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SABRINA DE CASTRO BRASIL
A INFLUÊNCIA DA DIETA HIPERLIPÍDICA NA PROGRESSÃO DAS LESÕES
PERIRRADICULARES
2017
Programa de Pós-Graduação em Odontologia
Av. Alfredo Baltazar da Silveira, 580, Cobertura 22790-710 – Rio de Janeiro, RJ
Tel. (0XX21) 2497-8988
ii
SABRINA DE CASTRO BRASIL
INFLUÊNCIA DA DIETA HIPERLIPÍDICA NA PROGRESSÃO DAS LESÕES PERIRRADICULARES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Estácio de Sá, visando a obtenção do grau de Doutor em Odontologia (Endodontia).
Orientadora:
Prof.ª Dra. Luciana Armada Dias
Co-orientadora:
Prof.ª Dra. Rachel Moreira Moraes Santos
UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ RIO DE JANEIRO
2017
iii
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a Deus, o autor da minha vida
e consumador da minha Fé.
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço de todo o meu coração, pois estou certa que pessoas
especiais fizeram parte da minha trajetória, e porque sei que nenhuma grande
conquista é obtida apenas com o próprio esforço. Vale destacar que não é pelo
“valor de p” que descobrimos a significância de cada uma na nossa jornada,
portanto, cada participação deve ser considerada como importante e especial
nesta fase tão desafiadora e intensa da minha vida.
Agradeço primeiramente ao Professor Dr. José Freitas Siqueira Júnior,
coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia (PPGO), por ter
me presenteado com a possibilidade de realizar o sonho do Doutorado na
instituição que considero “Minha Casa Endodôntica”. Agradeço também pela
sua dedicação e comprometimento na formação de seus alunos. Obrigada por
nos ensinar que excelência é a nossa missão.
Agradeço aos meus pais Celi Brasil e Robenildo Brasil, especialmente à
minha mãe pelo apoio incondicional, por sonhar os meus sonhos, e por ter me
ensinado que todas as nossas conquistas requerem muito esforço, bom humor,
ética e honestidade.
Agradeço ao meu esposo Luciano Corrêa Netto, alguém que sei que
ainda dividirei muitos outros momentos de felicidade como este. Agradeço de
coração a ele que não mediu esforços para me ajudar e me motivar em todos
estes anos, por ter compreendido minha ausência em tantos momentos e por
ser tão amigo e companheiro nos momentos difíceis. Obrigada por você ser
v
esta pessoa tão especial.
Agradeço ao lindo presente que Deus me deu, meu filho amado Rafael
Brasil por tentar compreender tantas vezes as minhas faltas e momentos de
afastamento, por me incentivar mesmo sem entender direito o que eu estava
fazendo, por me fazer sorrir nos momentos de tristezas e incertezas, e por ser
a minha motivação, minha garra e vontade de vencer.
Agradeço a minha irmã, Paula Brasil, pelas palavras e atitudes de apoio
e motivação, e ao meu cunhado Julio Rocha, por me ajudar sempre com tanta
prontidão nos momentos em que o computador travava, os arquivos apareciam
como corrompidos, impressora que parava de funcionar, conversão de
imagens, enfim, todo esse caos tecnológico.
Agradeço a minha orientadora Luciana Armada, pela parceria, por toda a
dedicação, paciência, confiança e por sua admirável competência. Agradeço
por me desafiar a ir além, por ter me conduzido em todo o caminho diante das
adversidades, e pelas boas risadas nos bons momentos. Obrigada pela
disponibilidade, pela mão estendida e por ser a pessoa incrível que você é.
Tenho um orgulho enorme de ter sido orientada por você.
Ao professor e coordenador adjunto do PPGO Flávio Alves, meu “pai
endodôntico”, pelo ensino da Endodontia com tanta paixão e excelência desde
a especialização, e por ter me ensinado e guiado pelo caminho da docência.
Obrigada por ser um mestre de excelência e uma referência, pela sua
motivação contagiante e por fazer parte de forma tão direta da minha formação
vi
de especialista à Doutora, motivo de muito orgulho e alegria para mim.
Agradeço aos demais professores que compõem e que fizeram parte da
equipe PPGO- Estácio: professores Isabela Rôças, Milton de Uzeda, Hélio
Lopes, Lúcio Gonçalves, Fábio Vidal, Mônica Schultz, José Cláudio
Provenzano, Fábio Ramôa e Dennis Carvalho por todo o conhecimento
compartilhado.
Agradeço a minha co-orientadora, professora Rachel, por toda a
paciência ao me conduzir no trabalho, considerando minha decisão em
trabalhar com o modelo animal desde o Mestrado. Agradeço pelo exemplo de
profissional e de ser humano, pela amizade, disponibilidade, e por me ensinar
tanto com sua grande experiência.
Agradeço aos funcionários da Universidade Federal Fluminense,
especialmente a Arlete Santos, parceira incansável em todos os trabalhos e ao
bioterista Redinei Laurindo por todo o apoio.
Agradeço ao Laboratório de Nutrição Experimental da Universidade
Federal Fluminense, que nos abriu as portas para a realização do trabalho,
especialmente ao professor Carlos Alberto Soares pela parceria, e a
doutoranda Daniele Ribeiro pela ajuda na etapa de confecção da ração.
Agradeço aos professores Monique Sandin e Leonardo Tostes,
coordenadores do Curso de Odontologia do UNIFESO, o qual faço parte como
docente, pelo tremendo apoio e compreensão nas minhas ausências. Aos
meus colegas de trabalho, especialmente a querida Thaís Labuto pela
vii
compreensão e ajuda em tantos momentos.
Agradeço a minha secretária Rosilene por me apoiar sempre em tudo,
por me ajudar na difícil tarefa de cuidar da minha agenda e dos meus pacientes
em meio a tantas remarcações e ausências.
Agradeço a querida secretária do Programa de PPGO- Estácio Angélica
Pedrosa pelo apoio, amizade e “maternidade” todos esses anos, e pela sua
alegria, competência e disponibilidade para ajudar sempre.
Agradeço aos amigos que fiz nesta longa caminhada no PPGO- Estácio
Renata Val, Andrea Campello e Fábio Barcellos pela grande amizade que
fizemos. Amigos para uma vida inteira.
viii
ÍNDICE
RESUMO ..........................................................................................................ix
ABSTRACT .......................................................................................................x
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... ..xi
LISTA DE TABELAS ........................................................................................xiii
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................... xiv
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................... 3
3. JUSTIFICATIVA ......................................................................................... 20
4. HIPÓTESE ................................................................................................. 21
5. OBJETIVOS ............................................................................................... 22
6. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 23
7. RESULTADOS ........................................................................................... 28
8. DISCUSSÃO .............................................................................................. 39
9.CONCLUSÃO.................................................................................................45
10.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................46
11. ANEXOS .....................................................................................................54
ix
RESUMO
Objetivo: Avaliar os efeitos da dieta hiperlipídica na progressão das lesões
perirradiculares.
Materiais e Métodos: Foram utilizados ratos Wistar (n=24), isogênicos, com 8
semanas de idade. Metade dos animais foi submetida a dieta hiperlipídica (H) e
a outra metade a dieta normal (C). Após 8 semanas, foi estimulado o
desenvolvimento de lesão perirradicular nos primeiros molares inferiores
esquerdos através da exposição pulpar. A massa corporal foi verificada
semanalmente. Ao final dos períodos experimentais (21 e 40 dias), os animais
foram sacrificados. Sangue, fígado e mandíbula foram coletados para a
realização da análise bioquímica (colesterol total, HDL, VLDL e triglicerídeos
séricos); avaliação hepática (massa hepática total, massa hepática relativa,
triglicerídeos e colesterol); e análise radiográfica (tamanho de lesões
perirradiculares).
Resultados: A dieta hiperlipídica promoveu aumento significativo na massa
corporal (p<0,02), nos níveis séricos de triglicerídeos (p<0,03) e VLDL (p<0,04)
no grupo H 40 dias, nas massas hepáticas total (p<0,01) e relativa (p<0,005),
nos níveis de triglicerídeos hepáticos (p<0,02) e no tamanho de lesões
perirradiculares (p<0,0008).
Conclusão: As alterações metabólicas provocadas pela dieta hiperlipídica
foram capazes de influenciar a progressão de LP.
Palavras- chave: Dieta hiperlipídica; Periodontite apical; Mandíbula.
x
ABSTRACT
Aim: Evaluate the effects of high-fat-diet in the progression of periapical
lesions.
Materials and Methods: Winstar rats (n=24), isogenics and virgins, 8-weeks
old were used. Half of the animals received a high-fat-diet (H) and the other half
a control diet (C). 8 weeks after the periapical lesions were induced by pulp
exposure of their mandibular left first molars. Body weight was checked weekly.
At the end of the experimental periods (21 days and 40 days of injury), the
animals were sacrificed and blood, liver and jaws were collected for serum
analysis of total cholesterol, HDL and triglycerides, liver triglyceride and
cholesterol analysis and radiographic analysis of jaws.
Results: The high-fat-diet resulted in significant increased body mass (p<0,02),
high serum levels of triglycerides (p<0,03) and VLDL (p<0,04) H 40 group, liver
mass (p<0,01), fractioned liver (p<0,005), liver triglycerides (p<0,02) and in
periapical lesions size (p<0,0008).
Conclusions: The results showed that the high-fat-diet acted as a disease
modifier, influencing the progression of periapical lesions.
Keywords: High-fat-diet; Jaw; Periapical lesion.
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Análise comparativa dos níveis séricos de
colesterol total (mg/dL).............................................
PÁGINA
29
Figura 2. Análise comparativa dos níveis séricos de HDL
(mg/dL).....................................................................
30
Figura 3. Análise comparativa dos níveis séricos de VLDL
(mg/dL).....................................................................
31
Figura 4. Análise comparativa dos níveis séricos de
triglicerídeos (mg/dL)..............................................
32
Figura 5. Análise comparativa da massa hepática total (g)......
33
Figura 6. Análise comparativa da massa hepática relativa (g).
34
Figura 7. Análise comparativa do colesterol hepático
(mg/dL).....................................................................
35
xii
Figura 8. Análise comparativa de triglicerídeos hepáticos
(mg/dL) ...................................................................
36
Figura 9.
Figura 10.
Análise comparativa do tamanho de lesões
perirradiculares........................................................
Radiografias de mandíbulas de ratos......................
38
38
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição das dietas experimentais (AIN 93-G)............. 24
Tabela 2. Médias dos valores de massa corporal (g) por
grupo..................................................................................
28
Tabela 3. Médias dos valores séricos de colesterol total, HDL,
VLDL e triglicerídeos (mg/dL) por grupo........................
32
Tabela 4. Médias dos valores das massas hepáticas total e relativa
(g) por grupo......................................................................
34
Tabela 5. Médias dos valores de colesterol e triglicerídeos
hepáticos (mg/dL) por grupo..............................................
36
Tabela 6. Médias dos tamanhos das lesões perirradiculares (pixel)
por grupo.............................................................................
37
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
ABC ATP- binding cassete transporters
Apo Al Alipoproteína A
C Controle
FcϒR Receptor celular de superfície gama
FcϒRIIIa Receptor celular de superfície gama IIIa
H Hiperlipídico
HDL Lipoproteína de alta densidade
HIV Síndrome da imunodeficiência adquirida
Hs-CRP Proteína C reativa de alta sensibilidade
IFN- ϒ Interferon gama
IL Interleucina
LDL Lipoproteína de baixa densidade
LP Lesão perirradicular
ml Mililitro
OPG Osteoprotegerina
PG Prostaglandinas
PMNs Monócitos polimorfonucleares
RANK L Receptor activator of nuclear kappa ligant
RNA Ácido ribonucleico
TNF Fator de necrose tumoral
VLDL Lipoproteína de baixa densidade
1
1. INTRODUÇÃO
A lesão perirradicular (LP) é uma doença de etiologia essencialmente
microbiana, cujo avanço possui forte relação com a resposta imunológica do
hospedeiro, que ocorre no intuito de conter o avanço da infecção (RÔÇAS &
SIQUEIRA, 2008).
Apesar da utilização de técnicas e protocolos considerados eficazes e
altamente recomendados, falhas na terapia endodôntica ou diferentes
respostas às infecções endodônticas podem transcorrer (QUESNELL et al.,
2005). Tais situações ocorrem porque alguns indivíduos apresentam condições
que podem influenciar na susceptibilidade à doença (SEGURA-EGEA et al.,
2005; SEGURA-EGEA et al., 2015).
Diversos estudos têm sido desenvolvidos no intuito de relacionar fatores
sistêmicos ou hábitos adquiridos com o desenvolvimento, diagnóstico,
severidade e cura das LP (SEGURA-EGEA et al., 2005; ARMADA-DIAS et al.,
2006; SEGURA-EGEA et al., 2015; BRASIL et al., 2016). Estas condições são
referidas como modificadores da doença e podem esclarecer o surgimento de
sintomatologia dolorosa em casos assintomáticos, a cura tardia de algumas
lesões, e explicar porque alguns canais adequadamente tratados podem
resultar em fracasso (SEGURA-EGEA et al., 2015).
A associação entre estilo de vida, dieta e fatores genéticos pode ser
responsável pelo desenvolvimento de um estado hiperlipidêmico, que é
considerado um fator de risco ao desenvolvimento e progressão de algumas
doenças (HAGH et al., 2014). A hiperlipidemia viabiliza o desenvolvimento de
2
um estado inflamatório, caracterizado pelo aumento dos níveis plasmáticos de
citocinas pro-inflamatórias tanto em animais como em seres humanos,
comprometendo e reduzindo significativamente a qualidade e a densidade
óssea (CLEMENTE-POSTIGO et al., 2012; SANGWAN et al., 2016).
Estudos sobre a influência de fatores sistêmicos na doença periodontal
apontam que as alterações no lipidograma provocadas por dietas hiperlipídicas
atuam como possíveis causas de fracasso na terapia periodontal (CLEMENTE-
POSTIGO et al., 2012; FUJITA & MAKI, 2016).
É provável que esta condição também altere a fisiopatologia das LP, que
são processos inflamatórios caracterizados por destruição óssea. Porém, na
literatura, ainda são escassos os relatos sobre a influência da dieta hiperlipídica
na progressão de LP.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Infecção Endodôntica
As principais patologias que acometem a polpa e os tecidos
perirradiculares são de natureza inflamatória e etiologia infecciosa. Estudos
clássicos (KAKEHASHI et al., 1965; SUNDQVIST, 1976; MÖLLER et al., 1981)
indicam que microrganismos são os principais responsáveis pela progressão e
manutenção da LP.
No intuito de tentar impedir que a infecção no sistema de canais se
dissemine através dos tecidos moles, instala-se um processo inflamatório
promovido pela relação entre as defesas do hospedeiro e a agressão causada
pelos patógenos endodônticos, originando assim a LP crônica (RÔÇAS &
SIQUEIRA, 2008).
A intensidade da resposta inflamatória varia conforme o tipo de agressão
e, principalmente, a sua intensidade. Após rompimento da integridade tecidual,
a resposta inflamatória prepara os tecidos alterados para o reparo. Na
persistência do estímulo agressor, as respostas de defesa do hospedeiro,
específicas ou inespecíficas, podem gerar o dano tecidual. No caso de doenças
pulpares e perirradiculares, a destruição tecidual causada pelas defesas do
hospedeiro parece ser mais significativa do que os próprios efeitos diretos
proporcionados pelos microrganismos (SARAF et al., 2014).
A infecção endodôntica difere de outras infecções que ocorrem em
qualquer local do corpo, pois microrganismos penetram no sistema de canais
4
radiculares além do alcance das defesas do hospedeiro e de antibióticos
sistêmicos. A falta de suprimento sanguíneo na polpa necrosada ou em dentes
tratados endodonticamente impede o transporte de células/moléculas de
defesa ao sítio infectado (CHÁVEZ DE PAZ, 2007; JUNGERMANN et al.,
2011).
A infecção normalmente é restrita ao espaço intrarradicular, e pode ser
classificada como primária ou pós-tratamento endodôntico (secundária ou
persistente). Em alguns casos, um biofilme extrarradicular pode ser formado
sobre a superfície externa da raiz em torno do forame apical, caracterizando a
infecção extrarradicular (RICUCCI et al., 2016).
2.2. Mediadores Químicos Envolvidos na Progressão das Lesões
Perirradiculares
Os mediadores químicos endógenos da inflamação são substâncias que
agem na destruição de bactérias, além de serem responsáveis pela indução,
controle e amplificação dos eventos vasculares e celulares da inflamação.
Podem ser vasoativos, causando vasodilatação e aumento da permeabilidade
vascular e quimiotáticos (RADICS et al., 2003).
Diversos mediadores químicos, dentre eles as citocinas, têm sido
associadas às LPs (STASHENKO et al., 1998; KAWASHIMA & STASHENKO,
1999; RADICS et al., 2003).
5
É possível verificar que, em resposta a infecção endodôntica, o papel
das citocinas pró-inflamatórias é de grande importância no controle da
reabsorção óssea e destruição tecidual (MORSANI et al., 2011).
Diversas citocinas, como interleucinas (IL-1β, IL-6, IL-11, IL17) e fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α) são liberados aos tecidos perirradiculares, e
regulam o processo de formação da LP. Ao atingirem níveis críticos, ocorre o
estímulo de células do estroma e de osteoblastos para expressarem Receptor
Activator of Nuclear Kappa Ligant (RANKL), e reduzirem a produção de
osteoprotegerina (OPG), dando início a osteoclastogênese (TAKAYANAGI,
2005a; TAKAYANAGI, 2005b).
A IL-1 é um regulador chave de defesa a infecções microbianas e o
maior modulador de catabolismo de matriz extracelular e reabsorção óssea.
Existem basicamente duas formas de IL-1: α e β. IL 1-β é 15 vezes mais
potente que a IL-1α e mil vezes mais que TNF em induzir reabsorção.
Macrófagos são os principais produtores de IL-1. Células endoteliais e algumas
epiteliais também podem produzir essa citocina (KAWASHIMA &
STASHENKO, 1999). A IL-1 pode induzir a expressão de TNF e IL-6 que
também estão envolvidas no processo inflamatório (COIL et al., 2004).
O TNF pode existir nas formas α e β. TNF-α é um polipeptídeo
sintetizado predominantemente por macrófagos e linfócitos T, estes últimos
tipos celulares em menor quantidade. TNF-β, também conhecido como
linfotoxina, é uma glicoproteína produzida exclusivamente por linfócitos T e B
ativados. Ambas as moléculas induzem a formação de osteoclastos a partir dos
precursores e estimulam a função de osteoclastos maduros. Seus efeitos sobre
6
os osteoclastos também são indiretos, sendo mediados por osteoblastos. Além
disso, TNF também inibe a neoformação óssea (TAKAYANAGI, 2005a;
TAKAYANAGI, 2005b).
HENRIQUES et al. (2011) encontraram níveis significantes de TNF-α em
LPs refratárias em dentes com tratamento endodôntico, quando comparadas a
dentes saudáveis. Como é um potente mediador das respostas imunológicas
aguda e crônica, o TNF-α tem a capacidade de aumentar a reabsorção óssea.
A IL-6 é uma citocina sintetizada por macrófagos, células endoteliais,
fibroblastos e outras células. É produzida por osteoblastos em resposta a
outros agentes envolvidos na reabsorção como o paratormônio (PTH),
prostaglandina (PG) e IL-1. A IL-6 pode estimular a formação de osteoclastos a
partir de precursores hematopoiéticos (HUANG et al., 2001).
A IL-17 atua principalmente em células endoteliais estromais e epiteliais,
bem como no subconjunto de monócitos para induzir a secreção de
mediadores pró-inflamatórios. Esta citocina está associada tanto na fase ativa e
reabsortiva, quanto na fase crônica da LP. A correlação positiva entre
Interferon gama (IFN-γ) e IL-17 foi demonstrada em culturas de LPs, sugerindo
que ambas as citocinas são importantes para a exacerbação da inflamação
(HENRIQUES et al., 2011).
2.3. Modificadores da Doença Endodôntica
Embora existam protocolos altamente eficazes à erradicação das
doenças pulpares e perirradiculares, diferentes respostas à infecção podem
7
ocorrer ao mesmo tipo de tratamento endodôntico. Acredita-se que isto ocorra
devido a presença de fatores que, embora não sejam a causa, possam
influenciar na susceptibilidade, desenvolvimento ou severidade da doença,
principalmente por deficiências na resposta do sistema imunológico. Tal fato
pode esclarecer o surgimento de sintomatologia dolorosa em casos
assintomáticos, a cura tardia de algumas lesões, e explicar o fracasso de
canais radiculares bem tratados. Os modificadores da doença com potencial de
influenciar a LP incluem condições sistêmicas (diabetes e infecções virais),
genéticas (polimorfismo genético) e hábitos adquiridos (tabagismo) (SEGURA-
EGEA et al., 2015).
2.3.1. Diabetes mellitus
Diabetes mellitus é um transtorno no metabolismo dos carboidratos,
lipídios e proteínas caracterizado pela hiperglicemia, que ocorre pela
inadequada secreção de insulina, pela resistência insulínica ou por ambas as
situações (LIMA et al., 2013; WOLLE et al., 2013). A doença pode se
apresentar de formas distintas.
A diabetes mellitus tipo 1 é uma condição autoimune desenvolvida
durante a infância ou adolescência, e é responsável por 5 a 10% dos casos.
Ocorre como resultado de uma profunda deficiência de insulina pela destruição
das células beta de Langerhans, por uma resposta autoimune, infecção viral ou
toxicidade, requerendo a necessidade de insulina exógena para o controle da
glicemia (BENDER & BENDER, 2003).
8
Diabetes mellitus tipo 2, a mais comum, é caracterizada por um
comprometimento metabólico e alteração nos níveis de insulina no sangue,
apresentando-se de forma mais elevada que o normal (SEGURA-EGEA et al.,
2015). O tipo 2 da doença é responsável por 85 a 90% dos casos, tendo início
na meia-idade ou mais tarde, embora também possa ocorrer em jovens. A
diabetes também pode se manifestar como intolerância aos carboidratos no
período da gravidez, sendo então conhecida como diabetes gestacional
(VERNILLO, 2001).
Diabetes é uma doença crônica, complexa, progressiva e debilitante. Ao
se instalar, sintomas clássicos como polidipsia, poliúria e polifagia podem se
manifestar e serem seguidos por letargia e até coma (BENDER & BENDER,
2003; LIMA et al., 2013). Angiopatia, hipertensão, aterosclerose e alterações da
permeabilidade vascular também podem ser encontradas nos diabéticos. Além
disso, estes pacientes podem desenvolver comprometimento nas funções dos
neutrófilos, nefropatia, retinopatia, neuropatia e redução da síntese e
maturação de colágeno (WOLLE et al., 2013).
Os diabéticos são particularmente propensos ao desenvolvimento de
inflamação crônica. As complicações orais mais frequentes são xerostomia,
infecções, dificuldade na cicatrização, aumento da incidência e severidade de
cáries, candidíase, gengivite e doença periodontal (SEGURA-EGEA et al.,
2005).
Os resultados dos diversos estudos sugerem forte associação entre o
diabetes mellitus e a LP (SEGURA-EGEA et al., 2005; ARMADA–DIAS et al.,
2006; CINTRA et al., 2014). Existem evidências associando a doença com
9
maior prevalência de LPs primárias e pós-tratamento endodôntico, maior
tamanho de lesões, maior probabilidade de infecções perirradiculares
assintomáticas e pior prognóstico. No entanto, novos estudos epidemiológicos
prospectivos são necessários a fim de esclarecer melhor tal relação (SEGURA-
EGEA et al., 2015).
2.3.2. Polimorfismo genético
Consiste em uma variação genética na sequência de bases
nucleotídicas ou na estrutura cromossômica, que ocorre com uma frequência
maior que 1% na população. O tipo mais comum de polimorfismo é o que
envolve um único nucleotídeo, chamado de polimorfismo de nucleotídeo único
ou polimorfismo de transição. Nesta condição, ocorre a substituição de um
nucleotídeo por outro durante a replicação, resultando na troca de um único par
de bases. Observa-se alteração na estrutura e na função de um gene,
consequentemente afetando a expressão de proteína (KINANE & HART, 2003).
A susceptibilidade e/ou gravidade das doenças inflamatórias podem ser
afetadas na presença de polimorfismos em genes relacionados com a
inflamação, como por exemplo, no gene receptor celular de superfície gama
(FcϒR) (SIQUEIRA et al., 2009).
A relação do polimorfismo com sintomatologia de doenças pulpares
também tem sido avaliada (SÁ et al., 2007; AMAYA et al., 2013). Estudos
sugerem que fatores genéticos podem influenciar no desenvolvimento de
abscessos perirradiculares agudos, e que polimorfismos de citocinas pró-
10
inflamatórias podem induzir a ocorrência de LP aguda ou crônica. Por outro
lado, SIQUEIRA et al. (2011) investigaram a associação do polimorfismo
genético do receptor FcϒRIIIa com LP pós-tratamento e concluíram que esta
condição não influencia a resposta do tratamento endodôntico em dentes com
LP.
A resposta ao tratamento também foi avaliada por RÔÇAS et al. (2014),
ao investigarem a associação dos polimorfismos dos genes CD14-260C > T e
TLR4 + 896A > G e LP pós-tratamento. Os resultados sugerem que os
polimorfismos em genes CD14 e TLR4 não influenciam a resposta ao
tratamento endodôntico de dentes com LP.
2.3.3. Vírus da imunodeficiência humana
Os efeitos do vírus da imunodeficiência humana (HIV) no sistema
imunológico são conhecidos e bem documentados (BRITO et al., 2009;
FONTES et al., 2014). No período de 8 a 12 semanas após a infecção, o HIV
atinge níveis muito elevados como milhões de moléculas de RNA/mL, e em
seguida, atingem níveis muito baixos (5.000-15.000 moléculas/mL) ou até
mesmo indetectáveis, sugerindo o controle da infecção (BRITO et al., 2009).
Supostamente, a infecção pelo HIV também pode ser considerada como
um fator modificador da LP. O alvo primário do HIV, as células T CD4, são mais
predominantes nas fases agudas da lesão, enquanto as células T CD8
predominam na fase crônica, havendo um declínio gradual no número de
células T CD4. A falta de células T-Helper também constitui importante razão
11
para deficiência na defesa contra vários agentes microbianos, e pode contribuir
para o atraso no reparo tecidual após tratamento endodôntico. Considerando
que células T CD4 têm um papel vital na ativação de células B, macrófagos e
outras células T, suspeita-se que pacientes com uma baixa contagem dessas
células podem ter dificuldades em apresentar uma defesa imunológica efetiva
contra os microrganismos (QUESNELL et al., 2005).
Em contrapartida, a terapia antirretroviral tem permitido que o RNA do
HIV atinja e mantenha níveis abaixo dos detectáveis, tornando assim, a
infecção por HIV uma doença crônica com grande demanda para o tratamento
médico e odontológico (CAMPO et al., 2007; BRITO et al., 2009). GAMA et al.
(2016) comprovaram a hipótese de que o perfil de células inflamatórias (CD3,
CD4, CD8, CD20 e células CD68-positivas) e a expressão de marcadores
imunológicos (TNF-α, IFN-γ, IL-6, e IL-18) em LPs são semelhantes entre
pacientes não-infectados e infectados pelo HIV sob terapia antirretroviral
altamente ativa (HAART).
A prevalência de lesões perirradiculares em indivíduos brasileiros
infectados pelo HIV foi verificada por FONTES et al.(2014). Foram avaliados
2.214 dentes e os resultados demonstraram que a prevalência de LP em
indivíduos infectados não estava relacionada ao HIV.
2.3.4.Tabagismo
Embora ainda existam controvérsias a respeito da relação entre o
tabagismo e LP, alguns autores consideram este hábito um potencial fator de
12
risco à doença, além de considerarem que esta associação pode exercer papel
relevante no curso da doença (KIRKE VAN & WENZEL, 2003; SEGURA-EGEA
et al., 2015).
O tabagismo crônico exerce efeitos deletérios sobre os aspectos
morfológicos e funcionais da microcirculação como comprometimento da
vasodilatação, agregação plaquetária, disfunção celular e alterações nos níveis
de mediadores químicos da inflamação (DUNCAN & PITT FORD, 2006).
Nos indivíduos fumantes, ocorrem alterações na resposta à infecção
pela supressão das funções dos leucócitos polimorfonucleares, macrófagos,
linfócitos T, anticorpos e imunoglobulinas A, G e M, além de apresentarem
elevado nível de mediadores da fase aguda da resposta inflamatória, como
TNF-α e IL-6 (KRALL et al., 2006).
O tabagismo também induz a uma resposta inflamatória sistêmica
crônica que persiste mesmo após cessado o uso do cigarro. O nível de
proteína C-reativa no sangue é mais elevado em tabagistas do que em não-
tabagistas, particularmente em pessoas que consomem mais de 1 maço por
dia. Estas observações sugerem que uma vez que uma infecção bacteriana
comece na polpa e nos tecidos adjacentes, é menos provável que os
tabagistas consigam limitar a destruição tecidual (KRALL et al., 2006).
Um estudo transversal realizado por BUKMIR et al. (2015), avaliou o status
perirradicular de dentes tratados endodonticamente e não tratados em
indivíduos fumantes e não fumantes. Os resultados revelaram, após
pareamento por sexo, idade e o número total de dentes, que fumantes
apresentaram, em média, dois dentes com LPs a mais quando comparados
13
aos não-fumantes. Porém, em dentes tratados endodonticamente não houve
diferença entre fumantes e não fumantes, quanto ao número de dentes com
presença de LPs. Estes achados corroboram os resultados de Segura- Egea et
al. (2008), ao avaliarem a prevalência de periodontite apical em pacientes
fumantes e não fumantes. Na população avaliada, o tabagismo foi
significativamente associado com uma maior frequência de tratamento
endodôntico e com um aumento da prevalência de LPs.
LÓPEZ-LÓPEZ et al. (2012) concluíram em estudo que, após analisar sexo,
idade, número de dentes, estado endodôntico, qualidade da obturação e
estado diabético como co-variáveis, a presença de LPs está fortemente
associada ao tabagismo. No entanto, novos estudos devem ser desenvolvidos
a fim de esclarecer esta relação.
2.3.5. Osteoporose
A osteoporose é a doença mais comum do metabolismo ósseo.
Caracteriza-se por redução de massa óssea e deterioração tecidual,
conduzindo a um aumento da fragilidade óssea e um consequente aumento ao
risco de fratura. Tal condição ocorre principalmente pelas alterações no
metabolismo ósseo, provenientes da deficiência de esteroides sexuais em
mulheres no período pós-menopausa (LIU et al., 2012).
Poucos são os estudos que correlacionam a osteoporose com as LPs
(GILLES et al., 1997; LIU et al., 2012; BRASIL et al., 2016).
14
LÓPEZ-LÓPEZ et al. (2015) relataram uma associação entre baixa
densidade mineral óssea e aumento da frequência de LPs em mulheres pós-
menopausa. Os resultados de BRASIL et al. (2016) também demonstraram
alterações ósseas resultante de longo período de deficiência de estrogênio,
influenciando na progressão de LPs que após 40 dias em ratas.
Os resultados dos diferentes trabalhos demonstraram forte associação
entre a osteoporose e a LP. Entretanto, a comparação entre os achados é
dificultada pela diferença existente entre as metodologias (GILLES et al., 1997;
LIU et al., 2012; LÓPEZ-LÓPEZ et al., 2015; BRASIL et al., 2016).
2.3.6. Hiperlipidemia
Os lipídeos são moléculas orgânicas que apresentam funções
estruturais, que atuam como precursores de hormônios e como reserva
energética e promovem o transporte de vitaminas. Após a ingestão de
alimentos ricos em lipídeos, quilomícrons são produzidos pela mucosa
intestinal e englobam seus núcleos, os triglicerídeos, viabilizando a absorção
de lipídeos via circulação linfática (BARRIOS et al., 2017). Após a absorção no
intestino e síntese no fígado, triglicerídeos são envolvidos por lipoproteínas
especializadas de baixa densidade (VLDL) e são transportados de diferentes
locais como sistema digestivo, fígado e tecido adiposo. VLDL são produzidos
no fígado e atuam como carreadores de triglicerídeos e colesterol. A formação
de triglicerídeos também pode ser considerada um processo de desintoxicação
celular (PANIAGUA, 2016). As lipoproteínas de alta densidade (HDL) removem
o excesso de colesterol dos tecidos periféricos e o transporta para o fígado
15
para sua reutilização ou excreção, o que é conhecido como transporte reverso
de colesterol. Esta condição se inicia quando pequenos precursores de HDL
(Apo Al/ HDL e pré-ß/HDL) recebem colesterol e fosfolipídeos através da
interação com os transportadores ABC (ATP- binding cassete transporters)
(PANIAGUA, 2016). A redução da concentração de colesterol intracelular induz
a expressão do receptor de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) na
membrana celular de hepatócitos resultando no aumento da extração de LDL
do sangue e redução das concentrações de LDL no plasma (BARRIOS et al.,
2017).
A associação entre estilo de vida, dieta e fatores genéticos pode ser
responsável pelo desenvolvimento de um estado hiperlipidêmico, que é
considerado um fator de risco ao desenvolvimento e progressão de algumas
doenças (HAGH, 2014).
A hiperlipidemia está associada a um estado de inflamação crônica, com
aumento de TNF-α e IL- 6, que interferem na diferenciação de células adiposas
e no mecanismo de ação de adiponectinas e leptinas até o tecido adiposo se
tornar disfuncional. Neste estado, o indivíduo pode apresentar resistência
insulínica e hiperinsulinemia, provavelmente o primeiro passo para disfunção
no sistema metabólico. Quando um processo inflamatório é estabelecido no
tecido adiposo, o metabolismo lipídico é alterado, iniciando o processo de
hipertrigliceridemia pós-prandial devido à sobreprodução de VLDL pelo fígado e
por sua permanência prolongada no plasma. A associação entre obesidade,
resistência à insulina, hiperglicemia, hipertrigliceridemia, hipertensão e
16
esteatose hepática viabilizam o desenvolvimento da síndrome metabólica
(PANIAGUA, 2016).
Alterações cardiovasculares, cânceres e diabetes são responsáveis por
cerca de 65% das mortes e, de forma geral, a hiperlipidemia e o acúmulo de
gordura abdominal estão associados com o aumento do risco do
desenvolvimento destas doenças (PANIAGUA, 2016). A dieta hiperlipídica
pode aumentar o pico de insulina pós-prandial, de glicose e dos níveis de
triglicerídeos, afetando o transporte reverso de colesterol, e diminuindo os
níveis séricos de HDL (ZHOU, et al., 2016).
A resistência à insulina e hiperglicemia em pré-diabéticos e diabéticos
está frequentemente acompanhada pela dislipidemia. Estudos têm
demonstrado que níveis de triglicerídeos elevados e HDL mais baixos podem
ser a causa da resistência insulínica (SALAZAR et al., 2014; ZHOU, et al.,
2016).
A patogênese da esteatose hepática também pode estar relacionada ao
consumo de dieta hiperlipídica. O acúmulo hepático de lipídios predispõe a
ocorrência de estresse oxidativo, peroxidação lipídica, disfunção mitocondrial e
produção de citocinas pró-inflamatórias, contribuindo para inflamação, fibrose e
morte celular (TESSARI et al., 2009).
A origem da doença cardiovascular também pode estar relacionada ao
aumento nos níveis séricos de colesterol. OSIPOV et al. (2009) afirmam que
pacientes com miocárdio hipercolesterolêmico apresentam vulnerabilidade a
isquemia, principalmente nos casos de hipercolesterolemia crônica. Tal
condição pode ocorrer pelo comprometimento dos mecanismos
17
cardioprotetores, como o aumento da expressão de proteínas pro-apoptóticas,
aumento de respostas inflamatórias miocárdicas, estresse oxidativo e inibição
da síntese de óxido nítrico (LI et al., 2015).
O desenvolvimento da aterosclerose, apesar de considerado
multifatorial, também tem demonstrado estreita relação com a
hipercolesterolemia. Lesões ateroscleróticas são precedidas por uma camada
de gordura e acúmulo de células lipídicas abaixo do endotélio. Além disso,
outros tipos celulares como macrófagos, que ao migrarem através das paredes
dos vasos, podem fagocitar partículas de LDL presentes no sangue e que ficam
depositados nas paredes das artérias, formando as placas ateroscleróticas
(SLUTZKY-GOLDBERG et al., 2013).
A hipercolesterolemia também tem demonstrado associação com a
doença periodontal (CLEMENTE-POSTIGO et al., 2012; HAGH et. al., 2014;
FUJITA & MAKI, 2016). Historicamente, esta doença tem sido relatada como
infecciosa, considerando as bactérias do biofilme dental seu principal agente
etiológico. Entretanto, a resposta inflamatória do hospedeiro pode exercer
papel fundamental no desenvolvimento e na progressão da doença. Alterações
no metabolismo ósseo e aumento de mediadores pró-inflamatórios têm sido
apontados como fatores que podem influenciar na resposta local do hospedeiro
(MULUKE et al., 2016).
Sugere-se que o estado hiperlipidêmico também pode atrasar ou
dificultar a cicatrização periodontal pós-tratamento pelo aumento da secreção
de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e IL-1β a partir de monócitos
18
polimorfonucleares (PMNs) bem como uma redução na produção do fator de
crescimento por macrófagos (SANGWAN et al., 2016).
Estudos em ratos têm relacionado à dieta hiperlipídica com diabetes tipo
2 e doença periodontal (CLEMENTE-POSTIGO et al., 2012; FUJITA & MAKI,
2016). Os resultados demonstram que esta dieta viabiliza o desenvolvimento
de um estado inflamatório, caracterizado pelo aumento dos níveis plasmáticos
de citocinas pro-inflamatórias tanto em animais como em seres humanos,
comprometendo e reduzindo significativamente a qualidade e densidade
ósseas (CLEMENTE-POSTIGO et al., 2012).
A perda óssea alveolar também pode ser provocada por endotoxinas
bacterianas (LPS), que são um potencial mediador inflamatório nos casos de
dieta hiperlipídica induzida. Em geral, as endotoxinas bacterianas estão
presentes em grandes quantidades no intestino. Em uma refeição rica em
gordura, o desenvolvimento de endotoxemia pós-prandial pode ocorrer devido
à translocação de endotoxinas bacterianas a partir do intestino para a
circulação, onde estimulam a inflamação periodontal e perda óssea alveolar
(CLEMENTE-POSTIGO et al., 2012; FUJITA & MAKI, 2016). A progressão da
periodontite estimula a ação de endotoxinas e outros produtos bacterianos a
entrarem no tecido periodontal e na circulação sanguínea causando reações
inflamatórias sistêmicas ou locais (HAGH et al., 2014).
Apenas o trabalho de KIMAK et al. (2015) correlaciona LP e alterações
lipídicas. Os autores avaliaram a relação entre o tamanho da LP e marcadores
inflamatórios (hsCRP, IL-6, TNF-α) e lipídeos e lipoproteínas (fosfolipase
lisossomal, ApoAI, e alipoproteína B) no soro sanguíneo de pacientes com LPs
19
acima de 50 anos e abaixo de 50 anos. Os resultados sugerem que ApoAI e
LpPLA2 em HDL têm ação anti-inflamatória, e que pacientes com idade
superior a 50 anos apresentaram lesões perirradiculares de maior tamanho. Os
dados da literatura sobre a distribuição de partículas de lipoproteínas em
indivíduos ainda são insuficientes, então esta condição requer mais estudos.
20
3. JUSTIFICATIVA
Alterações no lipidograma provocadas por dietas hiperlipídicas podem
ser responsáveis por aumentos na resposta inflamatória e na reabsorção
óssea. Porém, na literatura ainda são escassos os relatos sobre a influência
desta dieta na progressão de LP.
21
4. HIPÓTESE
A hiperlipidemia promove um estado inflamatório, caracterizado por
níveis plasmáticos elevados de citocinas pro-inflamatórias indutoras da
reabsorção óssea. Considerando a fisiopatologia da infecção endodôntica,
espera-se verificar aumento na progressão de LP em ratos com alterações no
lipidograma provocadas por dieta hiperlipídica.
22
5. OBJETIVO
5.1. Objetivo Geral
Avaliar os efeitos da dieta hiperlipídica na progressão das LP.
23
6. MATERIAIS E MÉTODOS
6.1. Parecer Ético
O projeto de pesquisa está de acordo com Princípios Éticos da
Experimentação Animal do COBEA e obteve aprovação do Comitê de ética no
uso de animais (CEUA), sob o número de protocolo 594 (Anexo 1).
6.2. Seleção da Amostra e Dieta
Para realização deste estudo foram utilizados 24 ratos adultos machos,
da linhagem Wistar que, após desmame, com 8 semanas de idade, foram
mantidos em gaiolas individuais, com temperatura ambiente controlada (25 a
27º C), umidade constante e ciclo claro/escuro de 12 horas (6:00 h às 18:00 h).
Após um período de aclimatação de 1 semana, os animais foram divididos
randomicamente em 2 grupos (grupo controle, com dieta normal e grupo de
estudo, com dieta hiperlipídica). A água foi fornecida ad libitum e a ração foi
pesada e quantificada a cada fornecimento que ocorreu por um período de 8
semanas.
A formulação da dieta hiperlipídica seguiu o protocolo estabelecido pela
AIN-93G (REEVES,1997) (Tabela 1). Os animais foram mantidos no biotério do
departamento de Nutrição Experimental da Universidade Federal Fluminense
(UFF).
24
Tabela 1 - Composição das dietas experimentais (AIN 93-G).
Ingredientes Dieta controle (g/kg) Dieta hiperlipídica (g/kg)
Caseína 20 20
Amido de milho 52,9 35,9
Sacarose 10 10
Óleo de soja 7 7
Banha 0 17
Celulose 5 5
Mix Mineral 93G 3,5 3,5
Mix Vitamínico 1 1
L-Cistina 0,3 0,3
Colina 0,25 0,25
TBHQ (mg) 14 14
Quantidade de ingredientes utilizados no preparo de 100g de ração. TBHQ: hidrodroquinona-terc. Fonte: Reeves, 1997.
6.3. Desenvolvimento de LP
Após o período de 8 semanas de alimentação (FUJITA & MAKI, 2016),
todos os animais foram anestesiados com Tiopenthal (0,1ml /100g PC), e o
esmalte e a dentina dos primeiros molares inferiores esquerdos foram
desgastados com broca carbide esférica de ½ (KG Sorensen, São Paulo,
Brasil) com motor de baixa rotação (Dentec, CS 421, Brasil). A abertura foi
realizada na fóssula mesial da superfície oclusal até exposição pulpar por um
único operador.
25
Desta forma, 4 grupos experimentais foram formados, de acordo com o
protocolo estabelecido por BRASIL et al.,2016:
Grupo controle com lesão de 21 dias (C 21 dias): n=6
Grupo dieta hiperlipídica com lesão de 21 dias (H 21 dias): n=6
Grupo controle com lesão de 40 dias (C 40 dias): n=6
Grupo dieta hiperlipídica com lesão de 40 dias (H 40 dias): n=6
Ao final de cada período experimental (21 e 40 dias após
desenvolvimento da lesão), os animais foram sacrificados por exsanguinação,
sob anestesia com Tiopenthal (0,2 ml/100 g PC), e foram coletados sangue,
fígado e mandíbula.
6.4. Avaliação Biométrica
A massa corporal dos animais foi verificada semanalmente até o dia do
sacrifício. A pesagem foi realizada com auxílio de uma balança digital (Mettler
Toledo, Marte As 1000, SP, Brasil).
6.5. Avaliação Bioquímica
Amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca e o colesterol
total, VLDL- colesterol, HDL- colesterol e triglicerídeos foram analisados no
equipamento BT Plus 3000 (Roma, Itália) através dos kits Wiener (Rosario,
Argentina).
26
6.6. Avaliação massa hepática
O fígado de cada animal foi removido, lavado em solução salina a 0,9%,
pesado e conservado a -80°C. O peso do fígado dos animais foi registrado para
as análises da massa hepática total (peso total do fígado) e massa hepática
relativa (razão peso do fígado/peso corporal) para comparação dos resultados
entre os grupos.
A análise foi realizada no Laboratório de Nutrição experimental da
Universidade Federal Fluminense.
6.7. Avaliação de lipídios hepáticos
As amostras de fígado de cada animal foram utilizadas para análise de
lipídios hepáticos pelo protocolo estabelecido por HAUG & HOSTMARK (1987).
Para cada amostra, 5% do peso do fígado foi homogeneizado com 5 ml de
álcool isopropílico, colocados em tubo de centrífuga, onde foram mantidos por
2 dias a 4°C, e em seguida centrifugado (RDE, MC 28, RJ, Brasil) durante 10
minutos a 3000 rpm. Os triglicerídeos e o colesterol hepáticos foram
quantificados nas alíquotas dos sobrenadantes pelos Kits Bioclin (Belo
Horizonte, MG, Brasil).
A análise foi realizada no Laboratório de Nutrição experimental da
Universidade Federal Fluminense.
27
6.8. Avaliação Radiográfica
As hemi-mandíbulas esquerdas foram lavadas e imersas em solução de
formol tamponado. Após este processo, as tomadas radiográficas foram
realizadas em Aparelho Radiográfico Digital (Modelo Radioesfera – Siemens –
SP, Brasil), e o posicionamento das peças sobre a película radiográfica foi
padronizado a fim de evitar distorções nas imagens.
As áreas das LP presentes nos ápices das raízes mesiais dos primeiros
molares das mandíbulas esquerdas foram mensuradas nas radiografias através
do software Image J (National Institute of Mental Health, Bethesda, USA).
6.9. Análise Estatística
A análise comparativa dos dados obtidos foi realizada através de testes
não paramétricos Kruskal-Wallis e Dunn´s Multiple Comparison utilizando o
programa GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc, California, USA). A
significância estatística considerada foi de p<0.05.
28
7. RESULTADOS
7.1. Avaliação Biométrica
Os valores numéricos das médias de massas corporais inicial e final e
de Δ (diferença entre massa corporal final e inicial) podem ser observados na
Tabela 2. Não houve diferença significativa entre a massa inicial dos animais
do estudo. Porém, foi possível verificar que os grupos H apresentaram a massa
corporal final e o Δ superiores em todos os períodos experimentais (C 21:
ganho 27%, H 21: ganho 35,5%, C 40: 26 %, H 40 dias: ganho 36,4%) quando
comparados com os grupos C. Esses dados foram estatisticamente
significativo.
Tabela 2. Médias dos valores de massa corporal (g) por grupo.
Grupos
Massa
corporal inicial (g)
Massa
corporal final (g)
∆ (g)
C 21 194,9 12,7 271,2 18,7
73,6 ± 27,38
H 21 189,3 17,2 293,7 37,0*
104,3 ± 37,0
C 40 193,2 14,3
271,4 16,2
70,8 ± 18,9
H 40 191,8 11,6 302,3 18,0* 110,0 ± 20,1
Os resultados são expressos por média ± DPM. Δ= massa corporal final- massa corporal inicial. C: controle H: dieta hiperlipídica. Teste Kruskal-Wallis p<0,0083 (valor ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn).
29
7.2. Avaliação Bioquímica
7.2.1. Concentrações séricas de colesterol total
Os valores numéricos das médias das concentrações séricas de
colesterol total podem ser observados na Tabela 3. Os níveis séricos de
colesterol total foram semelhantes em todos os grupos, e não houve diferença
estatisticamente significativa (Figura 1).
C 21 H 21 C 40 H 400
5
10
15
20
25
30
35
Co
les
tero
l (m
g/d
L)
Figura 1. Análise comparativa dos níveis séricos de colesterol total (mg/dL) entre os grupos. C:controle H: dieta hiperlipídica. Teste Kruskal-Wallis.
7.2.2. Concentrações séricas de HDL
Os valores numéricos das médias das concentrações séricas de HDL
podem ser observados na Tabela 3. Os níveis séricos de HDL foram
semelhantes em todos os grupos, e não houve diferença estatisticamente
significativa (Figura 2).
30
C 21 H 21 C 40 H 400
10
20
HD
L (
mg
/dL
)
Figura 2. Análise comparativa dos níveis séricos de HDL (mg/dL) entre os grupos. C: controle, H: dieta hiperlipídica. Teste Kruskal-Wallis.
7.2.3. Concentrações séricas de VLDL
Os valores numéricos das médias das concentrações séricas de VLDL
podem ser observados na Tabela 3. Os valores do grupo H 40 apresentaram-
se mais elevados, e foi encontrada significância estatística entre C 40 x H 40
(Figura 3).
31
C 21 H 21 C 40 H 400
10
20
VL
DL
(m
g/d
L)
Figura 3. Análise comparativa dos níveis séricos de VLDL (mg/dL) entre os grupos. C: controle, H: dieta hiperlipídica. Teste Kruskal-Wallis
#C 40 vs H 40 p<0,0083 (valor ajustado pelo teste
de Múltipla Comparação de Dunn).
7.2.4. Concentrações séricas de triglicerídeos
Os valores numéricos das médias das concentrações séricas de
triglicerídeos podem ser observados na Tabela 3. Os valores dos grupos H
apresentaram-se mais elevados, e foi encontrada significância estatística entre
C 40 e H 40 (Figura 4).
#
32
C 21 H 21 C 40 H 400
25
50
75
100
Tri
gli
ce
ríd
eo
s (
mg
/dL)
Figura 4. Análise comparativa dos níveis séricos de triglicerídeos (mg/dL) entre os grupos. C: controle, H: dieta hiperlipídica. Testes Kruskal-Wallis e Dunn´s Multiple Comparison
#C 40 vs
H 40 Wallis p<0,0083 (valor ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn). .
Tabela 3. Médias dos valores séricos (mg/dL) de colesterol total, HDL, VLDL e triglicerídeos por grupo.
Grupos
Colesterol total
(mg/dL)
HDL
(mg/dL)
VLDL
(mg/dL)
Triglicerídeos
(mg/dL)
C 21 30,7 ± 6,5 15,2 ± 3,5 5,3 ± 1,5 30,8 ± 7,3
H 21 26,1 ± 4,4 16,6 ± 3,2 6,1 ± 1,6 46,5 ± 24,0
C 40 28,4 ± 6,1 14,5 ± 2,8 5,8 ± 2,1 29,0 ± 11,6
H 40 27,1 ± 3,0 11,0 ± 2,8 15,6 ± 6,2 79,5 ± 32,8*
Os resultados são expressos por média ± DPM. C: controle H: dieta hiperlipídica. Teste Kruskal-Wallis p<0,0083 (valor ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn).
#
33
7.3. Avaliação hepática
7.3.1. Massa hepática total
Os dados referentes à massa hepática total podem ser observados na
Tabela 4. Os valores dos grupos H foram mais elevados, e foi encontrada
significância estatística quando comparados C 21 x H 21 e C 40 x H 40 (Figura
5).
C 21 H 21 C 40 H 400.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Massa h
epáti
ca
tota
l (g
)
Figura 5. Análise comparativa da massa hepática total (g) entre os grupos C: controle, H: dieta hiperlipídica. Teste Kruskal-Wallis *C 21 vs H 21 p<0,05,
# C 40 vs H40 Wallis p<0,0083 (valor
ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn). .
7.3.2. Massa hepática relativa
Os dados referentes a massa hepática relativa podem ser observados
na Tabela 4. Os valores dos grupos H foram mais elevados, e foi encontrada
significância estatística quando comparados C 21 x H 21 e C 40 x H 40 (Figura
6).
* #
34
C 21 H 21 C 40 H 400.0
1.5
3.0
4.5
Massa h
epáti
ca
rela
tiva (
g)
Figura 6. Análise comparativa da massa hepática relativa (g) entre os grupos C: controle, H: dieta hiperlipídica. Teste Kruskal-Wallis, *C 21 vs H 21 p<0,05,
# C 40 vs H40 p<0,0083 (valor
ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn).
Tabela 4. Médias dos valores das massas hepáticas total e relativa (g) por grupo.
Grupos Massa hepática total (g)
Massa hepática relativa (g)
C 21 8,9 ± 0,7 2,5 ± 0,3
H 21 11,3 ± 1,4* 3,8 ± 0,5*
C 40 7,8 ± 1,1 2,7 ± 0,4
H 40 10,9 ± 1,0* 3,9 ± 0,5*
Os resultados são expressos por média ± DPM. C: controle, H: dieta hiperlipídica. Testes Kruskal-Wallis p<0,0083 (valor ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn).
* #
35
7.3.3. Colesterol hepático
Os dados referentes ao colesterol hepático podem ser observados na
Tabela 5. Os valores apresentaram-se semelhantes entre os grupos, e não foi
encontrada significância estatística (Figura 7).
C 21 H 21 C 40 H 400
10
20
30
40
50
60
Cole
ste
rol
he
pá
tic
o (
mg
/dl)
Figura 7. Análise comparativa do colesterol hepático (mg/dL) entre os grupos C: controle H:dieta hiperlipídica. Teste Kruskal-Wallis p<0,0083 (valor ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn).
7.3.4. Triglicerídeos hepáticos
Os dados referentes aos triglicerídeos hepáticos podem ser observados
na Tabela 5. Os valores dos grupos H foram mais elevados, e foi encontrada
significância estatística quando comparados C 21 x H 21 e C 40 x H 40 (Figura
8).
36
C 21 H 21 C 40 H 400
150
300
450Tri
glicerí
deos
hep
áti
co
s (
mg
/dl)
Figura 8. Análise comparativa de triglicerídeos hepáticos (mg/dL) entre os grupos. C: controle, H: dieta hiperlipídica. Teste Kruskal-Wallis *C 21 vs H 21 p<0,05,
#C 40 vs H 40 p<0,0083 (valor
ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn). .
Tabela 5: Médias dos valores de colesterol e triglicerídeos hepáticos (mg/dL) por grupo.
Grupos
Colesterol
hepático (mg/dL)
p
Triglicerídeo
hepático (mg/dL)
p
C 21 45,3 ± 15,0 0,28 209,3 ± 68,5 0,0006
H 21 43,1 ± 16,8 377,1 ± 70,5
C 40 36,0 ± 10,5 240,5 ± 19,1
H 40 30,9 ± 9,2 389,0 ± 76,1
Os resultados são expressos por média ± DPM. C: controle, H: dieta hiperlipídica. Testes Kruskal-Wallis p<0,0083 (valor ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn).
* #
37
7.4. Análise radiográfica
Os valores numéricos das médias dos tamanhos das lesões
perirradiculares podem ser observados na Tabela 6. As lesões perirradiculares
foram maiores nos grupos H, e foi encontrada significância estatística quando
comparados C 21 x H 21 e C 40 x H 40 (Figura 9). Algumas das imagens
obtidas através de radiografia digital podem ser observadas na figura 10.
Tabela 6. Médias dos tamanhos das lesões perirradiculares (pixel) por grupo.
Grupos
Tamanho das lesões (pixel)
C 21 163,2 ± 75,1
H 21 430,7 ± 120,3
C 40 169,1 ± 110,1
H 40 446,7 ± 29,0
Os resultados são expressos por média ± DPM. C: controle, H: dieta hiperlipídica. Teste Kruskal-Wallis p<0,0083 (valor ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn).
38
C 21 H 21 C 40 H 400
100
200
300
400
500T
am
anh
o lesão
peri
rradic
ula
r (p
ixel)
Figura 9. Análise comparativa do tamanho de lesões perirradiculares entre os grupos. C:controle, H: dieta hiperlipídica. Testes Kruskal-Wallis *C 21 vs H 21 p<0,05,
#C 40 vs H 40
p<0,0083 (valor ajustado pelo teste de Múltipla Comparação de Dunn).
Figura 10. Radiografias de mandíbulas de ratos. A: C 21 dias; B: H 21 dias; C: C 40 dias; D: H 40 dias. As setas indicam as lesões perirradiculares nas raízes mesiais dos primeiros molares inferiores esquerdos. C: controle, H: dieta hiperlipídica.
# *
39
8. DISCUSSÃO
Diversos estudos têm utilizado a dieta hipercalórica em modelo animal
para avaliar a fisiopatologia de algumas condições como diabetes, obesidade e
hiperlipidemias. Acredita-se que este modelo apresenta eficácia na elucidação
da função de fatores específicos envolvidos na homeostase energética e
regulação do peso corporal (FUJITA & MAKI, 2016; PESSOA et al., 2015;
YANG et al., 2015; GILES et al., 2016).
No presente estudo foi empregada a dieta hiperlipídica estabelecida pelo
Instituto Americano de Nutrição para experimentação animal (REEVES, 1997),
corroborando o proposto por FUJITA & MAKI (2016) e PESSOA et al. (2015).
Os animais do grupo H foram submetidos a esta dieta por um período de 8
semanas, que segundo (FUJITA & MAKI (2016) é considerado tempo suficiente
para estabelecer alteração no perfil lipídico.
O desenvolvimento da LP e a determinação dos períodos de 21 e 40
dias para a avaliação da progressão das lesões seguiram o mesmo protocolo
utilizado por ARMADA-DIAS et al. (2006) e por BRASIL et al. (2016).
Foi possível verificar aumento significativo de massa corporal para o
grupo da dieta hiperlipídica após um período de 11 e 14 semanas,
concordando com os resultados de YANG et al. (2015), que forneceram a dieta
por um período de 12 semanas. Acredita-se que esses resultados se devam as
alterações no lipidograma causadas pela dieta. Nesta condição é observada
40
uma resposta inflamatória crônica com aumento da secreção de citocinas pro-
inflamatórias que desempenham papel chave no desenvolvimento da
obesidade relacionada a desordens metabólicas (CHEN et al., 2016; MULUKE
et al., 2016; SANGWAN et al., 2016).
Esses resultados contrastam com os de DA COSTA et al. (2015), que
após fornecimento da mesma dieta por um período de 160 dias não verificaram
aumento significativo de massa corporal em animais submetidos a dieta
hiperlipídica. Segundo DA COSTA et al. (2011), variações no peso podem ser
observadas quando implementada a dieta hiperlipídica. A perda ou pouco
ganho de peso ocorrem pela redução na ingestão da dieta devido a sua alta
densidade calórica. Em contrapartida, a menor saciedade causada por esta
dieta pode provocar aumento excessivo em seu consumo, chegando a
promover hiperfagia rica em gordura.
A avaliação do lipidograma sérico demonstrou níveis mais elevados de
triglicerídeos e VLDL no grupo H 40 dias, e ausência de diferença significativa
entre os grupos em relação ao colesterol total e ao HDL. Estes resultados se
assemelham a estudos prévios. MACRI et al. (2014) verificaram
hipertrigliceridemia e não verificaram valores significativos de HDL em ratas
Wistar submetidas a dieta hipercalórica com por 9 semanas para avaliação da
progressão da doença periodontal. Porém, foi utilizada uma dieta aterogênica,
com alta concentração de gordura saturada que possivelmente alterou os
níveis de HDL. PESSOA et al. (2015), forneceram dieta enriquecida em
lipídeos e carboidratos por um período de 5 semanas para ratas Wistar a fim de
induzir diabetes mellitus. Os autores verificaram hipertrigliceridemia no grupo
que consumiu dieta hiperlipídica, e ausência de diferença estatística nos níveis
41
de colesterol. YANG et al. (2015) também encontraram níveis mais elevados de
triglicerídeos ao utilizarem a dieta hiperlipídica em ratos, neste caso com o
fornecimento da dieta por um período de 12 semanas.
Em contrapartida, FUJITA & MAKI (2016) utilizaram dieta hiperlipídica
semelhante ao nosso estudo, por 12 semanas, para avaliação da doença
periodontal em ratos e verificaram níveis de colesterol total, HDL e
triglicerídeos significativamente maiores. Os resultados de HDL no estudo de
MACRI et al. (2014) também foram estatisticamente mais elevados.
Segundo ZHOU et al. (2016), o aumento dos valores séricos de
triglicerídeos e a diminuição nos níveis de colesterol total e HDL podem
representar um preditor a resistência insulínica. Já SALAZAR et al. (2014)
apontam estes valores como indicadores de doença cardiovascular. O aumento
nos níveis séricos de VLDL e triglicerídeos podem estar relacionados ao papel
do VLDL na secreção de triglicerídeos no fígado para eliminação de lipídeos.
Os valores referentes à massa hepática total foram significativamente
maiores nos grupos H, concordando com BUETTNER et al. (2006) ao
avaliarem os efeitos moleculares e metabólicos de dietas hipercalóricas em
ratos por um período de 12 semanas. Os achados de massa hepática relativa,
que indica o peso hepático em relação ao peso corporal, também corroboram
com os resultados encontrados por PESSOA et al. (2015), após o fornecimento
de dieta hiperlipídica por um período de 5 semanas em ratos diabéticos.
Em nossos resultados, os valores elevados de massa hepática dos
grupos H estão de acordo com os dados de triglicerídeos obtidos através das
análises sérica e hepática. Segundo PANIAGUA (2016), o aumento na massa
hepática ocorre pela esteatose decorrente do consumo da dieta hiperlipídica. O
42
aumento da secreção hepática de lipídeos via VLDL pode ser afetado,
dificultando ou impedindo o acúmulo de gordura no fígado. No entanto, este
acúmulo ocorre quando a síntese de triglicerídeos excede a capacidade da
síntese da VLDL, resultando na esteatose (PANIAGUA, 2016).
Através da extração hepática de lipídeos, foi possível observar aumento
de triglicerídeos nos grupos H e ausência de diferença significativa nos níveis
de colesterol. PESSOA et al. (2015) também verificaram aumento apenas nos
triglicerídeos hepáticos. Segundo SALAZAR et al., (2014) e ZHOU et al. (2016),
tal condição sugere a hipótese de resistência insulínica, pela diminuição na
função das células β. BUETTNER et al. (2006) observaram aumento de
triglicerídeos hepáticos, porém sem sinais de inflamação ou esteatose, e
também sugerem a hipótese de resistência à insulina.
Em condições de sobrenutrição, o tecido adiposo expande a níveis de
inflexibilidade (adiposidade), e neste estado apresenta um estado pós- prandial
mais longo que leva a hiperinsulinemia. Assim, a menor capacidade de
eliminação de ácidos graxos associada a uma lipólise aumentada pelo tecido
adiposo e um padrão disfuncional na liberação de adipocitonina pode resultar
na inflexibilidade do tecido adiposo e indiretamente induzir a redistribuição da
gordura para as áreas indesejadas e tóxicas com acúmulo de lipídeos.
Portanto, em um estado hiperlipidêmico desenvolvido lentamente, observa-se
que a hiperinsulinemia e hiperglicemia também progridem da mesma forma
(PANIAGUA, 2016).
Os dados séricos revelaram aumento nos níveis de triglicerídeos apenas
no grupo H 40 e ausência de diferença significativa nos níveis de colesterol.
43
A análise radiográfica revelou LP significativamente maiores nos grupos
H, demonstrando o efeito da dieta hiperlipídica na progressão das lesões. A
literatura é escassa ao que se refere ao assunto, dificultando a comparação
destes achados.
Ao relacionar hiperlipidemia e LP, KIMAK et al. (2015) investigaram a
relação entre o tamanho de LP, mensurado através de radiografias periapicais,
marcadores inflamatórios, lipídeos e lipoproteínas no soro sanguíneo em
pacientes com LP. Foram formados 4 grupos: grupo controle contendo
indivíduos clinicamente saudáveis e sem LP; grupo de estudo contendo
indivíduos com idade inferior a 50 anos, grupo de estudo contendo indivíduos
com idade superior a 50 anos, e um subgrupo de indivíduos com idade superior
e LP maiores. Os valores de apoAl acima e abaixo de 150 mg/dL foram
utilizados como critério para inclusão dos pacientes nos grupos. Os
marcadores inflamatórios foram mais elevados em pacientes com
hiperlipidemia. Além disso, foi verificado aumento significativo no tamanho de
LP em pacientes com níveis séricos de triglicerídeos mais elevados,
concordando com os resultados do nosso estudo.
SOARES et al., 2012 afirmaram que a hiperlipidemia causa redução na
densidade óssea devido à inibição da diferenciação osteoblástica por lipídeos
bioativos e aumento da atividade funcional de osteoclastos.
A associação entre dieta hiperlipídica e alterações no metabolismo
ósseo alveolar foi comprovada em estudos anteriores com modelo animal
(FUJITA & MAKI, 2016 MACRI et al., 2014 e clínicos (CUTLER et al., 1999;
LOSCHE et al., 2000; KATZ et al., 2002) que relacionaram esta dieta com a
doença periodontal. FUJITA & MAKI (2016) verificaram o desenvolvimento da
44
doença periodontal em ratos após o consumo de dieta hiperlipídica por um
período de 12 semanas e observaram a diminuição na densidade óssea
cortical, além de ruptura nas fibras do ligamento periodontal. Tais resultados
sugerem que esta dieta pode atuar como fator de risco ao desenvolvimento da
doença periodontal, pois induz a um estado inflamatório capaz de desenvolver
alterações na arquitetura óssea alveolar. MACRI et al. (2014) investigaram os
efeitos da dieta hiperlipídica e aterogênica por 9 semanas no osso alveolar de
ratas com doença periodontal induzida e também verificaram perda óssea
significativa no grupo tratado com a dieta.
45
9. CONCLUSÃO
As alterações metabólicas provocadas pela dieta hiperlipídica foram
capazes de influenciar a progressão de LP. Portanto, sugere-se que o estado
de hipertrigliceridemia aumentou a velocidade de progressão à doença
perirradicular.
46
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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54
11. ANEXOS
ANEXO 1 - Aprovação do projeto pelo Comitê de Ética.
55
ANEXO 2 - Artigo submetido
Azeredo SA, Brasil SC, Antunes H, Marques FV, Pires FR, Armada L.
Distribution of macrophages and plasma cells in apical periodontitis and the
relationship with clinical and image data. Med Oral Patol oral Cir Bucal, 2016
56
ANEXO 3 - Artigo submetido
Armada L, Brasil SC, Armada-Dias L, Bezerra J, Pereira RMR, Lilian
Takayama L, Santos RMM, Gonçalves LS, Nascimento-Saba CCA. Effects of
aging, gender, and hypogonadism on mandibular bone density. Gerodontology,
2016
57
ANEXO 4 - Artigo submetido
Almeida N, Brasil SC, Armada L, Ferreira D. Evaluation of macrophages in
persistent periradicular lesions post endodontic treatment of elderly patients.
Spec Care Dentist, 2016
58
ANEXO 5 - Artigo publicado
Silva T, Brasil SC, Armada-Dias L, Armada L. Eficácia dos testes térmico e
elétrico no registro do status pulpar: um estudo in vivo. Rev bras odontol 73:
92-95, 2016
