VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Qumica em Iniciao Cientfica 27 a 30 de julho de 2009

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AVALIAO DA CINTICA DE CRESCIMENTO NOS MEIOS (2XTY E TB) PARA A PRODUO DE ANTGENO KMP-11 DE LEISHMANIA CHAGASI.

1 Sirtys S. L de Andrade, 2 Roberta V. A. Chaves, 3 Mrcia R. S. Pedrini, 3 Gorete R. de Macedo

1 Bolsista de iniciao Cientfica PIBIC/CNPq/UFRN, discente do curso de Engenharia Qumica.

2 Aluno da Ps-Graduao do Programa de Ps Graduao em Engenharia Qumica da UFRN/RN

3 Professor do Departamento de Engenharia Qumica UFRN/RN

1,2 Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Departamento de Engenharia Qumica, Centro de Tecnologia.

Av Sem. Salgado Filho, 3000, Campus Universitrio, Natal RN, CEP: 59.072-970, Natal

e-mail: gomacedo@eq.ufrn.br

RESUMO - As Leishmanioses so enfermidades que produzem manifestaes cutneas, mucocutneas e viscerais. No Brasil cerca de duas mil pessoas so infectadas, sendo que 92% dos casos acorrem no Nordeste. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a cintica de crescimento de Escherichia coli recombinante nos meios 2xTy e TB para produzir o antgeno KMP-11 de Leishmania chagasi. Na primeira etapa foram realizados ensaios sem induo em incubador rotativo a 37C, 200rpm e pH inicial 7,0 para avaliar o crescimento microbiano nos meios. Avaliou-se a mxima velocidade especfica de crescimento (xmx) que para ambos os meios foi 0,1h

-1. O fator de converso de substrato em clula (YX/S), para o meio 2xTy e TB foi 0,8 e 0,83 respectivamente. Na segunda etapa, foram realizados ensaios nas mesmas condies de cultivo, nos quais, se realizou a induo por IPTG. A verificao da expresso do antgeno foi feita por eletroforese SDS-PAGE. Nas cinticas com induo foram analisados: fator de converso de substrato em produto (YP/S), e a mxima velocidade especfica de produo (Pmax). O fator de converso encontrado foi 1,1x10

-3 para os dois meios. A mxima velocidade especfica de produo (Pmax), foi 0,16 h

-1 e 0,13 h-1 para os meios 2xTy e TB, respectivamente. Palavras-chave: antgeno recombinante, induo, eletroforese

INTRODUO

A leishmaniose foi relatada no Brasil em 1936, primeiramente na regio Nordeste (Evans et al., 1992). De acordo com a espcie podem produzir manifestaes cutneas, cutneas difusas, mucocutneas e viscerais (Dossi, 2006). A Leishmaniose Visceral Americana causada pela espcie Leishmania chagasi, um parasita intracelular obrigatrio (Martins et al., 2006).

Comumente chamada de calazar, a leishmaniose, atinge cerca de duas mil pessoas por ano no Brasil, sendo que cerca de 92% dos casos ocorrem no Nordeste (S, 2006). Devido ao alto custo e a alta toxidade das drogas atualmente usadas na cura da leishmaniose faz-se necessria a busca de tratamentos alternativos mais eficazes e menos agressivos ao organismo (Rath et al., 2003). Por isso h um interesse especial na produo de antgenos atravs de microrganismos recombinantes para a

produo de protenas heterlogas de interesse (Cha et al., 2005), visando sua aplicao em soros e vacinas.

A Escherichia coli , atualmente, o microrganismo mais conhecido e estudado. O conhecimento de sua fisiologia permitiu o desenvolvimento de tcnicas de manipulao gentica, visando produo de protenas recombinantes de interesse, como por exemplo, antgeno de Leishmania chagasi (Liria, 1995; Choi & Lee, 2004; Makrides, 1996).

O antgeno Kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11) uma protena presente na superfcie da membrana em todos os membros da famlia Kinetoplastidae. Devido a sua alta conservao, um antgeno promissor para utilizao em vacina (Jardim,1995a, Jardim, 1995b;

Berberich,1998). Neste contexto o presente trabalho tem

por objetivo, avaliar o perfil da cintica de crescimento de E. coli recombinante, nos

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meios de cultivo 2xTY e TB (Terrific B roth). Verificar a capacidade de expresso do antgeno KMP-11 de Leishmania chagasi, quando o microrganismo submetido induo, tendo como molcula indutora o isopropilbetatiogalactosdeo (IPTG).

MATERIAL E MTODOS

Microorganismo Utilizado

Nesse trabalho o microrganismo utilizado foi o clone de Escherichia coli, KMP-11, contendo o vetor pQE que apresenta uma cauda (tag) de seis resduos de histidina como fuso e permite a purificao das protenas em colunas quelantes de Ni2+. Meios de Cultivo

Para a preparao dos meios de cultivo

foi utilizada gua destilada e depois de completa homogeneizao dos componentes, o mesmo foi reservado em frascos de erlenmeyer de 250mL. Em seguida foi realizada esterilizao em autoclave a 120C por 20 minutos. Os mesmos foram suplementados com antibiticos Kanamicina e Ampicilina nas concentraes de 100g/mL e 25 g/mL, respectivamente. A composio dos meios 2xTY e TB, em quantidade suficiente para 1L de gua destilada, est apresentada na Tabela 1.

Tabela 1 Composio dos meios de cultivo testados

Meios de cultivo Composio 2xTy TB Triptona (g) 16 12 Extrato de

Levedura (g) 10 24

NaCl (g) 5 - KH2PO4 (g) - 2,31 K2HPO4 (g) - 12,54 Glicerol (mL) - 4,0

Ativao do Clone

O clone utilizado nesse trabalho foi conservado a -20C, em um microtubo de 2 mL em meio Luria-Bertani (LB), sendo que para a ativao do mesmo foi realizada uma fermentao de 12 horas, nos meios 2xTY e TB, em incubador rotativo (Tecnal), utilizando erlenmeyer de 250mL os quais continham 50mL dos respectivos meios, sob as seguintes condies: 200 rpm, 37 C e pH inicial 7,0.

Inculo

O inculo foi obtido em seguida

ativao, em incubador rotativo, seguindo as mesmas condies de cultivo adotadas na ativao. A fermentao para a obteno do inculo teve uma durao de 8 horas e uma taxa de inoculao de 10% (v/v), sendo o volume final contido no erlenmeyer de 50mL.

Fermentao

A fermentao para o acompanhamento da cintica de crescimento foi realizada, assepticamente, em seguida adio do inculo, sob as mesmas condies de cultivo e mesma taxa de inoculao. Os pontos foram retirados a cada duas horas at que o microrganismo atingisse a fase estacionria, sendo a verificao feita pela medida da absorbncia a 590nm.

Induo

A induo foi realizada uma hora aps o incio da fermentao, o que corresponde ao incio da fase exponencial de crescimento do microrganismo. Como molcula indutora utilizou-se o isopropilbetatiogalactosdeo (IPTG), que tem por finalidade promover a expresso do antgeno KMP-11. O indutor foi utilizado numa concentrao final de 1mM. Concentrao Celular e Consumo de Substrato

A concentrao celular foi determinada utilizando a metodologia de massa seca. As amostras, de 2mL, foram retiradas em duplicata. A anlise do consumo de substrato foi realizada pelo mtodo do carbono orgnico total (TOC 5000A Total organic carbon analyzer Shimadzu). Quantificao e Verificao da Expresso do antgeno KMP-11

A quantificao do material extracelular e intracelular (aps lise celular com tampo de Urea 8M) foi realizada utilizando o mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951), aps purificao do material em coluna de afinidade contendo a resina Ni-SepharoseTM 6 Fast Flow. A expresso do antgeno foi verificada atravs de eletroforese em sistema desnaturante SDS-PAGE (Laemmli, 1970).

RESULTADOS E DISCUSSO

A avaliao do crescimento de E. coli

recombinante feita a partir de ensaios sem

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induo permitiu a elaborao das curvas de crescimento, bem como do consumo de substrato em ambos os meios. As curvas permitem observar que h ausncia de fase lag durante o crescimento microbiano. Como mostram as Figura 1 e 2.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 201,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

[X] [S]

Tempo (h)

Concentrao Celular (g/L)

9,0

9,5

10,0

10,5

11,0

11,5

12,0

Consum

o de Substrato (g/L)

Figura 1 Curva de concentrao celular e consumo de substrato E. coli, no meio 2xTY sem induo.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

[X] [S]

Tempo (h)

Con

centrao Celular (g/L)

13,5

14,0

14,5

15,0

15,5

16,0

16,5

17,0

17,5

18,0

18,5

Con

centrao de

Sub

strato (g/L)

Figura 2 Curva de concentrao celular e consumo de substrato, E. coli no meio TB sem induo.

Os parmetros cinticos calculados nessa etapa foram o fator de converso de substrato em clulas (YX/S) e a mxima velocidade especfica de crescimento (xmx). O xmx foi obtido a partir da linearizao da fase exponencial da curva de concentrao celular. Para os dois meios estudados foi obtido xmx = 0,1h

-1. O fator de converso encontrado foi YX/S = 0,81 e 0,83 para os meios 2xTY e TB respectivamente. O fator calculado pela Equao 1

t

XY

SX

=/ (1)

A avaliao dos ensaios, nos meios 2xTY e TB, com induo possibilitou a verificao da expresso do antgeno KMP-11, como mostrado na Figura 3.

Figura 3 Verificao da expresso do antgeno KMP-11, nos meios 2xTY e TB.

O ponto 4 mostra a banda protica intracelular aps a purificao, indicada pela seta, o ponto 5 corresponde ao extrato bruto intracelular, ambos expressos no meio 2xTY. O ponto 8 mostra a banda protica intracelular aps purificao, indicada pela seta, o ponto 9 corresponde ao extrato bruto intracelular, ambos expresso no meio TB. Os pontos 2, 3, 6 e 7 correspondem ao material extracelular aps purificao, onde no foi detectada nenhuma banda protica.

A curva de concentrao de protena intracelular, no meio 2xTY, mostrada na Figura 4

0 2 4 6 8 10 12

0,020

0,024

0,028

0,032

0,036

0,040

Conc. protena intracelular (g/L)

Tempo (h)

Figura 4 Curva de concentrao de protena intracelular, E. coli no meio 2xTY com induo.

O perfil da curva mostra que a produo est associada ao crescimento, visto que a mesma se mostra crescente durante toda a fase exponencial e o seu valor mximo 0,03168g/L, coincide com o final da mesma. O

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ponto referente ao momento de induo pode ser desconsiderado, pois este consiste num momento de elevado estresse para a clula e passvel de erro.

Os parmetros cinticos avaliados nesses ensaios foram o fator de converso de substrato em produto (YP/S) e a mxima velocidade especfica de produo (Pmx).

O Pmx representado pela Equao 2

dt

dP

XPmx

*][

1= (2)

O valor encontrado para o meio 2xTY foi

0,17 h-1. A Figura 5 mostra o perfil da curva de crescimento no meio TB.

0 2 4 6 8 10

0,022

0,024

0,026

0,028

0,030

0,032

Conc. protena intracelular (g/L)

Tempo (h)

Figura 5 Curva de concentrao de protena intracelular, E. coli no meio TB com induo.

A curva de concentrao de protena, no meio TB, mostra um perfil de produo tambm associado ao crescimento, sendo o valor mximo 0,02933g/L, quantificado pelo mtodo de Lowry, e coincide com o fim da fase exponencial de crescimento. O valor de Pmx encontrado para o meio TB foi 0,13 h-1.

A diferena no Pmx pode ser observada quando so analisadas as bandas proticas no resultado da eletroforese, Figura 3, que mostra uma banda mais espessa para o meio 2xTY o que coerente com os valores dos parmetros encontrados.

O fator de converso de substrato em produto, obtido pela Equao 3.

t

SY

SP

=/ (3)

Para os dois meios analisados o fator de

converso encontrado foi o mesmo, YP/S = 1,1*10-3.

Panda et al. 1999, estudaram a cintica da expresso de hormnio ovino de crescimento e a alta densidade celular, em batelada e batelada alimentada, expresso por Escherichia coli. Os parmetros cinticos apresentados neste trabalho esto em concordncia com os valores de concentrao de hormnio de crescimento 400 mg/L e xmx = 0,15 h-1 obtidos em seu estudo.

Ma et al, 2006, estudaram a influncia do meio TB, na otimizao da expresso de vetor funcional, expresso em E. coli, obtendo o meio TB como um meio satisfatrio para o crescimento microbiano, da mesma forma que neste estudo tambm verificou-se o meio TB como o meio mais satisfatrio para o crescimento microbiano.

Khan et al. 2009, estudaram o melhoramento da produo e regenerao de hormnio caprino de crescimento expresso por E. coli. Em seu estudo obteve a concentrao de hormnio igual a 337 mg/L a concentrao obtida no presente trabalho est em concordncia com a obtida em seu estudo.

No entanto, na literatura, no h trabalhos de bioprocessos com utilizao de clones de E. coli recombinante visando a produo de antgenos de Leishmania chagasi.

Os resultados supracitados esto coerentes com dissertaes de mestrado desenvolvidas no Laboratrio de Engenharia Bioqumica da Universidade Federal do Rio grande do Norte.

Vaz 2008, estudou os parmetros cinticos da produo dos antgenos eIF e Lack expressos em E. coli. Os resultados dos parmetros cinticos aqui calculados esto de acordo com os apresentados em sua dissertao.

Da mesma forma avaliao feita neste trabalho est em concordncia com os resultados apresentados por Chaves 2009, no cultivo de E. coli recombinante para produo do antgeno P36 de Leishmania chagasi.

CONCLUSES

As curvas de crescimento nos dois

meios no apresentaram fase lag, mostrando uma excelente adaptao do microrganismo aos meios estudados.

No houve diferenas significativas nos resultados dos parmetros cinticos avaliados, houve apenas uma diferena no Pmx, onde o meio 2xTY apresentou uma maior velocidade especfica de produo.

A eletroforese mostrou que os meios 2xTY e TB expressaram de forma satisfatria o antgeno KMP-11, sendo a banda protica

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mais espessa no meio 2xTY, sendo a produo predominantemente intracelular.

O meio 2xTY se mostrou o mais promissor, para o cultivo de E.coli recombinante quanto a expresso do antgeno KMP-11 de Leishmania chagasi.

REFERNCIAS

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AGRADECIMENTOS

Agradecimento, ao CNPq pelo apoio

financeiro, a Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao Laboratrio de Engenharia Bioqumica.