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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
LÍVIA PINTO DE LIMA
A MODULAÇÃO DA CAPTAÇÃO TIREÓIDEA DE RADIOIODO EM RATOS DEPENDE DO TAMANHO DO BÓCIO INDUZIDO POR
METIMAZOL
INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
RIO DE JANEIRO
2007
LÍVIA PINTO DE LIMA
A MODULAÇÃO DA CAPTAÇÃO TIREÓIDEA DE RADIOIODO EM RATOS DEPENDE DO TAMANHO DO BÓCIO INDUZIDO POR
METIMAZOL
Tese apresentada como exigência parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas
na área de concentração em Fisiologia sob a orientação da Prof. Dra. Denise Pires de Carvalho
INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
RIO DE JANEIRO
2007
Lima Pinto de, Lívia.
A Modulação da Captação Tireóidea de Radioiodo em Ratos Depende do
Tamanho do Bócio Induzido por Metimazol / Lívia Pinto de Lima – Rio de
Janeiro: UFRJ / Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2007. xi, 73f.: il. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas – Fisiologia) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2007. Orientadora: Denise Pires de Carvalho 1. NIS. 2. MMI. 3. bócio. 4. TSH. – Teses. I. Lima Pinto de, Lívia. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. III. Título
Este trabalho é dedicado às pessoas que eu mais amo, os
bens mais preciosos que Deus me deu: meu marido Adriano,
meus pais Jonas e Fátima e meu irmão Bruno.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pois quando tudo estava muito difícil Ele me ajudou e fez com que eu
chegasse até aqui.
Aos meus amados pais, que sempre me amaram, apoiaram, estimularam a
estudar e me ensinaram a escolher os caminhos corretos. O amor e a dedicação deles
foram sempre os fundamentos da minha vida e me fizeram ser quem eu sou.
Ao meu marido, Adriano, que é uma benção, uma jóia em minha vida e me deu
um apoio essencial para suportar as dificuldades que surgiram durante a realização
deste trabalho. Agradeço muito pela sua paciência, amor e cuidado.
À minha orientadora Denise, que, além de ser uma excelente cientista, é uma
pessoa muito boa, generosa e muito paciente. Agradeço muito pela sua orientação
durante todos os anos em que trabalhamos juntas, pelo exemplo de seriedade,
determinação e generosidade.
À minha “companheiríssima” de laboratório e amiga Andréa, que sempre me
ajudou muito desde que eu entrei no laboratório e foi de enorme importância durante a
realização desta tese e de outros trabalhos.
Aos muito queridos técnicos do nosso laboratório, Norma, Advaldo e Wagner,
que são pessoas maravilhosas, amigas e atenciosas. Sem a ajuda deles no cuidado
com os animais, nos dias de sacrifício e em várias outras etapas, a realização deste
trabalho não seria possível.
Aos demais membros do laboratório de fisiologia endócrina, pela ajuda em vários
momentos e anos de convivência muito prazerosos: professoras - Doris Rosenthal,
Tamar Frankenfeld e Vânia Maria. Alunos - Alba, Álvaro, Bruno, Camila, Daniele,
Débora, Elaine, Flávia, Fred, Glória, Luciene, Márcia, Michele, Monique, Mônica,
Nathércia, Renata Araújo, Renata Grosovsky, Rodrigo, Sabrina, Thiago e Valmara.
Ao professor Luiz Eurico Nasciutti, que gentilmente aceitou fazer a revisão deste
trabalho e contribuiu muito para a elaboração final da tese.
Ao professor Jorge Carvalho da UERJ que permitiu que eu fizesse a parte de
imunohistoquímica em seu laboratório e me ajudou muito na realização dessa técnica.
À técnica da UERJ Ana Lúcia, que foi muito gentil e dedicada, fazendo os
experimentos de imunohistoquímica comigo e me apoiou muito nessa fase do trabalho.
A todos os demais amigos, que sempre me deram força para que eu realizasse
esse trabalho, enfrentasse as dificuldades que iam surgindo e assim me ajudaram a
concluir este trabalho.
RESUMO
LIMA, Lívia Pinto de. A MODULAÇÃO DA CAPTAÇÃO TIREÓIDEA DE
RADIOIODO EM RATOS DEPENDE DO TAMANHO DO BÓCIO INDUZIDO POR
METIMAZOL. 73 f. Tese (Doutorado em ciências biológicas) – Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, 2007.
Recentemente, demonstramos que o co-transportador Na+/I- (NIS) é rapidamente
regulado por TSH e iodo em ratos com bócio (MMI 21 dias), e esta modulação
depende primariamente do conteúdo de iodo tireoideano. Neste estudo, nosso
objetivo foi avaliar a regulação do NIS por TSH em ratos, comparando estudos
feitos em ratos com diferentes graus de bócio. Ratos machos adultos receberam
MMI 0,03% na água de beber durante 5 (MMI 5d) ou 21 dias (MMI 21 d). Após os
respectivos períodos de tratamento, o MMI foi removido a intervalos de 1 (1d s/
MMI), 2 (2d s/ MMI), 3 (3d s/ MMI), 4 (4d s/ MMI) e 5 dias (5d s/ MMI) antes do
sacrifício. A administração de MMI causou aumento significativo de TSH após
ambos os tempos de tratamento com MMI. Entretanto, esse aumento foi bem mais
pronunciado nos animais MMI 21d, o que foi fundamental para que o
desenvolvimento de bócio fosse mais pronunciado nesses animais do que nos
animais que receberam MMI por 5 dias. O MMI aumentou significativamente a
captação tireóidea de radioiodo tanto por 5 quanto por 21 dias de tratamento.
Após a remoção de MMI, a captação decaiu mais rápido (1d s/ MMI) nos animais
MMI 21d, mesmo com o TSH ainda elevado, em comparação aos animais MMI 5d,
em que a captação só se normalizou no grupo 3d s/ MMI. Nossos dados indicam
que a regulação do NIS possa depender de fatores intrínsecos da tireóide que
podem variar de acordo com o tamanho e o tempo de permanência do bócio
Palavras-chave: NIS, MMI, bócio, TSH
ABSTRACT
LIMA, Lívia Pinto de. THE MODULATION OF THYROID UPTAKE OF RADIOIODINE DEPENDS ON GOITER SIZE INDUCED BY METHIMAZOLE. 73f. Thesis (Doctorate in biological sciencies) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.
Recently, we demonstrated that the sodium-iodide symporter (NIS) is rapidly regulated
by thyrotropin (TSH) and iodine in rats with goiter (MMI 21 days), and that this
modulation depends primarily on thyroid iodine content. Our aim was to evaluate the
modulation of NIS by TSH in rats and to compare the data of different size of goiter.
Adult male Wistar received MMI 0.03% in drinking water for 5 (MMI 5d) or 21 days (MMI
21d). After, MMI was removed at intervals of 1 (1d w/ MMI), 2 (2d w/ MMI), 3 (3d w/
MMI), 4 (4d w/ MMI) and 5 (5d w/ MMI) days before sacrifice. MMI increased serum TSH
in both MMI 21d and MMI 5d. However, the TSH was higher in MMI 21d than MMI 5d
rats. Both MMI 5 and 21d rats showed hyroid iodide uptake. After MMI withdrawal, the
thyroid iodide uptake decreasing was faster (1d w/ MMI) in MMI 21d rats, although the
TSH to be high. In MMI 5d rats, the thyroid iodide uptake was normal just in 3d w/ MMI
rats. Our results indicate that NIS regulation depends on the presence of other intrinsic
factors that could vary according with time and size of goiter.
Key-words: NIS, MMI, goiter, TSH
LISTA DE SIGLAS
ADNc – ácido desoxirribonucléico complementar
AMPc – adenosina 3’, 5’ monofosfato cíclico
ARNm – ácido ribonucléico mensageiro
CREB – cyclic AMP response element binding protein (proteína de ligação ao elemento
de resposta à AMPc)
DIT - diiodotirosina
EGF - epidermal Growth Factor (fator de crescimento da epiderme)
FGF – fibroblast growth factor (fator de crescimento de fibroblasto)
IGF - Insulin-like Growth Factor (fator de crescimento semelhante à insulina)
IRS – Insulin receptor substrate (substrato do receptor de insulina)
MAPK – mitogen-activated protein kinase (proteína quinase ativada por mitógeno)
MIT – monoiodotirosina
MMI – metilmercaptoimidazol
NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido
NIS – Na(+)/I (-) Symporter (co-transportador de sódio e iodeto)
NUE - NIS upstream enhancer (elemento ativador amontante do promotor do gene do
NIS)
PTU - 6-n-propil-2-tiouracil
rT3 - 3,3’,5’-triiodotironina ou T3 reverso
T2 - 3,3’-diiodotironina
T3 – 3, 5, 3’ triiodotironina
T4 – 3, 5, 3’, 5’ tetraiodotironina ou tiroxina
Tg – tireoglobulina
TGFβ - fator de crescimento de transformação β
TGFβR – TGFβ receptor (receptor de de TGFβ)
TPO – tireoperoxidase
TRH – thyrotropin-releasing hormone (hormônio liberador de tireotrofina)
TSH - thyroid-Stimulating hormone (hormônio estimulador da tireóide ou
tireotrofina)
TSHR – TSH receptor (receptor de TSH)
TTF-1 – thyroid transcription factor 1 (fator de transcrição tireoideano 1)
SUMÁRIO
Ficha catalográfica ................................................................................................. i
Dedicatória................................................................................................................ii
Agradecimentos ..................................................................................................... iii
Resumo ....................................................................................................................v
Abstract ....................................................................................................................vi
Lista de siglas .........................................................................................................vii
INTRODUÇÃO
1- Aspectos morfológicos da tireóide ....................................................................1
2-Biossíntese e secreção dos hormônios tireóideos........................................... 2
2.1-Metabolismo e transporte tireoideano de iodeto.................................................. 3
2.2–Tireoperoxidase ................................................................................................. 5
2.3-Sistema gerador de peróxido de hidrogênio ....................................................... 7
3-Regulação da função tireóidea .......................................................................... 8
3.1-Eixo hipotalámo-hipófise-tireóide ....................................................................... 8
3.2– Fatores de regulação do NIS.............................................................................10
TSH ..........................................................................................................................10
Tireoglobulina ...........................................................................................................11
Citocinas ....................................................................................................................11
Estrogênio..................................................................................................................12
Câncer tireóideo.........................................................................................................12
Organização tridimensional das células tireóideas....................................................13
3.3 - Auto - regulação tireóidea pelo iodo .................................................................14
4 - Bócio e fatores bociogênicos ...........................................................................17
Fator de crescimento de transformação β1 .............................................................. 22
OBJETIVOS ..............................................................................................................26
METODOLOGIA
1 – Animais ............................................................................................................... 27
2 – tratamento........................................................................................................... 27
3 – Medida da captação tireóidea de radioiodo......................................................... 29
4–Sacrifício .............................................................................................................. 30
5 - Preparo da tireoperoxidase ................................................................................ 30
6 - Dosagem da atividade tireoperoxidase pelo método de oxidação do iodeto...... 31
7–Radioimunoensaios ............................................................................................. 32
8 – Análises histomorfométricas............................................................................... 34
9 – Análise estatística ............................................................................................. 36
RESULTADOS
1 – Concentração sérica de TSH ......................................................................... 37
2 – Peso da tireóide ............................................................................................. 38
3 – Atividade tireoperoxidase ............................................................................... 39
4 – Captação tireóidea de radioiodo .................................................................... 41
5 – Concentrações séricas de T4 e T3 totais......................................................... 42
6 – Perímetro do colóide ...................................................................................... 45
7 – Expressão de TGFβ-1 ................................................................................... 46
DISCUSSÃO ...................................................................................................... 49
CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................. 61
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 62
INTRODUÇÃO
1 – ASPECTOS MORFOLÓGICOS DA TIREÓIDE
A tireóide normal localiza-se à frente da traquéia, entre o segundo ou
terceiro anel cartilaginoso, pesando aproximadamente 20g no adulto da espécie
humana; consiste de dois lobos separados por uma delgada faixa de tecido, o
istmo (Larsen et al., 2003; Capen, 1996).
Os folículos tireóideos são de forma esférica e tamanhos variáveis
delimitados por uma única camada de células epiteliais cubóides, as células
foliculares. A luz do folículo é preenchida pelo colóide, um material rico em
glicoproteínas produzidas pelas células foliculares, onde são armazenados os
hormônios tireóideos. O folículo tireoideano é irrigado por uma abundante rede
de capilares (Capen, 1996) e as células foliculares têm seu tamanho alterado
conforme o grau de estimulação da glândula, tornando-se colunares quando
estimuladas e pavimentosas quando não estimuladas (Larsen et al., 2003).
A célula folicular é polarizada, o que é fundamental para sua função.
Separada dos capilares sangüíneos pela membrana basal, está a membrana
basolateral da célula folicular, onde ocorre a captação do iodeto a partir da
corrente sangüínea. A membrana apical está em contato com o colóide e possui
numerosas microvilosidades que aumentam muito a área de contato celular com
o material coloidal. Perto da superfície apical da célula, onde há a organificação
do iodeto, ocorrem a endocitose e a fase inicial da secreção hormonal (Larsen et
al., 2003).
A tireóide inclui também uma população celular bem menos numerosa e
distinta das células foliculares. Tais células são denominadas células
parafoliculares ou células C, responsáveis pela produção do hormônio
calcitonina, envolvido no controle da homeostase do cálcio (Larsen et al., 2003).
2- BIOSSÍNTESE E SECREÇÃO DOS HORMÔNIOS TIREÓIDEOS
A glândula tireóide é responsável pela síntese, armazenamento e
secreção dos hormônios tireóideos em quantidades suficientes para atender à
demanda dos tecidos periféricos (Gentile et al., 1995; Larsen et al., 2003). Os
hormônios tireóideos são sintetizados através de reações de iodação e
acoplamento de radicais tirosila na molécula de tireoglobulina, uma proteína
produzida e secretada pelas células foliculares, principal componente do colóide.
A iodação dos radicais tirosila da tireoglobulina leva à formação de
monoiodotirosina (MIT) e diiodotirosina (DIT). O acoplamento entre dois resíduos
de DIT leva à formação de tiroxina (T4) e o acoplamento entre os resíduos de
MIT e DIT leva à formação de triiodotironina (T3) (Gentile et al., 1995).
A secreção hormonal se inicia com a reabsorção de gotículas de colóide
pelas microvilosidades da membrana apical da célula folicular tireoideana,
formando vacúolos intracelulares. Dentro da célula folicular, os vacúolos
contendo colóide fundem-se com lisosomas os quais possuem enzimas
proteolíticas que degradam a tireoglobulina, liberando T3 e T4, que atravessam a
membrana basolateral da célula, passando à circulação sangüínea (Bianco e
Kimura, 1998). Recentemente, foi proposto que os hormônios tireóideos
atravessem a membrana plasmática da célula folicular através de um
transportador específico de iodotironinas, pertencente à família de
transportadores de monocarboxilados (Friesema et al., 2003). As iodotirosinas
liberadas durante a proteólise da tireoglobulina podem sofrer desiodação
intratireóidea, havendo, dessa forma, reutilização de uma parte do iodo (Gentile
et al., 1995; Larsen et al., 2003).
Sob condições normais, em humanos, o T4 é o principal produto da
síntese hormonal, sendo secretado em quantidade aproximadamente 20 vezes
maior que a de T3, no entanto, possui atividade biológica muito pequena
comparada a T3. Assim, a maior parte do T4 sintetizado é desiodado a T3 no
interior da glândula tireóide e nos tecidos periféricos, sendo que apenas 20% do
T3 encontrado no plasma é secretado pela tireóide, pois o restante é proveniente
de desiodação periférica de T4 a T3 (Gentile et al., 1995; Bianco et al., 2002). Em
ratos, no entanto, a desiodação periférica de T4 contribui com apenas 60% do T3
circulante, sendo o restante secretado pela tireóide (Bianco et al., 2002).
2.1 - Metabolismo e transporte tireoideano de iodeto
O iodo está presente em alimentos como frutos do mar, derivados do leite
e pão. Sua forma iônica, o iodeto, é essencial à formação dos hormônios
tireóideos. Devido à sua importância na biossíntese desses hormônios,
estabeleceu-se a adição de iodeto de potássio ao sal de cozinha em alguns
países, assegurando um consumo de iodo adequado para a população (Bianco
e Kimura, 1998).
Em humanos, a depuração tireoideana de iodeto plasmático é de 10 a 25
ml/min e cerca de 1/5 do iodeto que perfunde a glândula é captado a cada
passagem. A concentração de iodeto é muito maior na célula folicular do que no
plasma, uma vez que este é concentrado sob forma orgânica no colóide dos
folículos tireoideanos (Bianco e Kimura, 1998).
O transporte de iodeto para o interior da célula folicular é o primeiro passo
para a biossíntese dos hormônios tireóideos e é realizado pelo co-transportador
Na+/I- (NIS). O NIS é uma glicoproteína pertencente à família de co-
transportadores que utilizam o gradiente de Na+ para o transporte de moléculas
para o meio intracelular (Dohan et al., 2003). O gradiente de Na+ é gerado pela
Na+/K+ ATPase, também presente na membrana basolateral do tireócito, assim o
NIS transporta ao mesmo tempo Na+ e I- (na proporção de 2:1, respectivamente)
para o interior da célula, sendo que o Na+ entra a favor de seu gradiente
eletroquímico e o I- entra contra o seu gradiente eletroquímico (Eskandari et al.,
1997). O transporte de iodeto é inibido por alguns ânions como o tiocianato e
perclorato (Smanik et al., 1996).
O NIS também está presente em outros tecidos como as glândulas
salivares, mucosa gástrica e glândula mamária em lactação (Dohan et al., 2003).
Seu ADNc foi clonado (Smanik et al., 1996) e foi proposto que a estrutura
secundária da proteína contenha 13 domínios transmembrana (Dohan et al.,
2003). Após a síntese e processamento pós-traducional do NIS, parte das
proteínas é endereçada para a membrana basolateral e outra parte é
armazenada em vesículas intracelulares. Dependendo do estímulo, o NIS pode
migrar das vesículas para a membrana basolateral, onde medeia o transporte
tireóideo de iodeto ou migrar da membrana para as vesículas intracelulares, o
que diminui a captação de iodeto pela tireóide (Riedel et al., 2001). O
mecanismo exato envolvido na migração do NIS para a membrana ainda não foi
esclarecido. Recentemente, foi obsevada em humanos, uma mutação em
homozigose na posição 543 do domínio citoplasmático. Esta mutação resulta em
troca de glicina por glutamina nesta região e causa glicosilação incompleta e
retenção intracelular do NIS, tornando-o inativo. Esses resultados sugerem que
essa região seja importante para a maturação e migração correta do NIS para a
membrana (De la Vieja et al., 2005)
O iodeto que entra no tireócito difunde-se através do citoplasma até a
membrana apical, atravessando a membrana e atingindo o colóide. Foi proposto
que este efluxo de iodeto seja mediado pela pendrina (um transportador de
cloreto e iodeto) (Scott et al.,1999) e, mais recentemente, pelo canal de cloreto
dependente de voltagem ClC- 5 (van den Hove et al., 2006). Na interface entre a
membrana apical e o colóide, o iodeto é oxidado e organificado. As reações de
oxidação e organificação são catalisadas pela enzima tireoperoxidase e podem
ser bloqueadas por inibidores desta enzima, como 6-n-propil-2-tiouracil (PTU) e
metilmercaptoimidazol (MMI) (Dohan et al., 2003).
2.2 -Tireoperoxidase (TPO)
A tireoperoxidase (TPO) é uma hemoglicoproteína que se encontra na
membrana plasmática apical da célula folicular, com o seu domínio catalítico
voltado para o colóide (Pohl et al., 1993). A TPO é a principal enzima envolvida
na biossíntese dos hormônios tireóideos e é considerada o principal componente
microsomal envolvido em doenças tireóideas auto-imunes (Abramowicz et al.,
1992).
A TPO purificada possui massa de aproximadamente 100kDa. Em
humanos, o gene da TPO está localizado no braço curto do cromossomo 2 e,
em ratos, no cromossomo 12. O gene humano possui 17 exons e 16 íntrons
(Taurog, 2000). Duas formas da enzima TPO foram encontradas em uma
biblioteca genômica de cDNA preparada a partir de ARNm isolado de paciente
com doença de Graves. O maior ADNc produzia uma proteína de 933
aminoácidos, identificada como TPO-1. O menor ADNc produzia uma proteína
com 57 aminoácidos a menos no meio da seqüência (deleção de códons na
seqüência de 533-590), no exon 10, identificada como TPO-2 (Cetani et
al.,1995). Perto da extremidade carboxila da TPO há 25 aminoácidos
hidrofóbicos que são provavelmente responsáveis por ancorar a TPO na
membrana plasmática (Gentile et al., 1995).
A TPO catalisa 3 reações da biossíntese hormonal: a oxidação de íons
iodeto, a iodação da tireoglobulina e o acoplamento de iodotirosinas formando
iodotironinas (Gentile et al., 1995).
Foi proposto que existem dois sítios catalíticos na TPO, um para ligar-se
ao I- e outro para ligar-se ao radical tirosila da molécula de tireoglobulina. Esses
dois substratos irão sofrer oxidação pela TPO produzindo radicais livres (I• e
tirosila•), que se ligam formando monoiodotirosina (MIT). A MIT, ainda ligada à
TPO, pode sofrer nova oxidação e reagir com I•, produzindo diiodotirosina (DIT).
As iodotirosinas formadas são acopladas, formando os hormônios tireóideos T4
ou T3 (Taurog, 2000).
O promotor da TPO é regulado via AMPc (Gérard et al., 1989). O TSH
aumenta os níveis de ARNm para TPO em várias preparações de células
tireóideas e isto pode ser observado também com a administração de análogos
do AMPc ou de agentes que aumentam os níveis intracelulares do mesmo (Pohl
et al.,1993; Taurog, 2000).
2.3 - Sistema gerador de peróxido de hidrogênio
O H2O2 é um potente oxidante de I- e um aceptor de elétrons essencial
nas reações catalisadas pela TPO. Possui papel limitante na iodação de
tireoglobulina e biossíntese hormonal, agindo como co-fator oxidante da TPO. A
adição de um sistema gerador de H2O2 a um preparado de tireóide retirada de
paciente com defeito na iodação da tireoglobulina e TPO normal, restaura a
capacidade de organificação de iodo (Gentile et al., 1995), indicando a
importância da molécula de H2O2 para a etapa de organificação de iodo na
tireóide. Foi demonstrada a geração de H2O2 na membrana apical da célula
folicular de ratos e porco e que esta reação era induzida por TSH via AMPc em
tireócitos de cachorro e porco (Raspé et al., 1995; Carvalho et al., 1996).
Acreditava-se que o mecanismo de formação de H2O2 envolvia a ação
de duas enzimas, a NADPH-oxidase e a NADPH citocromo c redutase.
Entretanto, Carvalho et al. (1996), demonstraram, em tireócitos suínos, que
somente a atividade da NADPH-oxidase é regulada por TSH, sugerindo que esta
enzima seja a responsável pela geração de H2O2 na tireóide e não a NADPH
citocromo c redutase. A atividade NADPH-oxidase foi caracterizada em tireóides
humanas (Cardoso et al., 2001; Leseney et al., 1999). A NADPH oxidase é uma
flavoproteína integral de membrana e requer concentrações micromolares de
cálcio para sua atividade (Leseney et al., 1999). Dupuy et al. (1999) clonaram
parte do gene ThOX que produz NADPH-oxidase em tireóides suínas e
humanas e De Deken et al., (2000) clonaram dois genes (ThOX 1 e ThOX2)
responsáveis pela produção de duas oxidases em tireóides humanas. As
proteínas ThOX 1 e ThOX2 parecem co-localizar-se na membrana apical do
tireócito com a tireoperoxidase, entretanto o papel da ThOx 1 na geração
tireóidea de H2O2 ainda não está definido (De Deken et al., 2000).
3- REGULAÇÃO DA FUNÇÃO TIREÓIDEA
3.1- Eixo hipotalámo-hipófise-tireóide
As concentrações de T3 e T4 circulantes são reguladas por um sistema
integrando o hipotálamo, a adenohipófise e a tireóide. A secreção e a produção
do hormônio tireotrofina ou hormônio estimulador da tireóide (TSH) são
estimuladas principalmente pelo hormônio hipotalâmico liberador de tireotrofina
(TRH). O TRH estimula a síntese e secreção do TSH, que por sua vez, estimula
todas as etapas de biossíntese dos hormônios tireóideos e o crescimento da
glândula. Os hormônios tireóideos exercem um papel inibitório sobre o TRH e
TSH, bloqueando sua síntese e secreção, formando um mecanismo de retro-
alimentação negativa (Wilber, 1995).
A estrutura do TRH corresponde a um tripeptídeo , o qual está presente
na circulação porta hipofisária, que irriga a maior parte da adeno-hipófise ou
hipófise anterior, porção da hipófise responsável pela síntese de TSH e outros
hormônios (Scanlon e Toft, 1996).
O TRH estimula a síntese e secreção de TSH e este efeito é
contrabalançado pela ação dos hormônios tireóideos, que inibem a expressão
do gene para TSH e sua liberação. Os hormônios tireóideos agem também
diminuindo a expressão do gene para os receptores de TRH na hipófise, com
conseqüente diminuição da síntese de TSH (Scanlon e Toft, 1996).
O TSH é um hormônio glicoprotéico sintetizado e secretado por células da
hipófise anterior denominadas tireotrofos. Sua estrutura consiste de 2
subunidades α e β ligadas não covalentemente. A subunidade α é comum para
outros hormônios glicoprotéicos: hormônio luteinizante, hormônio folículo
estimulante e gonadotrofina coriônica. A subunidade β tem uma seqüência
específica de aminoácidos que está relacionada à ligação do TSH com seu
receptor e à atividade hormonal (Wondisford et al., 1996).
O TSH exerce seus efeitos sobre a tireóide através da ligação ao seu
receptor, que é acoplado à proteína Gs. Quando o TSH se liga ao seu receptor,
a subunidade αs da proteína G ativa a enzima adenilato ciclase. A ativação
dessa enzima aumenta os níveis intracelulares de adenosina 3’, 5’ monofosfato
cíclico (AMPc) que ativa a proteína cinase A. O TSH, em altas concentrações,
pode estimular outra proteína G, a Gq, que leva ao aumento do cálcio
intracelular posterior à ativação da fosfolipase C, o que leva à formação de
diacilglicerol, que estimula a fosforilação da proteína cinase C. Ambas as vias
levam à fosforilação de várias proteínas que regulam a função e proliferação
tireóideas (Spaulding, 2000). O TSH estimula a proliferação celular e
vascularização da glândula tireóide. Além disso, todos os eventos que levam à
síntese e secreção dos hormônios tireóideos são estimulados por TSH. A
maioria desses efeitos é mediada pelo aumento da expressão de vários genes
envolvidos diretamente na biossíntese dos hormônios tireóideos, a saber:
tireoglobulina, TPO, NIS, Thox e também de fatores transcrição específicos na
regulação destes genes, como o TTF-1 e Pax-8, embora, recentemente tenha
sido observado que o TSH não regula a expressão dos ARNms do TTF-1 e
também da pendrina e do receptor de TSH (Bruno R et al., 2005).
3.2 – Fatores de regulação do NIS
TSH
O TSH regula a função do NIS, através da via adenilato ciclase
(Spitzweg et al., 2000). Foi verificado que o TSH aumenta também a expressão
do ARNm do NIS, pois o gene do NIS possui um elemento responsivo ao TSH,
que, em resposta à esse hormônio, estimula a atividade do promotor,
aumentando a transcrição do gene que codifica o NIS (Ohmori et al., 1998). Em
ratos, foi demonstrado recentemente que em uma região upstream do gene do
NIS existe um elemento responsivo ao TSH denominado NIS upstream
enhancer (NUE) (Ohno M et al., 1999). Recentemente, foi demonstrado que o
TSH é também um pré-requisito para a manutenção da expressão do NIS
(Bruno R et al., 2005).
O TSH regula não somente a transcrição e a tradução do NIS, mas
também sua localização subcelular. Kaminsky et al. (1994) demonstraram por
estudos de fracionamento subcelular de células FRTL-5 que o NIS é encontrado
majoritariamente em frações de membrana, mas também localiza-se em
vesículas intracelulares. Em cultura de células, a retirada do TSH causa
redistribuição das moléculas de NIS presentes na membrana para vesículas no
compartimento intracelular (Riedel et al., 2001). O mecanismo pelo qual o TSH
regula a distribuição do NIS ainda não foi elucidado. Foi demonstrado que o NIS
sofre fosforilação e que este efeito é modulado por TSH. Como é conhecido que
a fosforilação exerce papel crucial no endereçamento de vários transportadores,
é possível que a fosforilação do NIS também esteja envolvida com seu
endereçamento para a membrana basolateral (Riedel et al., 2001).
Tireoglobulina (Tg)
O acúmulo de Tg pouco iodada no colóide, parece ser um potente
supressor da expressão do NIS. Além disso, a Tg também parece inibir a
expressão de outros genes importantes para biossíntese hormonal, como da
própria Tg, TPO e receptor de TSH (TSHR). Esse efeito da Tg deve-se à sua
capacidade de inibir a expressão de genes que codificam fatores transcricionais
moduladores da expressão de Tg, TPO, TSHR e NIS, tais como TTF-1, TTF-2 e
Pax-8. Esse mecanismo parece constituir uma forma de autorregulação da
função tireóidea pela tireoglobulina (Suzuki et al., 1999). Entretanto, a definição
do seu papel fisiológico e a confirmação desses dados ainda não ocorreram.
Citocinas
Algumas citocinas, tais como fator de crescimento de transformação β1
(TGFβ1), fator de necrose tumoral α, interferon γ e interleucina 1α, parecem
levar à diminuição dos níveis de ARNm do NIS em células FRTL-5 e em culturas
de tireócitos humanos (Bidey et al., 1999; Spizweg et al., 2000). Sabe-se que na
tireoidite e em outras doenças da glândula, a captação de iodeto encontra-se
diminuída. Assim, é possível que esse efeito seja devido à inibição da expressão
do NIS exercida por citocinas presentes na tireóide nessas doenças (Spizweg et
al., 2000).
Estrogênio
Em culturas de células FRTL-5, foi demonstrado que a administração de
estradiol reduziu a expressão do ARNm do NIS e aumentou a proliferação
celular (Furlanetto et al., 1999). Mais recentemente, Furlaneto et al. (2001)
demonstraram que o estradiol diminuiu a captação de iodeto em cultura de
células FRTL-5 na presença ou ausência de TSH, embora, em nosso
laboratório, a administração de estradiol a ratas tenha aumentado a captação de
iodeto in vivo, sem alteração da concentração sérica de TSH (Lima et al., 2006),
sugerindo um importante papel regulatório do estrogênio sobre o NIS. No
entanto, os mecanismos de regulação que possam ajudar a explicar os
diferentes resultados entre os modelos de cultura de células de tireóide in vivo
ainda não foram elucidados.
Câncer tireóideo
Vários estudos têm demonstrado diminuição ou ausência da atividade do
NIS em casos de câncer da tireóide. A perda da polaridade e do endereçamento
de proteínas de membrana são observadas em câncer de células foliculares
tireóideas (Dohan et al., 2003), o que pode explicar, pelo menos em parte, a
diminuição da atividade do NIS nestas células. Uma vez que o radioiodo é uma
ferramenta útil no tratamento e diagnóstico de doenças tireóideas benignas e
malignas, vários estudos visam à compreensão dos fatores que regulam a
atividade do NIS (Heufelder et al., 2001). A elucidação desses fatores poderia
contribuir para o desenvolvimento de drogas que possam aumentar a captação
de radioiodo em câncer da tireóide, como é o caso dos inibidores da histona
desacetilase, que aumentaram a atividade do promotor do NIS por diminuir a
desacetilação de histonas (Puppin et al., 2005) e do ácido retinóico, que também
estimula a expressão do ARNm para NIS em células humanas de câncer de
tireóide (Schumutzler et al., 1997).
Organização tridimensional das células tireóideas
Sabe-se que a atividade do NUE, situado no gene do NIS, depende da sua
ligação com Pax-8 e também pode ser modulada por vários outros fatores de
transcrição na tireóide, como os que pertencem à família CREB (Chun JT et al.,
2004), sugerindo que NUE possa ser responsivo a vários sinais. Recentemente,
em cultura de tireócitos porcinos, foi demonstrado que o TSH ativa a expressão
de NIS somente se as células estiverem formando estruturas foliculares ou
agregados, mas sua expressão foi abaixo do limite de detecção em células
formando monocamadas. Já com relação à TPO, tireoglobulina e subunidade α
da Na+/K+-ATPase a regulação da expressão por TSH foi semelhante em células
em monocamadas ou em estruturas foliculares (Bernier-Valentin et al., 2006).
Esse trabalho sugere que a ativação da expressão do NIS por TSH pode
depender de interações entre as células que formam os folículos tireoideanos.
Foi demonstrado em tireócitos caninos e humanos, que a adesão entre as
células é mediada por uma proteína de membrana plasmática denominada E-
caderina. Sua expressão é estimulada por TSH (Brabant et al., 1995) e sua
degradação e internalização são inibidas por este hormônio via AMPc, em
tireócitos porcinos (Larsson et al., 2004). Por interagir com uma outra proteína
de membrana, a β-catenina, a E-caderina pode alterar indiretamente a
expressão de fatores de transcrição, inclusive de fatores do complexo AP-1
(Mann et al., 1999), que poderiam se ligar ao NUE (Chun et al., 2004).
3.3 Auto-regulação tireóidea pelo iodo
A auto-regulação tireóidea pelo iodo está relacionada à sua ação sobre
várias etapas da biossíntese hormonal, de maneira que a produção hormonal
varia de acordo com a quantidade de iodo na glândula. O aumento intra-
glandular de iodo organificado inibe diretamente várias etapas da biossíntese
dos hormônios tireóideos e as respostas ao TSH mediadas por AMPc (Rot;
Vagenakis, 2005).
Os candidatos para serem os compostos orgânicos responsáveis pela
auto-regulação são os iodolipídios ácido δ-lactona 6-iodo-5-hidroxi-8,11,14-
eicosa-trienóico e iodohexadecanal, sendo este último capaz de inibir
organificação do iodo e a produção de H2O2 (Panneels et al., 1994; Dugrilon,
1996). Recentemente, experimentos in vivo realizados em nosso laboratório
demonstraram diminuição da captação tireóidea de iodeto em ratos 2 dias após
a interrupção do tratamento com MMI, uma droga capaz de bloquear a TPO,
quando o TSH ainda encontrava-se elevado (Ferreira et al., 2005). Esses dados
reforçam a hipótese de que o efeito supressor do iodo seja mediado por um
composto orgânico iodado, já que, nessa situação, há aumento do conteúdo de
iodo organificado na glândula após a retomada de atividade TPO.
Em um estudo pioneiro, Wolff e Chaikoff (1948) observaram bloqueio da
organificação do iodo em ratos e humanos quando as concentrações séricas de
iodeto estão muito elevadas e esse efeito foi designado como efeito Wolff-
Chaikoff. A suscetibilidade ao efeito Wolff-Chaikoff pode ser aumentada quando
a captação de iodeto está alta como em situações em que o receptor de TSH é
persistentemente estimulado pelo próprio TSH ou algum auto-anticorpo capaz
de estimular o receptor, como na doença de Basedow-Graves. Assim, o paciente
pode desenvolver bócio e hipotireoidismo, se o excesso de iodeto persistir por
longos períodos (Larsen et al., 2003; Pearce et al., 2002). O mecanismo de
diminuição da organificação pelo excesso de iodo na tireóide não está
totalmente esclarecido. Apesar da diminuição da expressão do ARNm da TPO e
do NIS observada em ratos após administração crônica de doses moderadas de
iodeto de potássio (Eng et al., 1999), estudos sobre a TPO não têm
demonstrado efeito inibitório do iodo diretamente sobre a atividade desta enzima
in vivo (Cardoso et al., 2002; Cardoso et al., 2001; Ferreira et al., 2005). Por
outro lado, estudos de nosso laboratório demonstraram, na fração rica em
membrana, inibição da atividade da enzima NADPH oxidase, que produz o co-
fator para a TPO, em tecidos tireóideos humanos obtidos de cirurgia, em
pacientes com doença de Graves previamente tratados com iodo. A atividade
TPO, no entanto, não foi bloqueada pelo excesso de iodo (Cardoso et al., 2001).
Esses resultados sugerem que a inibição da organificação do iodo deve ser
devida ao efeito do iodo sobre a NADPH oxidase (Cardoso et al., 2002; Cardoso
et al., 2001).
Em relação ao transporte tireoideano de iodeto, foi demonstrada a
diminuição da sua atividade e da expressão do seu ARNm em estudos in vitro e
in vivo, em presença de excesso de iodeto (Price et al., 1986).
O excesso de iodeto diminui os níveis intracelulares de AMPc, que
modula o crescimento da tireóide, a síntese de NADPH oxidase, TPO, NIS e
outras proteínas tireóideas (Kopp, 2004), diminuindo não só a biossíntese
hormonal, mas também a proliferação celular das células tireóideas (Furlanetto
et al., 1999; Uyttersprot et al., 1997). Esse efeito do iodeto pode estar
relacionado à sua ação inibitória sobre adenilato ciclase, já que a ação
mitogênica do TSH é mediada por AMPc (Dumont et al., 1992).
Em pacientes que recebem doses moderadas ou altas de iodeto, a
inibição relativa da organificação e da formação de iodotironinas são reversíveis.
Após cerca de 2 semanas de administração de iodeto a pacientes com doença
de Graves, para diminuir a produção de hormônios tireoideanos, a tireóide é
capaz de retomar a síntese dos hormônios tireóideos. Esse efeito é denominado
escape (Wolff e Chaikoff, 1948) e é explicado por uma diminuição da captação
tireóidea de iodeto, reduzindo o conteúdo intraglandular de iodo organificado a
níveis insuficientes para manter o bloqueio da organificação. Eng et al. (1999)
demonstraram que o escape está associado à redução da expressão do ARNm
e da proteína do NIS em resposta à uma administração crônica ou aguda de
altas doses de iodeto. Em nosso laboratório, Ferreira et al. (2005) observaram
que, em ratos, a administração de NaI 0,05% por 1 dia diminuiu os níveis séricos
de T4, sem alterar os níveis de TSH e, aos 6 dias de tratamento, o T4 sérico
voltou aos níveis normais. Esses dados, provavelmente refletem o escape do
efeito Wolff-Chaikoff em ratos.
Quando há diminuição da ingestão de iodo, a biossíntese hormonal pode
diminuir, o que resulta em aumento dos níveis séricos de TSH. Além disso,
antes da redução da produção hormonal, o baixo conteúdo de iodo na glândula
a torna mais responsiva ao TSH (Kopp, 2004). A persistência tanto do aumento
sérico de TSH quanto da responsividade da tireóide a esse hormônio, pode
resultar em hiperplasia e hipertrofia da glândula, o que é denominado bócio.
4 - BÓCIO E FATORES BOCIOGÊNICOS
Bócio é definido como aumento do volume da tireóide, podendo ser
classificado em diferentes tipos de acordo com suas características morfológicas
ou funcionais. Do ponto de vista morfológico, o bócio pode classificado como
difuso ou nodular e do ponto de vista funcional, pode ser tóxico, se produzir
hipertireoidismo, ou atóxico se a produção hormonal permanecer dentro da
normalidade ou diminuir. O bócio difuso é a designação para a forma de bócio
que afeta difusamente toda a glândula, sem produzir nodularidade e o bócio
nodular, que pode ser subdividido em uni- ou multinodular é a designação para a
forma que se manifesta por nódulos bem definidos de tamanhos variáveis
(Studer et al., 1982)
O bócio pode ser endêmico, ocorrendo principalmente em áreas que
apresentam carência de iodo na alimentação. A carência de iodo resulta em
diminuição da produção hormonal com aumento compensatório de TSH, com
conseqüente hipertrofia e hiperplasia da glândula. Mas, além da carência de
iodo, outros fatores podem estar relacionados com o bócio endêmico, como
ocorre em populações cuja base da alimentação possui substâncias
antitireoideanas como o tiocianato, que inibem a captação tireoideana de iodeto.
O bócio pode também ser esporádico. Nesse caso, existe um predomínio no
sexo feminino, provavelmente devido à influência dos hormônios esteróides
femininos. O bócio esporádico pode ser causado por diversos fatores como:
defeitos enzimáticos hereditários que resultem em deficiência em alguma etapa
da biossíntese hormonal. Foram descritos defeito no transporte de iodeto,
defeito da organificação do iodo, defeito de iodotironina desiodase e defeito no
acoplamento de iodotirosinas. Esses defeitos resultam em diminuição da
produção hormonal com conseqüente aumento do TSH sérico. Outras causas de
bócio esporádico são as doenças autoimunes, como a doença de Basedow-
Graves e a tireoidite de Hashimoto. Na doença de Basedow-Graves, são
produzidos um ou mais auto-anticorpos contra o receptor de TSH, capazes de
se ligar a ele e estimular a glândula de forma semelhante ao TSH, produzindo
bócio e hipertireoidismo. Na tireoidite de Hashimoto, são produzidos auto-
anticorpos contra diferentes antígenos tireoideanos, como tireoglobulina, TPO e
NIS. Nesse caso, desenvolve-se bócio e hipotireoidismo (Studer & Ramelli.,
1982).
Como substâncias bociogênicas existem as drogas anti-tireoideanas, que
são utilizadas na clínica no tratamento do hipertireoidismo, para a diminuição da
produção dos hormônios tireoideanos. O uso prolongado dessas substâncias
causa diminuição dos níveis séricos de hormônios tireoideanos, resultando em
elevação dos níveis de TSH. Essa elevação pode causar bócio em animais com
função tireóidea normal. As tionamidas são exemplos de drogas
antitireoideanas, entre as quais as principais utilizadas na clínica são o 1-metil 2-
mercaptoimidazol (MMI) e o 6-propil – 2 tiouracil (PTU). Essas drogas são
ativamente transportadas para dentro da tireóide e seus efeitos sobre a
biossíntese hormonal parecem resultar dos seguintes mecanismos: competem
com os radicais tirosila na tireoglobulina, reduzindo sua iodação; interferem com
o acoplamento das iodotirosinas e ligam-se à tireoglobulina, podendo diminuir
sua iodação e sua proteólise. Em humanos, ambas as drogas são quase
completamente absorvidas a partir do trato gastrointestinal. Picos de
concentração sérica de MMI, ocorrem entre 1 a 2 horas após a ingestão, com
meia-vida de 4 a 6 horas. Em humanos, a eliminação de MMI pela tireóide é
lenta e as concentrações intratireoidenas após 17-20 horas são semelhantes às
observadas após 3 a 6 horas da administração. A meia-vida do PTU é mais
curta (90 minutos) e tem-se pouca informação sobre suas concentrações na
tireóide. Além do uso das tionamidas, a redução da produção de hormônios
tireoideanos pode ser obtida através do uso prolongado de soluções de iodeto
de potássio como a solução saturada de iodeto de potássio (SSKI, lugol).
Pacientes tratados com soluções de iodeto, apresentam diminuição das
concentrações de T3 e T4 após 7 a 14 dias de tratamento (Cooper, 2000).
Estudos feitos por Studer et al., (1992), mostraram o envolvimento de
fatores de crescimento autócrinos e parácrinos na gênese do bócio. Entre esses
fatores, estão os fatores angiogênicos, como o fator de crescimento vascular
endotelial (Viglietto et al., 1997 apud Biddey et al., 1999) e o fator de
crescimento derivado da placenta e endotelina (Sellitti & Hughes, 1990 apud
Biddey et al., 1999), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs;
Minuto et al., 1989 apud Biddey et al., 1999), fator de crescimento de
fibroblastos (Thompson et. al., 1998 apud Biddey et al., 1999 ), fator de
crescimento de hepatócito (Eccles et al., 1996) e o fator de crescimento
transformador β1 (TGFβ1; Grübeck-Loebenstein et. al., 1989 apud Biddey et al.,
1999). Foi demonstrado que o fator de crescimento vascular endotelial diminuiu
a proliferação de células FRTL-5 (Wang et al., 1998 apud Biddey et al., 1999).
Endotelina -1 é um vasoconstritor secretado por células tireoideanas de
diferentes espécies (Collin et al., 1992 apud Biddey et al., 1999; Tseng et al.,
1993 apud Biddey et al., 1999) e foi demonstrado inibir a captação de iodeto em
células tireoideanas de porco e a síntese de ADN estimulada por TSH em
células FRTL-5 (Tsushima et al., 1994 apud Biddey et al., 1999). Por outro lado,
foi observado que concentrações nanomolares de endotelina-1 estimulam o
crescimento de células tireoideanas de humanos em cultura (Eguchi et al., 1993
apud Biddey et al., 1999).
Estudos em cultura de células tireoideanas de várias espécies
demonstraram que IGFs agem sinergisticamente com TSH na tireóide, sendo
fundamental para os efeitos estimulatórios deste hormônio sobre o crescimento
e função tireoideanos (Ollis et al., 1989 apud Biddey et al., 1999; Williams et al.,
1988 apud Biddey et al., 1999). Alguns estudos evidenciaram estímulo da
expressão de IGF-1 na tireóide por TSH (Tode et al., 1989 apud Biddey et al.,
1999; Hofbauer et al., 1995 apud Biddey et al., 1999) e supressão da transcrição
de IGF-1 por iodo organificado intratireoideano (Beere et al., 1995 apud Biddey
et al., 1999; Hofbauer et al., 1995 apud Biddey et al., 1999). Células tireoideanas
normais expressam também os fatores de crescimento FGF- 1 e FGF-2 junto
com o seu receptor do tipo 1 (FGFR-1; Thompson et al., 1998 apud Biddey et al.,
1999) e esta expressão está aumentada no bócio. Em tireóides caninas e
murinas foram observados efeitos mitogênicos e de dediferenciação por FGF
(Chanoine et al., 1992 apud Biddey et al., 1999), enquanto não foi observado
nenhum efeito de FGF sobre o crescimento de células tireoideanas de humanos
(Taylor et. al, 1993 apud Biddey et al., 1999). O fator de crescimento de
hepatócito é secretado por células tireoideanas normais (Eccles et. Al, 1996).
Em tireóides humanas normais, a expressão do ARNm do seu receptor,
denominado met, foi encontrada ser abundante, mas a proteína não foi
detectada (Di Renzo et al., 1991 apud Biddey et al., 1999). Entretanto, a
expressão da proteína met está muito aumentada em tecidos de carcinoma
tireoideanos (Trovato et al., 1998 apud Biddey et al., 1999).
Entre todos esses fatores reguladores do crescimento da tireóide, o
TGFβ1 tem despertado especial interesse, devido a seus diferentes efeitos
sobre a glândula, regulando não só o seu crescimento, mas também sua
diferenciação, função e a produção de matriz extracelular.
Fator de crescimento de transformação ββββ1 (TGF ββββ1)
O TGF β1 é uma citocina pertencente à superfamília que inclui TGF βs,
ativinas e proteínas ósseas morfogenéticas, que regula o crescimento, a
diferenciação e a produção de matriz extracelular em muitos tipos celulares
(Kingsley DM et al., 1994 apud Nicolussi et al., 2003). A subfamília de TGF βs
possui três isoformas, que são TGF β1, TGF β2 e TGF β3 , sendo que somente
o TGF β1 foi detectado na tireóide de várias espécies (Cirafici et al., 1992 apud
Nicolussi et al., 2003; Cowin et al., 1992 apud Biddey et al., 1999). O TGFβ1 é
um dos principais reguladores da foliculogênese e da diferenciação das células
tireóideas. Os seus efeitos biológicos são mediados por diferentes receptores,
dentre os quais os mais amplamente distribuídos são os tipos I, II e III (TGFβRI,
TGFβRII e TGFβRIII). Os três tipos foram demonstrados em células tireóideas
FRTL-5 (Coppa et al., 1995 apud Nicolussi et al., 2003). TGFβRI e TGFβRII são
serina/treonina cinases e são essenciais para o início da sinalização por TGFβ1,
enquanto TGFβRIII é uma betaglicana, responsável pela apresentação do
ligante aos outros receptores (Lopez-Casillas et al.,1993 apud Nicolussi et al.,
2003). Diversas proteínas estão envolvidas na via de sinalização dos receptores
de TGF βs, dentre as quais as principais são as proteínas Smads. Na tireóide, a
ligação de TGF β1 com o heterodímero formado por TGFβRI e TGFβRII leva à
fosforilação de Smad2 e Smad3. Em seguida, Smad2 e Smad3 formam um
heteroligômero com Smad4, que se transloca para o núcleo, funcionando como
ativador transcricional de vários genes (Miyazono et al., 2000).
A expressão de TGFβ1 na tireóide parece ser regulada por iodo e por
TSH. Foi demonstrado em células tireoideanas porcinas, aumento do ARNm de
TGFβ1 após a exposição ao iodeto (Cowin et al., 1992 apud Biddey et al., 1999)
e estímulo da sua expressão por TSH em células FRTL-5 (Pekary et al., 1995
apud Biddey et al., 1999). Assim, é possível que em casos de deficiência de iodo
in vivo, a diminuída expressão de TGFβ1 poderia ser mascarada pelo aumento
de TSH sérico, que causaria aumento da síntese de TGFβ1 (Bidey et al., 1999).
Sabe-se que TGFβ1 exerce um efeito inibitório sobre a proliferação das
células tireóideas. Em cultura primária de tireócitos, TGFβ1 prolonga a fase G1
do ciclo celular (Cirafici et al., 1992 apud Nicolussi et al., 2003). Por outro lado,
cultura de tireócitos transformados exibem resistência ao efeito inibitório de
TGFbeta1 sobre o crescimento (Coppa et al., 1997 apud Nicolussi et al., 2003) e
a alteração da responsividade da tireóide a esta citocina está envolvida no
desenvolvimento de tumores benignos e malignos e de bócio atóxico (Bidey et
al., 1999) . O TGFβ1 parece inibir a proliferação dos tireócitos por diferentes
mecanismos. Um dos mecanismos propostos é a diminuição das respostas ao
TSH mediadas por AMPc, observada em culturas primárias de tireócitos
humanos e caninos (Taton et al., 2000 apud Nicolussi et al., 2003). Além disso,
também foi demonstrada atenuação da fosforilação de MAPK induzida por IGF-1
(Mincione G et al., 2003). O efeito inibitório de TGFβ1 sobre a proliferação dos
tireócitos pode ainda estar relacionada à diminuição da expressão de ARNm do
receptor de TSH, observada em cultura de tireócitos porcinos (Delorme N et al.,
2002).
Além de regular o crescimento da tireóide, o TGFβ1 exerce também um
importante papel regulatório sobre a atividade da glândula, regulando a
expressão de genes que codificam proteínas essenciais para biossíntese
hormonal. O TGF β1 diminui a expressão de NIS (Kawaguchi et al., 1997 apud
Nicolussi et al., 2003), tireoglobulina (Colletta et al., 1989 apud Nicolussi et al.,
2003), TPO (Nicolussi et al., 2003) e receptor de TSH ( TSHR) (Franzen A et al.,
1999). A ativação transcricional de NIS, TPO e tireoglobulina é regulada, no
mínimo, pelos fatores de transcrição TTF-1 e Pax-8. Em células FRTL-5, foi
demonstrada a redução do ARNm de NIS, TPO, tireoglobulina e Pax-8 por
TGFβ1, não havendo alteração da expressão de TTF-1, o que sugere que os
efeitos de TGFβ1 sobre NIS, TPO e tireoglobulina podem ser diretos e/ou
mediados pela diminuição de Pax-8. A inibição da expressão desses genes foi
atribuída à formação do complexo Smad2/Smad4, que se transloca para o
núcleo (Nicolussi A. et al., 2003). Posteriormente, outro trabalho, em cultura de
células tireoideanas PC CL3, não só demonstrou diminuição do ARNm de Pax-8,
mas também a diminuição da expressão da proteína. Esse estudo mostrou ainda
que existe uma interação física entre Smad3, ativada por TGFβ1, e Pax-8. Esta
interação resulta em redução da atividade de ligação de Pax-8 ao ADN
(Costamagna et al., 2004). Além disso, foi demonstrado que TGFβ1 inibe a
atividade NADPH oxidase, a captação de iodeto e a organificação de iodo em
cultura de tireócitos porcinos (Delorme et al., 2002).
Sabendo que as interações entre as células podem regular a função
tireoideana (Bernier-Valentin et al., 2006), no presente trabalho visamos estudar
se há correlação entre o tamanho da tireóide e a captação tireóidea de iodeto.
Objetivamos investigar a hipótese de que o tamanho da tireóide possa
influenciar a atividade do NIS, regulando assim a biossíntese hormonal conforme
o número de células da tireóide, ou seja, investigar se a atividade do NIS varia
de acordo com o grau de bócio. Além disso, estudar o quanto esse mecanismo
de controle seria dependente da concentração sérica de TSH, pois
questionamos se a biossíntese hormonal em glândulas com diferentes tamanhos
de bócio seria diferente sob altas concentrações de TSH. Questionamos se, em
situações de aumento do tamanho da glândula, os fatores de interação entre as
células possam exercer um controle do NIS mais pronunciado do que o exercido
por TSH. Esta possível regulação do NIS representaria um mecanismo de
controle fisiológico importante e fino sobre a biossíntese hormonal,
principalmente em situações de bócio.
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
No presente estudo, pretendemos investigar a influência do tamanho da
glândula tireóide sobre sua resposta ao hormônio tireotrófico (TSH).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar in vivo o efeito de níveis elevados de TSH sobre os seguintes
parâmetros da função tireóidea de animais com bócio avançado ou moderado:
� Função do co-transportador Na+/I- através da medida de captação rápida de
radioiodeto
� Atividade da enzima tireoperoxidase
� Níveis séricos de T3 e T4
→ RELACIONAR OS RESULTADOS OBTIDOS COM A EXPRESSÃO DE
TGFβ-1 NA TIREÓIDE
METODOLOGIA
1- ANIMAIS
Utilizamos ratos da linhagem Wistar, isogênicos, machos adultos (2-3
meses), mantidos em sala com luz e temperatura controladas, sendo água e
ração fornecidas ad libitum. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo
com os padrões de cuidados com os animais estabelecidos pelo Comitê
Institucional de Ética.
2 - TRATAMENTO
Um estudo feito em nosso laboratório demonstrou que a administração de
MMI 0,03% por 5 dias já aumenta significativamente o TSH sérico em ratos.
Este aumento no TSH sérico não é, entretanto, suficiente para causar um
aumento tão pronunciado no peso da glândula como ocorre após a
administração de MMI 0,03% por 21 dias. (Grosovsky, 2007, figura 1-A e figura
1-B, respectivamente).
Figura 1. A - Concentrações séricas de TSH em função tempo de tratamento com
MMI (0,03%) em ratos. A partir do 5o dia de tratamento há aumento significativo
(p<0,05) do TSH sérico. B - Peso da tireóide em função tempo de tratamento com
MMI (0,03%) em ratos. (extraído de Grosovsky, 2007).
Assim, para análise da modulação do NIS induzida por TSH na ausência
de bócio pronunciado, os animais receberam MMI 0,03% na água de beber
durante apenas 5 dias. Os animais controle receberam água. Após este
período de tratamento, o MMI foi retirado a intervalos de 1, 2, 3, 4, e 5 dias
antes do sacrifício, constituindo os seguintes grupos experimentais:
� Controle
� MMI – administração de metimazol (MMI) por 5 dias antes do sacrifício.
Todos os demais grupos receberam MMI por 5 dias e, de acordo com o
período após a retirada do MMI, tivemos os seguintes grupos:
� 1 d s/ MMI – retirada do MMI 1 dia antes do sacrifício
A
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� 2 d s/ MMI - retirada do MMI 2 dias antes do sacrifício
� 3 d s/ MMI - retirada do MMI 3 dias antes do sacrifício
� 4 d s/ MMI - retirada do MMI 4 dias antes do sacrifício
� 5 d s/ MMI - retirada do MMI 5 dias antes do sacrifício
Paralelamente, analisamos a modulação do NIS induzida por TSH na
presença de bócio pronunciado. Para isso, os animais receberam MMI 0,03%
na água de beber durante 21 dias. Os animais controle receberam água. Após
este período de tratamento, o MMI foi retirado a intervalos idênticos aos grupos
descritos acima. Dessa forma, foram constituídos os mesmos grupos
experimentais, apenas com a alteração do tratamento com MMI 0,03% de 5
dias para 21 dias.
3 – MEDIDA DA CAPTAÇÃO TIREÓIDEA DE RADIOIODO
A captação tireóidea de radioiodo para avaliar a função do NIS foi realizada
conforme descrito anteriormente em nosso laboratório (Ferreira et al., 2005). Os
animais receberam dose traçadora de 125 I (3700 Bq /animal, i.p.) diluída em 100
µl de NaCl 0,9%, 15 minutos antes do sacrifício, para avaliar a atividade do NIS
A seguir, a radioatividade das tireóides foi determinada em cintilador de fase
sólida de radioatividade gama (CompuGama, LKB, WALLAK) e relacionada à
dose injetada. Os resultados foram expressos em % de radioiodo captado/mg
tireóide.
4 – SACRIFÍCIO
Ao término dos tratamentos, os animais foram sacrificados por
decapitação. As tireóides contendo iodo radioativo foram retiradas, pesadas e
levadas a um contador de radioatividade gama. Em seguida, as glândulas foram
armazenadas a -20° C em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,2 contendo iodeto de
potássio 1mM, para que posteriormente ao decaimento da radioatividade, a TPO
fosse extraída. Pelo menos os animais de 2 experimentos não receberam iodo
radioativo para que fossem medidas as concentrações séricas hormonais. O
sangue dos animais foi coletado e centrifugado a 3000 rpm, durante 15 min, a 4°
C para a obtenção do soro, que foi armazenado a -20° C para posteriores
dosagem hormonais.
5 - PREPARO DA TIREOPEROXIDASE
O preparo da TPO foi realizado como descrito anteriormente (Ferreira et
al., 2005). Cada glândula foi homogeneizada em 500µl de tampão Tris-HCl-KI
50 mM, pH 7,2, sobre o gelo, usando-se homogeneizador Ultra-turrax. O
homogenato foi centrifugado em ultra-centrífuga a 200.000 × g, a 4°C por 35
minutos. A fração solúvel obtida da centrifugação foi desprezada e o precipitado
foi ressuspenso com 500 µl de digitonina (Sigma) 1% em tampão Tris-HCl-KI 50
mM, pH 7,2. A mistura permaneceu em câmara fria a 4°C por 24-48 h, sendo
então novamente centrifugada sob as mesmas condições da centrifugação
anterior. O precipitado foi desprezado e o sobrenadante, contendo a enzima
TPO pseudo-solubilizada, foi armazenada a -200 C para posterior dosagem da
atividade da enzima.
6 - DOSAGEM DA ATIVIDADE TIREOPEROXIDASE PELO MÉTODO DE
OXIDAÇÃO DO IODETO
A atividade de oxidação do iodeto pela tireoperoxidase foi medida como
descrito anteriormente (Moura et al., 1989; Carvalho et al., 1994). Neste método,
a atividade TPO é medida pela formação de tri-iodeto in vitro. Em uma cubeta de
3 ml adiciona-se diferentes volumes de TPO (10 a 100µl), glicose 11 mM, KI 24
mM e o volume final é ajustado em 2 ml com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH
7,4. A reação é iniciada através da adição de 10 µl de glicose-oxidase (0,1%). A
absorbância decorrente da geração de tri-iodeto (I3-) é medida utilizando-se um
espectrofotômetro (Hitachi - U 3300) no comprimento de onda de 353 nm. O
cálculo da atividade é feito a partir da variação da absorbância por minuto, em
função do volume de amostra utilizado, através do cálculo da inclinação da reta
de regressão, como exemplificada na figura 2. A atividade específica é obtida
dividindo-se a atividade de oxidação do iodeto (∆ abs353 nm/min por ml) pela
concentração de proteína (g/ml) de cada amostra, dosada pelo método de
Bradford (1976).
Figura 2. Medida da atividade TPO de oxidação do iodeto. A atividade TPO será
avaliada através da equação da reta de regressão feita a partir dos pontos obtidos como
exemplificado acima: y = a + bx, onde b é o coeficiente de inclinação da reta e
corresponde ao ∆ abs353nm.min-1.µl-1 de TPO (Ferreira et al., 2005).
7 – RADIOIMUNOENSAIOS
As concentrações séricas de TSH, T3, e T4 foram determinadas por
radioimunoensaio (RIE) nas amostras de soro obtidas dos animais no dia do
sacrifício. Todos os RIEs foram feitos em duplicata e a detecção da
radioatividade foi realizada em cintilador de fase sólida de radioatividade gama
(CompuGama, LKB, WALLAK).
RIE de TSH
As dosagens de TSH foram feitas por RIE específico, através de um kit
fornecido pelo National Institute of Diabetes and kidney Diseases (NIDDK–
302010000.0
0.1
0.2
µl TPO
ab
sorb
ân
cia
3
53
nm
/ m
in∆
Bethesda, EUA) e expressos em termos da preparação de referência 2 (RP – 2).
Este kit é composto por TSH murino purificado para a preparação das amostras
utilizadas na curva padrão (0,18 – 11,46 ng/ml), TSH murino purificado para ser
iodado e anticorpo de coelho anti -TSH murino (10 Ac).
A iodação da molécula do TSH com 125I foi feita em nosso laboratório,
pelo método da cloramina T e a molécula marcada foi purificada em uma coluna
(Biogel – P60 fino da Bio-rad, EUA) conforme previamente descrito (Ortiga,
1992). O RIE foi realizado pelo método do 20 anticorpo, com adição de 5 % de
polietilenoglicol (Ortiga, 1992). Os resultados foram expressos em ng/ml.
RIE de T3, T4
As concentrações séricas de T3 e T4 foram determinadas através de Kit
comercial para RIE de T3 (DLS – 3100 Active, TX, EUA) e T4 (DLS – 3200,
Active, TX EUA) totais, contendo anticorpos específicos aderidos à parede dos
tubos de polipropileno e com T3 e T4 ligados ao radiotraçador (125I) com atividade
específica de 5 µCi (185 KBq). As curvas padrão foram preparadas com T3 e T4
diluídos em soro de rato livre de iodotironinas nas concentrações de 25 a 1000
ng/dl e 1 a 50 µg/dl, respectivamente. Todo o procedimento foi realizado
seguindo-se as recomendações do fornecedor.
A sensibilidade do método para dosagem de T3 foi de 4,3 ng/dL. O
coeficiente de variação intra e interensaio foi sempre inferior a 10%.
Para dosagem de T4, a sensibilidade do método foi de 0,4µg/dL. Os
coeficientes de variação intra-ensaio e interensaio foram aproximadamente 5% e
7% respectivamente.
A contagem da radioatividade dos RIEs de T3 e T4 foi realizada em um
cintilador de fase sólida de radioatividade gama (CompuGama, LKB, WALLAK).
Os resultados foram expressos em ng/dL para o T3 e em µg/dL para o T4.
8 – ANÁLISES HISTOMORFOMÉTRICAS
Preparação dos tecidos
Após a sua excisão, as tireóides foram fixadas com solução aquosa de
formol a 10% por até 24h. Em seguida as glândulas foram submetidas a um
processo de desidratação, que se consistiu das imersões seqüenciais em
soluções de etanol a 70%, 95% e 99,5% em xilol. Após a desidratação,
conjuntos de 2 glândulas foram incluídas em blocos de parafina pura fundida a
60 0C. Cada bloco foi individualmente processado, sendo submetido a cortes
produzindo seções com espessura de 7µm feitos em micrótomos. Cada seção
foi recolhida em lâmina para microscopia.
Imunohistoquímica e análise do perímetro do colóide
A parafina de cada lâmina foi removida por subseqüentes tratamentos: 2
vezes com xilol por 5 minutos, 2 vezes com etanol 99,5% por 2 minutos, 2 vezes
com etanol 95% por 2 minutos, 2 vezes com etanol 70%, 2 vezes com água
destilada e 3 vezes com tampão citrato de sódio 0,1M, pH 6,0 por 5 minutos. As
lâminas foram mergulhadas em tampão citrato de sódio 0,1M, pH 6,0 e
submetidas por 3 vezes de 3 minutos ao microondas. A atividade peroxidase
endógena foi bloqueada por excesso de H2O2 10% por 15 minutos. A ligação
inespecífica foi bloqueada com leite Glória 5% por 30 minutos. As lâminas
foram incubadas durante 24 h, a 40 C, em caixas úmidas com o anticorpo contra
TGFβ-1 a 25 µg/ml (R&D Systems , específico para TGFβ-1 de ratos,
monoclonal). Essa incubação foi seguida por outra de 45 minutos a temperatura
ambiente com o segundo anticorpo (biotinilado, anti-rat DAKO). Foi realizada a
incubação com o terceiro anticorpo streptavidina-peroxidase (DAKO). A reação
foi revelada usando como cromógeno a diaminobenzidina (DAB) com H2O2 0,6
% por 15 minutos e então contra-coradas com hematoxilina por 30 segundos. O
mesmo material foi utilizado para análise dos perímetros dos folículos tireóideos.
Para essa análise, foi utilizado um programa específico (Image Pro), que mede
o comprimento da linha desenhada delimitando o colóide (Imagem 1). Tanto
para imunohistoquímica quanto para a análise dos perímetros dos colóides
foram analisados pelo menos 10 campos de 3 animais por grupo.
Imagem 1: Exemplo da delimitação do colóide para medida do perímetro do mesmo.
9 - ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média, tendo
sido realizados no mínimo 2 experimentos com no mínimo 5 animais em cada
grupo. Para a análise estatística dos resultados de atividade tireoperoxidase de
oxidação de iodeto e captação de radioiodo, utilizamos a análise de variância
não paramética, Kruskal-Wallis, seguida de teste de comparação múltipla de
Dunn. Os dados de TSH sérico sofreram transformada logarítmica e em seguida
foram analisados por ANOVA univariada, seguida de teste de comparação
múltipla de Bonferroni. Os resultados obtidos dos RIEs de T3, T4 totais, pesos
das glândulas e perímetros dos colóides foram analisados por ANOVA
univariada, seguida de teste de comparação múltipla de Bonferroni. As análises
histomorfométricas foram feitas a partir de pelo menos 10 campos, de 2 lâminas,
de pelo menos 3 animais por grupo.As diferenças foram consideradas
significativas quando p<0,05. Em gráficos, quando há diferenças significativas os
grupos recebem símbolos que são detalhados nas legendas.
RESULTADOS
1 – Concentração sérica de TSH
Após 5 dias de administração de MMI, a concentração sérica de TSH
aumentou significativamente [p<0,05, figura 3 A (Controle = 0,76 ± 0,11; MMI =
4,6 ± 1,85 ng/ml)]. Após os intervalos de 1 dia e 2 dias da retirada do MMI o TSH
continuou elevado significativamente e a partir de 3 dias sem MMI o TSH não
diferiu do controle [figura 3 A (1d s/ MMI = 3,94 ± 1,77; 2d s/ MMI = 2,01 ± 0,58;
3d s/ MMI = 1,04 ± 0,14; 4d s/ MMI = 1,33 ± 0,20; 5d s/ MMI = 1,32 ± 0,40
ng/ml)]. Após 21 dias de administração de MMI, a concentração sérica de TSH
também aumentou significativamente [p < 0,05, figura 3 B (Controle = 1,36 ±
0,89; MMI 21d = 16,92 ± 2,35 ng/ml)], sendo este aumento de muito maior
magnitude em comparação aos 5 dias de administração de MMI (figura 3 B).
Além disso, nesses animais, a normalização do TSH foi mais tardia, só
ocorrendo a partir de 4 dias da retirada do MMI [figura 3 B (1d s/ MMI = 14,20 ±
2,51; 2d s/ MMI = 5,739 ± 2,46; 3d s/ MMI = 6,16 ± 2,08; 4d s/ MMI = 1 ,67 ±
0,89; 5d s/ MMI = 1,31 ± 0,26 ng/ml)].
Figura 3: Concentração sérica de TSH em ratos controle e em ratos que receberam MMI 0,03% por 5 dias (A) ou 21 dias (B) antes da sua retirada ou não a intervalos de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias antes do sacrifício. A: Controle n = 10; MMI5d n= 10, 1d s/ MMI n = 10; 2d s/ MMI n = 10; 3d s/ MMI n = 8; 4d s/ MMI n = 10 e 5d s/ MMI n = 10. # p < 0,05 vs controle; * vs controle 2d, 3d , 4d e 5d s/ MMI. B: Controle n = 9; MMI 21d n= 9, 1d s/ MMI n = 8; 2d s/ MMI n = 9; 3d s/ MMI n = 9; 4d s/ MMI n = 6 e 5d s/ MMI n = 7. # p < 0,05 vs demais grupos; * vs Controle, MMI, 1d, 4d e 5d s/ MMI
2 – PESO DA TIREÓIDE
Ambos os tempos de tratamento de MMI aumentaram significativamente
os pesos das tireóides dos animais, sendo a magnitude deste aumento muito
maior nos animais que tomaram MMI durante mais tempo [figura 4A , (Controle =
12,91 ± 5,91; MMI 5d = 20,26 ± 10,63 mg) e figura 4B (Controle = 16,33 ± 2,12;
MMI 21d = 41,86 ± 9,30 mg)]. Nos animais que tomaram MMI durante 5 dias ,
após 4 dias da retirada da droga houve normalização do peso da tireóide [figura
4A (1d s/ MMI = 20,92 ± 10,44; 2d s/ MMI = 22,47 ± 10,37; 3d s/ MMI = 19,32 ±
8,77; 4d s/ MMI = 15,98 ± 7,94; 5d s/ MMI = 14,71± 7,46 mg)]. Já nos
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Figura 4: Pesos das tireóides (em mg) em ratos controle e ratos que receberam MMI 0,03% por 5 dias (A) ou 21 dias (B) antes da sua retirada ou não a intervalos de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias antes do sacrifício. A: Controle n = 20; MMI 5d n= 22, 1 d s/ MMI n= 22; 2 d s/ MMI n = 24; 3 d s/ MMI n = 22; 4 d s/ MMI n = 19 e 5 d s/ MMI n = 17; # p < 0,05 vs controle; * vs controle e 5d s/ MMI; ∆ vs controle ,4d e 5d s/ MMI. B: Controle n = 9; MMI 21d n= 7, 1 d s/ MMI n= 7; 2 d s/ MMI n = 10; 3 d s/ MMI n = 9; 4 d s/ MMI n = 4 e 5 d s/ MMI n = 5 # p < 0,05 vs controle; * vs controle e 5d s/ MMI. animais que tomaram MMI durante 21 dias, o peso da tireóide permaneceu
elevado, não se normalizando após a retirada do MMI [figura 4B (1d s/ MMI =
34,64 ± 9,49; 2d s/ MMI = 34,65 ± 10,46; 3d s/ MMI = 35,33 ± 11,57; 4d s/ MMI
= 37,25 ± 6,60; 5d s/ MMI = 31,00 ± 2,91 mg)].
3 – Atividade tireoperoxidase
A atividade tireoperoxidase aumentou significativamente, após a
administração de MMI por 5 dias. Já a partir de 1 dia de retirada do MMI, houve
queda da atividade tireoperoxidase para valores semelhantes aos encontrados
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Figura 5: Atividade específica tireoperoxidase de oxidação do iodeto em ratos controle e ratos que receberam MMI 0,03% por 5 dias ou 21 dias antes da sua retirada a intervalos de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias antes do sacrifício. A: Controle n = 16; MMI n = 16, 1d s/ MM n = 7; 2d s/ MMI n = 7; 3d s/ MMI n = 7; 4d s/ MMI n = 7 e 5d s/ MMI n = 6. * p < 0,05 vs Controle, 1d s/ MMI, 3d s/ MMI, 4d s/ MMI e 5d s/ MMI. B: Controle n = 7; MMI n = 7, 1d s/ MM n = 8; 2d s/ MMI n = 8; e 5d s/ MMI n = 8.
Figura 6: Atividade tireoperoxidase de oxidação do iodeto não correlacionada à concentração de proteína em ratos controle e ratos que receberam MMI 0,03% por 5 dias ou 21 dias antes da sua retirada a intervalos de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias antes do sacrifício. A: Controle n = 10; MMI n = 10, 1d s/ MMI n = 7; 2d s/ MMI n = 7; 3d s/ MMI n = 7; 4d s/ MMI n = 7 e 5d s/ MMI n = 6 # p < 0,05 vs Controle, 1d s/ MMI, 3d s/ MMI, 4d s/ MMI e 5d s/ MMI; * vs Controle, 4d s/ MMI, 5d s/ MMI. B: Controle n = 7; MMI n = 7, 1d s/ MMI n = 8; 2d s/ MMI n = 8; e 5d s/ MMI n = 8. # vs Controle, 3d s/ MMI.
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no grupo controle (figura 5A), apesar do TSH ainda estar elevado nos grupos 1d
e 2d s/ MMI (figura 3A). Com relação ao grupo que recebeu MMI durante 21
dias, não houve diferenças significativas entre os grupos (figura 5B). Entretanto,
diferenças significativas podem ter sido mascaradas pelo grande aumento da
concentração de proteínas nas glândulas de animais que receberam MMI, além
da própria variabilidade inerente ao método de dosagem da atividade TPO.
Assim, decidimos representar também a atividade da enzima sem relacionar
com a concentração de proteínas, representando somente o coeficiente de
inclinação da reta obtida a partir do gráfico da atividade de formação de triiodeto
em função do tempo por ml de amostra (figuras 6A e 6B) Dessa maneira,
pudemos observar aumento da atividade TPO não específica no grupo 2d s/
MMI dos animais que receberam MMI por 5 dias (figura 6A) e nos MMI e 1d s/
MMI dos animais que receberam MMI por 21 dias (figura 6B).
4 – Captação tireóidea de radioiodo
Após 5 dias de tratamento com MMI, os animais apresentaram aumento
significativo da captação tireóidea de radioiodo, que permaneceu elevada até 2
dias da retirada do MMI (figura 7A). A partir de 3 dias da retirada de MMI a
captação diminuiu, atingindo os níveis do grupo controle (figura 7A). Este
resultado está em conformidade com a queda de TSH que ocorreu também a
partir de 3 dias da retirada de MMI nestes animais (figura 3A). Nos animais que
receberam MMI durante 21 dias também houve aumento significativo da
captação tireóidea de radioiodo, o qual foi mais pronunciado do que nos
animais que receberam MMI por 5 dias. Mas após 1 dia da retirada de MMI a
captação diminui para valores semelhantes aos do grupo controle (figura 7B),
apesar do TSH ainda estar muito elevado nestes animais (figura 3B). Após 2
dias da retirada de MMI a captação voltou a aumentar, tornando-se
significativamente maior do que no grupo controle, permanecendo elevada
após 3 dias da retirada de MMI e somente normalizando-se a partir de 4 dias
sem MMI. Os resultados obtidos dos grupos de 2d- e 3 d s/ MMI estão em
conformidade com os valores de TSH encontrados nestes animais, que foram
mais altos do que no grupo controle (figura 3B).
Figura 7: Captação de radioiodeto 15 min após sua administração em ratos controle e ratos que receberam MMI 0,03% por 5 dias (A) ou 21 dias (B) antes da sua retirada ou não a intervalos de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias antes do sacrifício. A: Controle n = 17; MMI 5d n= 18, 1d s/ MMI n= 19; 2d s/ MMI n = 21; 3d s/ MMI n = 19; 4d s/ MMI n = 16 e 5d s/ MMI n = 15. # p < 0,05 vs os demais gupos. B: Controle n = 8; MMI 21d n= 7, 1d s/ MMI n= 7; 2d s/ MMI n = 10; 3d s/ MMI n = 9; 4d s/ MMI n = 4 e 5d s/ MMI n = 5. # p < 0,05 vs controle; * vs controle, 1d s/ MMI, 4d s/ MMI e 5d s/ MMI; ∆ vs controle, 1d s/ MMI e 5d s/ MMI.
5 – Concentrações séricas de T4 e T3 totais
B
Con
trol
e
MM
I 5d
1d s
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I
2d s
/ MM
I
3d s
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I
4d s
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I
5d s
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0.1
0.2
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Con
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MM
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1d s
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I
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/ MM
I
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/ MM
I
4d s
/ MM
I
5d s
/ MM
I
0.0
0.1
0.2
*
% *
I/ m
g t
ireó
ide
####
∆∆
A
Embora o tratamento com MMI durante 5 dias tenha sido capaz de
aumentar significativamente o TSH do animais (figura 3A) , a diminuição do T4
total sérico não foi significativa. Após 1 dia da retirada do MMI, os níveis de T4
total sérico continuaram baixos, embora não tenham alcançado significância em
relação ao controle (figura 8 A).
Figura 8: Concentração sérica de T4 total em relação em relação ao grupo controle em ratos que receberam MMI 0,03% por 5 dias (A) ou 21 dias (B) antes da sua retirada ou não a intervalos de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias antes do sacrifício. A: Controle n = 9; MMI 5d n= 11, 1d s/ MMI n= 13; 2d s/ MMI n = 13; 3d s/ MMI n = 11; 4d s/ MMI n = 10 e 5d s/ MMI n = 11* p < 0,05 vs MMI 5d e 1ds/ MMI; # vs controle, MMI 5d e 1ds/ MMI; ∆ vs controle, 1d , 2d e 4d s/ MMI. B: Controle n = 9; MMI 21d n= 9, 1d s/ MMI n= 10; 2d s/ MMI n = 10; 3d s/ MMI n = 10; 4d s/ MMI n = 7 e 5d s/ MMI n = 8. # p < 0,05 vs controle; * vs demais grupos; ∆ vs 3d s/ MMI, 4d s/ MMI e 5d s/ MMI.
Com a retirada do MMI, e a conseqüente restauração da síntese de T4,
observou-se aumento do T4 sérico em relação ao grupo controle a partir de 2
dias sem MMI, sendo este aumento significativo somente nos grupos de 3 dias e
5 dias sem MMI (figura 8 A).
A B
Con
trol
e
MM
I 5d
1d s
/MM
I
2d s
/MM
I
3d s
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I
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I
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I
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I
0
T 4to
tal s
éric
oem
rela
ção
ao
co
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ole
*
∆
*
#### ####
*
1
2
3
Já a administração de MMI durante 21 dias provocou diminuição
significativa do T4 sérico, permanecendo significativamente menor do que o
grupo controle após 1 dia da retirada do MMI (figura 8B). Após 2 dias da retirada
do MMI, observou-se restauração da síntese de T4 e este aumento tornou-se
significativo em relação ao grupo controle a partir de 3 dias sem MMI (figura 8B).
A administração de MMI durante 5 dias diminuiu significativamente a
concentração sérica de T3 (figura 9A), apesar de ter reduzido apenas não
significativamente a concentração de T4. Após 1 dia da retirada de MMI, o T3
sérico continuou significativamente mais baixo que o grupo controle e só foi
normalizado a partir de 2 dias da retirada de MMI (figura 9A). Após 4 dias e 5
dias da retirada de MMI os níveis de T3 começam a diminuir, tornando-se mais
baixos que os do grupo controle (figura 9A), apesar dos níveis de T4
continuarem mais altos com relação ao grupo controle (figura 8A).
Nos animais que receberam MMI durante 21 dias, houve diminuição do T3
sérico (figura 9B), assim como houve diminuição do T4 (figura 8B). A partir de 1
dia da retirada de MMI, já houve normalização do T3 e apenas no grupo 2 dias
sem MMI houve aumento significativo do T3 com relação ao grupo controle
(figura 9B).
Figura 9: Concentração sérica de T3 total em ratos controle e ratos que receberam MMI 0,03% por 5 dias (A) ou 21 dias (B) antes da sua retirada ou não a intervalos de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias antes do sacrifício. A: Controle n = 13; MMI 5d n= 10, 1d s/ MMI n= 12; 2d s/ MMI n = 12; 3d s/ MMI n = 12; 4d s/ MMI n = 11 e 5d s/ MMI n = 8. # p < 0,05 vs controle, 2d s/ MMI. B: Controle n = 9; MMI 21d n= 9, 1d s/ MMI n= 10; 2d s/ MMI n = 10; 3d s/ MMI n = 10; 4d s/ MMI n = 7 e 5d s/ MMI n = 8. # p < 0,05 vs os demais grupos; * vs controle, 2d s/ MMI e 3d s/ MMI.
6 – Perímetro do colóide
O tratamento de MMI por 5 dias diminuiu significativamente o tamanho do
colóide, que retornou aos valores do grupo controle após 1 dia da retirada de
MMI (figura 10 A). Com 3 dias e 4 dias da retirada de MMI o tamanho do colóide
é maior do que no grupo controle e com 5 dias de retirada retorna aos valores
normais (figura 10 A). Após 21 dias de tratamento com MMI também
observamos diminuição significativa do perímetro do colóide, que se normaliza
após 1 dia da retirada de MMI e aumenta significativamente com 4 dias de
retirada. Após 5 dias da retirada de MMI o perímetro do colóide retorna aos
valores do grupo controle (figura 10 B).
A B T
3to
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l)T
3to
tal s
éric
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4d s
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100
200
T3
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/dl)
T3
tota
l sér
ico
(ng
/dl) ####
*
Figura 10: Perímetro do colóide em cortes histológicos de tireóides de ratos controle e ratos que receberam MMI 0,03% por 5 dias (A) ou 21 dias (B) antes da sua retirada ou não a intervalos de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias antes do sacrifício. A: # p < 0,05 vs demais grupos; * vs controle, 1d, 3d e 4s/ MMI. B: * p < 0,05 vs controle, 1d, 4d e 5d s/ MMI; # vs controle, MMI 21d, 2d e 3d s/ MMI. 7 – Expressão de TGFββββ-1
A imunomarcação para TGFβ-1 foi fraca em tireóides de animais controle
(figura 11 A) e de animais que receberam MMI por 5 dias (figura 11 B). Após 1
dia da retirada de MMI observamos marcação intensa no citoplasma das
tireóides desse grupo (figura 11 C). Após 2 dias da retirada de MMI a marcação
foi fraca (figura 11 D) e torna a ser mais intensa no terceiro dia da retirada de
MMI (figura 11 E); foi negativa no quarto dia da retirada de MMI e positiva no
quinto dia da retirada da droga (figura 11 G). Após 21 dias de tratamento com
MMI, a imunomarcação para TGFβ-1 foi negativa (figura 12 A) e se torna
positiva com 2, 4 e 5 dias da retirada de MMI (figura 12 C, E e F).
Con
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1d s
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I
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3d s
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*
#
B
#
A
Figura 11: Cortes histológicos de glândulas tireóides submetidas à técnica da imunoperoxidase, utilizando anti-TGFβ-1 como anticorpo primário. Os animais receberam MMI 0,03% por 5 dias antes da sua retirada ou não a intervalos de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias antes do sacrifício. As setas indicam as regiões positivas para a presença de TGFβ-1. A barra de calibração corresponde a 10µm de comprimento, em aumento de 40x, resolução 1280x1024.
1d s/ MMI1d s/ MMI
A
B C
D E
F G
ControleControle
MMI 5dMMI 5d
2d s/ MMI2d s/ MMI 3d s/ MMI3d s/ MMI
4d s/ MMI4d s/ MMI 5d s/ MMI5d s/ MMI
Figura 12: Cortes histológicos de glândulas tireóides submetidas à técnica da imunoperoxidase, utilizando anti-TGFβ-1 como anticorpo primário. Os animais receberam MMI 0,03% por 21 dias antes da sua retirada ou não a intervalos de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias antes do sacrifício. As setas indicam as regiões positivas para a presença de TGFβ-1. A barra de calibração corresponde a 10µm de comprimento, em aumento de 40x, resolução 1280x1024.
5d s/ MMI
4d s/ MMI
A B
MMI 21d 1d s/ MMI
2d s/ MMI
3d s/ MMI
C D
E F
4d s/MMI
DISCUSSÃO
Em humanos, assim como em ratos, o tamanho do bócio é dependente
do tempo e da magnitude de aumento do TSH sob os quais a tireóide
permanece submetida. Sendo assim, existe uma grande variedade de tamanhos
de bócio encontrados na população com disfunções tireoideanas, o que justifica
a necessidade do aprofundamento sobre o conhecimento das possíveis
diferenças da função tireóidea, dependendo do tamanho da tireóide. Além disso,
devido à variabilidade do conteúdo de iodo nas dietas encontradas em diferentes
locais do país e do mundo, é importante conhecer a fisiologia da tireóide no
momento da normalização do conteúdo de iodo na dieta após diferentes
intervalos de carência de iodo. No presente estudo, utilizamos o tratamento com
MMI por 5 dias para estudarmos a resposta tireóidea à normalização do iodo em
glândulas com indução aguda da proliferação e submetidas à carência de iodo
por curto tempo. Para estudarmos a resposta tireóidea à normalização do iodo
em glândulas com bócio a longo prazo e submetidas à carência de iodo
cronicamente, utilizamos o tratamento com MMI por 21 dias.
Neste estudo, observamos que o tratamento de ratos por 5 dias com MMI
não causou aumento tão pronunciado do peso da tireóide como ocorre no
tratamento com a mesma dose desta droga por 21 dias. Esse resultado era
esperado, pois a elevação de TSH nos animais MMI 21d foi de muito maior
magnitude e mais longa do que nos animais MMI 5d, o que resulta em maior
estímulo trófico da tireóide por TSH nos animais MMI 21d.
A diminuição da biossíntese de T4 também foi menos pronunciada nos
animais MMI 5d, provavelmente devido ao fato da TPO ter permanecido
bloqueada por MMI durante menos tempo. Sabe-se que a tireóide possui
hormônios tireóideos armazenados em seu colóide, o que explica o decréscimo
gradativo dos níveis séricos destes hormônios, quando ocorre o bloqueio da
biossíntese hormonal pelo MMI (Larsen et al., 2003). Tanto nos animais que
receberam MMI por 5 dias quanto nos que receberam por 21 dias, houve
recuperação da biossíntese de T4 e T3 a partir dos 2 dias da retirada do MMI e a
partir dos 3 dias da retirada de MMI os níveis séricos de T4 foram ainda mais
altos do que no grupo controle em ambos os modelos. Como nós observamos,
os níveis de TSH aumentaram nos animais que receberam MMI por 5 ou 21 dias
e somente normalizaram, após a retirada de MMI, a partir do terceiro dia e a
partir do quarto dia, respectivamente. A elevação de TSH resulta em estímulo da
expressão das proteínas envolvidas na biossíntese hormonal. Quando o MMI é
retirado, ocorre o desbloqueio da TPO, o que, aliado ao aumento da expressão
das proteínas responsáveis pela biossíntese hormonal provocado pelo aumento
de TSH, resulta em aumento da concentração sérica de T4. Mesmo após a
normalização de TSH tanto no grupo MMI 5d quanto no grupo MMI 21d, o T4
continuou elevado. Isso pode ter ocorrido devido não mais ao estímulo da
biossíntese, mas devido ao fato da auto-regulação pelo iodo intra-glandular não
ser tão eficiente em controlar a secreção de T4.
Já com relação aos níveis séricos de T3, o tratamento com MMI por 5 dias
reduziu o T3 sérico, que permaneceu abaixo dos níveis do grupo controle após 1
dia da retirada de MMI. Já a partir de 2 dias de retirada, houve normalização e
novamente redução do T3 a partir de 4 dias da retirada de MMI. Nos animais que
receberam MMI por 21 dias, o tratamento causou redução do T3 sérico, que
rapidamente aumentou atingindo os níveis do grupo controle a partir de 1 dia da
retirada de MMI. Entretanto, no grupo após 2 dias da retirada de MMI, a
concentração sérica de T3 ultrapassou os níveis do grupo controle, sendo mais
alta do que nos demais grupos.
Assim, comparando os resultados de T4 e T3 séricos em ambos os modelos,
verificamos que, a partir da normalização de TSH, os níveis de T3 foram normais
ou reduzidos apesar de os níveis de T4 estarem elevados. Isso sugere que, em
ratos, quando as variações hormonais são agudas, a concentração sérica de
TSH se correlaciona melhor aos níveis de T3 do que aos níveis de T4, ao
contrário do que ocorre em humanos (Larsen et al., 2003). Além disso, parece
haver diferenças quanto às respostas dos níveis de T3 entre os modelos
estudados: após a diminuição de T3, causada pelos tratamentos com MMI, o T3
normaliza-se com 1 dia da retirada de MMI nos animais que receberam a droga
por 21 dias, enquanto a normalização nos animais que a receberam por 5 dias
só ocorre no grupo 2 dias da retirada da droga; nos animais que receberam MMI
por 21 dias, ocorre aumento do T3 no grupo 2 dias da retirada de MMI, mas a
normalização da concentração sérica desse hormônio ocorre a partir de 3 dias
da retirada de MMI. Assim, animais com bócio a longo prazo e submetidos por
mais tempo à carência de iodo intra-glandular, tendem a apresentar mecanismos
de normalização de T3 muito eficientes, pois a normalização dos níveis séricos
desse hormônio tendem a ocorrer mais rápido tanto após a sua queda,
causando inclusive aumento significativo desse hormônio.
Sabendo que, em ratos, aproximadamente 50% do T3 sérico é proveniente da
biossíntese tireóidea e a outra parte da desiodação periférica de T4 (Bianco et
al., 2002), nossos resultados sugerem que a diminuição de T3 apesar dos altos
níveis de T4 possa ser resultado de uma diminuição da desiodação tireoideana
e/ ou periférica de T4. Perifericamente, o aumento dos níveis séricos de T4
resulta em diminuição da atividade da enzima desiodase tipo 2, que produz T3 a
partir de T4 (Larsen et al., 2003). Assim, já que nos grupos a partir do terceiro dia
da retirada de MMI o T4 encontrava-se alto, poderíamos encontrar níveis baixos
de T3, pois a atividade da enzima responsável pela geração do T3 proveniente de
T4 perifericamente deve estar diminuída. Recentemente, observou-se que o TGF
- β estimula a expressão da desiodase tipo 3 em fibroblastos humanos não
transformados retirados de pulmão (Huang et al., 2005). Essa enzima é
responsável pela inativação de T4 e de T3 perifericamente. Além disso, foi
demonstrado que esta enzima também é regulada por outros fatores de
crescimento, como o fator de crescimento da epiderme (EGF) e o fator de
crescimento de fibroblastos (FGF) (Sorimachi et al., 1977 apud Huang et al.,
2005). A enzima desiodase tipo 3 não é expressa na tireóide, mas assim como
fatores de crescimento podem regular a desiodação perifericamente, talvez
possam fazê-lo na tireóide, regulando a atividade da desiodase tipo1 na
glândula. Talvez, assim como fatores de crescimento estão envolvidos na
bociogênese e em diferentes etapas da biossíntese hormonal, poderiam também
regular a desiodação intra-tireóidea dos hormônios tireóideos, o que poderia
contribuir para explicar os resultados encontrados com relação aos níveis de T3,
caso a expressão de algum desses fatores esteja alterada nos nossos modelos.
Entretanto, experimentos futuros de dosagem da atividade das desiodases
tireóideas e periféricas são necessários para ajudar a explicar esses dados.
A captação tireóidea de raidioiodo aumentou significativamente aos 5 dias
de administração de MMI assim como o TSH sérico e, após a retirada do MMI, a
captação só retornou a valores semelhantes aos do controle a partir do terceiro
dia, quando o TSH normaliza. Nesse caso, a regulação do NIS parece ser
paralela à variação da concentração de TSH, como descrito nos modelos de
cultura celular. Com relação aos animais que receberam MMI por 21 dias,
observamos também aumento significativo da captação tireóidea de radioiodo no
grupo que recebeu MMI até o dia do sacrifício e diminuição da captação já a
partir do primeiro dia da retirada de MMI. A partir de 2 dias da retirada de MMI a
diminuição da captação foi menos acentuada do que no grupo de apenas 1 dia
sem MMI e diminui gradativamente até atingir valores semelhantes aos do grupo
controle a partir do quarto dia de retirada do MMI. Nesse caso, a regulação do
NIS não foi paralela a de TSH, pois esse hormônio permaneceu elevado em
todos os grupos experimentais, só se normalizando a partir do quarto dia da
retirada de MMI, enquanto a captação de radioiodo foi menor do que no grupo
MMI 21d já a partir do primeiro dia após a retirada do MMI. Assim, observamos
uma grande diferença quanto a velocidade de normalização da captação entre
os animais que receberam MMI durante 21 dias e os que receberam durante 5
dias, mas essa diferença não parece ser em função do TSH sérico, o que sugere
o envolvimento de outros fatores na regulação da função do NIS nesse animais.
Além do TSH sérico, outros fatores regulam a captação tireóidea de
iodeto e as demais etapas da biossíntese de hormônios tireoideanos. Entre
estes fatores, está principalmente o iodo intra-glandular organificado, que em
condições de aumento, resulta em diminuição dos níveis séricos de T4 e T3
(Wolff e Chaikoff, 1948). O aumento intra-glandular de iodo diminui a função do
NIS, da NADPH oxidase, da TPO, a endocitose de tireoglobulina e o aumento de
AMPc intracelular induzido por TSH (Heldin et al., 1985), reduzindo
conseqüentemente tanto a transcrição do RNAm do NIS quanto a sua exposição
na membrana basolateral dos tireócitos (Riedel et al., 2001). Acredita-se que
esses efeitos supressores do iodo sobre a função tireóidea sejam mediados por
um composto orgânico iodado (Taurog, 2000) dependente da enzima
tireoperoxidase (TPO). A atividade TPO específica tendeu fortemente ao
aumento no grupo que recebeu MMI por 5 dias até o dia do sacrifício, devido ao
aumento de TSH, e permaneceu normal em todos os grupos que tiveram o MMI
retirado, apesar do TSH encontrar-se significativamente elevado até o segundo
dia de retirada do MMI. Após a retirada do MMI, ocorre o desbloqueio da TPO,
que volta a organificar iodo. Nesta condição, a tireóide possui grande número de
moléculas de TPO, pois sua síntese foi estimulada pelo aumento de TSH sérico
ocorrido durante o tratamento com MMI. Sendo assim, a organificação de iodo
deve estar aumentada e também o conteúdo de iodo organificado intra-
glandular, o que poderia contribuir para a rápida diminuição da atividade TPO
observada após a retirada de MMI. Essa mesma rapidez de queda da atividade
não foi observada com relação ao NIS, entretanto. Isso provavelmente se
correlaciona ao fato de que a meia-vida do NIS é de aproximadamente 5 dias
(Riedel et al., 2001) e da TPO de apenas 11 horas (Niccoli- Sire, 2001).
Conforme demonstrado anteriormente por nosso grupo, com relação aos
animais que receberam MMI por 21dias, a atividade específica da TPO não se
alterou em nenhum dos grupos experimentais realizados. Entretanto, devido à
intensa hiperplasia e hipertrofia da tireóide causada pelo tratamento com MMI
durante 21 dias, a quantidade de proteína deve ter aumentado muito e isso pode
ter mascarado a atividade específica da TPO, já que esta atividade é obtida pela
razão entre a velocidade de formação de triiodeto in vitro e a concentração total
de proteína na glândula. Assim, a atividade TPO não correlacionada com a
concentração de proteína aumentou significativamente no grupo MMI 21d,
permaneceu aumentada após 1 dia da retirada de MMI e normalizou-se a partir
de 2 dias da retirada de MMI. Como nos animais que receberam MMI durante 21
dias o TSH encontrava-se elevado nos grupos 1 e 2 dias sem MMI, também
levantamos a hipótese de que tenha aumentado o conteúdo de iodo organificado
intra-glandular e poderia contribuir para explicar a normalização da TPO no
grupo 2 dias sem MMI mesmo com TSH elevado. Já com relação ao grupo 1 dia
sem MMI, a TPO permaneceu elevada, apesar do provável desbloqueio da
organificação do iodo e da grande quantidade de moléculas de TPO. Isso sugere
que, em condições de TSH sérico tão elevado uma possível diminuição da
atividade TPO pelo aumento de iodo organificado intra-glandular seja
sobrepujada pelo TSH. Como o aumento da captação de radioiodo observado
nos animais que receberam MMI por 5 dias até o sacrifício foi menos
pronunciada do que nos animais tratados com MMI por 21 dias, é possível que o
mesmo tenha ocorrido com relação ao conteúdo intra-tireóideo de iodo
organificado. Nestes estudos, os animais não receberam sobrecarga de iodo. O
aumento sugerido do conteúdo de iodo organificado na glândula deve-se apenas
à demonstração do aumento da captação de iodeto e da atividade não
específica da TPO. Entretanto, a magnitude do aumento do conteúdo de iodo
organificado nas tireóides destes animais deverá ser medida em experimentos
posteriores.
Após o tratamento com MMI até o dia do sacrifício, em ambos os
modelos, observamos diminuição do colóide. Esses resultados eram esperados
já que o TSH aumenta a endocitose de tireoglobulina (Dunn JT & Dunn AD,
2000), diminuindo o tamanho do colóide. Após a retirada de MMI e,
conseqüentemente, após a normalização do conteúdo intra-glandular de iodo, a
normalização do tamanho do colóide ocorre no primeiro dia, embora a
concentração sérica de TSH estivesse ainda aumentada nos dois modelos e no
quarto dia da retirada de MMI, o perímetro do colóide aumenta com relação ao
controle nos dois modelos. Esse resultados indicam que a diminuição da
resposta ao TSH ocorreu ao mesmo tempo após a normalização de iodo intra-
glandular em ambos os modelos, apesar de ter havido um aumento de TSH de
maior magnitude e mais prolongado nos animais que receberam MMI por 21
dias. Talvez, esses níveis provavelmente semelhantes de resposta ao TSH
expliquem a razão de a atividade TPO, níveis de T4 e T3 terem alcançado
valores semelhantes nos dois modelos estudados, apesar dos valores de TSH
terem sido bem mais altos em todos os grupos que receberam MMI por 21 dias.
Sabe-se que a proliferação dos tireócitos é controlada não só por TSH,
mas também por diferentes fatores de crescimento e citocinas que agem em
conjunto com este hormônio. Em humanos, foi observado o envolvimento de
vários fatores de crescimento autócrinos e parácrinos no desenvolvimento de
bócio multinodular não-tóxico (Bidey et. al, 1999). Além disso, foi demonstrada
diminuição nas concentrações de EGF, TGF-α e TGFβ-1 em nódulos
tireoideanos frios e diminuição de EGF e TGFβ-1 em nódulos quentes (Eszlinger
et al., 2001). Foi demonstrado que a diminuição da biodisponibilidade de TGFβ-
1 em cultura de tireócitos humanos contribui para o desenvolvimento de bócio
multinodular não-tóxico (Cowin e Bidey, 1996 apud Bidey et al., 1999). Alguns
destes fatores de crescimento também exercem influência sobre a função
tireoideana, como é o caso TGFβ-1, que, além de ser um supressor da
proliferação folicular, é também um supressor da função tireoideana, pois
diminui a transcrição dos genes que codificam a TPO, tireoglobulina, NIS e
receptor de TSH (Kang et al., 2001).
Em nossos modelos, observamos marcação muito fraca para TGFβ-1 no
grupo controle e nenhuma marcação no que recebeu MMI por 21 dias até o
sacrifício. Nos animais que receberam MMI por esse intervalo de tempo, a
marcação foi mais intensa no grupo 2d s/ MMI, mas também foi presente nos
grupos 4d e 5d s/ MMI. Talvez a intensidade da marcação no grupo 2d s/ MMI
tenha ocorrido por possível aumento transitório do conteúdo de iodo intra-
glandular nesses grupos, já que o iodo estimula a transcrição de TGFβ-1 na
tireóide (Cowin et al., 1992 apud Biddey et al., 1999). Nos animais que
receberam MMI por 5 dias, a marcação para TGFβ-1 foi muito fraca nos animais
que receberam o MMI até o dia do sacrifício, mas foi bem mais intensa após 1
dia da retirada de MMI; a marcação é menos intensa nos grupos após 2d, 3d e
5d da retirada de MMI e foi negativa no grupo 4d s/ MMI. Como o TGFβ-1
diminui a função do NIS, esperávamos que sua expressão estivesse mais
elevada no grupo 1d s/ MMI nos animais que receberam MMI por 21d em
comparação com o mesmo grupo de retirada de MMI nos animais que
receberam a droga por 5d, já que a captação tireóidea de radioiodo diminuiu
drasticamente naquele grupo. Assim, nos animais 1d s/ MMI que receberam
essa droga por 5 dias, uma possível supressão da expressão do NIS por TGFβ-
1, pode ter sido sobrepujada pelo TSH aumentado nesse grupo. É possível que,
pelo menos nesses animais, o papel fisiológico do aumento da expressão de
TGFβ-1 seja relacionado ao controle da proliferação celular e não ao controle da
função do NIS exercidos por essa citocina (Kang et al., 2001). Nossos resultados
sugerem que outros fatores independentes de TGFβ-1 agem no controle da
função do NIS após 1 dia de retirada de MMI nos animais que receberam essa
droga por tempo prolongado. Essa hipótese pode ser levantada porque no
mesmo grupo de retirada de MMI, após o tratamento mais curto com a droga,
observamos marcação para TGFβ-1, mas a captação tireóidea de iodeto
continua igual ao grupo que recebeu MMI até o dia do sacrifício.
Além disso, em nossos modelos, não descartamos a hipótese de que
outros fatores de crescimento e citocinas possam estar envolvidos. Talvez, não
por uma ação direta desses fatores sobre a atividade do NIS, mas um controle
do estoque intra-vesicular de NIS no interior do tireócito. A falta da ação do TSH,
por exemplo, faz com que as moléculas de NIS presentes na membrana
basolateral do tireócito sejam rapidamente internalizados em vesículas
intracelulares, em cultura de células (Riedel et al., 2001), diminuindo a captação
do iodeto, e este mecanismo é mais rápido do que a redução da expressão da
proteína, secundária à diminuição do RNAm do NIS. Sabe-se que o TGFβ-1
diminui a transcrição do RNAm (Kang, et al., 2001) para receptor de TSH.
Portanto, no momento da normalização de iodo intra-glandular após um longo
período de carência de iodo inta-glandular e de bócio, outros fatores reguladores
do crescimento ou o aumento do composto orgânico iodado poderiam causar
uma diminuição da resposta da tireóide ou apenas do NIS ao TSH , contribuindo
para a rápida diminuição da atividade de captação de radioiodo observada a
partir de 1 dia de retirada de MMI em ratos tratados com essa droga por 21 dias,
de forma independente da concentração sérica de TSH. Entretanto, a
normalização do perímetro do colóide, que reflete a resposta ao TSH, ocorrendo
de forma semelhante após a retirada de MMI nos dois modelos, sugere que a
regulação da resposta do NIS ao TSH não seja mediada por diminuição da
expressão de TSHR e sim por algum outro mecanismo.
Pela primeira vez, demonstramos que, em ratos, tireóides com tamanho
maior e submetidas por mais tempo à carência de iodo intra-glandular
apresentam regulação do NIS diferente com relação a glândulas de menor
tamanho. Esta afirmação se deve ao fato de que, em animais MMI 21d, a
captação de iodeto sofreu uma brusca supressão mesmo sob altas
concentrações de TSH, enquanto, nos animais MMI 5d, a captação caiu
lentamente acompanhando a queda de TSH, após a retirada do MMI. Sabendo
que a meia-vida do NIS em cultura de células é de 5 dias na presença de TSH e
3 dias na ausência desse hormônio (Riedel et al., 2001), sugerimos ainda que
uma queda tão rápida da captação tireóidea de radioiodo observada no grupo 1d
s/ MMI (apenas 1 dia de diferença em relação ao grupo MMI 21d), não deve ser
devida à redução da expressão do NIS mas, provavelmente, à redistribuição das
moléculas na membrana basolateral para vesículas intracelulares. Como os
mecanismos responsáveis pela redistribuição subcelular do NIS não são
conhecidos, não podemos formular hipóteses acerca dos mecanismos
envolvidos na rápida regulação do NIS que ocorre nesses bócios a longo prazo.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
→ O TSH normaliza após 1d da normalização do T3 sérico, apesar de haver
aumento significativo do T4;
→ O tamanho do colóide normaliza após 1d de retirada do MMI em ambos os
modelos, sugerindo que há diminuição de resposta ao TSH a partir deste
momento, pois o TSH permanece elevado;
→ Na condição de bócio crônico, mesmo em situações de TSH mais elevado
e por mais tempo, a retomada da biossíntese hormonal sofre regulação mais
fina do que na proliferação tireóidea aguda, de maneira a impedir a
tireotoxicose após a normalização do iodo organificado intra-glandular.
→ O NIS diminui agudamente nos animais com bócio crônico, provavelmente
secundário à endocitose das moléculas presentes na membrana basolateral.
→ Os mecanismos de regulação do NIS e da TPO e, portanto, da
biossíntese hormonal dependem do tamanho do bócio.
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