RODRIGO ANTONIO PELICIARI GARCIA

A SINCRONIZAÇÃO NORADRENÉRGICA E O

PAPEL DA INSULINA NA MODULAÇÃO DA

SÍNTESE DA MELATONINA PELA GLÂNDULA

PINEAL DE RATOS

São Paulo

2008

RODRIGO ANTONIO PELICIARI GARCIA

A SINCRONIZAÇÃO NORADRENÉRGICA E O

PAPEL DA INSULINA NA MODULAÇÃO DA

SÍNTESE DA MELATONINA PELA GLÂNDULA

PINEAL DE RATOS

Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências (Fisiologia Humana).

São Paulo

2008

RODRIGO ANTONIO PELICIARI GARCIA

A SINCRONIZAÇÃO NORADRENÉRGICA E O

PAPEL DA INSULINA NA MODULAÇÃO DA

SÍNTESE DA MELATONINA PELA GLÂNDULA

PINEAL DE RATOS

Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Fisiologia Humana Orientador: Prof. Dr. José Cipolla Neto Co-orientadora: Dra. Solange Castro Afeche

São Paulo

2008

DEDICATÓRIA

À minha mãe Jacira Peliciari, pelo seu apoio não somente

na realização deste trabalho, mas por sua dedicação

e constante presença em meu coração.

Muito obrigado!

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao Professor Dr. José Cipolla Neto, pela oportunidade, confiança, por

todos seus conselhos e principalmente pela sua prestimosa orientação. O verdadeiro

mestre será sempre lembrado com respeito, admiração e gratidão. Muito obrigado

Professor Cipolla!

À Dra. Solange Castro Afeche, pela co-orientação, ajuda e pelas preciosas dicas

as quais me dera para a realização desse trabalho.

Ao Dr. Martin E. Young do USDA/ARS Children’s Nutrition Research Center,

Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA, pelos

ensinamentos durante o doutorado sanduíche.

À CNPq, pelos apoios financeiros (PGI e SWE).

À Julieta Helena Scialfa, por todo o seu carinho, atenção, dedicação, e por todos

os sacrifícios. Muito obrigado Ju!

À Dra. Melissa Moreira Zanquetta, por toda ajuda, não somente na realização

deste. Muito obrigado!

Ao meu pai Luis Antonio Vieira Garcia, por ter me incentivado a seguir a ciência

biomédica e pelo seu carinho.

Aos amigos do laboratório: Sabrina, Simone, Daniella, Fernanda, Rafael, Marco,

Ana Carolina e Ana Lopes, obrigado pelas horas inestimáveis e pela convivência

pacífica.

Aos professores do ICB-I, os quais tive a oportunidade de conhecer e de trabalhar

direta ou indiretamente, especialmente à Profa. Maria Tereza, Profa. Carla R. O.

Carvalho, Prof. Fernando Abdulkader, Prof. Fábio B. Lima e Profa. Silvana Bordin.

Muito Obrigado!

Aos amigos Eduardo Rebelato Lopes de Oliveira e Cleyton R. Sobrinho.

Aos funcionários José Maria Rodrigues Júnior, Itamar Klemps Filho, Maria Alice

Silva Lima, Ilza Terra, Cláudio Lúcio de Castro, José Luis dos Santos, Edson Miranda,

Adilson Alves e a todos os funcionários e pessoas que direta ou indiretamente

contribuíram para a realização deste.

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Charles Louis de Montesquieu (1689-1755).

RESUMO

GARCIA, R. A. P. A SINCRONIZAÇÃO NORADRENÉRGICA E O PAPEL DA INSULINA NA MODULAÇÃO DA SÍNTESE DA MELATONINA PELA GLÂNDULA PINEAL DE RATOS. 2008. 126 p. Tese (Doutorado em Fisiologia Humana) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

A glândula pineal de mamíferos sintetiza o hormônio melatonina exclusivamente durante

o período noturno, caracterizando uma variação diária típica dos ritmos circadianos e

sazonais. Como a glândula perdeu sua característica de fotosensibilidade (característica

essa ainda observada em vertebrados não mamíferos), em vertebrados mamíferos, ela

depende de células gânglionares fotoceptoras presentes na retina e de uma via neural que

integra o eixo retino-hipotalâmico-pineal, para a geração de sua ritmicidade e

sincronização ao ciclo de iluminação ambiental. A complexidade da regulação da

produção da melatonina é, além disso, denotada pela presença de vários sistemas

peptidérgicos que estão potencialmente envolvidos na funcionalidade da glândula.

Entretanto, alguns processos na modulação ou potencialização dessa produção ainda não

foram descritos. Dentro dessa perspectiva, o papel da insulina na regulação da síntese de

melatonina foi estudado em culturas de glândulas pineais de ratos estimuladas com

noradrenalina, insulina e noradrenalina associada à insulina, em culturas temporizadas ou

não pela noradrenalina, avaliando: a produção de melatonina por Cromatografia Líquida

de Alto Desempenho (HPLC) com detecção eletroquímica; as atividades das enzimas

envolvidas na síntese da melatonina, por radiometria; assim como, a expressão gênica das

enzimas quantificada por Real-Time PCR. Os resultados demonstram que: a insulina em

uma concentração de 10-8M potencializa o efeito estimulatório noradrenérgico sobre a

síntese da melatonina, através da indução de um aumento da atividade da Triptofano

Hidroxilase (TPOH) em glândulas cultivadas de acordo com o protocolo de estimulação

aguda; enquanto que, em culturas temporizadas pela noradrenalina (12 h com

noradrenalina / 12 h sem noradrenalina, 2 ciclos), a insulina também manteve sua

capacidade estimulatória, potencializado a síntese da melatonina através da indução,

agora, de um aumento da atividade da Arilalquilamina-N-Acetiltransferase (AANAT); a

insulina por si, não afetou a atividade da Hidroxindol-Oxi-Metiltransferase (HIOMT), e

nem alterou as expressões dos genes que codificam as enzimas envolvidas na síntese da

melatonina tpoh, aanat e hiomt em ambas condições investigadas. Os resultados sugerem

uma interação entre as vias de sinalização da noradrenalina e da insulina, com a

respectiva potencialização da síntese da melatonina, induzida por noradrenalina,

observada pela adição da insulina, efeito esse que se dá, provavelmente, através de

mecanismos pós-transcricionais.

Palavras-chave: glândula pineal, melatonina, insulina, noradrenalina, triptofano

hidroxilase, arilalquilamina-N-acetiltransferase e hidroxi-O-metiltransferase.

ABSTRACT

GARCIA, R. A. P. NORADRENERGIC SYNCHRONIZATION AND THE ROLE OF INSULIN ON THE MODULATION OF MELATONIN SYNTHESIS IN RAT PINEAL GLANDS. 2008. 126 p. Ph. D. thesis (Human Physiology) – Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, 2008.

The mammalian pineal gland synthesizes melatonin in a circadian manner, peaking

during the dark phase. This synthesis is primarily regulated by sympathetic innervations

via noradrenergic fibers, but is also modulated by many peptidergic and hormonal

systems. A growing number of studies reveals a complex influence of melatonin in

various physiological processes, including modulation of insulin secretion and action. In

contrast, a role for insulin as a modulator of melatonin synthesis has not been

investigated previously. The aim of the current study was to determine whether insulin

modulates norepinephrine (NE)-mediated melatonin synthesis. The results demonstrate

that insulin (10-8M) potentiated norepinephrine-mediated melatonin synthesis and

tryptophan hydroxylase (TPOH) activity in ex vivo incubated pineal glands. When ex vivo

incubated pineal glands were synchronized (12 h NE-stimulation, followed by 12 h

incubation in the absence of NE), insulin potentiated NE-mediated melatonin synthesis

and arylalkylamine-N-acetyltransferase (AANAT) activity. Insulin did not affect the

activity of hydroxyindole-O-methyltranferase (HIOMT), nor the gene expression of tpoh,

aanat, or hiomt, under any of the conditions investigated. We conclude that insulin

potentiates NE-mediated melatonin synthesis in cultured rat pineal gland, potentially

through post-transcriptional events.

Key words: pineal gland, melatonin, insulin, norepinephrine, tryptophan hydroxylase,

arylalkylamine-N-acetyltransferase and hydroxyindol-O-methyltransferase.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA ..............................................16

2 OBJETIVOS.............................................................................................................36

3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................38

3.1 Animais ..................................................................................................................38

3.2 Culturas da Glândula Pineal................................................................................38

3.2.1 Culturas padrão da glândula pineal......................................................................38

3.2.2 Culturas temporizadas pela noradrenalina ...........................................................39

3.3 Dosagem de Melatonina .......................................................................................40

3.4 Atividades Enzimáticas ........................................................................................41

3.4.1 Análise radiométrica da atividade da TPH ..........................................................41

3.4.2 Análise radiométrica da atividade da NAT..........................................................41

3.4.3 Análise radiométrica da atividade da HIOMT.....................................................42

3.5 Extração de RNA e Análise Quantitativa por PCR em Tempo-Real...............43

3.6 Análise Estatística .................................................................................................44

4 RESULTADOS ........................................................................................................47

4.1 Culturas Padrão da Glândula Pineal ..................................................................47

4.2 Culturas Temporizadas pela Noradrenalina......................................................48

4.3 Atividades Enzimáticas ........................................................................................49

4.3.1 Atividade da TPH .............................................................................................49

4.3.2 Atividade da NAT.............................................................................................50

4.3.3 Atividade da HIOMT........................................................................................51

4.4 Expressão Gênica por PCR em Tempo-Real .....................................................52

4.4.1 Expressão da tph ...............................................................................................52

4.4.2 Expressão da nat ...............................................................................................53

4.4.3 Expressão da hiomt ...........................................................................................54

5 DISCUSSÃO.............................................................................................................57

6 CONCLUSÕES ........................................................................................................62

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................64

ANEXOS ......................................................................................................................77

ANEXO A: Tabela 1.....................................................................................................78

ANEXO B: Figura complementar ...............................................................................79

ANEXO C: Artigos completos publicados em periódicos ...........................................80

I) Publicação da tese .....................................................................................................80

II) Demais artigos publicados durante o doutorado......................................................88

ANEXO D: Artigo em preparação................................................................................102

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1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA

A glândula pineal e a biossíntese de melatonina

A glândula pineal, também denominada de órgão pineal, participa na

organização temporal de ritmos biológicos, atuando como mediadora entre o ciclo

claro/escuro ambiental e os processos fisiológicos regulatórios, incluindo a regulação

endócrina da reprodução, a regulação dos ciclos de atividade-repouso e sono/vigília,

assim como a regulação do sistema imunológico, entre outros (CIPOLLA NETO e

AFECHE, 1992).

A glândula pineal é uma estrutura epitalâmica pequena e única, situada

dorsalmente à região caudal do diencéfalo. Deriva-se de células neuroectodérmicas e,

semelhantemente às células da retina, desenvolve-se a partir de uma evaginação do teto

da parede do terceiro ventrículo (KAPPERS et al., 1960).

Nos roedores, a glândula pineal apresenta três porções distintas que

formam o complexo pineal: pineal profunda, pedúnculo pineal e pineal superficial. A

pineal profunda, ou lâmina intercalar, está localizada entre as comissuras posterior e

habenular, delimitando uma região ventricular chamada de recesso pineal, e da sua

porção dorsal emerge o pedúnculo pineal que se comunica com a pineal superficial.

(MOLLER, 1992) (Figura 1).

Figura 1. A figura apresenta a localização anatômica da glândula pineal de rato localizada na região epitalâmica, representada por três porções distintas: pineal superficial, pedúnculo pineal e pineal profunda. Modificado de Swanson, L. W. 1998.

Cérebro Cerebelo

Glândula Pineal

Córtex

Cerebral Cerebelo

Glândula Pineal

Cérebro Cerebelo

Glândula PinealGlândula Pineal

Cerebelo

Córtex

Cerebral Cérebro Cerebelo

Glândula Pineal

Córtex

Cerebral Cerebelo

Glândula Pineal

Cérebro Cerebelo

Glândula PinealGlândula Pineal

Cerebelo

Córtex

Cerebral

A síntese da melatonina, hormônio produzido e secretado

predominantemente á noite, é realizada pela glândula pineal de mamíferos, apresentando

uma flutuação circadiana (ritmo com ciclo em torno de 24 horas, podendo variar em até

4 horas) e sazonal de acordo com a variação do fotoperíodo (Figura 2).

Figura 2. Representação esquemática da informação fotoperiódica transmitida pela síntese de melatonina,

mostrando suas variações circadiana (A) e sazonal (B).

A produção dos indóis pineais precursores da melatonina inicia-se a partir

do aminoácido triptofano, que é hidroxilado pela enzima triptofano-hidroxilase (TPH)

formando 5-hidroxitriptofano (5-HTP), o qual é descarboxilado pela enzima

descarboxilase de L-aminoácido aromático (LAAD), gerando-se assim a serotonina (5-

hidroxitriptamina, 5-HT). A serotonina sofre ação da enzima passo-limitante

arilalquilamina N-acetiltransferase (AANAT ou NAT), que transfere um grupamento

acetil para a serotonina, tendo como produto a N-acetilserotonina (NAS). Essa, por sua

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A

B

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A

B

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vez, sofre ação da enzima hidroxi-indol-O-metiltransferase (HIOMT), que, substituindo o

hidrogênio do grupamento hidroxila do carbono 5 do grupo indólico por um grupamento

metil, forma a melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) (SUGDEN, 1989) (Figura 3).

Figura 3. Representação dos indóis precursores da síntese de melatonina, e do ponto de atuação de cada

enzima.

Diferentemente de outros vertebrados, a glândula pineal de mamíferos não

possui características fotossensíveis, sendo que, para sua sincronização ao ciclo diário de

iluminação ambiental (refletindo-se na síntese de melatonina), depende de células

ganglionares fotoceptoras presentes na retina, e da via de projeção retino-hipotalâmica

para os núcleos hipotalâmicos, incluindo os núcleos supraquiasmáticos. Estes, por sua

vez, conectam-se funcionalmente com a glândula pineal através dos núcleos

paraventriculares hipotalâmicos, neurônios pré-ganglionares simpáticos da coluna

intermediolateral da medula espinhal, gânglios cervicais superiores, dos quais se

originam os neurônios pós-ganglionares simpáticos, que se projetam para a glândula

N H

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N H

CH2CH(NH2)COOH

CH2CH2NHCOCH3 CH3O

CH2CH2NH2 HO

N H

CH2CH(NH2)COOH HO

CH2CH2NHCOCH3 HO

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N H

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SEROTONINA

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N H

TRIPTOFANO ������!!����""������ ���������������������� ����##��

pineal através dos ramos carotídeos internos e dos nervos conários (CIPOLLA NETO e

AFECHE, 1992; MOORE et al., 1995). A síntese da melatonina, que é deflagrada no

período escuro, deve-se à liberação de noradrenalina (Nor) pelos terminais simpáticos

que inervam a glândula pineal (KAPPERS, 1960) (Figura 4).

Figura 4. Representação esquemática da via de sinalização da síntese de melatonina em roedores. O

fotoestímulo é transmitido por células ganglionares específicas presentes na retina pela via de projeção retino hipotalâmica (RHP), incluindo os núcleos supraquiasmáticos (NSQs) presentes no hipotálamo (H), localizados acima do quiásma óptico (QO). Esses se comunicam com a glândula pineal por uma via que inclui os núcleos paraventriculares (PV), os neurônios pré-ganglionares simpáticos da coluna intermediolateral da medula espinhal (IML) e gânglios cervicais superiores (GCS), de onde se originam os neurônios pós-ganglionares simpáticos que inervam a glândula pineal (P), através dos ramos carotídeos internos (RCI) e nervos conários (NC).

A noradrenalina liberada no interstício da glândula interage com os

adrenoreceptores do tipo �1 e �1 (KLEIN, et al., 1983; VANECEK, et al., 1985). A

ativação do adrenoreceptor �1 mediado pela proteína G estimulatória (Gs), promove o

aumento da quantidade intracelular de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) pela

ativação da enzima adenilato ciclase (AC). Esse efeito é potencializado pela estimulação

dos adrenoceptores � (�1B), cujos efeitos são mediados por uma proteína Gq, levando à

ativação da fosfolipase C, a qual promove a hidrólise de fosfoinositídios de membrana,

com a conseqüente produção de trifosfato de inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG). O IP3,

atuando em seus receptores no retículo endoplasmático, induz a liberação do cálcio

RETINA��������

RHP

NSQ PVH

P NC

RCI SCG

IML

GCS RHP

QO

desses estoques, tendo como conseqüência um aumento do cálcio citoplasmático. O

aumento do cálcio induzido por noradrenalina caracteriza-se por um pico seguido de um

platô. A rápida elevação do cálcio deve-se à liberação do cátion a partir do retículo

(SCHAAD et al., 1995) e o platô que se segue se deve ao influxo de cálcio pelos canais

da membrana plasmática responsáveis pela reposição dos estoques intracelulares

(GOMPERTS et al., 2002).

O cálcio e o DAG ativam a proteína quinase C (PKC), potencializando o

aumento do AMPc, pois essa enzima pode fosforilar a adenilato ciclase ou a proteína Gs,

ativando-as. O AMPc e o cálcio intracelular são fundamentais para o processo de

ativação da enzima NAT. Em ratos, esse processo sinérgico entre AMPc e cálcio resulta

na transcrição e tradução protéica e, conseqüentemente, na síntese e ativação da NAT

(BORJIGIN et al, 1995; KLEIN et al, 1983; CHIK et al, 1988; SUGDEN et al., 1985;

SUGDEN et al., 1988; VANECEK et al., 1985). A NAT quando fosforilada pela

proteína quinase A (PKA), interage com a proteína 14-3-3 formando um complexo

protetor contra proteólise proteassomal (KLEIN et al., 2002) (Figura 5).

Figura 5. Figura ilustra os eventos desde a liberação da noradrenalina até a síntese e secreção da melatonina. Modificado de: (GANGULY et al., 2002). 5HT- serotonina; NAS- N-acetilserotonina; NAT-N-acetiltransferase; pNAT-NAT fosforilada; AR-receptor noradrenérgico; AC-adenilato ciclase; DAG-diacilglicerol; cAMP-monofosfato cíclico de adenosina; PKA-proteína quinase dependente de cAMP; CREB-proteína ligante a elemento responsivo ao cAMP; pCREB-CREB fosforilado; NOR/A-noradrenalina e adrenalina.

Em maiores detalhes, no rato, o aumento do AMPc e, conseqüentemente, a

ativação da PKA fazem com que a subunidade catalítica da PKA fosforile o fator de

transcrição CREB (proteína ligante a elementos responsivos ao AMPc). Este, por sua vez,

se liga ao seu sítio CRE na região promotora do gene da NAT, induzindo a transcrição

seguida da tradução citoplasmática da enzima. Porém, esse mecanismo regulatório da

transcrição do gene da NAT parece não ser único. Recentes publicações especulam ainda

a participação de uma histona (H3) que é fosforilada pelo estímulo noradrenérgico,

apresentando um transiente de fosforilação, refletindo provavelmente ativações noturnas

de genes controlados pela noradrenalina na glândula pineal de ratos (KLEIN, 2007;

CHIK et al., 2007).

O aumento do AMPc mencionado acima ocorre rapidamente após a

estimulação noradrenérgica dos adrenoceptores �1 e �1, alcançando níveis máximos em

minutos, com um aumento de aproximadamente 60 vezes em relação aos controles não

estimulados. Portanto, é possível que a grande quantidade inicial de AMPc seja

necessária para induzir processos de transcrição e tradução gênica, enquanto que

concentrações menores de AMPc são suficientes para manter a atividade da NAT. No

entanto, a indução máxima da atividade da NAT ocorre aproximadamente 4 a 6 horas

após o início da estimulação noradrenérgica, quando os níveis de AMPc já não são tão

elevados (KLEIN et al., 1978).

Um mecanismo de regulação inibitória que acontece na segunda metade da

noite deve-se à desfosforilação da CREB. Esse processo ocorre em paralelo a um

mecanismo inibitório direto envolvendo a síntese da proteína ICER (inducible cAMP

early repressor), a qual inibe a transcrição do gene da NAT, e conseqüentemente causa

redução na atividade da NAT. Esses dois fatores contribuem para a queda circadiana da

atividade da NAT que ocorre no fim da noite (KLEIN et al., 1970) (Figura 6).

Sinais adrenérgic

Figura 6. Representação esquemática da via de regulação pela geração rítmica da síntese de melatonina.

CREB fosforilada ativa a transcrição do gene da NAT, e na segunda metade da noite ocorre a ativação da região promotora P2 do gene CREM induzindo a síntese do ICER. FOULKES et al., 1997.

Os eventos pós-transcricionais também têm um papel importante na

regulação da NAT pois, como demonstrado em ratos, a fotoestimulação noturna reduz a

atividade da enzima sem alterar a quantidade de RNAm (ROMERO et al., 1975). A NAT

estabiliza sua atividade enzimática através da fosforilação pela PKA, associando-se com

a proteína 14-3-3, formando um complexo NAT/14-3-3 (GANGULY et al., 2001). Essa

associação impede que a NAT seja metabolizada por um mecanismo de proteólise

proteassomal (GASTEL et al., 1998).

A TPH é a responsável pela formação do 5-hidroxitriptofano, enzima

passo-limitante na síntese da serotonina. A concentração de triptofano na pineal é muito

elevada, sendo maior do que em qualquer outra parte do sistema nervoso central. O

transporte de triptofano no sistema nervoso central se dá através de um sistema de

transporte de aminoácidos neutros, e, assim, um sistema semelhante a esse poderia

carregar o triptofano para o interior dos pinealócitos (SUGDEN et al., 1989;

GUTIERREZ et al., 2003). A TPH não parece ser regulada negativamente por seu

substrato, uma vez que a síntese de serotonina em glândulas pineais em culturas não é

limitada pela captação aumentada do aminoácido triptofano (YOUNG e ANDERSON,

1982; GUTIERREZ et al., 2003).

Na glândula pineal do rato, a TPH apresenta um ritmo circadiano de

atividade, com atividade mais elevada no período noturno, fazendo com que a síntese de

5-hidroxitriptofano seja maior durante a noite. Esse aumento da atividade de cerca de 2

vezes durante a noite deve-se tanto à sua síntese aumentada, pela indução de transcrição

gênica e síntese protéica, como à ativação da enzima por fosforilação (BESANÇON et

al., 1996; SITARAM e LEES, 1978; SHIBUYA et al., 1978). Tanto o ritmo de formação

do RNAm, como o ritmo de atividade da TPH são induzidos por estimulação

noradrenérgica, pela via do AMPc e PKA, a qual através da fosforilação do CREB,

promove a transcrição da enzima TPH (BOADLE-BIBER, 1980; EHRET et al., 1991;

SHEIN e WURTMAN, 1971; SITARAM e LEES, 1984). A fosforilação da TPH pode

ocorrer pela PKA, pela quinase dependente de cálcio e calmodulina (CaMK) e pela PKC

(EHRET et al., 1989, 1991; JOHANSEN et al., 1995, 1996; KUHN et al., 1978;

SIMONNEAUX e RIBELAYGA, 2003).

A regulação da atividade da TPH também ocorre pela associação com a

proteína 14-3-3. A TPH fosforilada pela CaMK, PKC ou pela PKA liga-se à proteína 14-

3-3, aumentando, assim, a sua atividade e impedindo a sua desfosforilação (ICHIMURA

et al., 1987, 1995; BANIK et al., 1997; KLEIN et al., 2003).

A concentração de serotonina no pinealócito (regulada pela TPH)

apresenta uma variação diária, com concentrações mais elevadas durante o período claro

(apesar de sua taxa de renovação ser maior à noite: maior síntese e maior degradação).

No período claro, ela é metabolizada através da via da monoamina oxidase B (MAO B),

que possui uma variação circadiana com valores elevados durante o período claro (KING

e STEINLECHNER, 1985). A serotonina sob ação da MAO B é transformada em 5-

hidroxi-indolacetaldeído (5-HIAL), e este, por sua vez, sofre a ação da enzima aldeído

desidrogenase transformando-se em ácido 5-hidroxi-indolacético (5-HIAA) e sob ação da

enzima álcool desidrogenase é transformado em 5-hidroxitriptofol (5-HL). Ambos podem

ser O-metilados por ação da (HIOMT) (Figura 7).

Monoamina Oxidase (MAO B)

Aldeído Desidrogenase Álcool Desidrogenase

HIOMT HIOMT

5-Hidroxi-Indol-Acetaldeído

Figura 7. Via Desaminativa-Oxidativa da serotonina na Glândula Pineal.

A redução dos níveis de serotonina à noite deve-se a dois fatores: a

ativação da NAT pela estimulação noradrenérgica, transformando serotonina em N-

acetilserotonina; e a liberação de serotonina da glândula pineal também induzida pela

estimulação noradrenérgica (WALKER e ALOYO, 1985; ALOYO e WALKER, 1987,

1988).

A HIOMT, por sua vez, age na N-acetilserotonina (NAS), transformando-

a em melatonina. A atividade da enzima HIOMT no período noturno apresenta um

aumento de 1.5 vezes, enquanto o seu RNAm tem um aumento de 2 vezes

(RIBELAYGA et al., 1999 a, b; SIMONNEAUX e RIBELAYGA, 2003). O ritmo

circadiano do RNAm da HIOMT é dependente da estimulação adrenérgica, através da

ativação do receptor β-adrenérgico, e do aumento na concentração de AMPc. Já a

regulação do ritmo de atividade da enzima HIOMT parece ser dependente de eventos

pós-transcricionais, induzidos por neurotransmissores que aumentam a concentração

intracelular de cálcio (SIMONNEAUX et al., 1999).

O neuropeptídio Y (NPY) tem um efeito estimulatório sobre a atividade

da HIOMT, potencializando a síntese de melatonina (RIBELAYGA et al., 1997). Esse

efeito estimulatório se dá pelo influxo de cálcio na célula. O NPY também está

envolvido na regulação do ritmo de atividade da HIOMT. Estudos in vivo demonstraram

que a atividade da HIOMT correlaciona-se significativamente com a concentração do

NPY, que possui um ritmo diário e sazonal. SIMONNEAUX et al. (1999) observaram

que o aumento noturno do RNAm da HIOMT não tem relação direta com o aumento da

atividade dessa enzima. E adicionalmente a regulação da atividade da HIOMT parece

ocorrer em longo prazo, pois em trabalhos com animais expostos à luz constante ou em

que seus gânglios cervicais superiores foram removidos, verificou-se uma redução na

atividade da HIOMT (SUGDEN, 1989).

Uma vez sintetizada, a melatonina é secretada diretamente para a

circulação sangüínea, sendo degradada nos rins e no fígado, onde é convertida em 6-

sulfatoximelatonina (BROWN et al., 1991). A melatonina também pode ser metabolizada

no cérebro, onde é transformada em N-acetil-5-metoxiquinurenina pela enzima 2,3-

indolamina dioxigenase (HIRATA et al., 1974) (Figura 8).

Figura 8. Via de degradação da melatonina no fígado, rins e sistema Nervoso.

Dados na literatura demonstram que outras substâncias também podem

Melatonina

2,3-Indolamina Dioxigenase

6-Sulfatoximelatonina

6-Hidroximelatonina

Melatonina

2,3-Indolamina Dioxigenase

6-Sulfatoximelatonina

6-Hidroximelatonina

modular a síntese de melatonina, como acetilcolina, dopamina (DOPA), GABA,

prostaglandinas e serotonina. Peptídios, como o peptídeo intestinal vasoativo (VIP)

também regulam a síntese de melatonina, podendo induzir a transcrição do gene da NAT

e estimular a atividade da enzima por promover um aumento na quantidade da AMPc

(OLCESE, 1991; SIMMONEAUX et al., 1994).

Papel do Cálcio na Síntese de Melatonina

O cálcio, além de participar da ativação da PKC e na potenciação da

síntese do AMPc, parece também ter um papel importante nos eventos subsequentes à

elevação do AMPc intracelular que induzem a síntese de melatonina. Utilizando-se

análogos do AMPc, e aumentando-se o cálcio intracelular por várias manobras

experimentais, verificou-se que o cálcio tem um papel potenciador da atividade da NAT

(YU et al., 1993). Os mecanismos dessa ativação da NAT pelo cálcio não são conhecidos,

mas poderiam envolver a fosforilação da proteína CREB, através da ativação de uma

quinase dependente de cálcio. Evidências nesse sentido provêm de dados demonstrando

que agentes despolarizantes, como o KCl e a ouabaína (inibidor de Na+-K+ ATPase), que

aumentam o cálcio intracelular, induzem a fosforilação da CREB nos pinealócitos

(ROSEBOOM e KLEIN, 1995). Ainda, eventos pós-transcricionais poderiam estar

envolvidos, uma vez que estes também parecem ter um papel importante na regulação da

NAT (ROMERO et al., 1975). Os eventos pós-transcricionais poderiam envolver os sítios

de fosforilação pelas quinases protéicas dependentes de Ca2+, que foram identificados na

enzima, ou os grupos tióis, ou, ainda, a fosforilação de enzimas citosólicas que poderiam

regular a síntese, atividade ou estabilidade da NAT (BORJIGIN et al., 1995; COON et

al., 1995; KLEIN e NAMBOODIRI, 1982; KLEIN et al., 1992, 1996; NAMBOODIRI et

al., 1981; YU et al., 1993).

Da mesma forma que a NAT, as enzimas TPH e HIOMT também parecem

ser ativadas pelo cálcio. Foi demonstrado que a enzima TPH cerebral é um substrato para

a fosforilação por uma quinase protéica dependente de cálcio e calmodulina (EHRET et

al., 1989). De modo semelhante, a enzima na pineal poderia apresentar esse mesmo

mecanismo. Com relação à HIOMT, a sua dependência de mecanismos ativadores que

utilizam o cálcio foi demonstrada devido à sua ativação por neurotransmissores que

aumentam o cálcio intracelular na glândula pineal, como VIP e NPY (RIBELAYGA et

al., 1997; SIMMONEAUX et al., 1999).

O bloqueio de canais para cálcio dependentes de voltagem, por uma

neurotoxina do veneno da aranha Phoneutria nigriventer (ω-Phonetoxina IIA)

(AFECHE, 1994; CASSOLA e AFECHE, 1996; CASSOLA et al., 1998), que atua como

antagonista de canais L, N e, possivelmente, P/Q, reduziu as concentrações de N-

acetilserotonina de glândulas pineais de ratos, in vitro, estimuladas por noradrenalina.

Além da regulação da atividade da NAT por meio dos canais do tipo L,

sua síntese e atividade são reguladas também pelo cálcio liberado dos estoques

intracelulares devido a estimulação �1-adrenérgica.

Outros autores, no entanto, caracterizaram, na glândula pineal de ratos, a

presença de canais catiônicos não-seletivos, os quais seriam ativados pela noradrenalina,

promovendo a entrada de sódio e despolarização da membrana dos pinealócitos. Em

consequência, canais de cálcio dependentes de voltagem poderiam ser ativados,

induzindo um aumento do cálcio intracelular. Além disso, o AMPc parece ter um papel

importante na mediação dos efeitos da noradrenalina sobre a ativação dessas correntes

despolarizantes, pois análogos do AMPc induziram a mesma resposta (DARVISH e

RUSSELL, 1998).

Vários trabalhos demonstraram a importância e o envolvimento dos canais

de cálcio do tipo L na ativação da enzima NAT ou na síntese de melatonina (MEYER et

al., 1986; ZAWILSKA e NOWAK, 1991; ZHAO e TOUITOU, 1994). Dados recentes

obtidos em nosso laboratório mostraram que o bloqueio dos canais de cálcio dependentes

de voltagem do tipo L, pela nifedipina, reduziu as respostas máximas das curvas dose-

resposta de melatonina de glândulas pineais, em cultura, estimuladas com noradrenalina

(AFECHE et al., 2006). Esses dados demonstraram a importância do influxo de cálcio

através dos canais dependentes de voltagem do tipo L na potenciação da síntese de

melatonina, e que os seus efeitos dependem da estimulação dos receptores β-adrenérgicos

e ocorrem após os mecanismos de elevação do AMPc na glândula.

Uma provável ação do cálcio seria sobre os mecanismos de ativação da

NAT. De fato, os resultados obtidos em nosso laboratório mostraram uma redução na

atividade dessa enzima pelo bloqueio dos canais de cálcio do tipo L com a nifedipina. No

entanto, a redução da atividade da NAT foi bastante pequena (10%) quando comparada à

redução do conteúdo de melatonina (aproximadamente 40%).

O bloqueador de canais para cálcio do tipo N, a ω-conotoxina GVIA,

reduziu a resposta máxima de melatonina em glândulas pineais em cultura estimuladas

com noradrenalina. Esses resultados indicam também a importância desses canais na

potenciação da síntese de melatonina pelas glândulas pineais de ratos. Nesse caso,

também, verificou-se uma redução da atividade da NAT pelo bloqueio dos canais do tipo

N, o que explicaria a diminuição da síntese de melatonina (AFECHE et al., 2006).

Mecanismos de ação da melatonina

A ação biológica da melatonina pode ser atribuída tanto à sua interação

com receptores específicos (KRAUSE e DUBOCOVICH, 1990; STANKOV e REITER,

1990) quanto à sua capacidade de seqüestrar radicais hidroxila (TAN et al., 1993a;

1993b).

As características químicas da molécula da melatonina, pela presença dos

grupamentos metóxi, no carbono 5, e do grupamento acil, ligado ao nitrogênio do grupo

amina, são de anfifilicidade. Isto é, a melatonina tem a propriedade de difundir-se, com

igual capacidade, tanto em meios hidrofílicos quanto lipofílicos. Dessa forma, a

melatonina, uma vez produzida na glândula pineal, é imediatamente secretada e pode ser

encontrada em todos os compartimentos do organismo. Além disso, os carbonos 2 e 3 do

anel pirrólico possuem uma alta capacidade de doar elétrons. Isso confere a melatonina

uma alta capacidade redutora ou anti-oxidante. Ela é considerada um dos mais poderosos

agentes anti-oxidantes naturais (TAN et al., 2002) (Figura 9).

Figura 9. Representação esquemática das características químicas da molécula de melatonina.

A melatonina é uma molécula ubiqüamente encontrada nos seres vivos,

podendo ser encontrada em seres procariotos e eucariotos (unicelulares e pluricelulares).

Dadas essas características de aparecimento, manutenção e prevalência da melatonina,

desenvolveu-se, nas matérias vivas, uma grande série de mecanismos de ação mediando

as funções dessa molécula.

Assim, dependendo do local de sua produção e da organização do ser vivo

considerado, ela pode agir no interior da própria célula que a produz. Da mesma maneira,

ela pode sair da célula que a produz e exercer ações autócrinas (na própria célula),

parácrinas (em células vizinhas) e endócrinas (em células-alvo localizadas à distância)

(Figura 10).

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CH

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Figura 10. Ilustra os modos pelos quais a melatonina pode agir. Modificado de: CARRILLO-VICO et al.,

2004.

É provável que, ao longo da evolução, os mecanismos de ação da

melatonina tenham se tornado gradativamente mais complexos. Inicialmente a

melatonina poderia ter efetuado seu papel de sinalizador principalmente como anti-

oxidante, através de interações molécula a molécula e de modulador da atividade

enzimática. Posteriormente, quando da sua ação à distância, passou a interagir com

moléculas receptoras específicas, sejam de membrana, ou nucleares.

Dentre as suas ações intracelulares diretas pode-se ressaltar, além de seu

papel anti-oxidante: a mobilização de mecanismos reparadores do DNA; a regulação

EFEITO PARÁCRINO

EFEITO ENDÓCRINO

EFEITO AUTÓCRINO

EFEITO INTRÁCRINO

direta da atividade de várias enzimas; a ação intra-mitocondrial, regulando o metabolismo

oxidativo e o transporte de elétrons, além de regular processos de apoptose celular

(REITER 1995).

Em vertebrados, além de a melatonina ter uma produção e ação localizada

em diversos tecidos (retina, células do trato gastrointestinal, células imunocompetentes,

células da medula óssea, etc), através de ações autócrinas ou parácrinas, ela é produzida

centralmente, numa glândula endócrina (pineal), e passa a ter uma ação sistêmica,

hormonal, agindo, portanto, em células-alvo localizadas à distância, caracterizadas pela

presença de receptores específicos.

Os efeitos modulatórios da melatonina sobre os ritmos circadianos são

provavelmente mediados por receptores de alta afinidade localizados em células dos

núcleos supraquiasmáticos (REPPERT et al., 1996). Os receptores foram exaustivamente

demonstrados em ensaios de “binding” de derivados da melatonina marcados com

radioisótopos. Ligações de alta afinidade foram detectadas em alguns territórios do

sistema nervoso central e medula espinal, e em outros órgãos, como o rim, pulmão,

intestino, vasos sangüíneos e retina (KRAUSE e DUBOCOVICH, 1991).

A melatonina pode se ligar a vários receptores de membrana acoplados a

proteína G, exceto MT3, os quais são divididos em três classes de proteínas: MT1, MT2 e

MT3, uma enzima da família das quinonas redutases (WITT-ENDERBY et al., 2003).

Além disso, a melatonina pode se ligar diretamente ao seu receptor nuclear da família dos

receptores órfãos do ácido retinóico (RZR/ROR), a qual é composta por três membros: �,

� e � (SMIRNOV, 2001).

Os receptores MT1 e MT2 são homólogos e formam receptores de sete

alças que ativam proteínas Gi. Nos receptores ligam-se derivados da melatonina que

inibem, por mecanismo sensível à toxina pertussis, a ativação da adenilato ciclase,

induzida por forskolina, ou ativam canais para K+ do tipo retificador para dentro

(NELSON et al., 1996; KRAUSE e DUBOCOVICH, 1991; WHITE et al., 1987;

REPPERT et al., 1994; LIU et al., 1997). Trabalhos recentes demonstraram que a

melatonina também ativa a via de sinalização do Ca2+, potencializando a ativação da

fosfolipase C e da atividade da proteína quinase C (GODSON e REPPERT, 1997;

McARTHUR et al., 1997; BARRETT et al., 1999) bem como a via do ácido araquidônico

(BARRETT et al., 1999).

Por hibridização “in situ” verificou-se que a expressão dos receptores no

sistema nervoso central de mamíferos está restrita a algumas áreas, entre as quais os

núcleos supraquiasmáticos, a pars tuberalis, área postrema, cerebelo e hipocampo, sendo

as duas primeiras áreas os principais sítios de ligação para melatonina, tanto para

roedores como para humanos (REPPERT et al., 1988; VANECEK et al., 1987;

WILLIAMS, 1989). As áreas de hibridização são as mesmas que haviam sido marcadas

em ensaios de “binding” de derivados da melatonina (GILLETTE e McARTHUR, 1995).

Nos núcleos supraquiasmáticos de ratos, a expressão dos receptores é

variável no período de um dia, e o efeito da melatonina sobre os neurônios desses núcleos

dependerá, portanto, do momento da sua aplicação no período circadiano. O efeito,

quando ocorre, é o de inibição da atividade elétrica tônica, isto é, da freqüência de

disparos de potenciais de ação (STEHLE et al., 1989).

Glândula Pineal, Melatonina e Insulina.

A insulina (Ins) e os fatores de crescimento semelhantes à insulina dos

tipos I e II (IGF-I e IGF-II) são polipeptídios semelhantes em sua estrutura primária,

secundária e terciária. A insulina, além de suas ações específicas sobre o metabolismo de

carboidratos, gorduras e proteínas, tem também um papel no crescimento e na maturação

de células do sistema nervoso central e atua como modulador da atividade neuronal.

Assim, ela compartilha com os IGFs ações mitogênicas e promotoras do crescimento. Os

IGFs, por sua vez, exibem moderadamente os efeitos metabólicos da insulina.

O receptor de insulina (IR) é constituído por duas subunidades α e duas

subunidades ß. A subunidade α é extracelular e possui o sítio de ligação para a insulina e

inibe a atividade tirosina quinase da subunidade ß. Assim que ocorre a ligação hormônio-

receptor, há uma mudança conformacional no receptor e a subunidade ß que é uma

proteína transmembrana, se autofosforila e fosforila outros substratos endógenos em

resíduos de tirosina, e o ATP é a principal fonte de doação de fosfatos. Dessa maneira,

pela autofosforilação da subunidade ß do receptor de insulina, ocorre a fosforilação dos

substratos endógenos do IR.

O primeiro substrato endógeno descrito foi denominado substrato 1 do

receptor de insulina (IRS-1) (WHITE et al., 1985). O IRS-1 localiza-se no citoplasma e

na sua sequência básica são encontrados muitos sítios de fosforilação de serina, treonina e

tirosina.

Foi demonstrada uma associação entre a enzima fosfatidilinositol 3'-

quinase (PI3-K) com IRS-1 após estímulo com insulina através dos domínios YMXM e

YXXM do IRS-1 e os domínios SH2 da PI 3-kinase (FOLLI et al., 1992).

A PI3-K consiste de duas subunidades, uma catalítica e uma regulatória,

que contém dois sítios SH2 e desempenha um papel central nas ações metabólicas e

mitogênicas da insulina. A associação/ativação da PI3-K pela insulina pode transmitir

múltiplos sinais intracelulares. PI3-K catalisa a fosforilação dos fosfoinositóis na posição

três e produz fosfatidilinositóis, especialmente PI 3,4,5P3, que se liga a domínios de

diferentes moléculas sinalizadoras, alterando suas atividades e localizações intracelulares.

Além disso, esta proteína possui atividade serina quinase e tanto a subunidade catalítica

quanto a subunidade regulatória podem interagir com outras proteínas sinalizadoras.

Fosfatidilinositóis 3-fosfato regulam três classes principais de moléculas

sinalizadoras: a família das proteínas serina/treonina quinases AGC, a família das

GTPases Rho e a família de tirosinas quinases TEC.

A proteína mais bem caracterizada das quinases AGC é a PDK-1, quinase

dependente de fosfoinositol-1, que ativa a serina/treonina quinase AKT, também

conhecida como PKB. AKT tem sido sugerida como uma importante proteína na

transmissão do sinal insulínico, através da fosforilação da enzima glicogênio sintase

quinase 3 (GSK3), de fatores de transcrição denominados forkhead e do CREB.

A insulina estimula a MAPK (mitogen-activated protein kinase). Esta via

envolve a associação ao IRS-1 das seguintes proteínas: Shc, SHP2 e Grb-2. A proteína

SHP2 é uma fosfotirosina fosfatase que contém duas porções SH2 e se liga ao IRS-1

(SUN et al., 1991). Essa ligação ativa a fosfatase que parece exercer um importante papel

no crescimento celular induzido pela insulina. A Grb-2 é uma pequena proteína

citoplasmática que se liga ao IRS-1. A Grb-2 age como uma molécula adaptadora que

liga o fator permutador de guanina para a p21 ras, chamado mSOS (son-of-sevenless), a

fosfoproteínas como o receptor do EGF e o IRS-1. O complexo Grb/mSOS ativa a

p21ras, estimulando a sua ligação ao GTP.

A proteína ras se liga a Raf-1, a qual fosforila e ativa a MAP quinase

quinase (MAPKK), que finalmente ativará a MAP quinase (também conhecida como

ERK).

Desta forma o IRS-1 é uma proteína fundamental no processo de

transmissão do sinal insulínico, sendo recrutada na fase inicial dessa sinalização e

atuando como proteína ancoradoura capaz de ativar diversas enzimas.

Há pelo menos nove substratos do receptor de insulina descritos. Quatro

desses substratos compreendem a família de proteínas que apresentam homologia entre si

e são denominadas IRS-1, IRS-2, IRS-3 e IRS-4. Outros substratos incluem Gab-1,

p60dok, Cbl, APS e isoformas da proteína Shc (SALTIEL e KAHN, 2001).

As distintas proteínas IRSs parecem, portanto, servir a diferentes funções

celulares, provavelmente devido a diferenças na distribuição tecidual, localização

intracelular e atividade intrínseca das proteínas. Assim, há vários estudos sugerindo um

papel da sinalização insulínica no sistema nervoso central (SNC), na regulação da

ingestão alimentar, no crescimento e diferenciação neuronal, na liberação de

neurotransmissores e na plasticidade neuronal (BASKIN et al., 1999; SCHWARTZ et al.,

1992; HEIDENREICH, 1993; ROBINSON et al., 1994; JONAS et al., 1997; PLITZKO

et al., 2001).

Os receptores para insulina e para o IGF-I, no sistema nervoso central, são

muito semelhantes e compostos por duas subunidades, a �, à qual se liga o agonista, e a �,

que tem atividade de quinase específica para tirosina. As subunidades � de ambos os

receptores têm um peso molecular de 115.000 Da e as subunidades �, de 94.000 Da. O

receptor para o IGF-II apresenta estrutura monomérica e peso molecular de 250.000 Da,

sem atividade aparente de quinase.

O receptor para insulina apresenta maior afinidade à insulina do que para

IGF-I e IGF-II. O receptor para IGF-I tem alta afinidade para o IGF-I, mas também

reconhece o IGF-II e, em altas concentrações, a insulina. O receptor para IGF-II tem

maior afinidade para IGF-II do que para IGF-I, e não se liga à insulina (KAR et al.,

1993).

Os receptores para insulina no sistema nervoso central do rato foram

localizados e quantificados por ensaios de binding sites, e estão presentes em estruturas

como: cerebelo, bulbo olfatório, hipocampo, córtex, núcleos hipotalâmicos, substância

negra, gânglios da base, glândula pineal e outras (HILL et al., 1986; KAR et al., 1993).

Os receptores para IGF-I e II também foram caracterizados na glândula pineal (DE

KEYSER et al., 1994; SMITH et al., 1988), assim como o RNAm do receptor de

insulina, IGF-I e seus receptores e do IGF-II (PESCHKE et al., 2006.; AYER-LE

LIEVRE et al., 1991).

Em glândulas pineais cultivadas e tratadas com Losartan (antagonista do

receptor de Angiotensina II (AT1)), foi demonstrada uma inibição na síntese de

melatonina induzida pela noradrenalina, apresentando uma redução em todos os indóis

precursores da melatonina, mas principalmente do 5-HTP. Isso sugere uma ação

potencializadora da angiotensina II sobre a atividade da enzima TPH, possivelmente

dependente de vias de transdução que impliquem em fosforilação em tirosina

(BALTATU et al., 2002). Dessa forma, na glândula pineal, vê-se que a mobilização de

vias de transdução intracelular que impliquem na fosforilação de tirosina resulta na

amplificação do sinal da noradrenalina necessário para a síntese de melatonina. Assim, a

insulina promovendo fosforilações em resíduos de tirosina, poderia alterar a via de

síntese da melatonina na glândula pineal.

Em adição, a influência da melatonina inibindo a secreção da insulina (em

ilhotas de ratos isoladas), a qual também apresenta um ritmo circadiano observado nos

níveis plasmáticos, foi caracterizada (LIMA, et al., 1998; PICINATO et al., 2002 b, a).

Porém, a possível influência da insulina sobre a síntese de melatonina ainda não

caracterizada, nos possibilitou postular a hipótese de que o sinal insulínico modularia a

síntese de melatonina induzida pela noradrenalina.

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2 OBJETIVOS

Tivemos assim, como objetivo deste trabalho, estudar in vitro, utilizando

técnica de cultura de glândula pineal, o papel da insulina na regulação da síntese de

melatonina pela glândula pineal de ratos, através da quantificação de melatonina por

cromatografia líquida de alto desempenho com detecção eletroquímica e medição da

expressão e atividade das principais enzimas (TPH, NAT e HIOMT) envolvidas nesse

processo biossintético.

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3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar com peso corporal entre 150-

180g, fornecidos pelo biotério do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de

São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil. Os animais foram mantidos em um ciclo de 12h:

12h ciclo claro/escuro (início do período claro às 06:00 h, zeitgeber 0 (ZT0)),

acondicionados em biotério termorregulado (21 ± 2 oC), com comida e água ad libitum. O

protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal

(CEEA) do Instituto de Ciências Biomédicas da USP, protocolo no 79 fls 09 livro 2.

3.2 Culturas da Glândula Pineal

Os animais foram sacrificados por decapitação, e as glândulas pineais, 12

glândulas por grupo experimental, foram coletadas e colocadas imediatamente em meio

de cultura BGJb com fenol red (Fitton-Jackson Modification) modificado com BSA

(Albumina Sérica Bovina) (1 mg/mL), acrescido de glutamina (2 mM), ácido ascórbico

(0,1 mg/mL) e penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 µg/mL) (Gibco, Grand Island,

NY, 14072, USA), mantidas em gelo. No fluxo laminar as glândulas foram transferidas

para placas de cultura com 24 poços (2 glândulas por poço), contendo em cada poço 200

µL de meio de cultura e um disco de nylon de 4 mm, sobre o qual as glândulas foram

colocadas. As placas foram acondicionadas em uma câmara incubadora modular,

preenchida com carbogênio (95% O2 e 5% CO2), saturada de umidade, mantida na estufa

de CO2 a 37 oC (AFECHE et al., 2006).

3.2.1 Culturas padrão da glândula pineal

As glândulas foram mantidas em cultura por 48 h, sendo transferidas para

uma nova placa, com meio fresco, a cada 24 h. Após 48 h de cultura uma nova troca do

meio foi realizada e após as glândulas permanecerem 1 h no meio fresco, as glândulas

+ NORADRENALINA 10-6M

- NORADRENALINA

+ NORADRENALINA + INSULINA

12h

foram submetidas à estimulação, incubadas por 5 h de acordo com os seguintes

tratamentos: 1) Controle (grupos sem tratamento algum); 2) Nor (10-9M a 10-6M); 3) Nor

(10-6M) + Ins (10-9M a 10-7M) e Ins (10-8M) + Nor (10-9M a 10-6M) (Sigma Biochemical

CO, St. Louis, MO, USA). Após 5 horas, a incubação foi interrompida e as glândulas

coletadas individualmente em gelo seco, foram armazenadas a -80 ºC até a realização das

análises posteriores. Para o preparo das concentrações desejadas de Nor, foi utilizado HCl

0,01N com as diluições subseqüentes feitas em solução de Ác. ascórbico (50 mg/L)

(Figura 11).

Figura. 11. Desenho experimental da cultura padrão da glândula pineal. As glândulas foram incubadas na presença de noradrealina e noradrenalina + insulina por 5 h após 48 h em cultura.

3.2.2 Culturas temporizadas pela noradrenalina

Nas culturas temporizadas pela noradrenalina os animais foram

sacrificados e as glândulas cultivadas pouco antes do horário de transição do período

claro para o escuro (ZT 11). A temporização noradrenérgica foi realizada desde o

primeiro dia de cultura, pela adição de Nor (10-6M) por 12 horas em cada período de 24

h, em um total de 48 h de cultura, validada pela atividade da NAT (figura em anexo).

5h5h5h

Semelhantemente à cultura padrão da glândula pineal, a cada período de 24 h o meio de

cultura foi trocado. Após 48 h de cultura uma nova troca do meio foi realizada e após as

glândulas permanecerem 1 h no meio fresco, as glândulas foram submetidas à

estimulação, incubadas por 5 h com: Nor (10-6M) e Nor (10-6M) + Ins (10-8M). Após 5

horas, a incubação foi interrompida e as glândulas coletadas individualmente em gelo

seco, foram armazenadas a -80 ºC até a realização das análises subseqüentes (Figura 12).

Figura. 12. Desenho experimental da cultura temporizada pela adição de noradrenalina (10-6M ) por 12

h em intervalos de 24 h. As glândulas foram incubadas na presença de noradrenalina e noradrenalina (10-6M) + insulina (10-8M ) por 5 h após 48 h em cultura.

3.3 Dosagem de Melatonina

O conteúdo de melatonina presente nas glândulas pineais foi dosado por

cromatografia líquida de alta resolução com detecção eletroquímica (Waters System,

Milford, MA, USA). O sistema cromatográfico é composto por uma bomba Waters® 600

operada isocraticamente, uma coluna Resolve C18 (partícula esférica de 5µm;

3,9x150mm) e um detector eletroquímico 464 operado em modo DC, controlado pelo

programa computacional Empower (Waters System, Milford, MA, USA) através de uma

interface Bus/SATIN.

5h5h5h

Cada glândula foi sonicada (Microson XL 2005, Heat System Inc.,

Farmingdale, NY, USA) por 10 s em 120 µL de uma solução de ácido perclórico (0,1 M),

EDTA (0,02%) e metabissulfito de sódio (0,02%). Foram então centrifugadas por 2min a

13000 g (Eppendorf 5415C Centrifuge, Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY,

USA), retirando-se o sobrenadante, injetado no sistema de cromatografia (Injetor Mod.

7125, com loop de 20 µl, Rheodyne Inc., CA, USA).

O sistema utilizado é o de cromatografia de fase reversa, isocrática, tendo

como fase móvel uma solução contendo tampão acetato de sódio 0,1 M e ácido cítrico 0,1

M, EDTA 0,15 M e metanol (30%), com fluxo de 1 mL/min, potencial de oxidação de

900 mV e duração de aproximadamente 6 minutos para cada corrida.

Foram realizadas no início das dosagens curvas de calibração com 4

concentrações conhecidas do padrão (melatonina). As curvas de calibração foram obtidas,

usando-se o programa Empower da Waters, pela relação das diferentes concentrações de

cada padrão com as áreas dos picos correspondentes nos cromatogramas. A identificação

do pico de melatonina das amostras foi realizada pela comparação de seu tempo de

retenção com a dos padrões, e a quantificação realizada pelo programa computacional.

Soluções-estoque do padrão de melatonina (1 mM) foram preparadas em

HCl 0,1M, acrescido de EDTA 0,02% e metabissulfito de sódio 0,02%, aliquotadas em

tubos de microcentrífuga, e mantidas a -80 °C. Na ocasião de sua utilização, foram

descongeladas e diluídas em uma solução de ácido perclórico 0,1 M, EDTA 0,02% e

metabissulfito de sódio 0,02%, para a obtenção das concentrações desejadas.

3.4 Atividades Enzimáticas

3.4.1 Análise radiométrica da atividade da TPH

O método baseia-se na quantificação do [3H]-5-hidroxitriptofano, que é o

produto da reação catalisada pela enzima triptofano hidroxilase (TPH) e que tem como

precursor o [3H]triptofano.

Após os tratamentos, cada glândula foi sonicada em 0,2% de Triton X-100

em tampão fosfato de sódio (2 mM, pH=7, 40 µL). À cada amostra foram acrescentados:

HEPES (0,5 M, pH 7), catalase (1 mg/mL), triptofano (2 mM), ditiotreitol (1 M),

Fe(NH4)2 (SO4)2 (1 mM), 6-MPH4 (6-Metiltetrahidropteridina) (20 mM), de modo a

obter-se, respectivamente, as seguintes concentrações finais: 50 mM, 100 µg/ml, 50 µM,

5 mM, 10 µM, 500 µM; e 1 �l de [3H]triptofano (1 mCi/mL – previamente seco com

nitrogênio). O material foi incubado em banho-maria a 37 °C por 10 minutos. Em

seguida, foi acrescentada uma solução de carvão ativado (7,5% em 1 M HCl, 500 �L) de

modo a interromper a reação. As amostras foram centrifugadas por 2 minutos a 8000 rpm

(2 vezes). 200 µL do sobrenadante foram transferidos para tubos de cintilação. O líquido

de cintilação para amostras aquosas (Optiphase Hisafe-PerkinElmer) foi acrescentado e a

radioatividade foi determinada pela contagem em contador � (Beckman – LS 6500),

incluindo os brancos e totais.

3.4.2 Análise radiométrica da atividade da NAT

O método baseia-se na quantificação da N-[3H] acetiltriptamina que é o

produto da reação da [3H] acetil-coenzima A ([3H] acetil CoA) e da triptamina, como uma

indicação da atividade da enzima N-acetiltransferase. O produto marcado foi extraído em

clorofórmio e medida a radioatividade (DEGUCHI e AXELROD, 1972; modificado por

PARFITT et al., 1975).

Para isso, foram adicionados aos tubos de microcentrífuga, contendo uma

glândula pineal, 25 µl de triptamina (40 mM), 25 µL de [3H] acetilCoA (2 mM, atividade

final= 4 mCi/ mmol) e 50 µL de tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH= 6,8), mantidos no

gelo. As glândulas foram sonicadas e incubadas em banho seco a 37 ºC, por 20 minutos.

Em seguida, em cada amostra foi acrescentado 1 mL de clorofórmio saturado com água,

agitado por 1 minuto. Para a separação completa das fases aquosa e lipossolúvel, as

amostras foram centrifugadas por 40 s, a 14000 rpm.

A fase aquosa foi removida e foi acrescentado 200 µL do tampão fosfato.

Novamente as amostras foram agitadas, centrifugadas e a fase aquosa foi removida. 500

µL do clorofórmio contendo o produto da reação (3H-N-acetiltriptamina) foram

transferidos para o tubo de cintilação. Após a evaporação total do clorofórmio contendo o

produto da reação, o líquido de cintilação para amostras não-aquosas (Optiphase Hisafe-

PerkinElmer) foi acrescentado e a radioatividade medida em contador β (Beckman – LS

6500), incluindo os brancos e totais.

3.4.3 Análise radiométrica da atividade da HIOMT

Os substratos utilizados para a avaliação da atividade da enzima HIOMT

foram 14[C]-S-adenosil-L-metionina e N-acetilserotonina. O produto (14[C] melatonina)

foi extraído em clorofórmio e medida a sua radioatividade (RIBELAYGA et al., 1997).

As glândulas pineais foram sonicadas separadamente em tampão fosfato

de sódio (0,05 M, pH=7,9, 50 µL) e, em seguida, acrescentados 150 µL de uma solução

contendo 14C-S-adenosil-L-metionina (atividade 43,8 mCi) e N-acetilserotonina (1 mM).

As glândulas foram incubadas em banho seco por 30 minutos a 37 °C. Após 30 minutos

as amostras foram mantidas no gelo e acrescentados 200 µL de tampão borato de sódio

(12,5 mM, pH=10) e 1 mL de clorofórmio saturado em água, de modo a interromper a

reação. Os tubos foram agitados por 15 s e centrifugados a 13000 rpm (centrifuga

Eppendorf, Mod. 5804R) por 5 minutos a 4 °C. A fase aquosa foi aspirada e dispensada e

novamente acrescentados 200 µL de tampão borato de sódio. Os tubos foram agitados,

centrifugados e novamente retirada a fase aquosa. 600 µL do clorofórmio foram

transferidos para tubos de contagem e, após a total evaporação do clorofórmio, foi

acrescentado o líquido de cintilação para amostras não-aquosas (Optiphase Hisafe-

PerkinElmer) e contada a radioatividade em contador β (Beckman – LS 6500), incluindo

os brancos e totais.

3.5 Extração de RNA e Análise Quantitativa por PCR em Tempo-Real

A extração de RNA e a quantificação das amostras por PCR em tempo-

real (7900 HT Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystem, Foster city, CA, USA),

foram realizadas de acordo com os protocolos previamente publicados (BRAY et al.,

2008; YOUNG et al., 2002; GIBSON et al., 1996; CHOMCZYNSKI et al., 1987;

DEPRE et al., 1998). Para a quantificação da expressão dos genes pesquisados por PCR

em tempo-real foram desenhados, especificamente para cada gene analisado, primers e

probes utilizando o programa computacional Primer Express 3.0 (Applied Biosystem,

Foster city, CA, USA) a partir das respectivas seqüências disponibilizadas pelo banco

genômico (GenBank). As seqüências dos primers e probes (Taqman®) para os genes da

tph, nat e hiomt estão descritos na tabela 1 (ver anexos). Padrões de RNA foram

preparados para cada gene pesquisado, pelo uso do método T7 polimerase (Ambiom,

Austin, TX, USA), a partir do RNA total extraído das glândulas pineais; o uso dos

padrões de RNA permite a quantificação absoluta da expressão gênica. Foram preparados

padrões com concentrações conhecidas de RNA (2 pg; 200 fg; 20 fg; 2 fg e 0.2 fg/µl),

proporcionando-se assim a construção de uma curva de calibração, permitindo-se a

quantificação absoluta das amostras. Para a quantificação absoluta das expressões gênicas

foi utilizado o programa computacional SDS 2.2.2 (Applied Biosystem, Foster city, CA,

USA). A correlação entre o Ct (número de ciclos de PCR necessários para alcançar o

limiar de detecção do sinal de fluorescência) e a quantidade dos padrões de RNA foi

linear para todos os padrões preparados. Os resultados das expressões gênicas foram

representados como moléculas de RNAm por ng de RNA total (20 ng RNA total). As

figuras a seguir exemplificam a curva de calibração dos padrões (plaqueados em

duplicatas) e a correlação do número de ciclos e o sinal de fluorescência, assim como o

gráfico da amplificação das amostras (Figuras 13 A e B).

Figura. 13 A. Exemplificação da construção da curva de calibração e da correlação do número de ciclos e o sinal de fluorescência.

Figura. 13 B. Exemplificação do plotter de amplificação das amostras quantificadas correlacionadas com a curva de calibração construída pelos devidos padrões.

3.6 Análise Estatística

Os conteúdos de melatonina (expressos em ng/glândula), as atividades

enzimáticas (expressas em pmol/glândula/h) e os resultados das expressões gênicas

(moléculas/ng RNA total) foram representados como média ± SEM. Para cada bloco

experimental (3 replicatas) foi utilizado o teste ANOVA (Análise de Variância de uma

via), seguido de comparações entre grupos pelo teste de Bonferroni. Quando vários

grupos experimentais foram comparados a um grupo controle foi utilizado o teste de

segunda ordem de Dunnett. O programa utilizado para análise estatística foi o Graphpad

Prism data analysis and graph package (v 4.03, GraphPad Software, Inc., San Diego,

California, USA).

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4 RESULTADOS

4.1 Culturas Padrão da Glândula Pineal

Nos primeiros experimentos, utilizou-se noradrenalina em uma

concentração de 10-6M, como controle positivo, associada a diferentes concentrações de

insulina (10-9M a 10-7M). A figura 14 mostra o efeito da estimulação aguda da síntese de

melatonina induzida pela noradrenalina, com adicional potencialização da síntese pela

insulina. Foram observadas diferenças significativas nas médias dos grupos em

comparações entre o grupo controle (sem estimulação) e o grupo controle positivo (Nor

10-6M; P <0,001), adicionalmente aumentada para o grupo Nor+Ins 10-8M (P <0,01)

versus o grupo controle positivo.

Figura 14. Cultura padrão da glândula pineal. Efeito das diferentes concentrações de insulina sobre a

síntese de melatonina associadas com noradrenalina (10-6M). Na abscissa: grupos experimentais representados como média ± SEM, correlacionados com os valores da ordenada expresso em ng/glândula. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparison Test. #P < 0,001 vs controle e *P < 0,01 vs Nor 10-6M.

Sob o mesmo protocolo de estimulação referido na figura 14, foi realizado

um novo tratamento das culturas de glândulas pineais, no qual, diferentemente ao

Controle M-6

Nor 10

M-9

Nor+Ins1

0M-8

Nor+Ins1

0M-7

Nor+Ins1

0

0

5

10

15

#

*

Mel

aton

ina

ng/g

lând

ula

experimento mostrado na figura anterior, foram utilizadas várias concentrações de

noradrenalina, de 10-9M a 10-6M, e a concentração de insulina de 10-8M foi mantida fixa.

Analisando a indução da síntese de melatonina, foram obtidas respostas máximas para os

grupos: Ins+Nor 10-6M (P <0,001), seguido do grupo Ins+Nor 10-7M (P <0,05), em

comparações com seus respectivos grupos controles (Nor 10-6M; Nor 10-7M,

respectivamente), mostrando que o efeito da insulina foi observado somente diante da

resposta máxima (9.41 ± 0.63 vs. 13.20 ± 0.80 ng/glândula; P=0.002), uma vez que não

foram caracterizadas diferenças entre as EC50s (6.9 x 10-8 vs 5.5 x 10-8 M; P>0.05)

(Figura 15).

Figura 15. Curva dose-resposta para noradrenalina e noradrenalina+insulina , relacionando as

concentrações com os valores da quantificação da melatonina expressos em ng/glândula, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni's Multiple Comparison Test. *P<0,05 vs Nor 10-7M, # P<0,001 vs Nor 10-6M.

4.2 Culturas Temporizadas pela Noradrenalina

Nas culturas temporizadas pela noradrenalina, pode-se observar que o

fator temporização por si provocou um aumento adicional na síntese de melatonina em

comparação com o tratamento noradrenérgico agudo (Nor 10-6M (T) vs Nor 10-6M (A); P

<0,01). O efeito potencializador da insulina também pode ser observado diante da

temporização noradrenérgica, promovendo um efeito similar ao demonstrado nos grupos

3

6

9

12

15

Mel

aton

ina

(ng/

glân

dula

)

10-9 10-8 10-7 10-6

[Noradrenalina] M

Noradrenalina

Noradrenalina +Insulina 10-8M

tratados agudamente (Nor 10-6M (T) + Ins 10-8M vs Nor 10-6M (T); P <0,01) (Figura

16).

Figura 16. Cultura temporizada pela noradrenalina. (A) grupos experimentais estimulados agudamente

pela noradrenalina e noradrenalina associada à insulina. (T) grupos experimentais temporizados pela noradrenalina, associados ou não à insulina. Os valores da quantificação da melatonina estão expressos em ng/glândula, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s multiple comparisons test, #P< 0.001 vs demais grupos, *P< 0.05 vs Nor 10-6M (A), ***P< 0.01 vs Nor 10-6M (A), **P< 0.001 vs Nor 10-6M (A), +P< 0.01 vs Nor 10-6M (T), @P< 0.05 vs Nor 10-6M (A) + Ins 10-8M.

4.3 Atividades Enzimáticas

As atividades das enzimas-chave envolvidas na síntese da melatonina

foram avaliadas no intuito de revelar suas respectivas participações no processo

biossintético da melatonina, induzida pela noradrenalina de maneira aguda e temporizada,

potencializada ou não pela ação da insulina.

Controle

M (A

)

-6

Nor 10

M-8

M (A) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

M (T)

-6

Nor 10

M-8

M (T) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

0

5

10

15

20@

#

***

**

*

+M

elat

onin

ang

/glâ

ndul

a

Temporizado Agudo

4.3.1 Atividade da TPH

Nas culturas de glândulas destinadas ao estudo da atividade da TPH, foi

observado um aumento significativo da atividade enzimática diante da estimulação

noradrenérgica aguda associada à insulina (Nor 10-6M (A) + Ins 10-8M vs Nor 10-6M (A);

P< 0,001). Nas culturas temporizadas também se pode observar um aumento na atividade

da TPH, porem somente para o grupo Nor 10-6M (T) (P <0,01). A associação da insulina

no grupo temporizado não alterou o padrão de resposta observado no seu respectivo

controle (Nor 10-6M (T)) (Figura 17).

Figura 17. Análise da atividade da TPH em culturas estimuladas pela noradrenalina de maneira aguda (A) e temporizada (T), avaliando a formação do produto 3H-5 hidroxitriptofano. Valores expressos em pmols/glândula/h, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparison Test. *P <0,001 vs Controle; # P < 0,001 vs Nor 10-6M (A); *** P < 0,01 vs Nor 10-6M (A); **P < 0,05 vs Controle.

Controle

M (A)

-6

Nor 10

M-8

M (A) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

M (T)

-6

Nor 10

M-8

M (T) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

0

50

100

150

200

250

*

**

****

#

Ati

vida

de d

a TP

H3 H

-5 h

idro

xitr

ipto

fano

pmol

/gl/h

Agudo Temporizado

4.3.2 Atividade da NAT

Em relação aos estudos onde a atividade da NAT foi analisada, uma

atividade noradrenalina-dependente foi caracterizada, mostrada pelos grupos: Controle vs

Nor 10-6M (A) e Nor 10-6M (T); P <0,001. Na estimulação noradrenérgica aguda, a

insulina não foi capaz de alterar o padrão de atividade em relação ao seu grupo controle

positivo. Diferentemente, no tratamento temporizado a atividade da NAT demonstrou-se

significativamente alterada (P <0,01), e adicionalmente, essa atividade foi potencializada

pela associação da insulina ao tratamento (Nor 10-6M (T) vs Nor 10-6M (T) + Ins 10-8M;

P< 0,01). (Figura 18).

Figura 18. Análise da atividade da NAT em culturas estimuladas pela noradrenalina de maneira aguda (A)

e temporizadas (T), avaliando a formação do produto N-3H acetiltriptamina. Valores expressos em pmols/glandula/h, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparison Test. *P <0,001 vs Controle, **P <0,01 vs Nor 10-6M (T), ***P <0,001 vs Nor 10-6M (T) + Ins 10-8M, @P <0,001 vs NE 10-6M (T), #P <0,01 vs Nor 10-6M (T) + Ins 10-8M.

Controle

M (A)

-6

Nor 10

M-8

M (A) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

M (T)

-6

Nor 10

M -8

M (T) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

0

1000

2000

3000

*

****#

*** ***@

*

Ati

vida

de d

a N

AT

N-3 H

ace

tilt

ript

amin

apm

ol/g

l/h

Agudo Temporizado

4.3.3 Atividade da HIOMT

Na análise da atividade da HIOMT, apesar de se caracterizar uma

tendência ao aumento da atividade enzimática no tratamento noradrenérgico, não foram

observadas diferenças significativas para os grupos com tratamento agudo e temporizado.

Diante da associação da insulina aos tratamentos, nenhum efeito que levasse à

modificação da atividade da enzima foi observado (Figura 19).

Figura 19. Análise da atividade da HIOMT estimuladas pela noradrenalina de maneira aguda (A) e

temporizada (T), avaliando a formação do produto 14C Melatonina. Valores expressos em pmols/glandula/h, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparisons Test.

Controle

M (A)

-6

Nor 10

M-8

M (A)+

Ins 1

0

-6

Nor 10

M (T)

-6

Nor 10

M -8

M (T)+

Ins10

-6

Nor 10

0

150

300

450

Ati

vida

de d

a H

IOM

T14

C M

elat

onin

apm

ol/g

l/h

Agudo Temporizado

4.4 Expressão Gênica por PCR em Tempo-Real

O estudo da expressão gênica, tph, nat e hiomt, mostrou-se necessário para

se esclarecer o possível mecanismo de regulação (em nível transcricional ou pós-

transcricional) induzido pelos tratamentos.

4.4.1 Expressão da tph

Diferentemente do observado na figura 18 (atividade enzimática), o

tratamento insulínico não alterou a expressão da tph em ambos os tratamentos (agudo e

temporizado). Adicionalmente, a temporizarão noradrenérgica não promoveu alterações

no padrão da expressão gênica (Figura 20).

Figura 20. Análise da expressão da tph por PCR em tempo-real. Glândulas estimuladas pela noradrenalina

de maneira aguda (A) e temporizada (T). Valores expressos em moléculas de RNAm/ng de RNA total, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparisons Test.

Controle

M (A)

-6

Nor 10

M-8

M (A) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

M (T)

-6

Nor 10

M-8

M (T) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

0

30000

60000

90000

120000

tph

RN

Am

/ ng

RN

A t

otal Agudo Temporizado

4.4.2 Expressão da nat

Coincidentemente com a atividade da NAT (figura 18), a expressão gênica

também apresentou (como esperado) a regulação noradrenérgica-dependente, observada

na comparação do grupo controle com o grupo controle positivo (Nor 10-6M (A)) e

demais grupos (P <0,001). A adição da insulina aos dois protocolos de estimulação

(agudo e temporizado) não induziu alteração na expressão do gene, o que também foi

observado para o grupo somente temporizado pela noradrenalina (Figura 21).

Figura 21. Análise da expressão da nat por PCR em tempo-real. Glândulas estimuladas pela noradrenalina

de maneira aguda (A) e temporizada (T). Valores expressos em moléculas de RNAm/ng de RNA total, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparisons Test. *P <0,001 vs demais grupos.

4.4.3 Expressão da hiomt

De maneira similar à analise da atividade da HIOMT (figura 19), os

tratamentos noradrenérgicos (agudo e temporizado), assim como a adição da insulina aos

Controle

M (A)

-6

Nor 10

M-8

M (A) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

M (T)

-6

Nor 10

M-8

M (T) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

0

3000

6000

9000 ** **

nat

RN

Am

/ ng

RN

A t

otal

Agudo Temporizado

respectivos tratamentos, não promoveram alterações na expressão da hiomt, com exceção

do grupo Nor 10-6M (T) + Ins 10-8M comparado ao controle (sem estímulo) (Figura

22).

Figura 22. Análise da expressão da hiomt por PCR em tempo-real. Glândulas estimuladas pela noradrenalina de maneira aguda (A) e temporizada (T). Valores expressos em moléculas de RNAm/ng de RNA total, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparisons Test. *P <0,05 vs Controle.

Controle

M (A)

-6

Nor 10

M-8

M (A) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

M (T)

-6

Nor 10

M-8

M (T) +

Ins 1

0

-6

Nor 10

0

350

700

1050

1400 *hi

omt

RN

Am

/ ng

RN

A t

otal

Agudo Temporizado

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5 DISCUSSÃO

Cultura padrão da glândula pineal

De acordo com resultados previamente descritos (AFECHE et al., 2006;

BARBOSA, 2000), foi utilizada como constituinte dos grupos controles positivos, a

noradrenalina numa concentração de 10-6M, sendo esta uma concentração ideal para a

indução da síntese de melatonina em glândulas pineais cultivadas. Adicionalmente,

construiu-se uma curva dose-resposta para noradrenalina, onde se pode validar o efeito

indutor da noradrenalina como controle positivo nesses experimentos, acordando com os

resultados previamente descritos (Figura 15).

No primeiro bloco experimental, a síntese de melatonina em glândulas

cultivadas foi induzida agudamente pela estimulação noradrenérgica (controle positivo).

No intuito de se testar a hipótese formulada, foram analisados os efeitos de diferentes

concentrações de insulina, associadas ao principal estímulo indutor da síntese da

melatonina (noradrenalina). Pôde-se correlacionar ao efeito indutor noradrenérgico um

aumento significativo no conteúdo de melatonina, diante da associação insulínica na

concentração de 10-8M (Figura 14).

Adicionalmente, a concentração de insulina 5nM foi utilizada no

tratamento de cultura de células primárias (adipócitos), concentração esta que

corresponde à concentração da estimulação máxima do transporte de glicose, além de ser

uma concentração muito próxima da concentração fisiológica, que é da ordem de 10-9M

(ALONSO-VALE et al., 2006).

O fato de que uma concentração maior de insulina do que 10-8M não

promoveu um efeito dose-dependente sobre a síntese de melatonina pode ser justificado

uma vez que concentrações maiores de insulina podem agir não somente em receptores

de insulina, mas também em receptores de IGF do tipo I e II (KAR et al., 1993). Os quais

ocasionalmente já foram caracterizados e descritos como presentes na glândula pineal

(SMITH et al., 1988.; DE KEYSER et al., 1994.; AYER-LE LIEVRE et al., 1991). Dessa

forma, a insulina poderia atuar em um cross talk ou em uma cross-activation, diminuindo

assim a especificidade da sinalização da insulina. Suplementarmente, em experimentos

preliminares, a utilização da insulina no tratamento das culturas de glândulas pineais na

ausência de Nor não promoveu alteração no padrão da indução da síntese da melatonina

em comparação com seu respectivo controle (dado não mostrado).

Complementando a caracterização do papel da insulina na potencialização

da síntese de melatonina nos tratamentos agudos, na figura 15, onde as curvas dose-

resposta para noradrenalina e noradrenalina associada à concentração fixa de insulina (10-

8M) foram construídas, pôde-se evidenciar o efeito potencializador da insulina quando

associada à concentração de noradrenalina de 10-6M, promovendo assim a indução

máxima da síntese de melatonina.

Na tentativa de identificar o possível mecanismo pelo qual a insulina

associada à noradrenalina estaria promovendo a potencialização da síntese da melatonina

em glândulas pineais cultivadas, as análises das atividades das enzimas envolvidas na

síntese da melatonina, assim como os estudos das expressões gênicas foram realizados.

Isso permitiu estabelecer-se o nível de participação do mecanismo recrutado, seja em

nível transcricional e/ou pós-transcricional.

O aumento na síntese de melatonina diante do estimulo noradrenérgico

associado à insulina nos experimentos agudos (Figs. 14 e 15) pode ser justificado uma

vez que a atividade enzimática da TPH foi significativamente aumentada para o grupo de

mesmo tratamento (Figura 17).

Estudos recentes caracterizaram diferentes mecanismos capazes de ativar a

enzima TPH, seja por mecanismo dependente de fosforilação em tirosina, seja por PKA,

e até mesmo via indução da transcrição gênica. Dessa forma, a sinalização da

angiotensina II de maneira tirosina kinase, dependente do receptor AT1, em culturas de

glândulas pineais incubadas com losartan (antagonista do receptor AT1), participa na

ativação da TPH, promovendo uma redução em todos os indóis precursores da

melatonina, mas principalmente do 5-HTP (BALTATU et al., 2002). A ativação da via

tirosina quinase através do receptor AT1 também foi caracterizada por DOAN e

colaboradores (2001).

O aumento da atividade da TPH também foi caracterizado como

dependente da fosforilação por PKA (EHRET et al., 1991; JOHANSEN et al., 1995), e

pela CaMK e/ou PKC (RIBELAYGA et al., 1999). Assim, com a ativação da cascata de

sinalização induzida pela insulina, sabidamente poderia se ter a ativação da PI3-K e PKC

(SALTIEL e KAHN, 2001), levando à possível fosforilação direta da TPH, e à

potencialização da atividade da AC aumentando os níveis de AMPc, com conseqüente

ativação da PKA (KLEIN et al., 1983; SUGDEN e KLEIN, 1988; SUGDEN et al., 1988).

Devido ao fato de que o aminoácido triptofano é pré-requisito na síntese

de serotonina, a insulina poderia estar induzindo a captação de aminoácidos (CYNOBER,

2002), nas glândulas em cultura. Entretanto, estudos previamente publicados

demonstraram que a síntese de serotonina, em cultura de pinealócitos, não é limitada pela

taxa de captação do triptofano (GUTIERREZ et al., 2003).

Alternativamente, apesar da transcrição do gene da TPH poder ser

induzida por ativação da MAP quinase (WOOD e RUSSO, 2001), pudemos observar com

as análises das expressões gênicas que, de forma aguda (Figura 20), o mecanismo

transcricional induzido pela insulina sobre a referida enzima parece não participar na

potencialização da síntese de melatonina em glândulas pineais em cultura, o que é

consistente com os estudos que caracterizaram a atividade da TPH mediada por

mecanismos pós-transcricionais.

Dessa forma, nos experimentos com estimulação aguda, o efeito

potencializador observado pela associação da insulina ao tratamento noradrenérgico

aparentemente não se deveu ao aumento das atividades da NAT e da HIOMT, assim

como o das expressões gênicas (Figuras 18, 19 e 21, 22, respectivamente).

Culturas temporizadas pela noradrenalina

Nas culturas temporizadas pela noradrenalina (10-6M), tentou-se criar um

novo modelo de cultura de glândula pineal que pudesse se assemelhar ao ciclo de

estimulação in vivo. Períodos de 12 h de estimulação foram alternados com períodos de

igual duração, porém não-estimulados (ver materiais e métodos). Esse procedimento por

si foi capaz de induzir um aumento na síntese de melatonina maior do que o observado no

grupo estimulado agudamente. Semelhante ao tratamento agudo, o efeito de

potencialização da síntese da melatonina pela adição da insulina foi observado (Figura

16).

Da mesma forma que tentou-se esclarecer o mecanismo responsável pelo

aumento na síntese de melatonina pela insulina no tratamento agudo, o mesmo foi

averiguado no grupo temporizado, através das análises das expressões e atividades das

enzimas-chave envolvidas na biossíntese da melatonina.

Nas culturas temporizadas pela noradrenalina pode-se observar um

aumento significativo nas atividades das enzimas TPH e NAT. Entretanto, a associação

da insulina promoveu um aumento adicional na atividade da NAT (Figuras 17 e 18).

Novamente o efeito potencializador insulínico foi caracterizado em nível pós-

trancricional, uma vez que as expressões gênicas demonstraram-se inalteradas (Figuras

20- 22).

Assim, os dois modelos de cultura da glândula pineal apresentam

diferenças quanto à resposta da síntese de melatonina, sendo que as glândulas

temporizadas apresentaram uma resposta aumentada em comparação aos controles

positivos, caracterizando e enfatizando a importância do ritmo circadiano fisiológico da

liberação de noradrenalina no interstício da glândula, o qual sabidamente é um dos

principais reguladores da NAT e TPH.

A regulação da transcrição e atividade da NAT vem sendo extensivamente

estudada nos últimos tempos (KLEIN, 2007). Porém, acredita-se que ainda não foram

elucidados todos os processos responsáveis por essa regulação. Um dos processos

envolvidos na estabilização e proteção da NAT contra a proteólise proteassomal é a

interação que ocorre com a proteína 14-3-3, após sua ativação (KLEIN et al., 2002). Em

estudo recente, foi demonstrado que o estímulo insulínico é capaz de promover a

interação da proteína 14-3-3 com o substrato AKT, presente na via de sinalização da

insulina (RAMM et al., 2006). Entretanto, a possibilidade que ainda remanesce a ser

testada é a de que: a interação da proteína 14-3-3/NAT estimulada pela insulina seria a

responsável pelo aumento observado na atividade da NAT?

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6 CONCLUSÕES

Os resultados sugerem uma interação entre noradrenalina e insulina, com a

insulina potencializando a síntese de melatonina induzida pela noradrenalina em

glândulas pineais de ratos em cultura. Esse efeito ocorre aparentemente em nível pós-

transcriscional, uma vez que não foram observadas alterações nas expressões gênicas.

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����� ����� ����� �����

ANEXO A – Tabela 1. Seqüência de primers e probes para tpoh, aanat e hiomt, para análise

quantitativa por PCR em tempo real.

Gene Primer/Probe Sequence

Tpoh

Forward

Reverse

Probe

5’ –GCTGAACCCAGTTTTGCTCA –3’

5’ –TTGCTTGCACAGTCCAAACTC –3’

5’6 –FAM – AAGTAGCACGTTGCCAGTTTCTGAACCG – TAMRA – 3’

Aanat

Forward

Reverse

Probe

5’ –CCACCAGTGCGTTTGAGATT –3’

5’ –GACACAGGGTGAGGAAGTGC –3’

5’ 6 –FAM – AGCGCGAAGCCTTTATCTCAGTCTCG – TAMRA – 3’

Hiomt

Forward

Reverse

Probe

5’ –GGGCAAGACCCAGTGTGAG –3’

5’ –GGGCAAGAATGAAGAGGTCAG –3’

5’6 –FAM –TTTGTCGCTGGTGACTTCTTCCGTTC– TAMRA – 3’

ANEXO B – Figura complementar. Atividade da NAT em culturas de glândulas pineais

temporizadas pela noradrenalina em ciclos de 48 e 72 h.

Figura complementar. Análise da atividade da NAT em culturas estimuladas pela noradrenalina de

maneira aguda (A) e temporizadas (T) por 48 e 72 h, avaliando a formação do produto N-3H acetiltriptamina. Valores expressos em pmols/glândula/h, representados como média ± SEM.

Controle

M (A)

-6

Nor 10

M (T) 4

8h

-6

Nor 10

M (T) 7

2h

-6

Nor 10

0

300

600

900

1200A

tivid

ade

da N

AT

H3 -N

ace

tiltr

ipta

min

apm

ols/

gl/h

ANEXO C – Artigos completos publicados em periódicos I) Publicação da tese

II) Demais artigos publicados durante o doutorado

ANEXO D – Artigo em preparação

Melatonin receptors and circadian clock genes expressions

within cultured rat cardiomyocytes

Rodrigo Antonio Peliciari Garcia1,2, Melissa Moreira Zanquetta2, Molly S. Bray2, José

Cipolla Neto1, Martin E. Young2.

1 University of Sao Paulo, Institute of Biomedical Sciences, Department of Physiology

and Biophysics, Sao Paulo, SP, Brazil.

2 USDA/ARS Children’s Nutrition Research Center (CNRC), Baylor College of

Medicine, Department of Pediatrics, Houston, TX, USA.

Key words: melatonin, circadian clock genes, cardiomyocytes, nuclear receptors, ROR,

RORE.

Running title: Melatonin receptors and clock genes in heart

Address for correspondence:

Martin E. Young, D. Phil.

United States Department of Agriculture/Agricultural Research Service. Children’s

Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, Dept. of Pediatrics, 1100 Bates

St. Suite 5078, Houston, TX, 77030, USA.

Tel. 713-798-7567; Fax 713-798-7101

E-mail: meyoung@bcm.tmc.edu

Abstract

The pineal gland hormone melatonin provides the entrainment of various rhythms

to the external light/dark cycle. Recently, cardiovascular studies have demostrated that

melatonin interacts with many physiological processes and diseases as hypertension and

cardiopathologies. Down regulating blood pressure in nocturnal hypertension patients,

melatonin seems to be involved with: protective effects in the heart after infarction,

reduction of ventricular arrhythmias and preservation of capillary perfusion during

ischemia-reperfusion events. Additionally, cardiomyocytes circadian clocks might be

responsible for a great variety of intrinsic cell regulations, controlling contractile

function, metabolism and gene expression. Melatonin receptors (MT1, MT2, and

RZR/ROR) have been reported to be expressed in the heart but whether melatonin affects

and/or alters the pattern of gene expression within the cardiomyocytes, especifically the

circadian clock genes, was not established. Thus, the aim of this study was to evaluate

whether melatonin directly influences circadian clock genes expressions within cultured

rat cardiomyocytes. Adult cardiomyocyte isolation and cultures were performed,

melatonin 1nM and/or ethanol as vehicle were used for all treatments and gene

expressions were assayed by Real-Time PCR. Expression of melatonin receptors mt1,

mt2 and ror� was established within adult rat cardiomyocytes, highlighting the nuclear

receptor ror� expression. Melatonin did not alter the rhythmic expression pattern of

analyzed circadian genes, although avoided the decline in rev-erb� expression keeping its

expression chronically high for 12 hours. Thereby, in adult rat cardiomyocytes, melatonin

seems to exerce its action via nuclear receptor, potentially mediating an important role on

the light signal transduction to peripheral organs as the heart.

INTRODUCTION

The neurohormone melatonin synthesized by the pineal gland exclusively during

the dark period, reflecting the dark phase duration, characterizes a typical circadian and

seasonal rhythmic variation. The retino hypothalamic pathway (RHP), via

suprachiasmatic nuclei (SCN), regulates melatonin synthesis, controlling the

norepinephrine release in the pineal gland perivascular space at night [1], complementally

modulated by peptidergic systems [2-5]. Signalizing period and duration of night to the

body, melatonin provides the entrainment of various rhythms to the ambiental cycles,

including light/dark (LD) [6, 7] and seasonal cycles, for example, entraining the

sleep/awake cycles and reproductive rhythm [8].

The role of melatonin on the regulation of many physiological processes has been

extensively studied. Classically, its effects are well known on the amelioration of some

circadian rhythm disorders found on jet lags, shift workers, as well as on sleep disorders

[9] and on the energy metabolism regulation [6]. Melatonin is also known for its highly

efficient antioxidant capacity, neutralizing and scavenging free radicals, which can cause

serious damage to the cell, including nuclear DNA damage [10, 11]. In addition,

melatonin is used as an efficient anticarcinogenic molecule, exerting an important role on

tumors treatment and prevention [12-14].

With regard to melatonin’s action on the cardiovascular regulation, some

researches have shown a reduction on nocturnal blood pressure in nocturnal hypertension

patients treated with melatonin [15, 16]. Melatonin also participates in the reduction of

ventricular arrhythmias and preserves capillary perfusion during ischemia-reperfusion

events in cardiomyopathic hamsters [17], and seems to be involved with protective

effects in the heart after infarction [18].

Several cell surfaces receptors are utilized by melatonin, which are divided in two

classes: G-protein coupled melatonin receptors MT1 and MT2, and MT3 melatonin

receptor, a quinone reductase type II enzyme family [19]. In addition, melatonin can bind

directly to the nuclear receptor RZR/ROR (retinoic acid receptor-related orphan receptor)

family, which is comprised of three family members: �, � and � [20- 22]. Melatonin

receptors are expressed in the central nervous system, including SCN, and in peripheral

tissues [20, 23].

The SCN, located in the ventral anterior hypothalamic region, is entrained by the

LD cycle via RHP [24], and possesses the central oscillatory machinery (biological

clocks) where the so called clock genes, such as bmal1 (brain and arylhydrocarbon

receptor nuclear translocator (arnt)-like protein 1), clock; per (period), cry

(cryptochrome) and rev-erb� (reverse strand of the c-erb� gene), are rhythmically

expressed and auto-regulated by a transcriptional and translational positive and negative

feedback loops. CLOCK and BMAL1 proteins heterodimerize and form a complex that

activates rhythmic transcription of various clock controlled genes, including clock

component genes itselves, as bmal1. PER and CRY, once synthesized, inhibit

CLOCK:BMAL1 complex with additional participation of REV-ERB� [25- 29]. It is well

known that this molecular clockwork is much more complex, involving a great number of

molecular factors, new players and processes that affects the function of the clock [30].

Clock genes were also characterized in almost all peripheral tissues (e. g. heart,

adipose tissue, muscle cells) and in central structures outside the SCN [29, 31-33]. The

circadian clock genes expression is not only auto-regulated by feedback loops. Their

expression also can be driven and/or modulated by neurohumoral factors, such as: 1)

norepinephrine, which influences the timing of the circadian clock within the

cardiomyocytes in culture [34], and induces per1 expression (but not circadian

expression) with no effect on per2 expression in rat pineal gland cultures [35]; 2)

angiotensin II, that acts as a zeitgeber (timekeeper) to the circadian clock within vascular

smooth muscle cells [36]. Furthermore, in rats, circadian genes participate in the

stablishment of some behavioral rhythms controlled by other central structures outside

SCN, for example, locomotor activity rhythm, driven by caudade and putamen nuclei

with per1, per2 and bmal1 involvement [32], and feeding rhythm, with dorsomedial

hypothalamic nucleus participation in per oscillatory expression under restricted feeding

[37].

It has been shown that nuclear receptors as RZR/ROR, when activated by its

ligands, bind to RORE (retinoic acid receptor–related orphan receptor response element)

in E-box sequences, activating transcriptional processes. In the rat SCN, melatonin phase-

advances the rev-erb� mRNA expression rhythm and phase-shifts the bmal1 mRNA

expression [38]. Additionally, bmal1 mRNA rhythmic expression can be driven by ROR�

and REV-ERB� competing for the same promoter element (RORE) [39]. Melatonin

induces cry1 mRNA expression; acutely inhibits mt1 expression; advances the timing of

rev-erb� expression peak and modulates per1 expression in the pars tuberalis of Siberian

hamster [40]. The cry1 expression melatonin-induced, was also demonstrated in the rat

pars tuberalis [41].

The intrinsic regulation of gene expressions within the cardiomyocytes have been

extensively studied [29, 33, 34, 42, 43], in an attempt to clarify the knowledge of

molecular mechanisms controlling the daily variations in the circadian clock expressions

within the heart, and conseqüently, to help to understand cardiovascular diseases and the

repercussion of many pathophysiological states, like diabetes, obesity and sleep

disorders, on the cardiovascular system.

Although the expression of melatonin receptors (MT1, MT2, and RZR/ROR) in

peripheral organs has been reported by many authors [18, 22, 44], cell type expressing

receptors and whether melatonin directly affects and/or alters the pattern of gene

expression within cultured rat cardiomyocytes were not identified and established yet.

Thus, the aim of this study was to demonstrate whether melatonin directly influence

circadian gene expression in cultured rat cardiomyocytes.

MATERIAL AND METHODS

Animals

Male Wistar rats (150-175g) were housed in the animal facility of the Children’s

Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, Houston, TX, and kept under a

12 h: 12 h light/dark cycle (lights on at 06:00AM), in a temperature controlled room

(23±1 oC), with food and water ad libitum at least 10 days before the sacrifice. Ethics

approval was granted by the Institutional Animal Care and Use Committee (AN-4049).

Adult Rat Cardiomyocyte Isolation and Culture

Cardiomyocytes were isolated and cultured in L-glutamine-free DMEM (Sigma

Biochemical CO, St. Louis, MO, USA) with 4500mg glucose/l, supplemented as

described previously [34]. Before all treatments, cardiomyocytes were cultured for 24

hours (2 hours in a 5% FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen CO, Carlsbad, California,

USA) labeled plating medium + 22 hours in a medium without FBS, labeled

equilibration medium), incubated at 37 oC, 95% O2, 5% CO2. All media were pre-

warmed to 37 °C, 95% O2, 5% CO2, for at least 2 hours before utilization (culture flasks

– Corning Inc, Lowell, MA, USA). Additionally, all media changes were performed on a

37 °C pre-heated gel pad within a biological safety cabinet.

Treatments

To promote the activation of gene rhythmic expressions, a serum shock (50% of FBS -

challenge medium) was applied exclusively during the first 2 hours (starting at time 0).

At the end of serum shock, the medium was changed for a post-challenge medium,

constituted of 2.5% of FBS [34] (except for the experiment 2), followed by the

treatments. Two kinds of treatments using melatonin (Sigma Biochemical CO, St. Louis,

MO, USA) at 1nM and vehicle (ethanol) as control were performed: 1) melatonin/vehicle

were applied after the serum shock for a 2 hours period. After this treatment period, the

media were changed (no treatment) (Fig. 3 A); 2) 14 h after the serum shock (time 16)

melatonin/vehicle were applied in the cardiomyocytes cultures (Fig. 4 A). In both kinds

of experiments the cells were kept in culture for 40 hours. 750 µl of Tri-Reagent

(Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH, USA) per well was used for all

terminating cell time points (arrows), as depicted in figures 2 - 4. All samples were stored

and kept at -80 °C until subsequent analysis.

RNA extraction and quantitative RT-PCR

RNA extraction and quantitative RT-PCR were performed by using methods described

previously [43, 45, 46]. Specific quantitative assays were designed from rat sequences

available in the GenBank, for two core circadian clock genes bmal1 and rev-erb� and for

one circadian clock regulated gene dbp (albumin D-element binding protein); primers and

probes sequences for these Taqman assays have been published previously [33, 47] with

melatonin’s receptor genes exceptions. Taqman assays for rat mt1, mt2 and ror� are

presented in table 1. Standard RNA was made for all assays by the T7 polymerase

method (Ambion, Austin, Texas, USA), using total RNA isolated from rat hearts; the use

of standard RNA allows absolute quantification of gene expression. The correlation

between the Ct (the number of PCR cycles required for the fluorescent signal to reach a

detection threshold) and the amount of standard was linear over at least a 5-log range of

RNA for all assays (data not shown). Gene expression data are represented as mRNA

molecules per ng total RNA.

RESULTS

Isolated rat cardiomyocytes, without any stimulation and/or treatment, were kept

for a 24 hours period under culture condition. Three types of melatonin receptors, mt1,

mt2 and ror� were amplified within the cardiomyocytes. The nuclear receptor ror� has

shown the higher expression compared to the membrane receptors (Fig. 1).

As ror� expression was observed in cardiomyocytes, a circadian protocol was

tested on an activated transcriptional mechanism by the use of 50% serum shock (Fig. 2

A), to identify whether ror� expression could present a rhythmic pattern. �-actin did not

show rhythmic expression after serum shock, and then was used as negative control (Fig.

2 B). Rhythmic inductions of bmal1, rev-erb� and dbp were characterized and used as

positive controls (Figs. 2 C-E), proving the success of the circadian induced model.

Although the oscillations showed during the 38 hours period after serum shock, the

expression of ror� did not demonstrate an intrinsic rhythmic pattern, as can be seen on

figure 2 F.

Once melatonin’s receptors expression were stablished, the possible role of

melatonin affecting the pattern of circadian gene expression on an activated clockwork

machinery due to serum shock within the cardiomyocytes, was investigated (Fig. 3 A).

Melatonin did not alter or influence circadian gene expressions of bmal1, rev-erb� and

dbp, as well as the timing of the phase of these investigated genes (Fig. 3 B-D). In fact,

the treatment with only melatonin (without serum shock) was unable to promote

alterations and/or trigger rhythmic transcription of the same genes within the

cardiomyocytes (data not shown).

Another type of treatment with melatonin was made (Fig. 4 A), despite

melatonin’s first treatment did not influence the expression pattern of the analyzed genes

(as demonstrated on Fig. 3). 16 hours after the initial culture time, the presence of

melatonin in the media avoided the decline on rev-erb� expression for 12 consecutive

hours, changing the pattern of gene expression (Fig. 4 B). Circadian expressions of bmal1

and dbp can be seen in figures 4 C and 4 D. No differences were shown with melatonin’s

treatment in both genes.

DISCUSSION

Many researches have shown the importance of melatonin and its interaction with

the cardiovascular system, demonstrating important effects as reductions of blood

pressure [15, 16] and ventricular arrhythmias [17], and its protective effects after heart

infarction [18]. Thus, melatonin could be acting via its membrane and nuclear receptors

in the heart. The expression of melatonin receptors was already characterized within rat

and mouse hearts by many authors [18, 22, 44]. In this study, the cell type expression was

also demonstrated within rat cardiomyocytes, the main functional cell type within the

heart. Of all melatonin receptors analyzed, the nuclear receptor ror� was highly

expressed, while membrane receptors mt1 and mt2 have shown a basal expression. In

cardiomyocytes, ror� seems to be the most relevant melatonin receptor, considering that

expression of other subtypes of melatonin receptors such as ROR�, seems to be

characterized especially within SCN [48, 49].

The question whether melatonin could act as a zeitgeber has been extensivelly

investigated. Considering the presence of melatonin receptors in the SCN and in

peripheral tissues, which permits the action of melatonin in the circadian clock

mechanism, Masson-Pévet (2007) [50] suggested that REV-ERB� could be linking the

physiological effect exerted by melatonin and the circadian clock component genes

functioning. In the rat SCN, melatonin treatment mainly affects bmal1, rev-erb� and

partially prevents the decrease of ror� mRNA expression [38]. In the Siberian hamster

pars tuberalis, melatonin induces cry1, inhibits mt1, alters the timing of rev-erb� and

modulates per1 mRNA expressions [40]. Melatonin also affects the expression of cry1 in

the rat pars tuberalis [41].

Within the cardiomyocytes, the presence of melatonin for a short period of time in

the media did not promote any significant alterations on the expression of analyzed

circadian genes, in spite of the fact that nuclear receptor ror� was highly expressed, and

has an important effect on the modulation of clock machinery. ROR� induces bmal1

expression via its RORE, while REV-ERB� inhibits bmal1 expression, thus competing to

the same RORE [39, 51- 53]. In the present case a similar effect was not shown.

However, based on rev-erb� rhythmic expression (peaking between time 8 and 16),

clearly demonstrated on figure 4, the presence of melatonin (added to media 16 hours

after the culture initial time) for a long period of time kept rev-erb� expression

chronically high for a 12 hours period, attenuating its oscillations. Melatonin avoided the

decline on rev-erb� expression when its peak was declining, by stimulating its

expression. These results are consistent with data presented by AGEZ et al. (2007) [38],

that shown in the rat suprachiasmatic nuclei melatonin affected rev-erb� expression with

no participation of ror�, although in the present study the phase-advance on rev-erb�

within the cardiomyocytes was not observed.

The action of melatonin on SCN circadian clock was shown to be preferentially

post-translational, considering that in rodents clock genes transcription are not affected

by an injection of melatonin on the first circadian night, but it changes some patterns of

clock genes expression on the second night [54]. These data could explain the unchanged

gene expressions of bmal1and dbp with the presence of melatonin, suggesting that

melatonin’s action in the circadian system of the cardiomyocytes may involve not only

transcriptional but also post-translational mechanisms and should be studied further.

Bray et al. (2008) [55] by the use of a cardiomyocyte-specific circadian clock

mutant mice, have demonstrated that cardiomyocyte circadian clock influences

myocardial contractile function, metabolism, and gene expression. And as demonstrated

in this study, melatonin affecting rev-erb� expression could additionally modulate the

functional, metabolic and gene expressions alterations, primarily driven by the circadian

clock within cardiomyocytes.

In summary, the expression of melatonin receptors mt1, mt2 and ror� was

established within adult rat cardiomyocytes, highlighting the nuclear receptor ror�

expression. Melatonin did not alter the rhythmic expression pattern of analyzed circadian

genes. However, melatonin delivered at proper time in the cardiomyocytes culture,

avoided the decline in rev-erb� expression, keeping its expression chronically high for a

12 hours period. Based on the above mentioned facts it is possible to speculate that

melatonin, in adult rat cardiomyocytes, might be exerting its action via nuclear receptor,

potentially mediating an important role on the light signal transduction to peripheral

organs as the heart.

ACKNOWLEDGEMENTS

Supported by FAPESP grant 04/06767-2, CNPq (RAPG scholarship 202127/20060),

(MMZ 200166/20069), and by the National Heart, Lung, and Blood Institute grant (MEY

HL074259).

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Table 1. Primer and probe sequences for rat mt1, mt2 and ror�, real-time quantitative RT-PCR assays

Gene Primers/Probe Sequence

mt1

Forward

Reverse

Probe

5’ –CCTCTACACTGGCCTTCATCC –3’

5’ –CGAGGTCTGCCACAGCTAAA –3’

5’ 6–FAM – ATATTCCCTGCGTTCCTGAGCTTCTTGTTG – TAMRA – 3’

mt2

Forward

Reverse

Probe

5’ –TCCTCTCGGTGCTCAGGAAC–3’

5’ –AGGTCAGCCAAGGCCAGATT–3’

5’ 6–FAM – ACCACAAATAAATTACCTGCGTTCCGCAG – TAMRA – 3’

Ror�

Forward

Reverse

Probe

5’ –CAGGCAGAGCTATGCGAGC –3’

5’ –TCCACAGATCTTGCATGGAAT –3’

5’ 6–FAM –CCAGCCGAGGTATCTCAGTCACGAAGAA – TAMRA – 3’

Legends

Figure 1. Rat cardiomyocytes culture. Melatonin receptors mt1, mt2 and ror� mRNA

expression. Cardiomyocytes were kept in culture for 24 hours, no treatment and/or serum

shock. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparison Test. *P< 0.001 vs mt1

and mt2.

Figure 2. Rat cardiomyocytes culture. (A) Experimental protocol representation. After 24

hours of equilibration period, a serum shock (50% of FBS - challenge medium), was

applied exclusively during the first 2 hours (time 0-2). At the end of serum shock the

medium was changed for a post-challenge medium, constituted of 2.5% of FBS. The

arrows represent all collecting time points (hours). (B) �-actin mRNA expression

(negative control). (C, D and E) mRNA rhythmic expressions of bmal1, rev-erb� and

dbp, respectivelly (positive controls). (F) ror� mRNA expression. mRNA expressions

values were expressed in mRNA/ng total RNA, plotted as means ± SEM.

Figure 3. Rat cardiomyocytes culture. (A) Experimental protocol representation. After 24

hours of equilibration period, a serum shock (50% of FBS - challenge medium), was

applied exclusively during the first 2 hours (time 0-2). At the end of serum shock the

medium was changed for a post-challenge medium, constituted of 2.5% of FBS, and

melatonin 1 nM and/or vehicle were added to the cultures for a 2 hours period (time 2-4).

The arrows represent all collecting time points (hours). (B, C and D) mRNA rhythmic

expressions of bmal1, rev-erb� and dbp, respectivelly, normalized by �-actin. Values

were expressed in mRNA/ng total RNA, represented in arbitrary units, plotted as means ±

SEM.

Figure 4. Rat cardiomyocytes culture. (A) Experimental protocol representation. After 24

hours of equilibration period, a serum shock (50% of FBS - challenge medium), was

applied exclusively during the first 2 hours (time 0-2). 14 hours after the serum shock

(time 16), melatonin (1nM) and/or vehicle were added to the cultures and kept until the

end of the experiments. The arrows represent all collecting time points (hours). (B, C and

D) mRNA rhythmic expressions of bmal1, rev-erb� and dbp, respectivelly, normalized

by �-actin. Values were expressed in mRNA/ng total RNA, represented in arbitrary units,

plotted as means ± SEM. *P < 0.05.

0

250

500

750

rorαααα mt1 mt2

*

mR

NA

/ng

Tota

l RN

A

FIGURE 1FIGURE 1

40

Time (hours)

Plating

Equilibration

2 h

24 h50% Serum shock

2.5% Serum

0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36

A40

Time (hours)

Plating

Equilibration

2 h

24 h50% Serum shock

2.5% Serum

0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36

A

0

20000

40000

60000

�-a

ctin

mR

NA

/ng

tota

l RN

A

4 8 12 16 20 24 28 32 36 402Time (hours)

B

0

20000

40000

60000

�-a

ctin

mR

NA

/ng

tota

l RN

A

4 8 12 16 20 24 28 32 36 402Time (hours)

4 8 12 16 20 24 28 32 36 402Time (hours)

B

0

2000

4000

6000

bmal

1m

RN

A/n

g to

tal R

NA

4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)

C

0

2000

4000

6000

bmal

1m

RN

A/n

g to

tal R

NA

4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)

C

8000

4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)

0

2000

4000

6000

rev-

erb�

mR

NA

/ng

tota

l RN

A

D

8000

4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)

0

2000

4000

6000

rev-

erb�

mR

NA

/ng

tota

l RN

A

D

0

2000

4000

6000

8000

dbp

mR

NA

/ng

tota

l RN

A4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)

E

0

2000

4000

6000

8000

dbp

mR

NA

/ng

tota

l RN

A4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)

E

1600

0

400

800

1200

ror�

mR

NA

/ng

tota

l RN

A

4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)

F

1600

0

400

800

1200

ror�

mR

NA

/ng

tota

l RN

A

4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Time (hours)

F

FIGURE 2FIGURE 2

FIGURE 3FIGURE 3

40

Time (hours)

Plating

Equilibration

2 h

24 h

50% Serum shock

2.5% Serum

0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36

A

Melatonin/Vehicle

40

Time (hours)

Plating

Equilibration

2 h

24 h

50% Serum shock

2.5% Serum

0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36

A

Melatonin/VehicleA

rbitr

ary

units

bmal

1/�

-act

in(m

RN

A/n

g to

tal R

NA

)

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Time (hours)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Melatonin

Vehicle

2

B

Arb

itrar

y un

itsbm

al1/�

-act

in(m

RN

A/n

g to

tal R

NA

)

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Time (hours)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Melatonin

Vehicle

2

B

C

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Time (hours)

Melatonin

Vehicle

2

Arb

itrar

y un

itsre

v-er

b�/�

-act

in(m

RN

A/n

g to

tal R

NA

)

C

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Time (hours)

Melatonin

Vehicle

2

Arb

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v-er

b�/�

-act

in(m

RN

A/n

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NA

)

D

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Time (hours)

Melatonin

Vehicle

2

Arb

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-act

in(m

RN

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tal R

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)

D

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Time (hours)

Melatonin

Vehicle

2

Arb

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y un

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p/�

-act

in(m

RN

A/n

g to

tal R

NA

)

FIGURE 4FIGURE 4

A40

Time (hours)

Plating

Equilibration

2 h

24 h50% Serum shock

0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36

Melatonin/Vehicle

A40

Time (hours)

Plating

Equilibration

2 h

24 h50% Serum shock

0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36

Melatonin/Vehicle

*

B

0

0.2

0.4

0.6

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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Time (hours)

Vehicle

Melatonin

2

*

**

Arb

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RN

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A) 12 h12 h *

B

0

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Time (hours)

Vehicle

Melatonin

2

*

**

Arb

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RN

A) 12 h12 h

B

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Time (hours)

Vehicle

Melatonin

2

*

**

Arb

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0

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2

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Vehicle

Melatonin

2

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D

0

0.050.1

0.150.2

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MelatoninArb

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al1/

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tota

l RN

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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 402

Vehicle

MelatoninArb

itrar

y un

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al1/

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ctin

(mR

NA

/ng

tota

l RN

A)

Time (hours)