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Marycel Rosa Felisa Figols de Barboza
AÇÃO DO FENOBARBITAL SOBRE ALGUNS ASPECTOS
DO METABOLISMO HEPÁTICO DA TIROXINA
Dissertação apresentada ao Instituto de Bloclenclas da Universidade de São Paulo para obtenção do título de "Mestre em Ciências".
SÃO PAULO 1877
Marycel Rosa fetlsa Figols de Barboza
AÇÃO 0 0 F E N O B A R B I T A L S O B R E A L G U N S A S P E C T O S
00 M E T A B O L I S M O H E P Á T I C O DA T I R O X I N A
O •
SAO PAULO
1977
Dissertação apresentada ao I n s t i t u t o de^ Biociências do Univers idade de-Sco Pau Io para obtençõo do t f t u l o
de "Mestre em Ciências"
l-^S ; i T U ! 0 P E = Q U
D i s s e r t a ç ã o e l a b o r a d a no C e n t r o de
A p l i c a ç õ e s Biomédicas de R a d i o i s ó
t o p o s e Rad iações do I n s t i t u t o de
E n e r q i a A tómica - Sao P a u l o
O r i e n t a d o r : P r o f . D r . W i l i a n N i c o l a u
À ndnha true.
à meus filhos.
y... •
Aos Professores
Dr. Wilian Nioolau
Dr. Rmulo Ribeiro Pieroni
Dr. Lido Marques de Assis
Dr. Antonio Sessoj
Âs colegas
Clara Bogarczuk
Emiko Muramoto
Etsuko Ikeda de Carvalho
Josefa Paredes Villalobos
Neusa Maria Alves Abelin
Margo V. Hehl Rebelo dos Santos
Vânia Caira Borghi,
Â
Sra. Idelma Freitas Pagliusi,
nossos agradecimentos.
RESUMO
E s t u d a r a m - s e as m o d i f i c a ç õ e s ocas ionadas p e l o f e n o b a r b i
t a l an r a t o s submet idos a doses d i a r i a s de 20 mg d u r a n t e c i n c o d i a s .
Houve a l t e r a ç ã o da massa hepá t i ca com inc remento de peso
e p r o l i f e r a ç ã o do r e t T c u l o endop lasmá t i co l i s o e r u g o s o , acompanhado de
aumento na v e l o c i d a d e do f l u x o e do i o d o t o t a l b i l i a r nos r a t o s sob e s
t i m u l o do f e n o b a r b i t a l .
Não se v e r i f i c o u a l t e r a ç ã o no P . B . I . s é r i c o , e v i d e n c i a n
d o , e n t r e t a n t o , ma io r con jugação da t e t r a i o d o t i r o n i n a e um incremento
s i g n i f i c a t i v o na exc reção b i l i a r do g l i c u r o n i d a t o de t i r o x i n a . Embora
menos a c e n t u a d o , houve -tamben aumento na exc reção da T ^ h e p á t i c a .
J J j
ABSTRACT
Some aspec t s o f T ^ metabo l i sm were s t u d i e d in r a t s s u b
m i t t e d t o d a i l y doses o f 20 mg o f p h é n o b a r b i t a l f o r 5 d a y s . ^ ^ ^ I - T ^ was
used as t r a c e r m a t e r i a l .
An en largement o f hepa t i c mass accanpan ied by p r o l i f e r a
t i o n o f smooth and rough endop lasmic r e t i c u l u m was o b s e r v e d . P B I remai
ned unchanged . T o t a l i o d i n e , b i l i a r y f l u x , T ^ and I t s g l u c u r o h i d a t e in
c reased a f t e r p h é n o b a r b i t a l a d m i n i s t r a t i o n .
I N S T I T U T O (JE P E P C Ü • • :? • • ?: . í. ' I C - S E N U C L E A R E S I. P. E.
SUMARIO
pag.
1 . INTRODUÇÃO 1
2 . P R O P O S I T O DO T R A B A L H O 6
!
3 . M A T E R I A L E MÉTODOS 7
3 , T , A n i m a i s , 7
3 . 2 . Amb ien te 7
3 . 3 . D i e t a 8
3 . 4 . Manuse io dos an ima is 8
3 . 4 . 1 . Pesagem 8
3 . 4 . 2 . C i r u r g i a 8 1 2 5
3 . 4 . 3 . I n j e ç ã o de t e t r a i o d o t i r o n i n a ( T ^ - I ) 9
3 . 4 . 4 . C o l e t a da b i l e 9
3 . 4 . 5 . C o l e t a de amos t ra sanguínea 9
3 . 4 . 6 . Remoção do f í g a d o 9
3 . 4 . 7 . Hepa tec tcmia para m i c roscop ia e l e t r ô n i c a 1 0
3 . 5 . Mé todos a n a l í t i c o s 1 0
3 . 5 . 1 . Ob tenção do hormônio marcado 1 0
3 . 5 . 1 . 1 . T é c n i c a de iodação 1 0
3 . 5 . 1 . 2 . P u r i f i c a ç ã o do hormônio marcado 1 1
3 . 5 . 1 . 3 . Contagem das f r a ç õ e s 1 1
J""" 3 . 5 . 1 . 4 . T e s t e de rend imen to da iodação e de p u r e z a
do hormônio iodado 1 1
3 . 5 . 2 . F i l t r a ç ã o da b i l e em gel de Sephadex G-25M 1 2
3 . 5 . 2 . 1 . P r e p a r a ç ã o da co luna de Sephadex 1 2
] 3 . 5 . 2 . 2 . C r w n a t o g r a f i a b i l i a r em Sephadex G - 2 9 i . . . . 1 4
3 . 5 . 2 . 3 . I d e n t i f i c a ç ã o do g l i c u r o n i d a t o de t i r o x i n a . 1 4
3 . 5 . 2 . 3 . 1 . H i d r ó l i s e do g l i c u r o n i d a t o de t 1 ^ '
r o x i n a 1 6
3 . 5 . 2 . 3 . 2 . C r o m a t o g r a f i a do h i d r o l i z a d o em
Sephadex G-25M 16
3 . 5 . 2 . 3 . 3 . C r o m a t o g r a f i a em papel 1 6
3 . 5 . 3 . Dosagem do P B I s é r i c o e i odo t o t a l b i l i a r 1 8
3 . 5 . 4 . M i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a 20
3 . 5 . 5 . A n á l i s e e s t a t í s t i c a 20
4 . R E S U L T A D O S 23
4 . 1 . Peso dos an ima i s 23
4 . 2 . Peso do f í g a d o 23
4 . 3 . F l u x o b i l i a r 26
4 . 4 . A v a l i a ç ã o do P B I s é r i c o e i odo t o t a l b i l i a r 26
4 . 5 . C r a n a t o g r a f l a dos compostos iodados b i l i a r e s 30
4 . 6 . M i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a 3 7
5 . D I S C U S S Ã O 40
5 . 1 . Peso dos an ima i s e peso do f í g a d o 40
5 . 2 . F l u x o b i l i a r 41
5 . 3 . I odo l i g a d o às p r o t e í n a s s é r i c a s ( P B I ) 42
5 . 4 . Iodo b i l i a r t o t a l 42
5 . 5 . C r o m a t o g r a f i a b i l i a r em co luna de Sephadex G - 2 5 M 43
5 . 6 . T i r o x i n a e g l i c u r o n i d a t o de t i r o x i n a 43
6 . CONCLUSÕES 46
7 . R E F E R E N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S 4 7
1. INTRODUÇÃO
Alguns anos apôs a identificação da tetraiodotironina O 4 ) ,
KENDALl^^ evidenciou a importância da excreção biliar como via metahÔ
liça e/ou excretora deste hormônio em cães oue receberam intravenosamen_
131 - 131 te T^- I exógeno (453 do I era eliminado na bile apos 50 horas). A
(B 43 44 451
partir deste relato outros autores 1 * ' ' ' confirmaram a excreção
da T^ inalterada através da bile.
ALBERT e c o l . ^ afirmam em suas experiências que este hormô
nio e concentrado rapidamente pelo fígado e, um minuto apôs a injeção 125
traçadora, 40% da T^- I encontra-se presente no fígado; a seguir hã
acréscimo paulatino da radioatividade hepática, acompanhado por um au
mento paralelo na bile, que e lançada no trato gastrointestinal.
(B 43)
Nos anos seguintes, outros autores^ * 'tentaram evidenciar
os componentes biliares, porem devido ã falta de melhor desenvolvimento
da metodologia de separação SÓ identificaram a T^ e o iodeto. Em 1950,
TAUROG^) introduziu novas técnicas de separação crornatografica em pa
pel e conseguiu identificar mais duas frações além da T^ e iodeto : um
metabolito desconhecido e um composto conjugado da T 4 que se denominou
composto U. 0 mesmo autor^ 5^, en trabalho posterior, identificou este
Gonposto a t r a v é s de h i d r o l i s e com b e t a - g l i c u r o n i d a s e (componente e s t r u
t u r a l do r e t T c u l o endop lasmát i co l i s o ) , que e x c r e t a d o po r v i a b i l i a r no
t r a t o g a s t r o i n t e s t i n a l não era encon t rado nas f e z e s dos a n i m a i s e s t u d a
d o s , v i s t o se r o mesno h i d r o l i z a d o pe la b e t a - g l i c u r o n i d a s e e n t é r i c a . A
p a r t i r d e s t a s obse rvações o a u t o r c o n c l u i u que o composto U e ra g l i c u r o
n i d a t o de t i r o x i n a e uma das fo rmas de m e t a b o l i z a ç ã o h e p á t i c a do hormõ-
S a b e - s e que uma das i m p o r t a n t e s v i a s m e t a b ó l i c a s dos p r o d u t o s
n a t u r a i s , das d rogas e das s u b s t â n c i a s t ó x i c a s é a t r a v é s da r e a ç ã o e s
quemat i zada a s e g u i r :
U D P G * + ZNAD"^ UDPGA + 2NA0H + 2 H * (desidrogenase
UDPG)
UDPGA + R - O H R - O - G L I C U R O N I D A T O + UD? ( g l i c u r o n i l
t rans ferase )
E s t e s p r o d u t o s são e x c r e t a d o s na u r i n a e nas f e z e s como g l i c u
r o n i d a t o s a t r a v é s de e s t e r i f i c a ç ã o d i r e t a ou apôs p r é v i a h i d r o x l l a ç ã o (46 )
E x i s t e m numerosos es tudos sobre os e f e i t o s de d rogas c a u s a d o
r a s de aumento da a t i v i d a d e enz in rá t i ca dos microssomas h e p á t i c o s para
m e t a b o l i z a ç ã o desses p r o d u t o s ^ ^ ' ^ ^ ' ^ ^ ^ . Um dos métodos que p e r m i t e m e
l h o r a n á l i s e d e s t e mecanismo e n z i m á t i c o s e r i a o es tudo das a l t e r a ç õ e s
p r o d u z i d a s po r b a r b i t ú r i c o s ou drogas no s i s t e m a .
A obse rvação de que o f e n o b a r b i t a l e s t i m u l a a s í n t e s e p r o t e i
c a , a t r a v é s de aumento na r e l a ç ã o R i W D N A , sugere um a la rgamen to das c é
* UDPG = u r i d i n a - d i f o s f a t o - g l i c o s e ; KAD = nicot inaaida-adenina-dinucleo t ídeo; UDPGA = acido ur idina d i f o s f o g l i c u r ô n i c o ; NADH =nicotiñainida-ade n ina-dinucleot ídeo Reduzido; UDP » u r i d i n a - d i f o s f a t o . ~
l \ s M T U r c U í i p ; ; s G u " • / R I : ; / ' ? E N U C L Í T A R E S i
l u l a s i n d i v i d u a i s que l e v a r i a m a um acrésc imo no peso do f í g a d o ( 3 )
D i v e r s o s a u t o r e s im f e i t o e x p e r i ê n c i a s em homogeneizados de
f í g a d o de r a t o cem i n t u i t o de v e r i f i c a r a a l t e r a ç ã o e n z i m á t i c a p r o d u z i
da p e l o f e n o b a r b i t a l . P L A T T ^ ^ ^ ^ e O R R E N I U S ^ ^ ^ ^ encont ra ram um aumento
na a t i v i d a d e da g l i c u r o n i l t r a n s f e r a s e , e n t r e t a n t o L U C I E R ^ ^ ^ ^ v e r i f i c o u
e x i s t i r redução da r e f e r i d a e n z i m a .
P o r o u t r o l a d o , os b a r b i t ú r i c o s , por suas ações s e d a t i v a s ceji
t r a i s , têm s i d o usados há mu i t o tempo como a u x i l i a r e s no t r a t a m e n t o das
t i r e o t o x i c o s e s e , no c u r s o dos ú l t i m o s v i n t e a n o s , o b t i v e r a m - s e novos
dados sobre a i n t e r a ç ã o d e s t a s drogas com os s í t i o s de l i g a ç ã o dos h o r
mônios t i r e o i d e a n o s , t a n t o nas c é l u l a s como no p lasma . T a i s i n t e r a ç õ e s
a f e t a r i a m a concen t ração das i o d o - t i r o n i n a s na c i r c u l a ç ã o ou i n f l u e n c i a
r i am a d i s t r i b u i ç ã o , o metabo l i smo e a exc reção dos hormônios t i r e o i d e a ^
n o s ^ ^ ^ , podendo-se c i t a r , como exemp lo , as a l t e r a ç õ e s da depuração f e -
c a l de T . ' ^ - " * ) .
L e v a n d o em cons ide ração as c a r a c t e r í s t i c a s da d i s t r i b u i ç ã o pe
r i f é r i c a e do me tabo l i smo dos hormônios t i r e o i d e a n o s ( F i g u r a 1 ) , O P P E -
NHEIMER e c o l . ^ ^ ^ ^ , numa s é r i e de es tudos e x o e r i m e n t a i s em r a t o s , d e
monst raram que o f e n o b a r b i t a l e s t i m u l a a v e l o c i d a d e de depuração da T ^
em ma io r p ropo rção que a de t r i i o d o t i r o n i n a ( T ^ ) . E s t e e f e i t o é d e v i
d o , não a uma a l t e r a ç ã o nas p r o t e í n a s p l a s m á t i c a s t r a n s p o r t a d o r a s dos
ho rmôn ios , mas a um aumento nas l i g a ç õ e s h e p a t o c e l u l a r e s e e s t í m u l o no
mecanismo de cap tação h e p á t i c a da T ^ .
SCHWARTZ e c o l . ^ ^ ^ ^ sugerem e x i s t i r aumento nas l i g a ç õ e s de
T ^ nos h e p a t Ô c i t o s apÔs adm in i s t ração do f e n o b a r b i t a l , d e v i d o ao aumen
t o do número de s í t i o s de l i g a ç õ e s nas f r a ç õ e s m i c r o s s o m a i s , presumive l
I I I
r;
í
1
T IREOJOE
^ ^ H J P O T A L A M O
TECIDO EXTflAHEPATICO
I -
VA N Ú C L E O
I - I
F I G U R A 1 - R E P R E S E N T A Ç Ã O ESQUCt^^T ICA DO f ! E T A B Q L i y - 1 0 E D I S T R I B U I Ç Ã O
DOS HORMÔNIOS T I R E O I D I A N O S
I mente p e l a p r o l i f e r a ç ã o do r e t T c u l o endop lasmát i co l i s o .
G O L D S T E I N ^ ' sugere que as m o d i f i c a ç õ e s na exc reção h e p á t i c a
" i n v i v o " da T ^ e s t a r i a m ma is l i g a d a s ao aumento do f l u x o b i l i a r que ãs
a l t e r a ç õ e s da g l i c u r o n i l t r a n s f e r a s e . O inc remento de exc reção de ^^^I
na b i l e em r a t o s p r ê - t r a t a d o s com f e n o b a r b i t a l f o i acompanhado de aumen
t o p r o p o r c i o n a l do f l u x o b i l i a r , permanecendo i n a l t e r a d a a concen t ração
d o i s ó t o p o . N e s t e t r a b a l h o , as quan t i dades r e l a t i v a s de T ^ e de seu
g l i c u r o n i d a t o se assemelhavam ãs do g rupo c o n t r o l e em e x p e r i ê n c i a s t a n
t o " i n v i v o " quanto " i n v i t r o " .
J
2 . P R O P O S I T O DO TRABALHO
De posse de me todo log ia mais r e f i n a d a de separação dos ccmpo¿
t o s iodados b i l i a r e s , nos propusemos:
a ) E s t u d a r as m o d i f i c a ç õ e s q u a l i t a t i v a s e q u a n t i t a t i v a s ocas ionadas p e
la a d m i n i s t r a ç ã o de f e n o b a r b i t a l en r a t o s , no que se r e f e r e ã e x c r e
ção b i l i a r da t i r o x i n a r a d i o a t i v a e seu g l i c u r o n i d a t o ;
b) R e a v a l i a r os achados da l i t e r a t u r a , quan to ao aumento do f l u x o b i
l i a r e da massa h e p ã t i c a , nos an ima is submet idos ã r e f e r i d a d r o g a ;
c ) V e r i f i c a r se ã essas a l t e r a ç õ e s correspondem m o d i f i c a ç õ e s na i o d o p r o
teTnemia e na concen t ração b i l i a r de i o d o t o t a l .
3 . M A T E R I A L E MÉTODOS
3 . 1 . A n i m a i s .
Foram u t i l i z a d o s 24 r a t o s fêmeas da raça W i s t a r , no rma
i s , com peso v a r i a n d o de 150 a 200 g ramas , mant idos no E i o t e r i o do I n s
t i t u t o de E n e r g i a A tómica de São P a u l o .
Os an ima i s fo ram separados em d o i s g r u p o s :
a ) Grupo t r a t a d o com f e n o b a r b i t a l ( G F ) :
Composto de 1 2 an ima is que receberam, d u r a n t e c i nco d í a s ,
i n j e ç õ e s i n t r a p e r i t o n e a i s d i a r i a s de 20 mg de f e n o b a r b i t a l sód ico d i l u í
dos em s o l u ç ã o f i s i o l ó g i c a . D e z r a t o s foram submet idos a sequência e x
p e r i m e n t a l a b a i x o d e s c r j t a . D o i s an ima is (QFM) foram u t i l i z a d o s para
es tudo da c i t o l o g i a hepá t i ca po r m i c roscop ia e l e t r ô n i c a .
b ) Grupo c o n t r o l e ( G C ) :
Composto de 12 an ima is que receberam so lução f i s i o l ó g i c a ,
v i a i n t r a p e r i t o n e a l , d u r a n t e c i n c o d i a s . Dez r a t o s foram submet idos ã
sequênc ia e x p e r i m e n t a l a b a i x o d e s c r i t a . D o i s an ima is (GCM) foram u t i l i ^
zados pa ra es tudo da c i t o l o g i a h e p á t i c a po r m i c roscop ia e l e t r ô n i c a .
3 . 2 . A m b i e n t e .
I I
8
D u r a n t e o d e c o r r e r da e x p e r i e n c i a os an ima is fo ram m a n
t i d o s ã t e m p e r a t u r a a m b i e n t e , s u j e i t o s a i l uminação n a t u r a l em s a l a
a p r o p r i a d a .
3 . 3 . D i e t a .
Os an ima is dos g r u p o s , c o n t r o l e e t r a t a d o , fo ram m a n t i -
^ dos com r a ç ã o ba lanceada para an ima is de l a b o r a t o r i o * . O f e r e c e u - s e água
n a t u r a l "ad l i b i t u m " .
3 . 4 . Manuse io dos a n i m a i s .
3 . 4 . 1 . Pesagem.
Os an ima i s fo ram pesados em ba lança a n a l í t i c a * *
no q u i n t o d i a da e x p e r i ê n c i a .
3 . 4 . 2 . C i r u r g i a .
Os a n i m a i s fo ram mant idos a n e s t e s i a d o s d u r a n t e t o
do o d e c o r r e r da c i r u r g i a com mascara a b e r t a contendo a lgodão embebido
em é t e r e t í l i c o . A t r a v é s da i n c i s ã o sobre a l i n h a a l v a , p e n e t r a v a -
se na c a v i d a d e abdominal expondo -se o f í g a d o . Após r e b a t e r o ó rgão v i
s u a l i z a v a - s e o c o l é d o c o , que e ra c a t e t e r i z a d o na sua porção p rox ima l
com um tubo de p o l i e t i l e n o de 0 ,5 nn de d i â n e t r o i n t e r n o . R e c o l o c a n d o -
* Moinho são Cr i s tóvão , Rio de Jane iro , RJ ** Met t l er P lOOON.
I
]
]
]
]
J J J
s e 0 f T q a d o na c a v i d a d e , s u t u r a v a - s e a s e g u i r a p e l e , permanecendo e x
pos ta a c á n u l a , cu ja porção t e r m i n a l e ra f echada a t r a v é s de p i n ç a .
_ -loc 3 . 4 . 3 . I n j eção de t e t r a i o d o t i r o n i n a (T^ , - 1 ) .
Os an ima is de ambos os g rupos receberam po r v i a
J i n t r a p e r i t o n e a l uma dose t r a ç a d o r a de 40 p C i de T ^ - ^ ^ ^ I COTÍ a t i v i d a d e
e s p e c i f i c a de 7 0 p C i / p g .
3 . 4 . 4 . C o l e t a da b i l e .
J Imed ia tamente após a a d m i n i s t r a ç ã o do m a t e r i a l ra_
d i o a t i v o , i n i c i o u - s e a c o l e t a da secreção b i l i a r . E s t a c o l e t a p r o l o n -
J g o u - s e po r um p e r í o d o de 4 h o r a s , a v a l 1 a n d o - s e seu vo lume f i n a l i As
amost ras f o ram conservadas ã t e m p e r a t u r a de - 2 0 ° C .
3 . 4 . 5 . C o l e t a de amostra s a n g u í n e a .
Ao f i n a l das 4 h o r a s , f o i r e t i r a d a uma amostra
sangu ínea p o r punção c a r d í a c a . Apos r e t r a ç ã o do coagu lo e c e n t r i f u g a -
cão do s a n g u e , o soro o b t i d o f o i conservado ã t empera tu ra de - 2 0 ° C .
3 . 4 . 6 . Remoção do f í g a d o .
Apôs a c o l e t a do sangue , p rocedeu -se ã h e p a t e c t o -
1 0
mia t o t a l e pesagem imed ia ta dos ó r g ã o s .
3 . 4 . 7 . Hepa tec tcm ia para m i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a .
Os an ima i s (GFM e GCM) fo ram s a c r i f i c a d o s po r go l
pe b rusco no c r â n i o e após a b e r t u r a do abdômen f o i r e t i r a d o o l ó b u l o
" cauda tum" do f í g a d o .
3 . 5 . Métodos a n a l í t i c o s .
3 . 5 . 1 . Obtenção do hormônio marcado.
3 . 5 . 1 . 1 . T é c n i c a de i o d a ç ã o .
Em t ubo de ensa io con tendo 1 , 5 a 2 mCi 1 2 5 *
de N a - I com a t i v i d a d e de 521 mCi/ml a d i c i o n o u - s e s u c e s s i v a m e n t e :
a ) 50 p l de so lução a l c o ó l i c a de iodo m e t á l i c o ( I 2 ) » con tendo 4 y g ;
b ) apôs um m i n u t o , 200 p i de so lução amoniacal de T - ( 4 0 y g ) ;
c ) 200 y l de á l c o o l b u t í r i c o t e r c i a r i o ;
d ) uma g o t a de so lução sa tu rada de f o s f a t o de s Ó d i o .
Após a g i t a ç ã o , a g u a r d o u - s e 1 5 m inu tos pa
r a r e a l i z a ç ã o d a r e a ç ã o , què f o i i n t e r romp ida p e l a a d i ç ã o de 500 y l de
so lução a l c o ó l i c a de s u l f i t o de s Ó d i o , p reparada em á l c o o l b u t í r i c o t e r
c i á r i o ^^y^^ ( 1 ' 1 ) -
* New England Nuc lear , Boston.
3 . 5 . 1 . 2 . P u r i f i c a ç ã o do hormônio marcado .
A so lução con tendo o hormônio marcado *
f o i t r a n s f e r i d a para uma co luna de Sephadex G - 2 5 F (22 cm de a l t u r a x
0,6 cm de d i â m e t r o ) , p rev iamen te e q u i l i b r a d a com tampão f o s f a t o 0 ,05 M, ' l^
pH 1 1 , 9 . A co luna f o i e l u r d a com o mesmo tampão e f r a ç õ e s de 2 ml c o l e
tadas em t u b o s con lendo uma g o t a de HCl I H .
3 . 5 . 1 . 3 . Contagem das f r a ç õ e s .
A r a d i o a t i v i d a d e f o i de te rm inada num con^ ** _
t a d o r gama t i p o poço . O b t i v e r a m - s e t r e s f r a ç õ e s r a d i o a t i v a s : a p r i -1 2 5
me i ra f o i I l i v r e , a segunda, p r o t e í n a s d a n i f i c a d a s , e a t e r c e i r a , o
hormônio marcado p u r o . E s t a ú l t i m a f o i u t i l i z a d a na expe r i ênc i í i d i l u í
da em p r o p i l e n o g l i c o l a 50%.
3 . 5 . 1 . 4 . T e s t e de rend imen to da iodação e de pu re
z a do hormônio i o d a d o .
Uma a l í q u o t a do hormônio marcado , an tes
da passagen no Sephadex , d i l u í d a 1 / 4 0 0 em tampão f o s f a t o 0 ,05 M , pH
1 1 , 9 , e o u t r a a l í q u o t a das f r a ç õ e s o b t i d a s com hormônio p u r o , d i l u í d a
a 1 / 5 0 , no mesmo t a m p ã o , fo ram submet idas a e l e t r o f o r e s e em papel Wha t -***
man 3MM em tampao Ve rona l 0 ,05 H , pH 8 , 6 , f o r ç a i ó n i c a = 0 , 0 7 5 , s u ^
me t i da ã v o l t a g e m de 400 V d u r a n t e 45 m i n u t o s .
* Pharmacia-Fine Chemica:is AB, Uppsala , Sweden. ** Automatic Gania Counting System, Nuclear Chicago Corporation,
I l l i n o i s , USA. * * * Whatman England by U & R Ealston Ltd .
r I
1
o rend imento da iodação f o i f o r n e c i d o pe^
I a r e l a ç ã o e n t r e as con tagens t o t a i s e as do p i c o c o r r e s p o n d e n t e ao hor
mônio e v a r i o u e n t r e 60 e 802 a n t e s da passagem na co luna de Sephadex
( F i g u r a 2 ) . O g rau de p u r e z a do hormônio iodado f o i o b t i d o pe la mesma
r e l a ç ã o na e l e t r o f o r e s e das a l T q u o t a s aoôs a passagen na co luna de S e
p h a d e x , v a r i a n d o e n t r e 96 e 98% ( F i g u r a 2 ) .
3 . 5 . 2 . F i l t r a ç ã o da b i l e em gel de Sephadex G - 2 5 M .
3 . 5 . 2 . 1 . P reparação da co luna de Sephadex .
Com base na p r o p r i e d a d e do Sephadex de
sepa ra r os componentes iodados da b i l e , u t i l i z o u - s e a m e t o d o l o g i a de
L I S S I T Z K Y e c o l s . ^ ^ ^ ' ^ ^ ^ m o d i f i c a d a p o f IKEDA e c o i s . ® .
A co luna de v i d r o u t i l i z a d a f o i de 40 an
de a l t u r a e 2 , 5 cm de d i â m e t r o i n t e r n o com a f u n i l a m e n t o na ex t r em idade
i n f e r i o r , onde f o i adap tado um tubo de bor racha com p i p e t a de P a s t e u r
para c o n t r o l a r o f l u x o de s a T d a d o p e r c o l a d o . Logo acima da e x t r e m i d a
de a f u n i l a d a , c o l o c o u - s e l ã de v i d r o com o o b j e t i v o de r e t e r o ge l de
Sephadex .
U t i l i z o u - s e para cada c o l u n a 35 g de ge l
de Sephadex G - 2 5 M , p rev iamen te man t i do . em 1 2 0 ml de agua com a g i t a ç ã o
e s p o r á d i c a e conservado a 4 ° C , d u r a n t e 24 h o r a s , a f i m de p e r m i t i r ao
ge l um ganho de l i q u i d o adequado . O g e l , assim p r e p a r a d o , f o i co locado
na c o l u n a , p r o c u r a n d o - s e o b t e r um bom empacotamento (homogene idade, sem
fo rmação de bo lhas de a r ) .
I .1 c ,
1 1 3
E o. ò
8.10
6.10
4 J 0
2 . J O
.4.
e Cl
36.10
30.10
24.10
8.10
I 2.10
4 6.10
Antes da purificação
6 1 % livre
3 9 %
4
9 7 %
Apo's a p u r i f i c a ç ã o em sephadex 6 - 2 5 F
3 %
2S livra
8 12 16 2 0 24 28 cm.
F I G U R A 2 - E L E T R O F O R E S E e-l TAMPAO V E R O N A L D E UMA A L Í Q U O T A DO HORMÔNIO
M A R C A D O . A N T E S E A F í S P U R I F I C A Ç Ã O e-l S E P H A D E X G - 2 5 F
I I
14
C o l o c o u - s e um d i s c o de papel de f i l t r o
do mesmo d i â m e t r o i n t e r n o da co luna sobre o g e l , pa ra imped i r a penetra^
çâo de i m p u r e z a s e man te r o empacotamento do mesmo. A c o l u n a , ass im
p r e p a r a d a , f o i e q u i l i b r a d a com tampão T R I S - H C l , pH 7 , 4 , 0 ,05 M.
3 . 5 . 2 . 2 . C r o m a t o g r a f í a b i l i a r em Sephadex 6 -25 H .
C o l o c o u - s e cu idadosamente uma a l T q u o t a
de b i l e ( 0 , 1 a 0 ,2 m l ) na c o l u n a ; i n i c i o u - s e a c o l e t a das f r a ç õ e s com
v e l o c i d a d e c o n s t a n t e de 1 m l / m i n u t o . Apôs pene t ração da b i l e no g e l ,
e l u i u - s e a co luna com aprox imadamente 120 ml de T R I S - H C l , c o l e t a n d o - s e
f r a ç õ e s de 3 ml em tubos de v i d r o . O r e f e r i d o tampão e l u e sucessivamen f26 2 7 1
t e p r o t e í n a s i o d a d a s , i o d e t o e t i r o s i n a s iodadas^ ' \ Na e tapa s e
g u i n t e , a c r e s c e n t o u - s e 80 ml de A - A ( a m i l o l - a m õ n i a 2 N ) a f i m d e ' s e p a r a r
as t i r o n i n a s i odadas r e t i d a s no ge l e , f i n a l m e n t e , 80 ml de amõnia 2 N ,
para p o s s i b i l i t a r a e l u i ç ã o do g l i c u r o n i d a t o de T ^ ^ ^ ^ ^ . A r a d i o a t i v i d a
de de cada amost ra f o i medida num con tado r gama a u t o m á t i c o ; o tempo de
acúmulo de con tagens f o i de 1 0 m i n u t o s , pa ra d i m i n u i r o e r r o e s t a t í s t i
c o . F o i c a l c u l a d o o po rcen tua l das f r a ç õ e s o b t i d a s na separação em r e
l a ç ã o ao t o t a l da r a d i o a t i v i d a d e e l u í d a da co luna ( F i g u r a 3 ) .
3 . 5 . 2 . 3 . I d e n t i f i c a ç ã o do g l i c u r o n i d a t o de t i r o
x i n a .
A s amostras c o r r e s p o n d e n t e s a f r a ç ã o I V ,
supos tamente con tendo g l i c u r o n i d a t o de t i r o x i n a , f o ram submet idas a ana
\
1 5
]
]
]
] u 60 o < o
> 50
O < tc
• 30
^ 20
10
O
Cromatografía doa compostos Iodados
a Controle
EU Fenobarbital
I T
F I G U R A 3 - R E P R E S E N T A Ç Ã O E S O U m A l I C A DO P O R C E N T U A L D E R A D I O A T I V I D A D E
... C O R R E S P O N D E N T E A S F R A Ç Õ E S O B T I D A S NA C R O M A T O G R A F Í A P^ S E
PHADEX G - 2 S I DOS COMPOSTOS IODADOS B I L I A R E S
I I
16
l i se a f i m de serem i d e n t i f i c a d a s . As f r a ç õ e s de ma io r r a d i o a t i v i d a d e
do p i co I V fo ram concen t radas po r aouec imento (aprox imadamente 30°C ) ,
sob c o r r e n t e de n i t r o g ê n i o para e v i t a r a ox idação das mesmas e , pa ra a
r e t i r a d a da amõn ia . A s e g u i r , o m a t e r i a l f o i l i o f 1 1 i z a d o .
3 . 5 . 2 . 3 . 1 . H i d r ó l i s e do g l i c u r o n i d a t o de
t i r o x i n a .
Ao m a t e r i a l l i o f 1 1 i z a d o f o l
a d i c i o n a d o tampão a c e t a t o pH 4 , 5 e so lução de b e t a - g l i c u r o n i d a s e * , c o n
tendo 5000 U I de enz ima p o r mi de s o l u ç ã o . R e a l i z o u - s e a h i d r ó l i s e por
incubação d u r a n t e 1 8 h o r a s , a 3 7 ° C . Após c e n t r i f u g a ç ã o , r e a j u s t o u - s e o
pH a 7 , 4 com NaOH 0 ,1 N no s o b r e n a d a n t e .
3 . 5 . 2 . 3 . 2 . C r o m a t o g r a f i a do h i d r o l i z a d o
en Sephadex G - 2 5 M.
Uma a l T q u o t a do h i d r o l i z a d o
f o i submet ida a c r o m a t o g r a f i a em gel de Sephadex , u t i l i z a n d o - s e a mesma
t é c n i c a d e s c r i t a no Ttem 5 . 5 . 5 . O b t i v e r a m - s e q u a t r o f r a ç õ e s c o r r e s p o n
d e n t e s : i o d o p r o t e T n a , i o d e t o , T ^ e g l i c u r o n i d a t o de T ^ ( F i g u r a 4 ) .
3 . 5 . 2 . 3 . 3 . C r o m a t o g r a f i a em p a p e l .
A t e r c e i r a f r a ç ã o o b t i d a na
* Ketodase, procedente da General Diagnost ic D i v i s i o n , Warner, Chi lcot t Div i s ion - Morr i s P i a i n , New Jersey, USA.
1 I N S T I T U T O D E P E S O U ' P A S E v R f É ^ I C ' S E N U C L E A R E S
i 1 7
8.10
3 6.10
E a. * 3
4.10
2.10
Cromatografia em sephadex
do hidrolizado
A. A.
9 , 9 4 %
l 2,08 7o H
n r 78,79 %
NH OH 2N 4
9,19%
§0 100 150 ml.
200 250
FIGURA 4 - CRœiATOGRAFIA EU S E P H A D E X 6 -25 H DO HIDROLIZADO CO?.l
BETA-GLIGURONIDASE
1 8
f i l t r a ç ã o em gel de Sephadex do h i d r o l i z a d o f o i submet ida a c r o m a t o g r a
f i a em p a p e l . E s s a f r a ç ã o e l u i d a em ami lo l f o i a g i t a d a com NH^OH 2N a
f i m de e l i m i n a r impurezas que permanecem no s o l v e n t e o r g â n i c o , enquanto
e são e x t r a í d a s p e l a f a s e aquosa . E s t a ú l t i m a f o i concen t rada
p o r aquec imento (30 a 4 0 ° C ) sob c o r r e n t e de n i t r o g ê n i o . O e x t r a t o a s
sim o b t i d o f o i d i s s o l v i d o com 0,1 a 0 ,2 ml de me tano l -amõn ia ( 9 9 : 1 ) e
co locado em papel c e c r o m a t o g r a f i a 1'hatman 3 ITA. U t i l i z o u - s e o s i s tema
monodimens iona l ascenden te em c i t r a t o de sód io a 20%, pH 8 , 6 . O tempo
de d e s e n v o l v i m e n t o f o i de 90 m i n u t o s .
Uma m i s t u r a de padrões não ra_"
d i o a t i v o s em volume de 40 y l (1 mg de Na I , 4 mg de T ^ , 4 mg de T ^ , d i
l u í d o s r e s p e c t i v a m e n t e em 2 ml de NH^OH 2 N ) foram c rcma tog ra fados c o n
j u n t a e p a r a l e l a m e n t e com a amost ra a ser a n a l i s a d a .
Os padrões não r a d i o a t i v o s f o
ram i d e n t i f i c a d o s por meio de reações q u í m i c a s ; p a r a os compostos com
agrupamentos f e n ó l i c o s f o i u t i l i z a d a a re_agão de Pau l y e , na i d e n t i f i c a ^
ção do i o d e t o de s ó d i o , o c l o r e t o de p a l ã d i o ^ ^ ^ ^ . Após r e v e l a ç ã o químj^
c a , os cromatogramas foram secados e r e c o r t a d o s em t i r a s de 1 cm de lar^
g u r a . A r a d i o a t i v i d a d e de cada f r a ç ã o f o i de te rm inada em con tado r gama
a u t o m á t i c o . C o n s t r u i u - s e um g r a f i c o pe los r e s u l t a d o s o b t i d o s ( F i g u r a
5 ) .
3 . 5 . 3 . Dosagem do PB I s é r i c o e i odo t o t a l b i l i a r .
A s amost ras sanguíneas e b i l i a r e s fo ram a n a l i s a
d a s , pa ra de te rm inação da i odop ro te i nem ia e iodo t o t a l b i l i a r , pe lo Au-
1 0 . 1 0
8 . Í 0
Ê 3 ¿. 6 . 1 0
4.10
2 . 1 0
1 9
Cromatografia em papel
8 12 16 2 0 cm.
2 4 2 3
F I G U R A 5 - C R O f i A T O G R A F I A D l P A P E L fiO S I S T S I A M O N O D I M E N S I O N A L A S C E N D E N T E
( C I T R A T O D E S ? D I O pH 8 . 6 )
| t ^ s T i T U T o DET P E S O U P A s r - R ' : e . , c . g e
I 20
t o A n a l y s e r * pa ra P B I ^ ^ ^ ^
3 . 5 . 4 . M i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a .
0 l ó b u l o "caudatum" do f T g a d o f o i c o r t a d o em c u
bos de aprox imadamente 1 mm de espessura e mant idos em so lução de g l u t a
r a l d e i d o a 2% em tampão f o s f a t o " 0 ,1 N e pH 7 , 4 , d u r a n t e urna h o r a . A se
g i i i r , p r o c e d e u - s e a f i x a ç ã o do mesmo em a c i d o Osmico a 1% no tampão ac i
ma r e f e r i d o , d u r a n t e urna h o r a . O m a t e r i a l f o i corado em a c e t a t o de u ra
n i l a 1% por 1 6 h o r a s .
Apôs d e s i d r a t a ç ã o s e r i a d a em á l c o o l e ace tona ,
fo rmaram-se b l o c o s em a r a l d i t e , d e i x a n d o - o s em e s t u f a a 60°C p o r um p e
r i o d o de 2 a 3 d i a s .
** A t r a v é s de u l t r a m i c r ô t o m o , o b t i v e r a m - s e c o r t e s
q u e , apôs terem s i d o s corados en a c e t a t o dé u r a n i l a e c i t r a t o de chum
b o , foram a n a l i s a d o s e f o t o g r a f a d o s em m i c r o s c o p i o e l e t r ô n i c o * * * ( f i g u
r a s 7 e 8 ) .
3 . 5 . 5 . A n á l i s e e s t a t í s t i c a .
Para comparação r e l a t i v a dos dados o b t i d o s nos
grupos em e s t u d o , e s t i m o u - s e a v a r i â n c i a a t r a v e s d o t e s t e F ^ ^ ^ \ a p l i
cando -se a s e g u i n t e f o r m u l a ;
^2 * AutoAnalyser "Technicon" ** Ultranicrotomo "Sorval l" M T 2-B
*** "Cari Z e i s s " , modelo EÍ-9S 2.
i 21
onde :
= d e s v i o padrão de ma io r v a l o r
$2 = d e s v i o padrão de menor v a l o r .
Nos casos onde o F encon t rado f o i menor que o F
c r i t i c o ( v a r i â n c i a s i n u a i s ) , e s t i ^ o u - s e a s i g n i f i c â n c i a da d i f e r e n ç a pa^
r a dos d i v e r s o s pa râmet ros e s t u d a d o s , pe lo t e s t e t de " S t u d e n t " corres^
p o n d e n t e ^ ^ ^ ^ , dado p e l a f o r m u l a :
GL = n, + Hg - 2
onde :
n . = número de a n i m a i s
= v a l o r medio
s = v a r i â n c i a do r e f e r i d o v a l o r y^.
S^. = d e s v i o padrão r e l a t i v o ao y.
G L = g raus de l i b e r d a d e .
Nos dena is c a s o s , ou se ja naque les em que o F e n -
22
contrado foi maior oue o F crTíicc fvariãncias desiquais), aplicou-se o
teste t respectivo, dado pela f 5 m u l a :
onde:
n. = número de animais
y. «= valor rcedio
= desvio padrão r s v i v o aos
f = graus de liberdade.
23
4. RESULTADOS
4.1. Peso dos animais.
Foram comparados os pesos dos animais controles e trata
dos com fenobarbital, antes do inicio do ensaio experimental. A Tabela
I apresenta os resultados da análise estatística. Observa-se que as miê
dias e os desvios padrões de ambos os arunos foram de 151,50 ± 30,83 g
e 156,80 ± 31,40 g, respectivamente. !
Evidenciou-se pelo teste t de "Student" que os pesos ini
ciais dos ratos dos dois grupos não diferiram significantemente en
tre si.
4.2. Peso do fígado.
Os valores individuais relativos aos pesos dos fígados
nos animais normais e tratados com fenobarbitaT estão expressos na Tabe
la II, sendo as medias e os desvios padrões de 6,33 ± 0,83 q para o gru_
po controle e 8,93 ± 1 ,48 g para o grupo tratado. Esta diferença de pje
so mostrou ser estatisticamente significante ao nível de p ^ 0,05.
i 24
T A B E L A I
P E S O D O S A N I f l A I S (GRAMAS)
R a t o no GRUPO
C O N T R O L E R a t o nO GRUPO
F E N O B A R B I T A L
1 1 1 0 1 1 1 3 0
2 135 12 128
3 1 4 0 13 125
4 1 2 0 1 4 1 3 0
5 1 7 5 1 5 180
6 190 16 200
7 205 1 7 2 1 0
8 160 18 1 7 0
9 130 1 9 145
1 0 150 20 150
fT 1 5 0 , 5 0 M 1 5 6 , 8 0
dp 30,83 dp 3 1 , 4 0
F = 1 , 0 4 t = 0 ,3809
F * = 2 ,98 t * = 2 , 1 0 0 9 G L = 18
* Abreviaturas u t i l i z a d a s nas tabe las :
M = n i d i a ; dp = desvio padrao; ? = F obt ido; t = t obt ido; GL= grau de l i b e r d a d e ; F* = F c r i t i c o para p$0,05; t* =• t c r i t i c o para p^0,05
li 25
T A B E L A I I
P E S O D O F Í G A D O (GRAMAS)
R a t o nP GRUPO
C O N T R O L E R a t o n9 GRUPO
F E N O B A R B I T A L
1 5,33 11 7 , 8 1
2 6 ,00 , 1 2 7 , 6 1 (
3 5.83 13 7 , 5 0 r
4 5,50 1 4 8 ,00
5 7 , 1 8 15 1 0 , 7 0 - >
6 7 , 2 0 1 6 1 0 , 5 0 -
7 7 , 9 0 1 7 1 1 , 6 5 ^ i
8 6 ,25 1 8 9 ,02
9 5,90 1 9 8 , 2 0
1 0 6 ,20 20 8 , 3 0
M 6,33 M 8,93
dp 0 ,83 , dp •
1 , 4 8
F = 3 , 1 8 t = 4 , 8 4 5
F * = t * =
2 ,98 2 , 1 3 1 5 = 15
I N S T I T U I O C i ; P G S Q U f ' - S E ! -R :, É ' :C •• 5 E N U C L f A R E S I. P F.
I-
í
]
]
]
I
I
I
]
26
4 . 3 . F l u x o b i l i a r .
Os v a l o r e s co r responden tes ao f l u x o b i l i a r de cada g r u
p o , e x p r e s s o s em m i l i l i t r o s de b i l e c o l e t a d a d u r a n t e 4 h o r a s , encontram
se na T a b e l a I I I . V e r i f i c o u - s e que as medias e d e s v i o s padrões são de
0 ,40 ± 0 ,09 m l / 4 horas pa ra o GC e 0 , 7 5 ± 0 , 1 9 m l / 4 horas pa ra o G F .
J C o n s t a t o u - s e , p o r t a n t o , um aumento e s t a t i s t i c a m e n t e s i g n i f i c a n t e de f l u
x o b i l i a r no G F quando comparado ao G C .
4 . 4 . A v a l i a ç ã o do P B I s é r i c o e i odo t o t a l b i l i a r .
Mas t a b e l a s IV e V e s t ã o d e s c r i t o s os r e s u l t a d o s r e f e r e n
t e s ao PBI s é r i c o e iodo t o t a l b i l i a r , exp ressos em pg de i odo l i g a d o
Jl ã p r o t e í n a s por 100 mi de soro e em pg de iodo t o t a l en 1 0 0 mi ^de b i l e .
V e r i f i c o u - s e que as médias e os d e s v i o s padrões do PBI s é r i c o e n c o n t r a -
I dos fo ram de 1 , 5 7 ± 0,35 y g / 1 0 0 mi e 1 , 9 0 ± 0 ,45 p g / l O O mi pa ra o GC e
G F , r e s p e c t i v a m e n t e . A t r a v é s do t e s t e t de " S t u d e n t " , p a r a v a r i a ñ c i a s
i g u a i s , o b s e r v o u - s e um t = 1 ,83 (para 1 8 g raus de l i b e r d a d e ) , demons
t r a n d o não e x i s t i r d i f e r e n ç a e s t a t i s t i c a m e n t e s i g n i f i c a t i v a e n t r e os
g rupos ao n T v e l de p í 0 , 0 5 .
Q u a n t o a exc reção do i o d o t o t a l b i l i a r , p o d e - s e c o n s t a
t a r que as" méd ias e os d e s v i o s padrões fo ram de 3 , 1 5 ± 0 , 7 7 y g / l O O ml
J p a r a o GC e 6 , 1 1 ± 0 ,60 y g / 1 0 0 ml para o G F . Ao a p l i c a r o t e s t e t ( v a
r i â n c i a s i g u a i s ) v e r i f i c o u - s e que os d o i s g rupos são e s t a t i s t i c a m e n t e
J d i f e r e n t e s (p 0 , 0 5 ) , sendo a exc reção do i odo t o t a l b i l i a r m a i o r no
g rupo t r a t a d o .
I Î
li
T A B E L A I I I
F L U X O B I L I A R (ml D E B I L E / 4 HORAS)
F = 4 , 4 5 7 t = 5 ,2645
R a t o nO GRUPO
CONTROLE R a t o nP GRUPO
F E N O B A R B I T A L
1 0 ,28 1 1 0 ,53
2 0 ,42 12 0 ,58
3 0 ,40 13 0 ,55
4 0 ,30 14 0 ,62
5 0 ,48 15 0,95
6 0 ,50 16 1 , 0 3 V 7 0,53 1 7 1 . 0 4 ,j 8 0,35 1 8 0 ,80
9 0 ,42 1 9 0 ,65
1 0 0,33 20 0 ,65
M 0 ,40 ÍT 0 , 7 5
dp 0 .09 dp 0 , 1 9
F * = 2 ,98 t * = 2 ,3050 G L = 8
2 7
T A B E L A IV
P . B . I . ( SANGUÍNEO ) ug / TOO ml
GRUPO I GRUPO
CONTROLE I R a t 0 n Ç FENOBARBITAL
1 1,20 j n 1,40
2 1,10 I i
12 1,50
3 i ,20 ;' 13 1,60
4 1,30 1 i
14 1,60
5 1,80 1 15 2,10 ^
6 i ,50 ; 16 2,50 (
7 2,10 i 17 2,60
8 1,80 ! 18 2,40
9 1,70 ! i
19 1,60
10 1,60 ! 20 1,70
M 1,57 j M 1,90
dp 0,35 1 dp 0,45
1,650 1,83
F* = 2 ,98 t* » 2 ,1 CO
r,L = 18
i
T A B E L A
I O D O T O T A L B I L I A R ( p g / 1 0 0 m i )
29
GRUPO GRUPO R a t o no C O N T R O L E R a t o no F E N O B A R B I T A L
1 2 , 1 0 ¿ n 5,200
2 2,300 1 2 5,50^
3 2,700 1 3 5,30j!í
4 2 ,50d 1 4 5,600
5 3,600 1 5 6.45J) 1
6 3,800 1 6 6,80(¡i
7 4,200 1 7 7.300 4,200 J
8 4 , 1 0 0 1 8 6.500
9 - 3 ,50d - 1 9 6,300
10 2,70p 20 6,150
M 3 . 1 5 0 ÍT 6,110
- dp 0,770 dp 0,600-
F = 1 , 2 4 5 F * = 2 , 98
t = 9,01 t * = 2 , 1 0 0 = 18
I I W S T I T U T O Ce. P E S O U ' p A S E M i F R S K ' r i c ' ' S E N U C L E A R Ç S é
3
30
I
I
1
3
4 . 5 . C r o m a t o g r a f i a dos compostos iodados b i l i a r e s .
As t a b e l a s V I e V I I apresentam os v a l o r e s p o r c e n t u a i s r e
f e r e n t e s as f r a ç õ e s o b t i d a s na separação c r o m a t o g r a f i c a dos componentes
i odados b i l i a r e s em ge l de Sephadex , dos g rupos c o n t r o l e e t r a t a d o
com f e n o b a r b i t a l . Das q u a t r o f r a ç õ e s r e s u l t a n t e s , uma mereceu ma io res
c u i d a d o s pa ra sua i d e n t i f i c a ç ã o , a f r a ç ã o I V , que apôs h i d r o l i s e enz ima
t i c a e subsequente c r o m a t o g r a f i a em Sephadex e p a p e l , r e v e l o u ser g l i c u
r o n i d a t o de T¿j ( f i g u r a s 4 e 5 ) .
C o n s i d e r a n d o - s e e x i s t i r um e q u i l í b r i o i s o t ó p i c o e n t r e os
J q u a t r o compar t imentos ( i o d e t o , p r o t e í n a s i o d a d a s , e g l i c u r o n i d a t o de
- T ^ ) , o i odo t o t a l b i l i a r dosado d i s t r i b u i r - s e - ã igua lmente em todos
* e l e s ; d e s t a m a n e i r a , pode-se c a l c u l a r as q u a n t i d a d e s r e l a t i v a s de iodo
1 em cada f r a ç ã o po rcen tua l o b t i d a pe la c r o m a t o g r a f i a da b i l e en Seph£
dex ( F i g u r a 6 ) . Es t imando d e s t e modo a massa de i o d o t o t a l e s t á v e l em
J cada f r a ç ã o , fo ram o b t i d o s r e s u l t a d o s i n d i v i d u a i s de cada g r u p o , que se
encont ram nas t a b e l a s V I I I e I X . Ne las es tão i n c l u í d a s as r e s p e c t i v a s
I méd ias e d e s v i o s p a d r õ e s . A T a b e l a X m o s t r a os r e s u l t a d o s da a n á l i s e b£
t a t í s t i c a a que fo ram submet idos os dados a n t e r i o r m e n t e c i t a d o s .
A p l i c a n d o o t e s t e t de " S t u d e n t " aos v a l o r e s r e l a t i v o s
das f r a ç õ e s I e I I , v e r i f i c o u - s e que não são e s t a t i s t i c a m e n t e s i g n i f i
c a n t e s ( p ^ ^ 0 , 0 5 ) , suger indo que em ambos os g r u p o s , c o n t r o l e e t r a t a
d o , não houve a l t e r a ç ã o na e l i m i n a ç ã o b i l i a r de i o d o p r o t e í n a s e i o d e t o .
E n t r e t a n t o , o b s e r v o u - s e que as médias e d e s v i o s padrões r e f e r e n t e s aos
dados da f r a ç ã o I I I ( t i r o x i n a ) foram de 0,906 ± 0 ,206 pg de 1 ^ / 1 0 0 ml e
1 , 6 7 5 ± 0,353 yg de I 2 / I O O ml pa ra o GC e G F , r e s p e c t i v a m e n t e . A t r a v é s
31
T Á P E L A V I
C R O M A T O G R A F Í A D O S C O Î I P O S T O S I O D A D O S B I L I A R E S EM S E P H A D E X fí-25M {%)
G R U P O C O N T R O L E
\ F R A C Ö E S
R a t o n? ^ \ I I I I I I I V
1 6 , 8 7 1 2 , 9 8 3 1 , 8 4 4 8 , 3 1
2 6 ,42 1 1 , 8 8 3 0 , 7 6 50,44
3 7 , 2 0 1 7 , 2 7 2 4 , 8 7 50,66
4 7 , 0 0 1 3 , 0 0 3 2 , 0 0 4 8 , 3 0
5 5 ,42 1 0 , 8 8 2 8 , 7 6 54 ,94
6 6 , 4 0 1 2 , 5 8 2 7 , 2 8 5 3 , 7 4
7 5 ,20 1 2 , 5 8 2 8 , 9 8 53,24
8 3 , 2 9 20,86 2 4 , 9 4 50,91
9 7 , 1 0 1 1 , 8 0 3 2 , 5 0 4 8 , 6 0
1 0 5 ,30 1 1 , 5 0 2 8 , 3 5 53 ,85
M 6,02 13 ,53 28 ,93 - - 5 1 , 3 5
dp 1 , 2 3 3 . 1 1 2 , 6 7 2 , 4 8
! -1 32
] T A B E L A V I I
J CROf IATQGRAFIA DOS COMPOSTOS IODADOS B I L I A R E S m SEPHADEX G-25f-1 (%)
GRUPO F E N O B A R B I T A L
I
1 I
\ f r a ç o e s
R a t o no > v
1
I I I I I I IV
n 5 , 1 7 10,59 22,38 61,86
12 6,25 7,95 24 ,07 6 1 , 7 3
13 5,51 6,99 24,81 62,69
14 6 ,10 8,35 25,34 60,21 ,
15 5,25 7 , 1 5 26,38 61,22
16 4 , 1 6 6,25 28,39 61 ,20
1 7 6 ,70 8,24 30,25 54,81
18 2 ,67 8,24 30,98 58,11
19 5,72 8,53 30,93 54,82
20 5 , 1 7 10,09 27 ,96 56,78
M 5,27 8,24 2 7 , 1 5 59,34
dp 1 , 1 5 1,33 3,02 2,98
5
FIGURA 6 - REPRESENTACAO ESQUEMÁTICA DA AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DAS
FRAÇÕES OBTIDAS NA CROMATOGRAFIA EM SEPHADEX G - 2 5 M DOS
— COMPOSTOS IODADOS BILIARES (ug de W I O O ml b i l e )
34
T A B E L A V I I I
1 ^
A V A L I A Ç Ã O Q U A N T I T A T I V A DE IODO T O T A L NAS F R A Ç Ü E S O B T I D A S P E L A
CROMATOGRAFIA 01 SEPHADEX DA B I L E (yg de I g / 1 0 0 mT)
GRUPO CONTROLE
T R A Ç Õ E S
I
à
R a t o nÇ \ ^ I I I I I I IV
1 - 0 , 1 4 4 / 0 , 2 7 3 0,669 1 , 0 1 5
2 0 , 1 4 8 0 , 2 7 2 0 , 7 0 7 1 , 1 7 2
3 0 , 1 9 4 0 ,466 0 .671 1 , 3 6 8
4 0 , 1 7 2 0 ,325 0 ,796 1 , 2 0 8
5 0 , 1 9 5 0,392 1,035 1 , 9 7 8
6 0 ,243 0 , 4 7 8 1 , 0 3 7 2 . 0 4 2
7 0 , 2 1 8 0 ,528 1 , 2 1 7 2 , 2 3 6
8 0 , 1 3 5 . 0,855 1,023 2 , 0 8 7
9 0 ,249 0 , 4 1 3 1 , 1 3 8 1 . 7 0 1
1 0 0 , 1 4 3 0 , 3 1 1 0 , 7 6 5 1 ,454
- M 0 , 1 8 4 0.431 0,906 1 , 6 2 6
dp 0 ,042 0 , 1 7 3 0 ,206 0 ,439
3 i
T A B E L A I X
AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DE IODO TOTAL MAS FRAÇÕES OBTIDAS PELA
CROMATOGRAFIA EM SEPHADEX G-25M DA BILE ( ug dé Ig/lOO ml)
GRUPO" FEHOBARBITAL
\ F R A Ç O E S
Rato n9 \
I II I I I IV
11 0,269 0,551 1,164 3,217
12 0,344 0,437 1,324 3,395,
13 0,292 0,370 1,315 3,323
14 0,342 0,468 1,419 3,372
15 0,339 0,461 1,702 3,949
16 0,283 0,425 1,931 4,162
17 0,489 0,602 2,208 4,001
18 0,174 0,536 2,014 3,777
19 0,360 0,537 1,949 3,454
2.0 0,318 0,621 1,720 3,492
M 0,321 0,501 1,675 3,614
dp 0,080 0,087 0,353 0,330
36
T A B E L A X
ANALISE ESTATÍSTICA DOS DADOS REFERENTES A AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DE
IODO TOTAL MAS FRAÇÕES OBTIDAS PELA CROMATC^RAFIA BILIAR ET1 SEPfíADEX
G-25H, ENTRE OS GRUPOS ESTUDADOS (REFERENTE TABELAS VIII E IX)
\ . FRAÇDES
ESTATlSTICÀX.
I II III IV
F 3,61 4,552 2,938 >
1,769
t 1,057 0,715 5,949** 11 ,445***
GL 15 14 18 18
t* 2,1315 2,1448 2,100 2,100
t* • t critico para p - 0,05 F* - F critico para p » 0,05 ** = significante entre 0,05 > p > 0,001 *** « significante ao nível de p J 0,001
4
I
]
1
37
do t e s t e t de " S t u d e n t " e v i d e n c i o u - s e e x i s t i r d i f e r e n ç a e s t a t i s t i c a m e n
t e s i g n i f i c a t i v a e n t r e ambos os g r u p o s , havendo ma io r exc reção b i l i a r
de nos an ima is t r a t a d o s cm f e n o b a r b i t a l .
C o n s t a t o u - s e que as médias e desv ios padrões dos v a l o r e s
r e f e r e n t e s a f r a ç ã o IV ( g l i c u r o n i d a t o de T ^ ) foram de 1 ,626 ± 0 ,439 pg
de 12 /100 mi pa ra o g rupo c o n t r o l e e 3 , 6 1 4 ± 0,330 pg de I 2 / I O O mi pa ra
o g rupo t r a t a d o . V e r i f i c o u - s e p e l o t e s t e t de " S t u d e n t " para v a r i â n c i
as i g u a i s que os d o i s g rupos d i f e r i a m e s t a t i s t i c a m e n t e e n t r e si (p ^
s , 0 , 0 0 ^ 1 ) , f i c a n d o p a t e n t e o inc remento de 1222 na e l im inação b i l i a r de
T 4 - G .
4 . 6 . M i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a .
O b s e r v a n d o - s e as f o t o g r a f i a s , o b t i d a s p e l a m i c r o s c o p i a
e l e t r ô n i c a na a n a l i s e dos t e c i d o s h e p á t i c o s , v i s u a l i z a m - s e as e s t r u t u
r a s c e l u l a r e s i n d i c a d a s pe las se tas (aumento de 36.000 x ) .
Nos t e c i d o s dos an ima is do GCM, v e r i f i c a - s e a p r e s e n ç a
de c i s t e r n a s acha tadas de r e t T c u l o endop lasmá t i co rugoso ( R E R ) e p r e s e £
ça de r e t T c u l o endop lasmá t i co l i s o ( R E L ) como é usual nos h e p a t ô c i t o s
( F i g u r a 7 ) . Nos t e c i d o s r e t i r a d o s dos an ima is do 6 R 1 , as mesmas e s t r u
t u r a s ap resen tam-se mais d e s e n v o l v i d a s ( F i g u r a 8 ) o que i n d i c a r i a p r o H
f e r a ç ã o do R E R e R E L .
38
FIGURA 7 - ELETRON-mCP.CGPAFIA DE FÍGADO DE RATOS NORMAIS (GCM)
Visualizam-se as senuintes estruturas: N = núcleo; M = rito
cÕndria; G = gotTcula de gordura; REL = retTculo endoplasma"
tico liso; RER = retTculo endoplasmatico ruaoso.
"umento = 36.000 x
II
1 39
F I G U R A 8 - E L E T R 0 N 4 1 I C R 0 G R A F I A D E F Í G A D O D E RATOS TRATADOS COT F E N O B A R
B I T A L DURANTE C I N C O D I A S ( G R ! )
V e r i f i c a - s e m a i o r d e s e n v o l v i m e n t o dos r e t í c u l o s l i s o e rugo
so em comparação com as mesmas e s t r u t u r a s v i s u a l i z a d a s na
F i g u r a 7 . (N = n ú c l e o ; '1 = m i t o c ô n d r i a ; R E L = r e t T c u l o endo
p l a s m á t i c o l i s o ; RER = r e t T c u l o endopl a s-nát i co r ugoso )
/aumento = 35 .000 x
40
5. DISCUSSÃO
São conhecidas várias publicações referentes ã ação do feno-
barbital sobre o tecido hepático e na excreção bi l iar dos hormônios t i -
reoideanos. A maioria dos a u t o r e s ^ ' * 5 , s u b m e t e m ratos fê
meas ou machos durante cinco dias a injeções intraperitoneais de feno-
barbital sodico na dose de 100 mg/kg de peso. Esta metodologia, foi
util izada para induzir e verif icar as alterações do sistema hepático pe
la referida droga. Os animais pertencentes ao grupo controle receberam,
paralelamente, injeções i.p. de solução f is iolÔnica, a fim de manter os
dois grupos nas mesmas condições de "s t ress" .
0 acesso cirúrgico escolhido pernitiu manter o animal vivo
sob Ótimas condições. Durante todo o decorrer da experiência, o ahdômem
permaneceu suturado expondo-se apenas uma cânula, que foi inserida no
dueto b i l i a r , o mais próximo possível do fTqado para que não houvesse
diluição da bile pelo suco panc rea t i co^ 9 ' 4 3 ^ .
5 . 1 . Peso dos animais e peso do fToado.
Visto que os dois grupos de animais, controle e tratado,
não diferiram entre s i quanto ao Deso in ic ia l , foram considerados como
pertencentes a um qruoo homogêneo, a fim de poder se avaliar os parame
tros en estudo.
nOLf)H"EIMf15) e PFRT uEL0T^ encontraram em suas experi
ências um acréscimo dejítf. de massa henãtica em ratos que recebe
ram fenobarbital durante cinco dias; entretanto, KLA.ASSEfl e
(17)
HARTV submetendo animais ao mesmo tino de tratamento, durante sete
dias, verificaram um incremento qe 25r?. 3e acordo com PAR KA isto se
ria devido ao fenômeno de hipertrofia e não hiperplasia parenouinatosa.
C O N N E Y ^ vincula o aumente do oeso do fíqado a maior
atividade enzimática m'crosscmal , constatando um incremento de 35* no
peso desse Ôrqão.
Os dados experimentais do presente trabalho concordam
com os da literatura, havendo aumento de 14* do peso de massa hepática
nos ratos tratados com a citada droga.
5.2. Fluxo biliar.
0 fluxo biliar ê* um importante parâmetro para determina-
ção da velocidade de excreção de compostos na bile 1 * ' ' ' ' '
^ \ Nos ensaios com fenobarbital evidenciou-se um aumento tanto de
fluxo biliar como de excreção de numerosos componentes biliares^'^ 7 ,
23,39)^ poBERTS E PLAA^^^ sugerem que esse incremento seria paralelo
a uma hipertrofia hepática, porém, K L A A S S E N v e r i f i c o u que esses
acréscimos não mantinham uma proporcionalidade, demonstrando um fluxo
significantemente aumentado (50") 24 horas após uma única dose de feno
barbital e, alcançando equilíbrio entre o segundo e sétimo dias de ad-
42
ministração; no entanto, o peso do fígado não se alterou significativa
mente nos primeiros dias, aumentando apenas 15 a 20% após o sétimo dia
de tratamento.
Pelos resultados aqui apresentados, pode-se verificar um
notável aumento do fluxo biliar (87*). Este dado, apesar de considera-
(4 15 39) velmente elevado, esta em concordância com vários autores 1 ' ' '.
5.3. Iodo ligado as proteínas sericas (PBI).
OPPENHEIMER* 3 0' 3 3) e BERNSTEIN^ nas suas experiências
em ratos, utilizando doses de fenobarbital de 100 mg/kg de peso durante
cinco dias, não constataram modificações significativas do PBI serico;
dados oue concordam com os resultados obtidos no presente trabalho.
Embora a iodoproteinemia não esteja alterada, a velocida_
de de secreção de encontra-se aumentada como foi verificado nas expe
riencias de GILLESPIE^ 1 3\
5.4. Iodo biliar total.
GOLDSTEIN e TAUPO^ 1 5) observaram em ratos tratados, du
rante cinco dias, com dose de fenobarbital de 50 mg/kg, um aumento na
excreção biliar de( I/acompanhado de incremento proporcional de flu
xo, embora a concentração do radioisótopo permanecesse inalterada.
Nos resultados aoui apresentados, hã um aumento do iodo
total biliar e do fluxo, não existindo porém a proporcionalidade citada
43
por GOLDSTEIN e TAUROG* A provável causa desta diferença estaria
na dose administrada, se fosse considerada a observação de KLAASSEN^ 2^
sobre a resposta em função da dose.
5.5. Cromatoqrafia biliar em coluna de Sephadex G-25 M.
A filtração em gel de Sephadex, juntamente com a técnica
dos traçadores radioativos, permite a separação dos compostos iodados
numa sÕ etapa, possibilitando assim, obtê-los num alto grau de pureza.
Apesar dos problemas de decomposição e retenção da no gel de Sepha
dex, esta técnica ainda apresenta maiores vantagens em relação aos mê"to_
dos de L I S S r r Z K Y Í 2 6 , 2 7 ) , C L A R K ^ e HOCMAN* 1 8).
Ouanto a composição da bile em relação aos compostos io-
125 -dedos, apos administração de T^- I, foram obtidas quatro frações, sen_
do a quarta identificada como qlicuronidato rie tiroxina, concordando /•» cn
com os dados encontrados por IKEDA e col.
5.6. Tiroxina e qlicuronidato de tiroxina.
OPPENHEIHER e c o l . * 3 0 ' 3 1 , 3 2 ' 3 3 ' 3 4 ) , SCHWARTZ* 4 1' 4 2 5 e
BERNSTEIN*^ verificaram em suas exneriências que o fenobarbital induz
em ratos um aumento acentuado no compartimento d e T ^ hepático, resultan
te da proliferação do retículo endoolasmãtico liso. Para estes autores
a eliminação acelerada do hormônio seria devida ao incremento de secre
ção biliar. Sugerem existir, também, um aumento no "turnover" de triio
riotironina sêrica, acompanhado de d-.minuicão na concentração deste hor-
44
mÔnio, provocando um estimulo na secreção de TSH pela pituitaria. Como
consequência desse fenômeno, haveria um impulso na produção tireoideana
de maior quantidade de hormônio com intuito de manter a disponibilidade
periférica.
Calcula-se que esse impulso duplique a secreção glandu
lar e estimule sua captação de iodeto/ estabelecendo um novo estado de
equilíbrio, no qual, tanto a concentração hormonal sérica como aquela
extra-hepática permaneceriam normais./
Desde que se postule que o fenoharbital aumenta a quantj[
dade de sítios de ligação na fração microssomal, a relação concentração
de T^/sítios de ligação permaneceria inalterada, embora o compartimento
hepático se encontre aumentado
A maior excreção biliar de leva, possivelmente, a um >
incremento também fecal deste hormônio, cono sugerem os dados de CAVA
LIERI * 6 ).
Na presente experiência, verificou-se oue o grupo subme
tido ao fenobarbital apresentou maior desenvolvimento dos retículos en-
doplasmaticos liso e rugoso das células hepáticas, e um aumento de tiro
xina biliar, o que concorda com a maioria dos autores supracitados. Es_
tes dados mostram ainda, a existência de elevada conjugação hepática de
T 4 , fato não observado "in vivo" ou "in vitro" por GOLDSTEIN e TAU
ROS * 1 5\
A maior conjugação poderá ser explicada pelas alterações
enzimáticas encontradas por SCHVARTZ^ 4 2^ e C O N N E Y ^ em homogeneizados
de fígados de ratos submetidos a ação do fenobarbital. Vários autores
verificaram em experiências similares proliferação de REI e RER com pre
45
dominância deste ultimo*" ' o que levaria a uma elevação dos níveis
hepáticos da UDPGA-desidrogenase e glicuronil-transferase, responsáveis
pela conjugação de com consequente aumento de glicuronidato de tiro-
xina.
46
6. CONCLUSÕES
Os resultados de nossas experiências permitem as seguintes
conclusões:
1. Sob a ação do fenobarbital houve incremento significante do\ fígado e
do fluxo biliar.
2. Este incremento foi acompanhado de maior excreção de tiroxina- I e
de seu glicuronidato quando os animais recebiam este hormônio por
via intraperitoneal. Não houve alteração da iodoproteinemia.
3. Contrastando com a literatura, o aumento na excreção hormonal e de
seu metabolito foi devido, não sÔ ao incremento do fluxo mas também
a maior concentração destes compostos na bile.
4. A microscopia eletrônica das células hepáticas dos animais submeti
dos ao fármaco em questão mostrou aumento dos retículos endoplasmati
cos liso e rugoso.
47
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