteriormente possa substituí-lo poruma nova citosina. As citosinas metiladas também podem sofrer desaminações acidentais,convertendo-se num outro nucleótido - neste caso, uma timina. Uma vez que o uracilo não é umabase azotada típica de ácidos desoxirribonucleicos, é mais fácil para as enzimas de reparaçãoreconhecerem uma desaminação de uma citosina não metilada, do que uma desaminação decitosinas-metiladas que resulta na mutação para uma timina – estas timinas são indistinguíveis dequalquer outra timina desoxirribonucleica.

Existem sistemas enzimáticos capazes de reconhecer as timinas que têm origem nadesaminação acidental de 5-metilcitosinas, mas a sua eficácia é reduzida precisamente porque não éfácil a identificação de timinas derivadas de mutação e timinas geneticamente herdadas. É por estemotivo que, em escalas de tempo evolutivas, se verifica uma evidente tendência para a perda decitosinas metiladas no genoma. Desta forma torna-se claro o porquê de as sequências de CpGacabarem por se aglutinar naquilo a que chamamos de ilhas CpG.

A metilação do DNA pode ocorrer em CpGs presentes em diferentes regiões do genoma (s. 9)

Ilhas CpGs presentes nas regiões promotoras ou nos primeiros exõeso Salvo algumas exceções importantes, estas ilhas tendem a permanecer não-metiladas

(60% dos promotores de genes Humanos – s. 10) na maioria genes do tipohousekeeping (codificam para proteínas essenciais ao metabolismo de qualquercélula, por exemplo)

CpG “ shores ” o Por "CpGisland shores " entende-se a "costa das ilhas CpG", ou seja, não é mesmo o

núcleo das ilhas de CpG, mas sim sequências algo periféricas com uma densidademenor de dinucleótidos CpGs. Estes é que são os locais de verdadeira metilaçãoepigenética, que determina a diferenciação fenotípica celular;

CpG nas regiões codificadoras – em cerca de 30% destas sequências; CpG em sequências repetitivas – 10%;

Ao contrário do que acontece com as ilhas de CpG associadas a promotores, as ilhas CpGs desequências repetitivas longas tendem a ser metiladas, para que se reduza a instabilidadecromossómica – este será um aspeto que talvez se torne mais evidente ao longo desta discussão, peloque será oportunamente discutido mais à frente.

A metilação de ilhas de CpG em promotores poderá determinar, por exemplo, fenómenos deimprinting mas não só: em vários tipos de cancro verificam-se fenómenos de metilação de regiõespromotoras com ilhas CpG .


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Padrão de metilação do DNA (s. 11)

Apesar de os padrões de metilação também serem transmitidos aos gâmetas (a partir dadivisão meiótica), após a fertilização verifica-se uma desmetilação abrangente de praticamente todoo genoma do indivíduo – repare- se na barra “ Demethylation ” no esquema do s. 11, onde se pode

observar que acompanha todo o desenvolvimento do zigoto até à formação de um aglomerado de 8células. Ainda não se sabe ao certo como este processo ocorre, mas as principais hipóteses são:

Perda passiva de metilações após a divisão celularo A inatividade das metiltransferases de manutenção facilmente resultará numa

perda do padrão de metilação, uma vez que nas primeiras divisões celularesapenas as cadeias parentais estariam metiladas, acabando por "diluir" essaregulação epigenética à medida que o número de divisões aumenta;

Eventual presença de uma enzima de desmetilação , revertendo o efeito das DNA MTases;

Durante a gastrulação é restabelecido o padrão de metilação caraterístico das célulassomáticas normais adultas ( De Novo Methylation , no s. 11), na sua maioria exatamente com a mesmaconfiguração que havia sido herdada dos progenitores. Apesar de já se conhecerem estes factos, aquestão ainda persiste: “Q ual o mecanismo responsável por "guardar memória" do padrão demetilação herdado, mesm o após este ter sido "apagado”?” .

Metilação e a tumorigéneseNo caso do cancro, a metilação dos promotores com ilhas CpG e/ou CpG shores facilita o

recrutamento de proteínas de ligação ao DNA-metilado, impedindo assim que se liguem fatores detranscrição que numa célula saudável iriam promover a transcrição do gene a jusante. É precisamenteisso que é ilustrado na sequência de imagens “ Gene silencing ”, no s. 13: o promotor não metilado éacessível pelos fatores de transcrição e a RNA polimerase (a verde, TF e RNA pol.), enquanto na célula

neoplásica há um bloqueio notório pela presença de nucleótidos 5-metilcitosina. Também na figura 1do 14º artigo se verifica que a hipermetilação tumorigénica afeta sobretudo as regiões dospromotores, ricas em ilhas CpG e “costas” de ilhas de CpG (CpG Island shores ), impedindo a ligaçãocorreta dos fatores de transcrição, e assim resulta numa expressão deficiente dos genes a jusante.

O promotor do gene BRCA1 é um dos exemplos de genes envolvidos na tumorigénese, comum promotor constituído por ilhas CpG. Este é também um bom exemplo de um gene do tipohousekeeping , uma vez que é responsável por codificar complexos proteicos de reparação de DNA,tanto em células mamárias como noutras células com outro tipo de diferenciação. Para outrosexemplos consultar a tabela 2.4, s. 14.

Os restantes esquemas do s. 13 evidenciam a hipometilação caraterística das célulasneoplásicas ao nível as sequências génicas (genes propriamente ditos , representados em Genetranscription ), assim como das sequências repetitivas ( genomic instability ). No caso dos genes istoresultará numa leitura errada da sequência nucleotídica:

Uns fatores de transcrição ligam-se no início do gene e permitem a leitura de quase todaa sequência nucleotídica;

Outros apenas iniciarão a meio do gene;

Isto será problemático para a célula uma vez que levará a uma tradução deficiente dasequência génica em causa.

A transcrição de sequências repetitivas, como é o caso de retrotransposões, aumenta ainstabilidade genómica porque estes elementos móveis podem gerar novas configurações da


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sequência nucleotídica, alterando a expressão de genes ou até mesmo a própria conformaçãocromossómica.

Epigenética na hipótese dos dois eventos de Knudson (5ª aula)

No s. 15 está esquematizado todo o percurso tumorigénico em genes supressores tumorais,nos quais é necessária a perda de expressão dos dois alelos para que se desenvolva a neoplasia. Como já havia sido referido na 5º aula, segundo a hipótese de Knudson são necessários dois eventos demutação para que se inicie a tumorigénese, sendo que no caso dos cancros familiares esse primeiroevento já é herdado dos progenitores, originando assim as formas familiares de cancro, como é o casodo síndroma de Lynch, por exemplo, mas também o do retinoblastoma.

Este é o momento oportuno para salientar a importância das alterações epigenéticas natumorigénese, uma vez que estas poderão ser também incorporadas nesta hipótese dos dois eventos.De facto, 50% dos genes que causam as formas familiares de cancro, sofrem metilação na respetivasformas esporádicas, ou seja, o resultado final poderá ser o mesmo, quer haja mutação ou metilação.Nos casos familiares é até frequente que a metilação acabe por assumir o papel de segundo hit ouevento (s. 15).

O esquema inferior do s. 15 demonstra que é possível chegar ao mesmo cancro só commutações (mutação e depois LOH – Loss of heterozigoty . Rever 5ª aula para melhor compreensão doque é o LOH), só com metilações ou pela conjugação destess dois processos tumorigénicos. O que nãoocorre simultaneamente é a mutação e a metilação no mesmo alelo – a metilação e a mutação sãomutuamente exclusivas num mesmo alelo.

No s. 16 é evidenciada o impacto equivalente de uma metilação (exemplo da alínea d)), emcomparação com a mutação por deficiências no sistema de reparação (exemplo b)) ou por quebras dacadeia de DNA (c)). Neste exemplo do efeito da metilação sobre o DNA é ilustrada a interação entrebases de 5-metil-citosina e agentes alquilantes, como é o caso dos benzopirenos (abordada a seguir,em “metilação de regiões codificantes”).

Metilação em regiões codificantes (s. 17)

A hipometilação de regiões codificantes contribui para o desenvolvimento de neoplasias, porpermitir a ligação incorreta de fatores de transcrição e maquinaria enzimática responsável pelatranscrição genética (RNA polimerase, p. ex.). Contudo, segundo Jones e Baylin (s. 17), a presença de5-metil-citosinas ao nível das regiões codificantes poderá também contribuir para o desenvolvimentoneoplásico, não por determinar uma ligação incorreta da maquinaria de transcrição, mas porquepoderá predispor para a ocorrência de mutações:

Desaminação espontânea o Como já foi referido anteriormente, as 5-metil-citosinas têm um potencial

mutagénico intrínseco pois espontaneamente sofrem fenómenos dedesaminação, convertendo-se em bases azotadas de timina;

o Temos uma mutação por transição C T;o 50% das mutações pontuais inativadoras na região codificante do supressor

tumoral TP53 ocorrem em citosinas metiladas; Resultando em cerca de 50% dos tumores esporádicos de cólon;


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Maior absorção de radiação ultra-violeta :o A presença do grupo metilo desvia o espetro de absorção da citosina para uma

gama de comprimentos de onda coincidentes com os da luz solar, tornando assima região codificadora mais suscetível à ocorrência de mutações, principalmenteassociadas ao cancro da pele;

o As mutações são do tipo transição CC TT Maior capacidade de ligação a benzopirenos

o A metilação aumenta a afinidade dos benzopirenos pela região codificante,facilitando assim a ocorrência de mutações do tipo G T;

o Mecanismo responsável por cerca de 32% das neoplasias do pulmão;

Hipometilação e perda de imprinting (s. 19, 20, 21, 22, 23 e 24)

As neoplasias benignas e os estadios precoces de tumores agressivos apresentam-sefrequentemente com aberrações de metilação de DNA: hipometilação global do DNA ehipermetilação específica nos promotores , o que confere alguma solidez à hipótese de que a

desregulação epigenética possa preceder transformações tumorais, como quando ocorre commutações em genes supressores tumorais, proto-oncogenes e instabilidade genómica.

A perda de metilação dos dinucleótidos CpG foi a primeira alteração epigenética a seridentificada em células tumorais (Feinberg e Vogelstein, 1983). Esta perda de metilação empromotores que estavam previamente silenciados permite a perda de diferenciação celular,caraterística do crescimento neoplásico.

Um estudo recente de grande escala de metilação do DNA com o uso de microarrays genómicos detetou extensas regiões genómicas hipometiladas em áreas não codificantes (Weber etal., 2005).

Durante o desenvolvimento de uma neoplasia, o grau de hipometilação do DNA genómicoaumenta à medida que a lesão progride de uma proliferação de células benignas, para um cancroinvasivo (Fraga et al., 2004). De entre os genes possivelmente afetados pela hipometilação temos:

Genes reguladores do desenvolvimento embrionário e crescimentoo Que deveriam estar silenciados;

Genes específicos de tecido, tais como antigénios de células germinativas, específicos dotumor em causa

o A família dos genes MAGE, BAGE, LAGE e GAGE não é expressa em células adultanormais;

Oncogenes que estão sobrexpressos devido a hipometilação, como é o caso do c-MYC,BCL2, B-CLLe R-RAS (cancro gástrico).

Como já foi referido anteriormente, o próprio fenómeno de imprinting depende de umametilação íntegra de um dos alelos, para que não haja sobrexpressão do gene. A “desmetilação” deum gene que sofreu imprinting provoca uma expressão bialélica. O tumor de Wilms (s. 23) é umexemplo de uma neoplasia em que 50% dos casos ocorrem com hipometilação, mais concretamentepor perda de imprinting (LOI – Loss Of Imprinting do gene IGF2 (insulin-like growth factor-2) – há umamaior expressão deste sinalizador de crescimento celular). O LOI no IGF2 é comum em indivíduosadultos e está associado a um risco 5 vezes superior de desenvolvimento de neoplasia colo-retal.


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A expressão excessiva de IGF-2 também está associada aos nefroblastomas. Quando todas ascélulas perdem o seu imprinting original (LOI) estamos perante um síndroma de Beckwith-Wiedemann.

É possível que “epimutações”, isto é, mutações, deleções ou expressões alteradas da

maquinaria epigenética (enzimas de metilação, p. ex.) constituam o “2nd -hit” na tumorigénese – osegundo evento necessário à tumorigénese, segundo a hipótese dois dois-eventos proposta porKnudson (5ª aula).

As desregulações epigenéticas mais conhecidas em tumores Humanos são os silenciamentosde genes supressores tumorais, resultantes de hipermetilação de promotores com CpG islands, comoé o caso do:

CDKN2A; MLH1 (recorde-se, envolvido no síndroma de Lynch); BRCA1; VHL;

Modificação de histonas (s. 25)As histonas são complexos proteicos que

entram na constituição do nucleossoma da cromatina.O centro dos nucleossomas é compostos por umoctâmero de histonas (esquema do lado direito;imagem do s. 26):

Duas histonas H2A; Duas histonas H2B; Duas histonas H3; Duas histonas H4;

A histona H1 dispõem-se perifericamente aonucleossoma e não está envolvida na modulaçãoepigenética. Todas as outras poderão ser alvo de modificação epigenética, ao nível do seu terminalamino (mais corretamente descrito como a cauda terminal- N). Esta modificação consiste na adiçãocovalente de um ou vários grupos químicos funcionais (figura 4-38 do Alberts, apresentada a seguir):

Acetilação de lisinas o É acrescentado um grupo acetil aos resíduos de lisina, presentes na cadeia

polipeptídica das histonas; Metilação de lisinas

o Poderá ser uma monometilação, di ou até trimetilação, conforme se observa nafigura 4-38 (apresentada a seguir) e no s. 27;


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Fosforilação de serinas ;

Estas modificações podem ocorrer na cauda de qualquer uma das histonas pertencentes aooctâmero (excluindo assim a H1). É também possível que haja modificações ao nível de aminoácidosque se localizam no centro do octâmero, mas essa não é uma discussão de interesse para o tema dopapel da epigenética no cancro.

As histonas que apresentam uma cauda- N com maiores dimensões são as H3 e a H4, pelo quenaturalmente serão as proteínas mais frequentemente modificadas.

Existem enzimas específicas para cada tipo de modificação, assim como para cada local dashistonas que sofre essa mesma modificação. De entre essas várias enzimas temos:

Grupos acetil o Acetiltransferases de histonas (HAT) - Para adicionar grupos acetil;o Desacetiltransferases de histonas (DHACs) e sirtuínas - Para remover grupos acetil;

Grupos metilo o Metiltransferases - Adicionar metilos;

o Demetiltransferases - Remover metilos; Grupos fosfatos o Cinases - Adicionar fosfatos;o Fosfatases – Remover esses grupos fosfatos;

Ubiquitinas o Ligases de ubiquitinas;o Desubiquitinases;

Entre outras;


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Estas modificações têm implicações importantes na ativação ou inativação de genes. Tome-seo exemplo da acetilação de lisinas, que acaba por lhes retirar carga positiva e assim perder a afinidadepara o DNA, tornando-o mais acessível para replicação, por exemplo (s. 30 – as HATs adicionam gruposacetil e por isso tornam o material genético ativo; As HADCs removem grupos acetil, inativando omaterial genético – note-se que a legenda da imagem está cruzada, e por isso não está totalmenteconcordante com a disposição do título do slide “Inativo/Ativo”).

No s. 24 é apresentado um exemplo de interação entre dois mecanismos epigenéticos numacélula neoplásica, impedindo assim a transcrição génica: a metilação de um promotor (pontos a negrosobre as sequências mais à esquerda) recruta MBPs (Methycytosine-binding proteins ), proteínas quese ligam à sequências metiladas, que por sua vez recrutam outros complexos proteicos que contêmDNMTs e HDACs, culminando numa alteração de conformação da cromatina que eventualmenteprovoca a repressão da transcrição génica.

Código das histonas (s. 26)

O número de modificações possíveis num nucleossoma individual é enorme, mas geralmentetendem a surgir em padrões, isto é, modificações num aminoácido são acompanhadas por outrasmodificações específicas noutros aminoácidos - p. ex., uma acetilação no aminoácido 9 pode sersempre acompanhada de uma metilação do 27 (tudo isto na mesma histona, mas os padrões poderãoenvolver várias histonas, presentes em nucleossomas diferentes). Muitas destas combinaçõesparecem ter um significado especial para a célula, pois determinam como e quando o DNA associadodeverá ser acessível. Diz-se que estas modificações constituem a hipótese do código de histonas : umtipo de padrão de modificações pode determinar que aquele excerto de cromatina seja reparado, porexemplo, ou então que não deva ser expresso.

Como exemplos de padrões de modificação de histonas temos os do s. 28, ou ainda os que

são apresentados no final do 3º parágrafo, do 14º artigo da bibliografia complementar: Exemplo de padrão de ativação

o Trimetilação das lisinas 4, 36 ou 79 na histona 3 H3K4me3, H3K36me3 ou K3HK79me3

H3, da histona 3; K, representa o resíduo de lisina; K#, o número doresíduo de lisina; me3, de trimetilação (poderia ser me2, se fosse umadimetilação);

o Monometilação da lisina 20, na histona 4, e da lisina 5 da histona 2B H4K20me e H2BK5me;

o Acetilação da lisina 9 e 14, da histona 3 H3K9ac e H3K14ac;

Exemplo de padrão de repressão o Di ou trimetilação H3K9

H3K9me2 e K3K9me3;o Trimetilação H3K27;o Metilação da lisina 20 da histona 4;

Nota : A substituição do “K” pelo “R” no padrão de metilação determina que, em vez de ser uma lisina,é uma arginina que é modificada (s. 27)


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Alteração do padrão das modificações das histonas em células neoplásicas (s. 29)

Em concordância com os exemplos de modificações de histonas supracitados, no s. 29 éapresentado um esquema geral do tipo de modificações das histonas presentes em células saudáveise células neoplásicas:

Célula normal o Nas regiões codificantes há um predomínio das acetilações que, tal como também já

foi referido, facilitam o acesso da maquinaria de transcrição ao interior da cromatina,aumentando assim a capacidade transcripcional. Note-se que também existemmetilações, mas são as acetilações que predominam;

o As metilações parecem surgir mais significativamente nas zonas “reprimidas”, isto é,nas zonas de heterocromatina;

Célula neoplásica o O padrão inverte-se: acetilações mais significativas na heterocromatina e metilações

nas zonas de regiões codificantes;

Regulação dinâmica da metilação das histonas (s. 31, 32, 33 e 34)

No s. 31 é reforçada a ideia de que as enzimas de modificação de histonas são específicas paracada resíduo, isto é, tomando o exemplo da enzima EZH2 percebemos que esta é específica para atrimetilação apenas do resíduo 27 de lisina – para o número 9 temos muitas outras enzimas.

Atualmente já se conhece uma grande quantidade de enzimas que modificam o código dehistonas (s. 32 e 33) e que por isso poderão estar envolvidas na tumorigénese. A enzima SMYD3, queé uma HMT (Histone methyl-transferase ) caraterística do H3K4, está sobrexpressa emhepatocarcinomas e cancro colo-retal, por exemplo.

Nota : Apesar de ser ilegível a tabela do s. 32, o exemplo da SMYD3 é apresentado no s. 33 e no 14ºartigo;

É a inter-relação entre fenómenos epigenéticos de metilação de DNA ou a partir do código dehistonas que se estabelece o epigenoma, ou seja, a informação acerca da expressão ou repressãogénica que não é codificada pela sequência nucleotídica. No s. 34 é apresentado um esquema quereúne a metilação de DNA e a modificação de histonas, numa comparação entre células saudáveis eoutras neoplásicas.

RNAs não-codificantes (ncRNA)Atualmente é um lugar comum dizer que a maior parte do nosso DNA corresponde a junk

DNA, isto é, sequências não codificantes sem importância para a nossa sobrevivência, ainda que estaseja uma ideia científica, pelo menos em parte, com os seus dias contados. Os exões codificantes degenes que codificam proteínas representam apenas 1,5% de todo o nosso DNA, e por isso é muitofrequente ouvir-se dizer que o restante material genético é obsoleto - apelidado de junk DNA .Atualmente já se sabe que uma boa parte deste material genético corresponde a sequênciasreguladoras, como é o caso de promotores, enhancers , insulators , entre outros. Para esta nossadiscussão importa referir que, no seio dessas sequências reguladoras, existe informação que étranscrita mas não sofre tradução, pois a sua verdadeira função é a de regular a expressão génica soba forma de moléculas de RNA não-codificantes (ncRNA).

Nota : Talvez haja mesmo material genético no ser Humano que é totalmente dispensável, dandoalgum sentido à expressão junk DNA . Prova disso é o facto de no passado dia 27 de março de 2014 aNature ter anunciado a síntese do primeiro cromossoma artificial de leveduras, no qual foi excluído


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aquilo que se pensava ser junk DNA , sem que trouxesse repercussões para o microrganismo emquestão;

Os ncRNA podem assumir várias formas, tal como é apresentado na tabela do s. 36, desdemicro RNAs (miRNAs), até RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs) ou mesmo os piRNAs que são formas

de repressão de transposões.miRNAs

Os miRNAs são as formas de ncRNAs que parecem ter um peso significativo nos mecanismosgenéticos e epigenéticos do cancro, conforme é demonstrado pela tabela do s. 37, onde sãoapresentados vários tipos de miRNAs cujas alterações estão implicadas no desenvolvimentoneoplásico.

Ao contrário de outras formas de RNA mais conhecidas (mRNA, p. ex.), os miRNAs nãocodificam para proteínas: a sua verdadeira função é a da inibição da expressão génica. O silenciamentoda expressão génica por miRNAs é um mecanismo preservado em todas as formas vivas, desde plantas

até seres Humanos, e por isso deverá ser visto como fundamental para a regulação génica. Aimportância destes agentes é de tal ordem que a sua descoberta deu direito à atribuição de um prémioNobel da Fisiologia ou Medicina, em 2006, a Andrew Fire e Craig Mello.

As estimativas mais recentes apontam para a existência de cerca de 1000 genes Humanos quecodificam para miRNAs, perfazendo assim cerca de 5% do genoma humano. Estes ácidos ribonucleicostêm cerca de 18 a 24 pares de bases, localizando-se (s. 39):

Intrões ou exões CpG ou não-CpG; Desertos génicos, regiões intergénicas e/ou em extremidades 3’UTR de mRNA;

Cerca de 60% genes Humanos são regulados por miRNA, podendo um único miRNA regulardezenas de transcritos, bem como um transcrito apenas pode ser alvo de vários miRNA.

Nota : Esta percentagem não corresponde à informação que é apresentada no s. 39, porque o ppt ainda não foi atualizado. 60% foi o número avançado pela profª. Dra. Carmen Jerónimo; No 15º artigoda bibliografia complementar (prof. Dr. Rui Henrique e profª. Dra. Carmen Jerónimo), alargam aestimativa de 30 a 70%;

As regiões codificantes para miRNA com implicações no desenvolvimento neoplásicodistribuem-se por todos os cromossomas (s. 40), exceto no cromossoma Y.

Regulação epigenética por miRNA (s. 41)

A transcrição dos genes miRNA produzem transcritos primários, genericamenterepresentados por pri-miRNA. O processamento desse pri-miRNA através do complexo proteicoDGCR8-Drosha dá origem a um pré-miRNA que, através do transportador exportina-5, passa para ocitosol. No citoplasma este RNA sofre ainda um outro processo de maturação, através de um “corteenzimático” executado por uma proteína designada por Dicer , formando-se assim uma cadeia duplade miRNA – no s. 41 está representada sob a forma de miRNA:miRNA porque este RNA estáemparelhado, como se fosse uma molécula de DNA. Repare-se que, logo após a sua transcrição, o pri-miRNA adota uma conformação fechada sobre si mesma, isto é, as suas bases emparelham umas comas outras, permitindo que se forme uma dupla cadeia, tal como no DNA. A enzima Dicer vai clivar opré-miRNA ao nível da sequência circular que permite o emparelhamento do RNA sobre si mesmo (s.41). Por ação de uma helicase, o miRNA:miRNA é desemparelhado e obtêm-se duas cadeias simplesde miRNA. De seguida a molécula de miRNA é encaminhada para um complexo multiproteico


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designado por complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC – RNA-Induced Silencing Complex ).Mesmo incorporado no RISC, o miRNA emparelha com cadeias simples de mRNA presentes no citosol,que numa outra qualquer situação teriam a função de traduzir a informação genética em proteínas,para que este complexo possa exercer uma de três funções (s. 41):

1.

Repressão translacionala. O miRNA emparelha com o mRNA, para que o RISC trave a tradução proteica,funcionando assim como um silenciamento do gene que está a ser traduzido;

b. No s. 38 também é apresentado de forma esquemática este mecanismo;2. Clivagem de mRNA

a. Neste caso o RISC não atua sobre o ribossoma, mas sim diretamente sobre o mRNApara que este seja degradado, funcionando novamente como uma forma desilenciamento do gene;

3. Ativação translacionala. Em alguns casos também é possível que os miRNA possam ter o efeito oposto à

repressão translacional, isto é, aumentam a tradução de determinados mRNA.Normalmente a ativação translacional dá- se por ligação do miRNA à extremidade 5’-UTR do mRNA;

Há ainda uma quarta possibilidade em termos de função do miRNA, mas esta é independentedo RISC, funcionando simplesmente como um decoy para impedir a ligação do mRNA ao ribossoma,que ficará assim impossibilitado de traduzir essa informação genética, pois encontra-se em duplacadeia.

O emparelhamento do miRNA com as moléculas de mRNA não tem de ser perfeito, podendomesmo haver uma variabilidade até 5% entre as bases dos dois ácidos ribonucleicos. É por este motivoque um mesmo miRNA poderá atuar sobre vários transcritos, assim como vários transcritos podemser alvo do mesmo miRNA.

Desregulação de miRNA no cancro (s. 42)

Devido à sua capacidade de controlo do crescimento, diferenciação e sobrevivência celular,através de mecanismos epigenéticos, não será de todo surpreendente que desregulações na funçãodo miRNA possam estar envolvidas na tumorigénese. Sistematicamente tem sido verificado que osmiRNAs sofrem alterações importantes em células neoplásicas, como é o caso de amplificações edeleções destes ácidos ribonucleicos que foram identificadas em vários cancros. Os miRNAs poderãointervir na transformação neoplásica através das seguintes maneiras:

Incremento da expressão de oncogenes

o Se um miRNA inibe a tradução de um oncogene, uma redução na quantidade ou nafunção desse miRNA irá determinar uma sobrexpressão do produto do oncogene.Neste caso o miRNA funciona como um supressor tumoral;

Redução da expressão de genes supressores tumorais o Se o alvo do miRNA for um gene supressor tumoral, a sua hiperatividade irá reduzir a

expressão de proteínas supressoras de tumores, e aqui o miRNA funcionará como umoncogene - oncomiRNAs ;

Em alguns casos de leucemias e linfomas há mesmo uma produção ineficaz ou até deleção domiRNA que controla a expressão de BCL2, uma proteína anti-apoptótica. Neste exemplo o miRNA

funcionaria como um supressor tumoral.


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Os defeitos de expressão de miRNA podem dever-se a vários tipos de defeitos genéticosrelacionados quer com a própria sequência nucleotídica que os codifica, quer com o seuprocessamento (s. 41):

Mutações no gene TARBP2;

Mutações no gene DICER1, produzindo DICERs não funcionantes; Mutações no gene XPO5, impedindo que haja passagem do miRNA do núcleo para ocitoplasma, por não haver exportinas5 funcionantes;

Na tabela do s. 43 são apresentados alguns exemplos de interações entre miRNAs e cancro.

The clonal genetic model of cancer (s. 44)

A visão clássica do crescimento neoplásico centrava-se nas alterações genéticas quetransformavam células normais em neoplasias benignas e noutros casos em neoplasias malignas.

À luz dos avanços científicos na área da epigenética percebeu-se que, para além das alterações

genéticas, existe um papel relevante das alterações epigenéticas que normalmente precede asprimeiras – as alterações epigenéticas conferem assim uma suscetibilidade para a ocorrência dealterações genéticas.

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8ª Aula (a) - Mecanismos de Carcinogénese IV, Alterações Epigenéticas - 11-04-2014