NAIANA DA ROSA

A SUPLEMENTAÇÃO DE ÁCIDO GRAXO POLIINSATURADO ÔMEGA-3 E OS

EFEITOS SOBRE A ATIVAÇÃO IMUNE MATERNA EM UM MODELO

EXPERIMENTAL DE AUTISMO

TUBARÃO

2015

NAIANA DA ROSA

A SUPLEMENTAÇÃO DE ÁCIDO GRAXO POLIINSATURADO ÔMEGA-3 E OS

EFEITOS SOBRE A ATIVAÇÃO IMUNE MATERNA EM UM MODELO

EXPERIMENTAL DE AUTISMO

Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientadora: Profa. Jucélia Jeremias Fortunato, Dra.

TUBARÃO

2015

NAIANA DA ROSA

A SUPLEMENTAÇÃO DE ÁCIDO GRAXO POLIINSATURADO ÔMEGA-3 E OS

EFEITOS SOBRE A ATIVAÇÃO IMUNE MATERNA EM UM MODELO

EXPERIMENTAL DE AUTISMO

Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.

Tubarão, 01 de outubro de 2015.

_______________________________________________________

Orientadora: Profa Jucélia Jeremias Fortunato, Dra.

Universidade do Sul de Santa Catarina

_______________________________________________________

Profa. Gislaine Tezza Rezin, Dra.

Universidade do Sul de Santa Catarina

_______________________________________________________

Prof. Fabricio Pagani Possamai, Dr.

Faculdades Esucri

Dedico este trabalho, especialmente a

minha mãe in memoriam, pelo exemplo

de pessoa e por me incentivar sempre.

Estaremos sempre juntas, mesmo não

estando perto, te amo.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por me acompanhar nessa jornada, iluminar meus

caminhos e ser meu refúgio e fortaleza nos momentos mais difíceis.

À Profa. Dra. Jucélia Jeremias Fortunato, pela orientação, ensinamentos,

pela dedicação e acima de tudo, pela pessoa magnifica que és, que nos faz ter amor

pela pesquisa, muito obrigada pelo carinho, amizade e poder me deixar participar da

sua vida e fazer com que eu me tornasse uma pessoa melhor.

À Profa. Dra. Patrícia Alves Reis e ao Laboratório de Imunofarmacologia -

IOC - Fundação Oswaldo (FIOCRUZ), pela realização das análises neuroquímicas.

Aos Professores do PPGCS da UNISUL, em especial à Prof.ª Dr.ª

Gislaine Tezza Rezin pela amizade, auxílio e pelos conhecimentos repassados.

Aos professores que atuaram como membros das bancas em que o

projeto de pesquisa foi apresentado e qualificado, pelas boas arguições e pelos

direcionamentos propostos.

As colaboradoras da UNISUL, responsáveis pela secretária do PPGCS

Silvane e Francieli, pela atenção com os alunos, dedicação, pelo carinho, amizade.

Aos meus colegas e parceiros de experimentos por toda a colaboração e

dedicação, em especial a Ana Olívia Martins, Marina Goulart e Camila Michalak,

vocês foram uns anjos, e contribuíram para que meu sonho se tornar-se realidade,

vocês tem um futuro brilhante pela frente. E ao mestre Evandro Cittadin, por dedicar

um pouco do seu tempo para nos ensinar práticas no laboratório.

A minha turma do mestrado em especial a minha grande amiga Lidiane

Borges Pinto que o mestrado me proporcionou, muito obrigada pela sua amizade.

A minha família que sempre me apoiou em todas as minhas decisões, que

me deram carinho, amor e sempre acreditou em mim, amo vocês.

A todas as pessoas não mencionadas, mais que, direta ou indiretamente,

contribuíram para a realização deste trabalho.

E por fim, a uma pessoa muito importante em minha vida, Daniel Arent

Wensing, que cuida de mim e me faz muito feliz, o meu eterno namorado, muito

obrigada por partilhar comigo os grandes momentos de nossas vidas.

A todos vocês...

Muito Obrigada!

Já experimentou acreditar em você?

Tente...

Você não faz ideia do que você é capaz.

(Rogério Stankevicz)

RESUMO

O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um distúrbio neurocomportamental

complexo desenvolvido na infância precoce, caracterizado por vários graus de

deficiência, incluindo prejuízo nas áreas do desenvolvimento pertinentes à interação

social, comunicação, comportamento e interesse. O TEA apresenta uma prevalência

global estimada de 1 para cada 68 crianças, seu diagnóstico se concentra

basicamente nas avaliações comportamentais, não havendo até o momento

biomarcadores para identificá-lo. Tanto fatores genéticos quanto ambientais, vêm

sendo ligados diretamente ao TEA. A heterogeneidade de suas manifestações faz

com que os tratamentos tornam-se ineficazes. Novas alternativas terapêuticas têm

sido sugeridas para melhorar os sintomas, entre eles o ácido graxo poliinsaturado

(AGP) ômega 3 (ω-3), tem apresentado resultados positivos no tratamento de

doenças neurológicas e psiquiátricas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos

da suplementação de AGP ω-3, sobre os parâmetros comportamentais e

bioquímicos em um modelo experimental de autismo induzido por lipopolissacarídeo

(LPS) a partir da ativação imune materna. A suplementação AGP ω-3 ou solução

salina foi administrada na prole a partir do dia pós-natal (PND) 30, na dose de 0,8

g/kg, via oral. No PND 52 os animais realizaram testes comportamentais, após foram

eutanasiados e as estruturas do encéfalo dissecado e analisado em níveis de:

enolase específica do neurônio (NSE), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)

e fator de transformação do crescimento beta (TGF-β). Os resultados deste estudo

indicaram que a ativação imune materna causou na prole alterações

comportamentais e neuroquímicas condizentes com o TEA, e a suplementação com

o AGP ω-3 apresentou resultados positivos, tanto comportamentais como

neuroquímicos.

Palavras-chave: Transtorno do Espectro Autista, Ômega-3, Enolase Específica do

Neurônio, Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro, Fator de Transformação do

Crescimento Beta.

ABSTRACT

The Autism Spectrum Disorder (ASD) is a complex neurodevelopmental disorder

developed in early childhood, characterized by several degrees of deficiency,

including deficits in the areas of the development relevant to social interaction,

communication, behavior and interest. The ASD has an estimated global prevalence

of 1 per 68 children , its diagnosis focuses basically on behavioral assessments, and

there is no biomarkers to identify it so far. Both genetic and environmental factors,

have been linked directly to the ASD. The heterogeneity of its manifestations causes

the treatments to become ineffective. New therapeutic approaches have been

suggested to improve symptoms, including polyunsaturated fatty acid (PUFA)

omega-3 (ω-3), has shown positive results in the treatment of neurological and

psychiatric diseases. The objective of this study was to evaluate the effects of PUFA

ω-3 supplementation on the behavioral and biochemical parameters in an

experimental model of autism induced by lipopolysaccharide (LPS) from the maternal

immune activation. The PUFA ω-3 supplementation or saline solution was

administered in offspring from postnatal day (PND) 30, at a dose of 0.8 g/kg, orally.

At PND 52, animals underwent behavioral tests, were euthanized after and the brain

structures dissected and analyzed for levels: neuron specific enolase (NSE) , brain-

derived neurotrophic factor (BDNF) and transforming growth factor beta (TGF-β). The

results of this study indicate that maternal immune activation caused behavioral and

neurochemical changes in the offspring consistent with the ASD, and

supplementation with PUFA ω-3 showed positive results, both behavioral and

neurochemical.

Keywords: Autistic spectrum disorder , Omega-3 , Neuron Specific Enolase, Brain

Derived Neurotrophic Factor , Transforming Growth Factor Beta

LISTAS

Lista de Abreviaturas

ADDM – Monitoramento das deficiências do autismo e desenvolvimento (do inglês,

Autism and Developmental Disabilities Monitoring)

AGE – Ácido Graxo Essencial

AGP – Ácido Graxo Poliinsaturado

ALA – Alfa-Linolênico

AMPc – 3’5’ Monofosfato de Adenosina

APA – Associação Americana de Pediatria (do inglês, American Psychiatric

Association)

Bcl-2 – B-cell Lymphoma 2

BDNF – Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (do inglês, Brain Derived

Neurotrophic Factor)

CaMKII – Proteína Cinase Dependente de Cálcio/Calmudolina tipo 2 (do inglês,

Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II)

CDC – Centro de controle e prevenção de doenças (do inglês, Centers for Disease

Control and Prevention)

CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais

CID-10 – Classificação Estatística de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde -

10ª Revisão

CREB – Proteína Ligante ao Elemento de Resposta ao AMPc (do inglês, cAMP

Response Element-Binding)

DG – Dia de Gestação

DHA – Ácido Docosaexaenóico

DSM – Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (do inglês,

Diagnostic and Statistical Manual)

ELISA – ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (do inglês, Enzime Linked

Immunosorbent Assay)

EPA – Ácido Eicosapentaenóico

IgG – Imunoglobulina G

IL – Interleucina

ip – Intraperitonial

IP3 – Trifosfato de Inositol (do inglês, Inositol Triphosphate)

LPS – Lipopolissacarídeo

MAPK – Proteína Cinase Ativada por Mitogênos (do inglês, Mitogen-Activated

Protein Kinase)

MCP-1 – Proteína Quimiotática de Monócitos-1

MEK – Proteína Cinase Ativada por Mitógeno / Proteína Cinase Regulada por Sinais

Extracelulares (do inglês, Mitogen-Activated Protein Kinase / Extracellular Signal-

Regulated Kinase)

MIA – Morte Indolor Assistida

NaCl – Cloreto de Sódio

NSE – Enolase Específica do Neurônio (do inglês, Neuron Specific Enolase)

OMS – Organização Mundial da Saúde

P75 (NTR) – Receptor de Neurotrofina p75 (do inglês, p75 Neurotrophin Receptor)

PI3K – Fosfatidilinositol 3-Cinase (do inglês, Phosphoinositide 3-Kinase)

PLC-γ – Fosfolipase\C-γ (do inglês, Phospholipase C, Gamma)

PND – Dia pós-natal

SNC – Sistema Nervoso Central

SNP – Sistema Nervoso Periférico

SPSS – Statistical Packege for the Sciences

TEA – Transtorno do Espectro Autista

TGF-β – Fator de Transformação do Crescimento Beta (do inglês, Transforming

Growth Factor Beta)

TID – Transtorno Invasivo do Desenvolvimento

TNF-α – Fator de Necrose Tumoral Alfa (do inglês, Tumor Necrosis Factor - Alpha)

Trk – Tirosina Cinase

TrkB – Tirosina Cinase Tipo B

ω-3 – Ômega 3

Lista de figuras

Figura 1 – Biossíntese dos ácidos graxos ω-3 .......................................................... 18

Figura 2 – Tipos de receptores tirosina cinase (Trk) e suas distintas afinidades para

as neurotrofinas ......................................................................................................... 23

Figura 3 – Visão geral do BDNF a sinalização através de receptores de TrkB ......... 25

Figura 4 – Diagrama esquemático das etapas do delineamento experimental

proposto no estudo. ................................................................................................... 33

Figura 5 – Teste de interação social recíproca .......................................................... 35

Figura 6 – Número (Figura 6A) e tempo (Figura 6B) de episódios de movimentos

estereotipados (grooming) realizados pelos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3,

LPS + AGP ω-3 ......................................................................................................... 40

Figura 7 – Tempo (em segundos) da interação social apresentado pelos grupos:

Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω-3. ................................................... 41

Figura 8 – Níveis proteicos de NSE nas estruturas encefálicas do hipocampo (Figura

8A) e cerebelo (Figura 8B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP

ω-3 ............................................................................................................................ 42

Figura 9 – Níveis proteicos de BDNF nas estruturas encefálicas do hipocampo

(Figura 9A) e cerebelo (Figura 9B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS

+ AGP ω-3 ................................................................................................................. 43

Figura 10 – Níveis de TGF-β nas estruturas encefálicas do hipocampo (Figura 10A)

e cerebelo (Figura 10B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω-

3. ............................................................................................................................... 44

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 13

1.1 TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA ........................................................ 14

1.1.1 Prevalência do TEA ........................................................................................ 15

1.1.2 Hipóteses Etiológicas .................................................................................... 16

1.2 ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADO ω-3 ....................................................... 18

1.2.1 AGP ω-3 e TEA ............................................................................................... 20

1.3 BIOMARCADORES............................................................................................. 20

1.3.1 Enolase Específica do Neurônio (NSE) ........................................................ 21

1.3.2 NSE e TEA ....................................................................................................... 22

1.4 FATORES NEUROTRÓFICOS ........................................................................... 22

1.4.1 Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) ........................................ 24

1.4.2 BDNF e TEA .................................................................................................... 25

1.5 FATOR DE TRANSFORMAÇÃO DO CRESCIMENTO BETA (TGF-β) ............... 26

1.5.1 TGF-β e TEA .................................................................................................... 27

1.6 MODELO ANIMAL DE TEA ................................................................................. 27

2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 29

2.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................................. 29

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 29

3. MÉTODOS ............................................................................................................ 30

3.1 TIPO DE ESTUDO .............................................................................................. 30

3.2 ANIMAIS .............................................................................................................. 30

3.3 ACASALAMENTO ............................................................................................... 30

3.4 ATIVAÇÃO IMUNE MATERNA ........................................................................... 31

3.5 PADRONIZAÇÃO DA NINHADA ......................................................................... 31

3.6 MEDIDAS DO PESO CORPORAL ...................................................................... 32

3.7 TESTES COMPORTAMENTAIS ......................................................................... 34

3.7.1 Comportamento Estereotipado ..................................................................... 34

3.7.2 Interação Social Recíproca ............................................................................ 34

3.8 ANÁLISES BIOQUÍMICAS .................................................................................. 35

3.8.1 Quantificação do BDNF por Western Blotting ............................................. 35

3.8.2 Quantificação da NSE por Western Blotting ................................................ 36

3.8.3 Quantificação do TGF-β por ELISA ............................................................... 37

3.9 ANÁLISE DE DADOS.......................................................................................... 37

3.10 ASPECTOS ÉTICOS ......................................................................................... 38

4 RESULTADOS ....................................................................................................... 39

4.1 TESTES COMPORTAMENTAIS ......................................................................... 39

4.1.1 Comportamento Estereotipado ..................................................................... 39

4.1.2 Teste de interação social recíproca .............................................................. 40

4.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS .................................................................................. 41

4.2.1 Quantificação de NSE .................................................................................... 41

4.2.2 Quantificação de BDNF .................................................................................. 42

4.2.3 Quantificação de TGF-β ................................................................................. 43

5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 45

6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 50

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 51

ANEXO...................................................................................................................... 66

ANEXO A- Parecer Aprovação do Comitê de Ética .............................................. 66

13

1. INTRODUÇÃO

O Transtorno do Espectro Autista (TEA) compreende diferentes

síndromes de perturbação do desenvolvimento neurológico1 que pode se manifestar

em conjunto ou isoladamente2. As características fundamentais da TEA incluem:

dificuldade de comunicação por deficiência no domínio da linguagem e no uso da

imaginação para lidar com situações e jogos simbólicos, dificuldade de socialização

e padrão de comportamento restritivo e repetitivo3.

O TEA apresenta uma etiologia bastante complexa e avanços científicos

sobre sua origem têm demonstrado que tanto fatores genéticos como ambientais

colaboram para a manifestação do transtorno4.

A heterogeneidade das manifestações clínicas faz com que os

tratamentos, na maioria das vezes, tornam-se ineficazes5. Novas alternativas

terapêuticas têm sido sugeridas para melhorar os sintomas nucleares deste

transtorno, entre elas, a mudança nos hábitos alimentares tem mostrado resultados

positivos e melhor qualidade de vida para indivíduos portadores do TEA6. Entre os

tratamentos, o ácido graxo poliinsaturado (AGP) ômega 3 (ω-3) tem apresentado

resultados positivos na terapêutica de doenças neurológicas7,8 e psiquiátricas9,10,

como componente restaurador de membranas celulares neuronais11 e ainda como

agente antioxidante10 e anti-inflamatório7.

Considerando que o TEA possa estar relacionado a uma alteração no

desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) decorrente de um processo

neuroinflamatório12, é possível que a administração contínua e prolongada de uma

dieta suplementada de AGP ω-3, possa reverter condições neuroquímicas e

comportamentais associadas a um modelo pré-clínico de autismo baseado em uma

infecção bacteriana pré-natal a partir da exposição ao lipopolissacarídeo (LPS).

Resultados positivos podem representar dessa uma nova abordagem terapêutica

nutracêutica que contribui para o progresso das condições clínicas apresentadas por

pacientes autistas e, consequentemente, a melhoria na qualidade de vida desses

pacientes e seus familiares.

14

1.1 TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA

Foi em 1911, pelo psiquiatra suíço Bleuler, que o termo autismo foi

utilizado pela primeira vez, para descrever crianças que apresentavam

características diferentes das demais, essas não tinham contato com a realidade,

gerando assim inabilidade em se comunicar13,14. No entanto, o autismo ficou

conhecido somente a partir de 1943 quando Leo Kanner, após estudar um grupo de

onze crianças, identificou anormalidades na fala, isolamento social, respostas

impróprias para o ambiente físico e outras alterações comportamentais diferentes de

doenças já conhecidas15,16. Kanner acreditava que o autismo era provavelmente

raro, e o mesmo era confundido com debilidade mental ou esquizofrenia15.

Somente entre os anos de 1950 e 1960 a causa biológica do autismo

começou a ser discutida17. Até então, acreditava-se que a doença era resultado da

falta de proximidade dos pais com seus filhos17. Essa compreensão contribuiu para o

surgimento do termo “mães-geladeira”, que expressava a falta de afeto e a frieza dos

pais17.

O autismo apareceu pela primeira vez somente na terceira edição do

Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM-III-R), revisado em

198918. No ano de 1994, com a atualização do DSM, em sua quarta edição (DSM-

IV)19 e com a Classificação Estatística de Doenças e Problemas Relacionados à

Saúde - 10ª Revisão20, o autismo foi classificado como um Transtorno Invasivo do

Desenvolvimento (TID) cujo portador poderia atingir níveis severos no desempenho

de atividades como: redução do contato visual, restrição em mostrar, pegar ou

utilizar objetos, atividades repetitivas e comportamentos estereotipados,

movimentação ou torção de mãos e dedos, agitação corporal ou

dificuldade/ausência de fala21,22.

Nessa mesma edição, o diagnóstico de TID foi baseado em um sistema

multicategórico, que incluía o Transtorno Autista, Transtorno de Asperger,

Transtorno Invasivo do Desenvolvimento sem outra especificação, Transtorno

Desintegrativo da Infância e o Transtorno de Rett21,23.

Na quinta edição do DSM1, lançada em 2013, o autismo passou a ser

definido como um distúrbio neurocomportamental complexo, caracterizado por vários

graus de deficiência incluindo interação social, agilidade de pensamento, mudanças

peculiares de linguagem e/ou percepção atrasada, prejuízo na comunicação verbal e

15

não verbal e inabilidade em responder a certos estímulos apresentando um

comportamento restrito e repetitivo12. A partir desta atualização, o DSM-V substituiu

o sistema multicategórico usado anteriormente por uma única dimensão do

diagnóstico – Transtorno do Espectro Autista1,24.

O diagnóstico no TEA ainda se concentra basicamente nas avaliações

comportamentais devido à ausência de marcadores biológicos para identificá-lo25,26.

Mesmo com os avanços recentes na capacidade de diagnosticar o transtorno

precocemente, na maioria dos casos esse diagnóstico acontece depois dos três

anos de idade27. A Associação Americana de Pediatria (APA) sugere realizar o

acompanhamento do desenvolvimento de todas as crianças até 24 meses, pois é a

partir do segundo ano de vida que os comportamentos característicos do TEA

surgem e esses são capazes de auxiliar no diagnóstico28. Estudos sobre a base

neurológica do TEA antes dos três anos de idade é decisivo para o tratamento, pois

é nessa fase que ocorrem os cuidados primários da infância e é nesse período que

os resultados do tratamento podem ser melhores28.

1.1.1 Prevalência do TEA

O TEA tem aumentado consideravelmente sua prevalência nos últimos

anos29. Pesquisas realizadas nos Estados Unidos pelo Centers for Disease Control

and Prevention (CDC) e Autism and Developmental Disabilities Monitoring (ADDM)

nos anos de 2011-2012, estimou a prevalência global do TEA como sendo 1:68

crianças com até oito anos de idade, representando um aumento de 23% na

prevalência de TEA comparado ao período de 2006-200830. Nos Estados Unidos a

prevalência estimada pelos mesmos centros de pesquisa mostrou que 2% das

crianças entre 6 e 17 anos apresentam sintomas de TEA, isso representa 1 a cada

50 crianças americanas29-32.

No Brasil, um estudo transversal estimou uma frequência de 27,2 casos

de TEA a cada 10.000 habitantes33. No estado de Santa Catarina, a prevalência de

casos diagnosticados, de acordo com as bases de dados das Associações de Pais e

Amigos dos Excepcionais (APAE), da Associação de Amigos dos Autistas (AMA) e

da Fundação Catarinense de Educação Especial (FCEE), apresentou um indíce

menor em relação ao Brasil, indicando 1,31 casos para cada 10.000 habitantes, no

entanto, esse estudo realizado em Santa Catarina apresentou limitações, devido ao

16

fato dos dados serem secundários, retrospectivos e adquiridos via e-mail, ligação

telefônica e instituição, pois na obtenção dessas informações pode ter ocorrido sub-

notificação, uma vez que os dados não eram informatizados e não havia orgão ou

instituição responsável em armazenar essas informações, outra limitação encontrada

foi que a população-alvo constituiu somente pelos indivíduos com evidências

diagnósticas que frequentavam as instituições, porém nem todos os autistas estão

inseridos nestas instituições34,35.

Em relação ao sexo, estudos tem demonstrado que o sexo masculino

apresenta cerca de três a quatro vezes mais chances de ser afetado pelo TEA do

que indivíduos do sexo feminino36,37. No entanto, esse valor pode sofrer alterações

de acordo com o grau de desenvolvimento intelectual, sendo que quando avaliados

indivíduos autistas com deficiência intelectual as proporções chegaram a 6% mais

presentes no sexo feminino do que no sexo masculino31. Ainda não existem estudos

conclusivos que esclareçam porque o sexo feminino apresenta menores incidências

de TEA sem deficiência intelectual38. Contudo, alguns autores sugerem que possa

estar relacionado a uma condição genética ligada ao cromossomo X, com isso

tornando homens mais propensos ao desenvolvimento da síndrome38. Outra

hipótese sugere que o hormônio estradiol atue como um agente neuroprotetor,

reduzindo a expressão de várias citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, desta

forma atenuando os sintomas do TEA e diminuindo as manifestações clínicas no

sexo feminino39.

1.1.2 Hipóteses Etiológicas

A etiologia do TEA é bastante complexa e na maioria dos casos o

processo patológico é desconhecido5. Estudos mostram que o TEA está diretamente

ligado a fatores genéticos, condições ambientais, neurobiológicas, neuroanatômicas,

metabólicas e imunológicas37,40-43.

Atualmente o TEA é considerado um distúrbio do desenvolvimento

neurológico44 que pode estar associado a um processo de neuroinflamação45,46. A

neuroinflamação, neste caso, está relacionada à ativação da micróglia que aumenta

a liberação de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias no SNC, causando ativação

de moléculas do sistema imunológico que, por sua vez, quando ativadas,

atravessam a barreira hematoencefálica, originando um feedback positivo e

17

acarretando uma tempestade de citocinas no SNC41. Quando a ativação acontece

em período pré-natal, o desenvolvimento encefálico do feto é comprometido

podendo ser a causa dos déficits de comunicação e movimentos estereotipados que

caracterizam o TEA ou ainda contribuindo para a perda de sinapses e a morte

neuronal47,48. Alguns estudos mostram que indivíduos diagnosticados com TEA eram

filhos de mães que sofreram perturbações durante o período gestacional incluindo

infecções49, traumatismos50 ou exposição a toxinas ambientais51.

Alterações nos circuitos neurais de diversas áreas encefálicas têm sido

envolvidas na etiologia do TEA, incluindo o sistema límbico42 e o cerebelo52. Por

isso, as pesquisas seguem o foco nas regiões encefálicas associadas às respostas

emocionais, entre elas, o córtex pré-frontal, córtex temporal, córtex cingulado

anterior, giro fusiforme e amígdala53. Além disso, estudos de neuroimagem indicam

um padrão anormal do desenvolvimento encefálico, com um crescimento acelerado

durante os primeiros anos de vida, seguindo pela desaceleração em algumas áreas

encefálicas, enquanto em outras áreas podem ocorrer parada no crescimento54.

A grande maioria dos tratamentos farmacológicos utilizados para o TEA

não são direcionados para os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na

fisiopatologia desse transtorno, isto porque eles ainda não estão totalmente

esclarecidos55. Além disso, um dos grandes problemas enfrentados pela terapia

farmacológica é o risco de baixa adesão dos pacientes aos medicamentos, devido

principalmente à demora da resposta terapêutica e aos efeitos colaterais55. Neste

sentido, a busca por alternativas não-farmacológicas que sejam capazes de atrasar

o início e a progressão dos sintomas do TEA e de suas complicações são

prementes9.

Nos últimos anos a nutrição tem adquirido cada vez mais um papel

relevante, tanto no desenvolvimento, como na alteração do percurso de doenças

neurológicas e psiquiátricas56,57. O AGP ω-3 tem sido estudado nessas doenças,

devido seus efeitos: antioxidantes, anti-inflamatórios, atuação na formação da

bainha de mielina, no desempenho cognitivo da atividade encefálica e comunicação

entre as células neuronais, apresentando também ação vasodilatadora e por isso

aumenta o aporte de oxigênio e nutrientes para o SNC58-60. Estudos recentes

apontam que a suplementação de AGP ω-3 pode contribuir positivamente para o

desenvolvimento neurológico de crianças diagnosticadas com TEA6,61-63.

18

1.2 ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADO ω-3

Os ácidos graxos essenciais (AGE), embora não sejam sintetizados

endogenamente, são essenciais para o desenvolvimento e funcionamento normal do

SNC e do sistema imunológico67. Entre os AGE está o AGP ω-3 que desempenha

um papel importante na patogênese de muitas doenças crônicas60. Os AGE

adquiridos da dieta, na maioria das vezes, se apresentam em suas formas primárias

como ácido α-linolênico (ALA) que pode sofrer uma dessaturação de enzimas e

sistema de alongamento de cadeias modicando-se em ácido eicosapentaenóico

(EPA) e ácido docosaexaenóico (DHA) originados do AGP ω-367 (Figura 1).

Figura 1 – Biossíntese dos ácidos graxos ω-3

(Levant, 2011)65

Em fontes de origem vegetal como óleos extraídos de soja, de girassol, de

milho, linhaça, nozes e em alguns vegetais verdes, como brócolis, rúcula, couve,

espinafre, pode-se encontrar AGP ω-3 na forma de ALA64 que pode ser

metabolizado em EPA e DHA pela ação de enzimas alongase e dessaturase66.

Devido ao fato dessas enzimas serem influenciadas por inúmeros aspectos como

tabagismo, consumo de álcool, diabetes e envelhecimento, os seres humanos se

tornam relativamente ineficientes em realizar esta síntese (≤ 6% de conversão) a

19

partir do ALA, portanto, o ALA pode não ser bem convertido em algumas

pessoas67,68.

Em algumas espécies de peixes é possível encontrar AGP ω-3 na forma

de EPA e DHA69, entre as opções estão: anchovas, arenque atlântico, salmão, truta

e sardinha 70-73. O EPA e o DHA encontrados nesses alimentos são importantes para

a estrutura e função encefálica e têm sido defendidas para o tratamento de vários

distúrbios neurológicos e psiquiátricos, incluindo transtornos de humor9,

esquizofrenia74, Transtorno do Déficit de Atenção com Hiperatividade (TDAH)75 e

TEA60.

Os eicosanóides sintetizados a partir dos AGP ω-3 exibem propriedades

anti-inflamatórias, atuando diretamente na membrana celular76. O DHA, em especial,

é o elemento de maior fluidificação em membranas celulares, neste sentido, é

essencial para desenvolvimento dos sistemas neurais sensoriais, perceptivos,

cognitivos e motores, durante esse período de maior crescimento do encéfalo que

compreende o último terço da vida fetal e os dois primeiros anos de vida59,60. Além

disso, o DHA desempenha papel neuroprotetor contra o estresse oxidativo em

astrócitos, em oligodendrócitos, em células ganglionares da retina e em linfócitos

humanos74,77,78. O AGP ω-3 tem sido sugerido como um complemento eficaz para a

prevenção de doenças neurodegenerativas que estão associados com o estresse

oxidativo, este resultado está relacionado ao melhor desempenho cognitivo em

animais de laboratório que receberam dieta rica em AGP ω-3 por 12 semanas

consecutivas79.

O EPA está presente no colostro e leite materno e desempenha um papel

chave na regulação do sistema endócrino, imunitário, função cardiovascular 60,80 e

tem ação anti-inflamatórias59,60,81.

Considerando que vários estudos apontam dano oxidativo e processo

inflamatório associados a transtornos do neurodesenvolvimento, incluindo TEA,

resultados sugerem que as manifestações clínicas apresentadas por pacientes

autistas podem estar relacionadas, em parte, pela deficiência ou desequilíbrio de

AGP ω-3, e que a suplementação possa representar uma alternativa terapêutica

para a melhoria dos sintomas 64,82.

20

1.2.1 AGP ω-3 e TEA

O uso de terapias comportamentais e medicamentosas têm-se

apresentado como insuficientes para o tratamento do TEA e doenças associadas83.

Estudos recomendam mudanças nos fatores nutricionais e ambientais como um

tratamento alternativo nestes casos83,84.

Atualmente sabe-se que o TEA não é uma doença única, na verdade se

trata de um distúrbio associado a diversas etiologias e a vários graus de severidade,

onde pode ser caracterizado por alterações comportamentais, de linguagem e de

cognição, com deficiência intelectual em 70% dos casos e crises epiléticas em

30%85. A associação entre o TEA e a epilepsia é bastante conhecida85. Um estudo

realizado no ano de 2013 relatou que a epilepsia esteve presente em 58 dos 206

indivíduos avaliados, representando um total de 28,2% da amostra total,

apresentando um índice bem maior quando comparado com a prevalência da

epilepsia na população em geral que apresentou um indicativo de 0,5 à 1% da

população afetada85. Estudo realizado em modelos animais de epilepsia com

suplementação de EPA e DHA permitiu que as doses do tratamento farmacológico

fossem reduzidas na fase de manutenção da doença, atenuando as convulsões

hipocampais86. Considerando a proximidade entre epilepsia e TEA, a suplementação

de AGP ω-3 na dieta destes últimos pode conduzir a uma melhoria dos sintomas

desta síndrome58.

Organizações governamentais e de saúde em todo mundo, vem criando

recomendações à população em geral, sobre a importância do consumo de peixe ou

óleo de peixe, pelo menos duas vezes por semana em função dos grandes

benefícios previstos pelo AGP ω-3 relacionados às doenças crônicas87. No geral, os

níveis recomendados para prevenção de doenças são inferiores ao recomendado

para tratamentos particulares, contudo mais estudos clínicos são importantes para

determinar corretamente dosagens e fórmulas mais eficazes para doenças

específicas88.

1.3 BIOMARCADORES

Os biomarcadores são definidos como indicadores de processos

biológicos normais, patológicos ou resposta farmacológica a uma intervenção

21

terapêutica89. Bioquimicamente, são moléculas sistêmicas que podem ser

determinadas em laboratórios, como proteínas ou enzimas que representam, direta

ou indiretamente, um ou mais processos biológicos ou patológicos ativos de um

sistema definido ou um estado de doença90. Essas moléculas têm sido utilizadas

como alvos potenciais de terapia na prevenção e tratamento de doenças

sistêmicas91 e do SNC92.

Um biomarcador ideal para avaliar uma lesão encefálica precisa ser

sensível e apresentar alta especificidade para o tecido encefálico, já que nem

sempre o líquor é disponível93. Os biomarcadores encefálicos utilizados

frequentemente são: adenilato cinase, creatina cinase, lactato, S100-β e Enolase

Específica Neurônio (NSE). Esta última proteína é considerada um dos mais

importantes marcadores de danos às células neuronais94,95. A avaliação dos níveis

de NSE pode contribuir e proporcionar a oportunidade de investigar a função ou

dano de estruturas neuronais em doenças psiquiátricas e neurológicas, incluindo o

TEA96.

1.3.1 Enolase Específica do Neurônio (NSE)

A NSE é utilizada como um marcador de soro específico para danos

neuronais97, no entanto, um estudo post mortem com hipocampos de indivíduos com

Alzheimer, mostrou que níveis de NSE podem também ser mensurados em regiões

encefálicas distintas, pois foi identificado uma oxidação da NSE no encéfalo desses

indivíduos98.

A NSE é uma enzima glicolítica concentrada no citoplasma dos neurônios

e células com diferenciação neuroendócrina, existindo em quantidades desprezíveis

no sangue periférico99. A partir do momento em que a NSE não é excretada, ocorre

um aumento em suas concentrações no líquor ou sangue significando, desta forma,

uma associação com dano estrutural para células neuronais e, por isso, pode ser

considerado um importante biomarcador para acompanhar a progressão de doenças

neurológicas e/ou avaliar o grau de severidade de determinada doença97.

22

1.3.2 NSE e TEA

A NSE representa 1,5% das proteínas solúveis totais do encéfalo, nos

estágios de lesão encefálica elas podem ser utilizadas para sugerir o

prognóstico100,101 a partir da quantificação do grau de lesão neuronal, ou seja, um

aumento na expressão de NSE antes dos sinais clínicos permite detectar danos

neuronais em estágios subclínicos e servir como referência para quantificar o grau

de neurodegeneração101,102.

Estudo realizado por Gelderblom e colaboradores101 com modelos

animais de doenças neurológicas agudas e crônicas pareados por idade e sexo,

mensurou níveis de NSE no plasma com o objetivo de avaliar a NSE como

biomarcador para estimar grau de lesão neuronal nos modelos animais, e identificou

aumento na expressão da NSE no modelo animal de doença neurológica aguda e

crônica. No modelo de doença neurológica aguda, foi observado três horas após a

lesão, um aumento nos níveis de NSE no plasma, sugerindo um dano neuronal

precoce e generalizada. E no modelo de doença neurológica crônica, assim como o

TEA, foi possível verificar no decorrer da doença níveis elevados de NSE no plasma,

sendo possível também de detectar o aumento dos níveis de NSE antes do início

dos sintomas clínicos, possibilitando estratégias de tratamentos neuroprotetores.

1.4 FATORES NEUROTRÓFICOS

As neurotrofinas são formadas por proteínas que exercem importantes

papéis na formação do SNC e do sistema nervoso periférico (SNP), atuando na

modulação da transmissão e plasticidade sináptica, sobrevivência, morfologia e

diferenciação neuronal103-105. A família das neurotrofinas é constituída pelo fator de

crescimento neural (NGF, do inglês nerve growth factor), o fator neurotrófico

derivado do cérebro (BDNF, do inglês Brain Derived Neurotrophic Factor), e

neurotrofina-3 (NT-3), NT-4/5 e NT-6103-105. As sínteses dessas proteínas ocorrem no

retículo endoplasmático e, a partir daí, são clivadas em moléculas menores que

chegam até as vesículas secretoras. Há dois tipos diferentes de vias de secreção: a

via Ca²+ dependente e exocitose de grânulos de secreção106.

Os fatores neurotróficos intercedem em diversas funções celulares

através da ativação de receptores, compreendendo a expressão dos genes

23

inteiramente envolvidos na regulação da neuroplasticidade e saúde celular107.

Grande parte dos papéis executados pelas neurotrofinas é compreendida pelo

receptor tirosina cinase (Trk), que tem como membros da família o receptor

neurotrófico tirosina cinase tipo A (TrkA) em conjunto com o receptor neurotrófico

tirosina cinase tipo B (TrkB) e o receptor neurotrófico tirosina cinase tipo C (TrkC)108.

As neurotrofinas ligam-se seletivamente a receptores específicos de Trk, ao passo

que todas as neurotrofinas se ligam a p75. Receptores Trk contém a imunoglobulina

G (IgG) para domínios extracelulares de ligação ao ligante e uma sequência de Trk

catalítico no domínio intracelular. Cada receptor, ativa várias vias de transdução de

sinal. A porção extracelular do p75 NTR (p75 (NTR), do inglês p75 neurotrophin

receptor) contém quatro repetições ricas em cisteína e a parte intracelular contém

um domínio de morte. A ligação ao receptor de neurotrofina p75 medeia à

sobrevivência, a migração celular e a mielinização através de várias vias de

sinalização. As interações entre os receptores Trk e p75 podem conduzir a

alterações na afinidade de ligação para as neurotrofinas106,108,109 (Figura 2).

Figura 2 – Tipos de receptores tirosina cinase (Trk) e suas distintas afinidades para

as neurotrofinas

(Chao, 2003)109

O aumento das neurotrofinas tem como principal papel proteger os

neurônios da excitotoxicidade, desta forma, tem sido apresentadas como

moduladoras da plasticidade sináptica, com função na neuroproteção e

24

reorganização, operando como dispositivo de equilíbrio endógeno para originar

regeneração e reparação no SNC e SNP110.

1.4.1 Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF)

O BDNF é uma proteína da família das neurotrofinas que se apresenta em

grande quantidade e amplamente distribuída no SNC, exibe uma expressão

significativa no hipocampo e córtex cerebral de crianças e adultos jovens e está

envolvida nos processos de aprendizagem e memória104,105. O BNDF tem uma

participação fundamental no ajuste da atividade sináptica e plasticidade, tanto por

meio de modificações funcionais como estruturais nos neurônios111,112.

As ações celulares do BDNF ocorrem através da mediação do TrkB e pelo

receptor de neurotrofina p75 (NTR) um membro da família do TNF110. A transcrição

de exons é dirigida por promotores diferentes, sendo então regulada por um

conjunto de mecanismos de sinalização, incluindo Ca2+, CREB (proteína ligante ao

elemento de resposta ao AMPc [3’ 5’ monofosfato de adenosina] do inglês, cAMP

response element-binding), MEK (proteína cinase ativada por mitógeno / proteína

cinase regulada por sinais extracelulares, do inglês mitogen activated protein kinase

/ extracellular signal-regulated kinase), MeCP2 (proteína de ligação a CpG metilado

2, do inglês, methyl-CpG-binding protein 2), CaMKII (proteína cinase dependente de

cálcio/calmudolina tipo 2, do inglês, Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II) e

hormônios112-114.

A ativação dos receptores estimula uma série de cascatas de transdução

de sinais, incluindo a proteína cinase ativada por mitogênos (MAPK, do inglês,

Mitogen-activated protein kinase), o fosfatidilinositol 3 cinase (PI3K, do inglês,

Phosphoinositide 3-kinase) e a via da fosfolipase\C-γ (PLC-γ, do inglês,

Phospholipase C, gamma), sendo também utilizada para acompanhar a liberação e

ativação do receptor neurotrófico112,114.

Após uma ligação do BDNF ao TrkB, ocorre uma dimerização e

autofosforilação, e assim que fosforilados estes resíduos formam locais específicos

de ligação para enzimas e proteínas “scaffolds”115,116, que são intermediários na

ativação dos domínios intracelulares de três cascatas de sinalização: (1) a ativação

intercedida por sch/Frs2 e Ras/Raf da via de MAPK que abrange MEK e ERK que

leva ao crescimento e diferenciação celular; (2) a ativação mediada por sch/Frs2 e

25

GAB1 da via PI3K, e a jusante via de Akt, levando à sobrevivência celular e, por fim,

a (3) última via de sinalização que é ativada diretamente pelo receptor PLCγ, que

origina IP3 (Inositol triphosphate) e DAG (diaglycerol) aumentando os níveis de

cálcio intracelular, originando em um aumento da atividade calmodulina cinase

(CaMK), levando a plasticidade sináptica112,115-117. Todas as três vias convergem no

fator de transcrição CREB, sendo alvo posterior deste mecanismo, responsável pela

transcrição de certa quantidade de genes que proporcionam a resistência celular,

compreendendo a Bcl-2 (do inglês, B-cell lymphoma 2) que através da inibição da

liberação do citocromo C protege o efeito anti-apoptótico112,116,118 (Figura 3).

Figura 3 – Visão geral do BDNF a sinalização através de receptores de TrkB

(adaptado de Autry e Monteggia, 2012)116

1.4.2 BDNF e TEA

No decorrer de diversas fases do desenvolvimento sináptico, plasticidade

sináptica, sobrevivência neuronal e migração celular, a via de sinalização

BDNF/TrkB está envolvida na transcrição e transdução de proteínas, por meio das

três vias biológicas ativas. Devido à função que exercem, os genes que codificam as

moléculas integrantes nestas três vias biológicas são possíveis candidatos na

etiologia do TEA119.

26

A via biológica PI3K atua nas funções de regulação do ciclo celular,

sobrevivência, diferenciação e proliferação celular, a via Akt desempenha função na

regulação de proteínas apoptóticas e fatores de transcrição. Associado ao TEA

sindrómico (esclerose tuberosa, neurofibromatose e macrocefalia) é possível

encontrar descrito na literatura mutações nos genes TSC1, TSC2, NF1 e PTEN, que

participam na via biológica PI3K-Akt120,121. As vias de sinalização de MAPK assim

como a via PI3K apresenta uma função essencial na síntese, tradução e/ou

transporte de proteínas com funções sinápticas, a via de sinalização PLCγ regula o

cálcio intracelular que conduz o processo de transcrição através de AMP cíclico e

proteínas cinase C119.

Modificações nos níveis de BDNF vêm sendo associadas à etiologia de

doenças neuropsiquiátricas como esquizofrenia, depressão e doença bipolar 122,123.

Portanto, considerando a hipótese de que modificações ao nível da ligação

BDNF/TrkB e/ou ao nível das três vias biológicas MAPK/MEK/ERK, PI3K-Akt e

PLCγ, são capazes de ocasionar à disfunção dos mecanismos de desenvolvimento

sináptico, é possível que uma alteração nestes níveis podem colaborar com fatores

de sensibilidade na etiologia do TEA119,120.

1.5 FATOR DE TRANSFORMAÇÃO DO CRESCIMENTO BETA (TGF-β)

O fator de transformação do crescimento (TGF-β, do inglês, transforming

growth factor beta) é uma proteína que controla a proliferação, diferenciação celular,

motilidade celular e apoptose celular, apresenta um importante papel como

reguladores imunológicos, podendo de fato coordenar diversos aspectos da resposta

imune124. O TGF-β exerce importante função em doenças autoimunes, como:

esclerose múltipla, miastenia gravis relacionada oftalmoparesia e diabetes

autoimune 125-128.

Estudos têm sugerido que o TGF-β pode ser um regulador importante no

processo de neurogênese e, desta forma, alterações nos níveis desta proteína

podem estar relacionadas às doenças que comprometem o desenvolvimento do

SNC, incluindo o TEA125,129-131.

27

1.5.1 TGF-β e TEA

O controle inadequado da resposta imunitária em crianças autistas tem

sido relacionada com baixos níveis plasmáticos de TGF-β125. Um estudo realizado

por Ashwood e colaboradores125, sugere que existe uma correlação significativa

entre os escores clínicos e níveis inferiores de TGF-β e esta condição pode estar

associada com a diminuição nos comportamentos adaptativos observados nestas

crianças. Devido à redução dos níveis de TGF-β, as respostas imunes em indivíduos

com TEA pode ser inadequada e mudança no sistema imunológico pode predispor

indivíduos para o desenvolvimento de possíveis respostas autoimunes e/ou

interações adversas neuroimunes durante a fase de desenvolvimento do SNC125,131.

A ativação imune materna em período pré-natal tem sido apontada como

fator importante para o desenvolvimento de comportamento autista na prole132.

Níveis diminuídos de TGF-β no hipocampo de ratos, apresentados pelos estudos de

Patterson132 e de Graciarena e colaboradores133, podem estar relacionadas com

alterações no processo de diferenciação e migração de neurônios e, por isso, o

TGF-β representa um papel importante na fisiopatologia de doenças neurológicas

como TEA e esquizofrenia134.

1.6 MODELO ANIMAL DE TEA

Entre diversas doenças humanas estudadas, a produção e a

personalização de modelos animais é uma conexão importante entre o entendimento

das propriedades moleculares da doença e o desenvolvimento de agentes

terapêuticos135,136.

Considerando a natureza complexa do TEA, especialmente devido a sua

heterogeneidade e ampla sobreposição de manifestações clínicas, além da

diversidade etiológica, realizar estudos utilizando unicamente modelos humanos

para TEA é um fator limitante. Desta forma, a utilização de modelos animais de

autismo permitem investigações controladas e prospectivas, assim como a utilização

de intervenções e desdobramentos dos mecanismos envolvidos.

Entre os modelos animais reproduzidos para mimetizar características

comportamentais, neurais, imunes e genéticas encontrados no TEA, estão aqueles

que utilizam agentes teratogênicos como ácido valpróico137 que afetam a migração

28

de diferenciação de neurônios serotoninérgicos, quando administrado em períodos

críticos da embriogênese de roedores137.

Evidências clínicas137,138 e experimentais132,139 têm apontado que as

infecções pré-natais podem interferir no ambiente intra-uterino, promovendo

anormalidades comportamentais com similaridades ao autismo137,140, inclusive com a

ativação inadequada de citocinas pró-inflamatórias137,138,140 e alterações na resposta

imune137,140,141. Neste sentido, um dos modelos experimentais de TEA estudados

extensivamente nos últimos anos mostra que a ativação imune materna a partir da

adiministração de LPS no 9,5 dia gestacional (9 dias e 12 horas), período antes do

fechamento do tubo neural142 é capaz de promover anormalidades comportamentais

semelhantes aquelas encontradas em indivíduos autistas.

A ativação imume materna permite caracterizar a exposição ao LPS como

modelo adequado para o estudo do autismo, uma vez que os animais submetidos

sistematicamente a esta endotoxina, conseguiram estabelecer as três características

principais de um modelo animal de doença: (a) validade de face (sintomas

semelhantes)132,143; (b) validade de constructo (causa semelhante)132,143 e (c)

validade preditiva (resposta análoga a tratamentos para prevenir ou reverter os

sintomas)132,143.

29

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar os efeitos da suplementação de AGP ω-3, sobre os parâmetros

comportamentais e bioquímicos em um modelo experimental de autismo.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar os efeitos da suplementação de AGP ω-3 sobre parâmetros de

comportamento estereotipado e interação social recíproca na prole de ratos

machos em PND 52;

Verificar o efeito da suplementação de AGP ω-3 nos níveis de NSE no

cerebelo e hipocampo;

Analisar o efeito da suplementação de AGP ω-3 nos níveis de BDNF no

cerebelo e hipocampo;

Avaliar o efeito da suplementação de AGP ω-3 nos níveis de TGF-β no

cerebelo e hipocampo.

30

3. MÉTODOS

3.1 TIPO DE ESTUDO

Estudo experimental utilizando o modelo da doença.

3.2 ANIMAIS

Para realização do estudo foram utilizadas 12 ratos Wistar (Rattus

norvegicus) fêmeas, virgens, pesando entre 250 e 300g, provenientes do biotério da

Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul – PUC/RS, acasaladas com 6

machos da mesma linhagem e peso. Durante todo o experimento, os animais

permaneceram em padrão sanitário controlado, onde foram mantidos em gaiolas de

polipropileno (46 x 31 x 21cm) forradas com cama de maravalha. Os animais ficaram

em temperatura controlada (22ºC+1ºC) e períodos de luz artificial (12 horas

claro/escuro). Durante todo o período experimental os animais receberam ração

comercial padronizada e água ad libitum.

3.3 ACASALAMENTO

Para a efetivação do acasalamento, as fêmeas foram colocadas ao final

do ciclo de luz (19 horas) nas gaiolas dos machos, sendo sempre introduzidas duas

fêmeas para cada macho. No horário das 7 horas da manhã do dia seguinte, período

inicial do ciclo de luz, foi verificado se ocorreu a prenhez, através do processo do

lavado vaginal. Este procedimento seguiu as descrições de Held e colaboradores144

e consistiu na introdução de NaCl por meio de uma pipeta plástica na vagina da

fêmea, onde foi coletado a secreção para análise em microscópio óptico e

investigada a presença de espermatozoides junto ao material biológico do animal.

Nas fêmeas que foram identificadas com a presença de espermatozoides

considerou-se o dia gestacional zero (DG 0)145. Estas fêmeas, agora denominadas

de matrizes, foram separadas aleatoriamente e colocadas em gaiolas moradias

individualmente, permanecendo nas mesmas, durante todo o período de prenhez.

31

3.4 ATIVAÇÃO IMUNE MATERNA

Para a caracterização do modelo animal de autismo a partir da ativação

imune materna, as matrizes foram divididas aleatoriamente e dois grupos. Um dos

grupos recebeu a administração intraperitoneal (ip) de uma única injeção de LPS

adquirido por extração fenólica a partir de Escherichia coli, sorotipo 0127:B8

(Sigma®), na dose de 100 µg/Kg no DG 9.5, diluída em 50 µg/Kg de solução aquosa

de NaCl 0,9% estéril142,146, caracterizando o grupo experimental (LPS-tratados). O

segundo grupo recebeu apenas solução NaCl 0,9% estéril ip no volume equivalente

ao grupo experimental, caracterizando o grupo controle (Salina-tratados). A

administração das substâncias ocorreu sempre no período vespertino (entre 15 – 17

horas).

3.5 PADRONIZAÇÃO DA NINHADA

A realização dos partos aconteceu de forma natural e no dia pós-natal

(PND) 1 e PND 2 não foi realizada nenhuma manipulação nos animais para evitar a

possibilidade de rejeição da mãe em relação a prole. No PND 3 as ninhadas foram

ajustadas em 4 fêmeas e 4 machos, totalizando 8 animais por ninhada. A distinção

entre os gêneros foi obtida através da identificação da diferença visual relacionada à

distância ano-genital, sendo maior em machos. Em PND 8-15 foi possível confirmar

a distinção entre os gêneros a partir da presença de testículos nos machos e de

mamas nas fêmeas147.

Os filhotes foram distribuídos em dois grupos:

Grupo Salina (n= 20): formado por ratos machos, procedentes de mães

do grupo controle (Salina-tratados).

Grupo LPS (n= 20): formado por ratos machos, procedentes de mães do

grupo experimental (LPS-tratados).

Todos os animais permaneceram com suas mães até PND 21, período

final de aleitamento, onde foi realizado o desmame e tanto as mães quanto a prole

de fêmeas foram submetidas ao procedimento de morte indolor assistida (MIA), que

foi realizada pelo responsável técnico do biotério da UNISUL. A prole de machos

permaneceu no biotério até o final dos procedimentos experimentais.

32

Cada um dos grupos experimentais foi subdivido em outros 2 grupos de

acordo com o tratamento recebido:

Grupo Salina + dieta padrão de laboratório + administração de salina (n=10)

Grupo LPS + dieta padrão de laboratório + administração de salina (n=10)

Grupo Salina + dieta padrão de laboratório + suplementação de AGP ω-3 (n=10)

Grupo LPS + dieta padrão de laboratório + suplementação de AGP ω-3 (n=10)

O AGP ω-3 foi administrado na dose de 0,8 g/kg, via oral*, uma vez ao

dia, sempre no mesmo horário (às 12 horas), durante 21 dias consecutivos. A

solução salina foi administrada no mesmo volume e mesma via. Os animais

receberam suplementação de AGP ω-3 ou solução salina, de acordo com o grupo

experimental, a partir de PND 30. A escolha da dose, horário de administração,

tempo de tratamento e idade dos animais seguiu a descrição de Zugno e

colaboradores74, que mostrou efeitos positivos do AGP ω-3 em respostas

comportamentais de ratos em um modelo experimental de doença neurológica.

As cápsulas de AGP ω-3 continham 1000mg de óleo de peixe, destas

10% eram de AGP EPA e 50% de AGP DHA. Foram escolhidas as cápsulas com

uma maior porcentagem de DHA, devido sua ação na sinaptogênese148 e na

fluidificação das membranas encefálicas59. O DHA interfere na atividade de

proteínas da membrana (canais iônicos, receptores, transportadores, enzimas),

modulando sistemas de neurotransmissores150. Estudos mostram sistemas

dopaminérgicos78 e serotoninérgicos140 afetados pela deficiência de AGP ω-3. A

suplementação de DHA até os 24 meses de idade, vem mostrando efeitos benéficos

no desenvolvimento do encéfalo59,148,149.

3.6 MEDIDAS DO PESO CORPORAL

O peso corporal foi avaliado em PND 30 para ajustar o volume das

dosagens de AGP ω-3 indicada para cada animal. No decorrer do período de

suplementação as medidas de peso corporal foram realizadas duas vezes por

* Para a administração via oral foram utilizadas agulhas de gavagem para camundongos no início do

tratamento (PND 30-PND 40) e substituídas por agulhas de gavagem para ratos a partir PND 41. A escolha das agulhas respeitou o tamanho e o peso dos animais nas diferentes idades, já que o tratamento iniciou-se com animais jovens seguindo até a idade adulta.

33

semana, para adequação da dose, de acordo com a descrição de Cysneiros e

colaboradores151.

A síntese das etapas do delineamento experimental está descritas na

Figura 4.

Figura 4 – Diagrama esquemático das etapas do delineamento experimental

proposto no estudo.

34

3.7 TESTES COMPORTAMENTAIS

Os testes comportamentais foram realizados 24 horas após a última

administração de AGP ω-3, entre o período das 9:00 às 13:00 horas, em baixa

iluminação e monitorados com câmera de vídeo. O pesquisador não permaneceu na

sala de experimentação para evitar qualquer interferência na resposta

comportamental dos animais. Antes de qualquer um dos procedimentos de avaliação

comportamental os animais eram levados em suas gaiolas-moradia à sala de

experimentação com 1 hora de antecedência – representando o período de

habituação. Todos os equipamentos foram limpos com álcool 70% após o teste de

cada animal, impedindo a permanência de odores.

3.7.1 Comportamento Estereotipado

O teste de estereotipia foi realizado em ratos adultos (PND 52) e seguiu

as descrições de Battisti e colaboradores152. A estereotipia foi considerado como a

permanência do animal em posição estacionária exibindo movimentos rápidos e

repetidos da cabeça e membros dianteiros, além disso, foi observado o

comportamento de subidas e/ou descidas, conforme os vários graus de estereotipia.

Os animais foram retirados de suas gaiolas-moradias, demarcados na

cauda com caneta apropriada e colocados em um aparato de campo aberto (60 x 60

x 30 cm), com três paredes de madeira e uma parede de vidro transparente. O piso

sólido foi dividido em 12 quadrantes iguais. Os animais foram acomodados no

quadrante superior esquerdo do campo aberto, de modo que ficassem de costas

para o centro do campo, onde foram avaliados durante 5 minutos. As imagens do

comportamento do animal foram capturadas por uma webcam 2.0 megapixels fixada

em um tripé e acoplada em um notebook e armazenadas para posterior análise dos

vídeos. Após o termino de cada teste, os animais eram retirados do aparato de

campo aberto e devolvidos à gaiola-moradia.

3.7.2 Interação Social Recíproca

De Acordo com Schneider e Przewłocki153, o teste para analisar a

interação social nos animais foi baseado na tendência natural dos roedores em

35

investigar com maior dedicação um indivíduo intruso que lhe foi apresentado pela

primeira vez. Neste teste os animais foram submetidos individualmente a interagir

com outro animal desconhecido do mesmo sexo e mesma faixa etária, durante 10

minutos, em um aparato de campo aberto com as mesmas características descritas

no teste de estereotipia. O teste de interação social foi conduzido posteriormente ao

teste de estereotipia e o registro das imagens foi realizado da mesma forma descrita

acima. Os parâmetros usados para avaliar o comportamento de interação social

recíproca seguiu as descrições de Moreira154 e quantificou os tempos de grooming,

de cheirar, de seguir, de chutar, de socar, de montar ou de permitir a monta pelo

outro animal (Figura 5).

Figura 5 – Teste de interação social recíproca entre dois ratos de mesmo sexo e

idade, que não tiveram contato inicial

(Pasciuto et al., 2015)155

3.8 ANÁLISES BIOQUÍMICAS

Após os testes comportamentais, os animais foram mortos, o encéfalo foi

removido rapidamente e as áreas de interesse foram dissecadas (hipocampo e

cerebelo) sobre superfície congelada e armazenados em freezer -80ºC para as

análises bioquímicas, conforme descrito a seguir:

3.8.1 Quantificação do BDNF por Western Blotting

Os tecidos encefálicos (hipocampo e cerebelo) obtidos dos animais foram

armazenados a -80°C até a utilização; posteriormente foram homogeneizados com

400 ml de tampão RIPA [Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, , 1% de Triton X-100,

36

0,5% de deoxicolato de sódio, 0,1% de SDS e inibidores de protease (Roche)]

durante 30 min em banho de gelo. O homogeneizado dos tecidos foram então

recolhidos, sonicados por 10 min, centrifugados a 13000 rpm por 10 min e

preparados para transferência Western Blotting.

As amostras foram sujeitos à eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida a

15% e, posteriormente, transferidas para membrana de difluoreto de polivinilideno

(PVDF) (Millipore, Bedford, MA, EUA). As membranas de PVDF foram bloqueadas

saturadas e em solução salina tamponada com Tris Tween-20 (TTBS) contendo

solução albumina bovina a 5%156, as membranas de PVDF bloqueadas foram então

incubadas durante a noite com anticorpo de coelho anti-coelho a 4°C (1:1000, Cell

Signalling, USA). Depois disso, as membranas de PVDF foram lavadas três vezes

em TTBS e incubadas com IgG anti-rato conjugado com fluoróforo infravermelho

(1:10000 Cell Signalling, USA), a 37°C durante 30 min. Na sequência, a membrana

foi submetida a scan em fotodocumentador (Odyssey LI-COR Biosciences) e a

densidometria realizada pelo programa Image Studio (LI-COR Biosciences). Os

níveis de expressão da proteína foram normalizados para beta- actina (anti-rato,

1:1000, Cell Signalling, USA). O valor de densidade integrada (IDV) foi usado para

representar o nível de proteínas.

3.8.2 Quantificação da NSE por Western Blotting

As amostras dos tecidos encefálicos (hipocampo e cerebelo) dos animais

foram preparadas e submetidas à eletroforese em dodecil-sulfato de sódio em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) e análise Western Blotting, conforme descrito por Fatemi

e colaboradores157-160. Para NSE, foram utilizados 10% de resolução de géis. Após

SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose

durante 2 horas a 300 mA. As transferências de Western Blotting foram bloqueadas

durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por incubação durante a noite em

anticorpos primários a 4°C. Os anticorpos primários utilizados foram anti-NSE (1:

2,000; Abcam Inc.) e anti-β-actina (1: 5000; Sigma-Aldrich). As membranas foram

incubadas em anticorpos primários durante a noite a 4°C. Após uma lavagem de 30

minutos em solução salina tamponada com fosfato suplementada com 0,003% de

Tween 20 (PBST), as manchas foram incubadas em anticorpos secundários durante

60 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos secundários utilizados foram

37

A9169 (anti-coelho de cabra de imunoglobulina G (IgG), 1: 80.000; Sigma-Aldrich) e

A9044 (IgG anti-rato de coelho, 1: 80.000; Sigma-Aldrich). As manchas foram

lavadas duas vezes em PBST, e as bandas visualizadas usando o sistema de

detecção ECL Western Blotting Plus (GE Healthcare, Little Chalfont,

Buckinghamshire, Reino Unido) e expostas a CL-XPosure Filme (Thermo Scientific,

Rockford, IL, EUA). Bandas imunorreativas foram quantificadas usando subtração do

fundo com um densitômetro de Bio-Rad e software multi-analista de Bio-Rad (Bio-

Rad, Hercules, CA, EUA) com o peso molecular aproximado de 46 kDa para NSE e

42 kDa para β-actina. Os resultados foram obtidos com base em pelo menos duas

experiências independentes.

3.8.3 Quantificação do TGF-β por ELISA

A quantificação de TGF-β foi realizada de acordo com método descrito por

Zanirati e colaboradores161. O tecido encefálico foi usado para análise de TGF-β pelo

ensaio adsorvente ligado a enzima (ELISA) utilizando duo set kit (R & D Systems,

Minneapolis, MN, EUA). Os encéfalos foram homogeneizados em tampão PBS

contendo triton 0,1% e inibidor de protéase (50mM - Roche AG, Basileia, Suíça) e,

em seguida, centrifugados (13000 rpm a 4ºC durante 20 minutos). O sobrenadante

foi recolhido e foi realizada quantificação de proteína pelo kit de ensaio de proteína

BCA (Thermo Scientific, EUA). O ensaio de ELISA foi realizado de acordo com o as

instruções do fabricante e a leitura foi realizada em 450 nm na leitora de microplacas

(SPECTRAMAX, Molecular Devices, USA). Os níveis de proteína foram

apresentados em pg/mg de proteína total.

3.9 ANÁLISE DE DADOS

Para os ensaios bioquímicos e comportamentais, os resultados foram

apresentados como média ± desvio padrão da média (E.P.M., 95%). A análise dos

dados bioquímicos entre os grupos foi realizada por meio de análise de variância

(ANOVA) de uma ou duas vias, seguido de post hoc de Newman-Keuls. Para os

testes comportamentais referentes à validação do modelo experimental foi utilizado o

teste T-Student. A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05.

38

As análises foram realizadas utilizando o programa Statistical Package for the Social

Sciences 20.0 (SPSS).

3.10 ASPECTOS ÉTICOS

Este estudo foi submetido à avaliação do Comitê de Ética no Uso de

Animais (CEUA) da Universidade do Sul de Santa Catarina e aprovado sob número

de protocolo 14.003.2.01.IV. A utilização dos animais seguiu a Diretriz Brasileira para

Cuidado e a Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos – DBCA do

CONCEA (Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal, Resolução

Normativa nº 12, de 20 de setembro de 2013, publicado no Diário Oficial da União –

Secão 1)162.

Para que fosse minimizado o sofrimento dos animais, foi utilizado o

tamanho de amostra mínimo e adequado para a realização da análise estatística. O

número de animais em cada grupo foi baseado no estudo de Graciarena e

colaboradores133 que avaliou parâmetros bioquímicos em um modelo animal de

autismo através da administração subcutânea de LPS.

39

4 RESULTADOS

Os resultados obtidos a partir das avaliações comportamentais e

bioquímicas foram ordenados da seguinte maneira:

4.1 TESTES COMPORTAMENTAIS

4.1.1 Comportamento Estereotipado

Uma das características do TEA é a presença de comportamento

repetitivo e estereotipado e a avaliação da atividade de grooming (movimento de

autolimpeza) têm sido amplamente utilizada como um índice de comportamento

repetitivo em estudos pré-clínicos do TEA155,163.

Os resultados deste estudo mostraram que a exposição pré-natal ao LPS

foi capaz de aumentar significativamente o número (Figura 6A) e tempo (Figura 6B)

de episódios de movimentos estereotipados (grooming) quando comparados aos

animais do grupo Salina-tratados [(F = 4,830; P= 0,041); (F = 2,681; P= 0,009),

respectivamente] (Figura 6). Considerando o parâmetro de grooming como

referência como um dos critérios utilizados para a validação do modelo experimental

proposto, os resultados mostraram que a suplementação de AGP ω-3 reverteu este

parâmetro avaliado entre os animais LPS + AGP ω-3 comparados aos animais do

grupo Salina+ AGP ω-3 [(F = 4,857; P= 0,005)]. O teste de estereotipia foi

mensurado durante 5 minutos, os dados foram expressos em média ± desvio

padrão, cada grupo apresentou um n= 10.

40

Figura 6 – Número (Figura 6A) e tempo (Figura 6B) de episódios de movimentos

estereotipados (grooming) realizados pelos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3,

LPS + AGP ω-3.*Diferença significativa no número de grooming (nº de episódios) entre os grupos

Salina e LPS. # Diferença significativa no tempo (segundos) entre os grupos LPS e LPS + AGP ω-3.

P<0,05 (T. Student).

4.1.2 Teste de interação social recíproca

A interação social é uma das características mais proeminentes do TEA,

podendo se manifestar através do isolamento ou comportamento social anormal,

incapacidade em participar de atividades em grupo, marasmo afetivo ou

manifestações inadequadas de se relacionar e dificuldade em transmitir emoções ao

outro2,155. O teste de interação social recíproca conduzido neste estudo foi avaliado

por tempo (em segundos), mensurado durante 10 minutos, os resultados mostraram

diferenças significativas nos parâmetros de cheirar, de seguir e de montar (Figura 7).

O grupo LPS-tratados diminuiu significativamente o parâmetro de cheirar quando

comparado ao grupo Salina-tratados [(F= 2,453; P= 0,001)] e reverteu esta condição

após suplementação de AGP ω-3 [(F= 7,217; P= 0,013)]. Embora os valores não

apresentaram-se significativos, foi possível observar uma tendência a menor tempo

de interação social recíproca no parâmetro seguir entre os animais expostos ao LPS

em período pré-natal, no entanto, quando comparados ao animais LPS e LPS+ AGP

ω-3, os resultados mostraram que a suplementação de AGP ω-3 foi capaz de

provocar alterações significativas neste parâmetro. O parâmetro de montar também

foi significativamente menor entre os ratos LPS-tratados [(F= 13,957; P= 0,002)], no

entanto, a suplementação de AGP ω-3 não apresentou resultados significativos para

este parâmetro. Os dados do teste de interação social foram expressos em média ±

desvio padrão, cada grupo foi composto por um n= 10.

41

Figura 7 – Tempo (em segundos) da interação social apresentado pelos grupos:

Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω-3. *Diferença significativa entre os grupos

Salina e LPS. # Diferença significativa entre os grupos LPS e LPS + AGP ω-3. P<0,05 (T. Student).

4.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS

4.2.1 Quantificação de NSE

A Figura (8) apresenta o resultado da densidometria da NSE de

hipocampo e cerebelo. Os resultados demonstraram um aumento dos níveis

proteicos da NSE significativamente maiores no hipocampo de animais LPS-

tratados, quando comparados aos Salina-tratados e esta condição foi revertida pela

suplementação de AGP ω-3, significativamente comparando os grupos LPS x LPS +

AGP ω-3. Ao contrário do hipocampo, o cerebelo não apresentou diferença

significativa para este marcador de dano neuronal. Os dados da quantificação de

NSE foram expressos em média ± desvio padrão, cada grupo foi composto por um

n= 6.

42

Figura 8 – Níveis proteicos de NSE nas estruturas encefálicas do hipocampo (Figura

8A) e cerebelo (Figura 8B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP

ω-3.*Diferença significativa entre os grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω-3.

P<0,05 (Newman-Keuls).

4.2.2 Quantificação de BDNF

Apesar de os níveis proteicos de BDNF das estruturas encefálicas

estudadas não apresentarem diferenças significativas em nenhum dos grupos

experimentais, os resultados mostraram uma tendência ao aumento deste fator

neurotrófico associado à suplementação de AGP ω-3 (Figura 9). Os dados da

quantificação de BDNF foram expressos em média ± desvio padrão, cada grupo

apresentou n= 6.

43

Figura 9 – Níveis proteicos de BDNF nas estruturas encefálicas do hipocampo

(Figura 9A) e cerebelo (Figura 9B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS

+ AGP ω-3.

4.2.3 Quantificação de TGF-β

A expressão do TGF-β foi quantificada no hipocampo e cerebelo dos

animais. A exposição pré-natal de LPS foi capaz de diminuir significativamente os

níveis de TGF-β no hipocampo e esta condição foi revertida pela suplementação de

AGP ω-3 (Figura 10). No cerebelo, embora os valores não tenham se mostrado

significativos, foi possível observar uma tendência ao aumento na expressão de

TGF-β após a suplementação de AGP ω-3. Os dados da quantificação de TGF-β

foram expressos em média ± desvio padrão, cada grupo analisado apresentou um

n= 6.

44

Figura 10 – Níveis de TGF-β nas estruturas encefálicas do hipocampo (Figura 10A)

e cerebelo (Figura 10B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω-

3.*Diferença significativa entre os grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω-3. P<0,05

(Newman-Keuls).

45

5 DISCUSSÃO

Os prejuízos persistentes na comunicação social recíproca, interação

social, padrões restritos e repetitivos de comportamento, atividades e/ou interesses

são evidenciados no TEA1. Sintomas assim estão presentes desde a infância, e se

perpetuam no decorrer do desenvolvimento, acarretando numa limitação e/ou

prejudicando as atividades do cotidiano155. Considerando o espectro de

apresentações, normalmente as manifestações da síndrome variam bastante,

dependendo da gravidade, do nível de desenvolvimento e da idade cronológica do

paciente1.

A etiologia e as características clínicas do TEA são complexas e

extremamente heterogêneas. Diversos fatores de risco potenciais como influências

genéticas164, epigenéticas165, ambientais e/ou fatores imunológicos140,166, têm sido

apontados como fatores causais para o desenvolvimento do TEA, considerando

assim um transtorno multifatorial167.

Experiências vivenciadas durante o período pré-natal são determinantes

para a saúde do feto132. A ocorrência de infecções maternas e a consequente

ativação do sistema imune da mãe ocasionam uma série de alterações estruturais e

funcionais no sistema nervoso da prole, podendo predispor o indivíduo a doenças

neurológicas na vida pós-natal, incluindo o TEA132.

Spencer e colaboradores146, em um estudo pré-clínico de TEA, mostraram

que a administração intraperitoneal de LPS no período pré-natal induziu a um

processo inflamatório no SNC dos fetos através do aumento da liberação de

citocinas pró-inflamatórias que, por sua vez, após atravessarem a barreira

hematoencefálica, conseguiram modular a atividade dos neurônios causando

alteração na neurotransmissão e, consequentemente, desenvolvendo

comportamentos semelhantes ao TEA em ratos Wistar. Os comportamentos atípicos

associados à exposição pré-natal de LPS podem se manifestar em períodos de curto

ou longo prazo168.

A manifestação de comportamentos estereotipados apresentados pelos

animais experimentais expostos ao LPS em período pré-natal e avaliados neste

estudo foi semelhante aos resultados de Spencer e colaboradores146 e replicados

por Kirsten e colaboradores142. Da mesma forma, os interesses limitados e prejuízo

46

na interação social recíproca foram confirmados neste estudo, especialmente, nos

parâmetros cheirar e montar. Considerando que estes representam comportamento

natural de roedores, uma alteração nas respostas dos testes de estereotipia e

interação social recíproca permite caracterizar este como um modelo adequado com

validade de face e de constructo, pelo menos.

A etiologia do TEA é julgada complexa5, tornando assim os tratamentos

farmacológicos clássicos insuficientes ou inadequados e a busca por terapias

complementares tem sido considerada uma alternativa interessante84. Suplementos

alimentares tem sido apontados como reguladores estruturais e funcionais do SNC e

eficazes no tratamento de doenças neurológicas e psiquiátricas9,10,59. O AGP ω-3,

em especial, é capaz de proporcionar atividades neurobiológicas através da

modulação da neuroplasticidade e formação da bainha de mielina, atuando no

desenvolvimento dos sistemas neurais sensoriais, perceptivos, motores e cognitivos

como aprendizagem e memória60. Além disso, apresenta ação anti-inflamatória59,64 e

antioxidante10.

A suplementação de AGP ω-3 durante as fases iniciais do

desenvolvimento do SNC, conduzidas neste estudo, foi capaz de reverter à resposta

comportamental de ratos expostos ao LPS em período pré-natal, exercendo, desta

forma, efeito positivo para as manifestações clínicas típicas do TEA. Em uma meta-

análise realizada por Lee e colaboradores e publicada em 201464, sugeriu que uma

melhor fluidificação da membrana encefálica proporcionado pela administração de

DHA na suplementação tenha uma participação importante na melhora no

comportamento de estereotipia e interação social de animais. Embora não se tenha,

até o momento, estudo conclusivo que apresente alteração em determinada via de

neurotransmissão associada à fisiopatologia do TEA, é possível que o

reestabelecimento de níveis de dopamina78 ou ainda a melhora na transmissão

sináptica glutamatérgica169 proporcionados pela suplementação de AGP ω-3,

tenham favorecido o desenvolvimento neuronal e auxiliado a redução dos sintomas

autistas neste modelo experimental. Resultados semelhantes foram encontrados por

Theije e colaboradores170 em um modelo de alergia alimentar.

A segunda etapa deste estudo teve objetivo de avaliar a expressão de

biomarcadores associados a alterações neurológicas. Os biomarcadores são

indicadores de processos biológicos normais, patológicos ou de resposta

farmacológica de uma intervenção terapêutica89. Embora não se tenha, até o

47

momento, um marcador biológico específico ou exame complementar para auxiliar o

diagnóstico do TEA, alguns estudos têm apontado alteração em níveis de

marcadores de danos às células neuronais como a NSE96, de fatores neurotróficos

como o BDNF171, além de alterações em fatores de crescimento como o TGF-β131.

A NSE é um importante marcador de danos às células neuronais95 e, por

ser uma enzima glicolítica, sua atividade metabólica pode refletir nos neurônios91.

Estudos têm mostrado que a análise da sua expressão pode contribuir para a

investigação de doenças neurológicas, como o TEA172. O aumento na expressão da

NSE no hipocampo de animais LPS-tratados em período pré-natal, quantificado

neste estudo, foi semelhante aos resultados encontrados por Ogundele e

colaboradores173 em um modelo de neuroinflamação a partir da intoxicação por

cianeto (20mg/kg). De modo geral, infecções maternas são capazes de provocar, na

prole, ativação da micróglia, metabolismo neuronal anormal e estresse oxidativo

durante o processo de neurogênese. É possível que uma ativação na micróglia e

aumento de dano oxidativo47, parâmetros frequentemente apresentados em modelos

pré-clínicos de TEA, estejam relacionados a um dano encefálico que trouxe como

consequência o aumento na expressão da NSE no hipocampo com consequentes

alterações neurológicas.

A suplementação de AGP ω-3 foi capaz de reverter os níveis diminuídos

de NSE no hipocampo. A deficiência de AGP ω-3 na alimentação, faz com que

ocorra uma redução nas concentrações de DHA no encéfalo, associado aos

menores índices de desenvolvimento neuronal174. Estudos in vitro169 e in vivo169

mostraram que a suplementação de AGP ω-3, especialmente como maior teor de

DHA, exerceu papel importante no neurodesenvolvimento, promovendo crescimento

neuronal no hipocampo, sinaptogênese, diferenciação celular e ações anti-

apoptótica169.

O BDNF é uma proteína que se apresenta naturalmente no SNC,

colaborando para o desenvolvimento do encéfalo pré e pós-natal e está relacionado

com os processos de aprendizagem e memória104,105,116, participando nos ajustes

das atividades sinápticas e na plasticidade neuronal112,119. Apesar de os valores de

expressão de BDNF não mostrarem-se significativos neste estudo, foi possível

observar uma tendência à diminuição desta proteína no hipocampo e cerebelo dos

animais expostos ao LPS em período pré-natal. Um estudo clínico conduzido por

Abdallah e colaboradores175, mostrou que pacientes autistas apresentam alteração

48

nos níveis de BDNF e sugeriu que níveis diminuídos estejam relacionados com

anormalidades na proliferação, migração e sobrevivência celular durante o

desenvolvimento do SNC, acarretando em alterações neurológicas descritas no

TEA, entre elas, comprometimento no processo de neuroplasticidade176. Estes

dados fortalecem a relação entre fatores ambientais que provocam diminuição dos

níveis de BDNF (nestes casos, ativação imune materna) e etiologia do TEA48,124,177.

Além disso, níveis diminuídos de BDNF podem estar relacionados à

regulação negativa de Akt cinase que regula, por sua vez, a Bcl2. Desta forma, a

alteração na atividade da via de sinalização anti-apoptótica BDNF-Akt-Bcl2 pode

representar um mecanismo implícito parcialmente responsável pela etiologia do

TEA178. É possível que um aumento no tamanho da amostra possa atingir a

significância estatística para este fator neurotrófico, em especial para o modelo

experimental de escolha deste estudo.

Um estudo de revisão conduzido por Das171 em 2013, mostrou que um

processo de neuroinflamação durante o período intra-uterino pode levar a alterações

no metabolismo de AGP e seus metabólitos. Os AGP ω-3 são conhecidos por elevar

os níveis de BDNF no encéfalo, e tanto o AGP ω-3 quanto o BDNF apresentam

papéis importantes no desenvolvimento do SNC e na função cognitiva171,179,180. Os

resultados deste estudo mostraram que a suplementação de AGP ω-3 aumentou,

embora com valores não significativos, a expressão dos níveis de BDNF no

hipocampo e no cerebelo de animais expostos ao LPS em período pré-natal. Esses

dados podem estar relacionados com capacidade dos metabólitos de AGP em

aumentar os níveis dos receptores de BDNF171. Neste sentido, sugere-se que

distúrbios neurocomportamentais na prole possam estar relacionados com a

deficiência de AGP ω-3.

O TGF-β é uma citocina que pode ser expressa no encéfalo e representa

um regulador essencial das respostas à lesão e inflamação de estruturas do

SNC181,182. O TGF-β é considerado uma citocina multifuncional e imunossupressora,

crítica para a homeostase imune e que desempenha um papel importante no

desenvolvimento em todo o processo de embriogênese175.

A redução nos níveis de TGF-β no hipocampo de animais LPS-tratados

em período pré-natal, apresentados neste estudo, foi semelhante aos resultados

encontrados por Ashwood e colaboradores125 e, mais recentemente por Gohary e

colaboradores183, quando demonstraram níveis diminuídos de TGF-β plasmático em

49

indivíduos autistas. A diminuição nos níveis de TGF-β pode estar relacionada com

uma alteração no processo de migração celular, apoptose ou ainda, regulação do

sistema imunitário do SNC. Além disso, o TGF-β, no hipocampo, desempenha uma

função importante na programação e modulação da interação social e

comportamento repetitivo131,133. Shen e colaboradores182, em um estudo utilizando

modelo experimental de Alzheimer, mostraram que o TGF-β exerce um papel

importante na manutenção da integridade neuronal e a sobrevivência dos neurônios

do SNC, evidenciando envolvimento no desenvolvimento e plasticidade neuronal182.

Somando-se a isto, o TGF-β é capaz de controlar o processo inflamatório e exercer

efeito neuroprotetor a partir de ações anti-inflamatórias e anti-apoptóticas184 e, por

isso, pode representar um fator de crescimento com potencial atuação na etiologia

do TEA185.

A suplementação de AGP ω-3 foi capaz de aumentar os níveis de TGF-β

no hipocampo. Esta condição pode estar relacionada à atenuação da ativação da

micróglia, principalmente devido a maior proporção da suplementação de DHA que

está envolvida na modulação de respostas inflamatórias186,187. O AGP ω-3, quando

utilizado em período prolongado por pacientes com doenças neurológicas ou

psiquiátricas, favorece a homeostasia e auxilia na redução das manifestações

clínicas apresentadas por estes pacientes10,174,188.

Por fim, em conjunto à crescente evidência de que a ativação imune

materna é um dos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento do TEA (modelo

animal e humanos), este estudo é a primeira evidência de que a suplementação de

AGP ω-3 está associada a melhora no comportamento de estereotipia e interação

social recíproca, além de diminuir os níveis de NSE e aumentar os de níveis de

expressão de BDNF e TGF-β. Em conclusão, os resultados obtidos neste estudo

auxiliam a compreensão do mecanismo neuroprotetor do AGP ω-3 e de seu

potencial papel na terapia não-farmacológica para tratamento do TEA.

50

6 CONCLUSÃO

Tomados em conjunto, os resultados do presente estudo indicam que a

ativação imune materna provocada pela administração de LPS no DG 9,5 causou na

prole adulta alterações comportamentais e neuroquímicas condizentes com o TEA,

sendo elas:

- Aumento de movimentos estereotipados e redução no comportamento

social recíproco;

- Aumento nos níveis de marcador de dano neuronal (NSE) e diminuição

da expressão de TGF- β no hipocampo de ratos LPS-tratados.

A suplementação de AGP ω-3 apresentou reversão do comportamento

autista e exerceu efeito neuroprotetor, especificamente:

- Diminuição de movimentos estereotipados e aumento no comportamento

social recíproco;

- Diminuição nos níveis de marcador de dano neuronal (NSE) e aumento

da expressão de TGF- β no hipocampo de ratos LPS-tratados.

Embora o AGP ω-3 tenha apresentado resultados positivos, tanto

comportamentais como neuroquímicos, no modelo experimental de TEA, novos

estudos são necessários para avaliar os efeitos da suplementação com este AGP

em outras fases do desenvolvimento e em doses de administração diferentes para

confirmar sua potencial ação como alternativa terapêutica para o tratamento do TEA.

E, a partir desses resultados, propor estudos com uma abordagem clínica.

51

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ANEXO

ANEXO A- Parecer Aprovação do Comitê de Ética