AF060BiotecnologiaVegetalProfessoresresponsáveis:

Prof.JoãoCarlosBespalhokFilho

Prof.LuizAntonioBiasiProfa.RenataFaierCalegarioProf.BrunoPortelaBrasileiroProfa.DaniellaN.M.Carneiro

Doutoranda:CarolinaS.SchuchovskiAugusto

CulturadeTecidosVegetaisv Tópicos:

v Organizaçãodolaboratóriov MeiosdeCultura(componentese

preparo)v  Assepsiav Organogênese

v  Embriogênese

Organizaçãodolaboratório

Finalidadedolaboratóriov  Pesquisa:

v  Estudodediversastécnicas,variedadedeespéciestrabalhadas,ensino

Finalidadedolaboratóriov  Comercial:

v  Biofábricas:produçãoemlargaescala,eficiência,custoreduzido

TécnicasuVlizadasv  Micropropagação

v  Culturademeristemas:ápicesmeristemáVcoslivresdevírus

v  TransformaçãogenéVca:introduçãodeumasequênciadefinidadeDNA

v  Culturadeóvulos:haploides

v  CulturadeembriõeszigóVcos(resgatedeembriões):superaradormênciadassementes,estudododesenvolvimentodoembrião,recuperarhíbridosrarosdecruzamentosincompaYveis

v  Protoplastos:célulassemparedecelular,estudosnomelhoramentogenéVco

Altocusto;Mãodeobraespecializada;AltocustodemateriaisContaminação;Oxidação;

Grandenºdemudas;Controledascondiçõesdetrabalho;

Livresdedoenças;Crescimentorápido;

MulVplicarplantasquenãoproduzemouproduzempoucassementes.

Mudasmicropropagadasv  Vantagensedesvantagens

Etapasdoprocessoinvitrov  Estabelecimentoinvitro

v  Desenvolvimentodoexplante,seguindoarotaescolhida

v  Transferênciadasplantasparaoambienteexterno

Etapasdoprocessoinvitro

CarcaterísVcasimportantesv  AmbienteassépVco

v  Temperaturaeiluminaçãocontrolados

Estruturabásicav  Saladelimpeza

v  Saladepreparodemeio

v  Saladetransferência

v  Saladecrescimento

v  Outrasdependências

Estruturadeapoio

v  Casadevegetaçãov  Câmaradenebulização

v  Temperaturacontrolada

v  Telado

Estruturabásicav Saladelimpeza

v  Descartemeiodecultura

v  Lavagemdevidraria

v  Autoclavagemdeáguaemeiodecultura

Estruturabásica

v Saladelimpeza

Estruturabásicav  Saladelimpeza

v  Piasfundas

v  Locaisparaarmazenarvidrossujos

v  Lavagem

v  Detergente

v  Hipocloritodesódio(NaClO)

v  Estufaparasecagem

v  Descartedematerial

v  Produtosquímicosemeiodecultura

Estruturabásicav Saladepreparodemeio

v  Preparodesoluçõesemeiosdecultura

Estruturabásicav Saladetransferência

v  LocaldemanipulaçãoassépVcadasculturas

Estruturabásicav Saladetransferência

Estruturabásicav  Saladecrescimento

Estruturabásicav Saladecrescimento

Estruturabásicav Saladecrescimento

v  Prateleirasv  Lâmpadas

v  Timerv Luminosidade-16h

v  Temperaturacontrolada:

v Arcondicionado:23ºC±2ºC

Estruturadeapoiov  Casadevegetação

v  CâmaradenebulizaçãoeclimaVzada

Estruturadeapoiov  Casadevegetação

v  CâmaradenebulizaçãoeclimaVzada

Estruturadeapoiov  Telado

Equipamentosv  Autoclave:

v  Esterilizaçãoa121ºCepressão1,05km/cm2

Equipamentosv  Autoclave:

v  Manuais,automáVcas

v  Horizontais,VerVcais

Equipamentosv  Deionizador:

v  Remoção:v Minerais

v íonsnasresinas

v  Nãoremovesubstânciasorgânicas

Equipamentosv  DesVlador:

v  Remoçãode:v Minerais

v  Subst.orgânicas

v  Aquecer,ferver,evaporar,condensarecoletar

Equipamentosv  Ultra-purificador–

sistemaMilliQ:v  Resinaseficientespara

remoçãominerais

v  ReVradadeparYculasorgânicas(filtrodemembrana0,22µm)

Equipamentosv  FornodeMicroondas:

Equipamentosv  Estufadesecagem:

v  Fornoelétricocomum

v  Secagemdevidaria

Equipamentosv  Geradoresdeeletricidadee

estabilizadoresdevoltagem:v  GaranVadefornecimentoininterruptode

eletricidade

v  Proteçãoaosaparelhos

Equipamentosv  Refrigeradorefreezer:

v  Soluçõesestoque,Reguladoresdecrescimento,Vitaminas,Materialvegetal

Equipamentosv  Balança:

v  Macronutrientes,precisão0,1g

v  Balançadeprecisão:v  Altocusto;

precisãode0,1mg

Equipamentosv  AgitadormagnéVco

Equipamentosv MedidordepH:

v  Calibraçãoperiódicacomsoluçõesestoque

Equipamentosv  Câmaradefluxolaminar:

Equipamentosv  Câmaradefluxolaminar:

v  ImprescindívelparaostrabalhosdemanipulaçãoassépVca

Equipamentosv  Câmaradefluxo

laminar:v  Arpassapor

umfiltrobacteriológico

v  AmbientecompressãoposiVva

Equipamentosv  Câmaradefluxolaminarcomluzultra-

violeta:v  Ligar20minutosantes

v  Desligaraluz

v  Nãopermanecernasala

v  Queimaduras

v  Altamentemutagênica

Equipamentosv  Dispensadordemeio

decultura:

Equipamentosv Microscópio

estereoscópico:

Equipamentosv  Agitador

orbital:

Equipamentosv  Lamparinadeálcooloubico-de-bunsen

Equipamentosv Micropipetas

Equipamentosv  Ar-condicionado

Equipamentosv  Biorreatoresdeimersãotemporária

Equipamentosv  Biorreatoresdeimersãotemporária:

v  MulVplicaçãoemlargaescala

Equipamentosv  Fotografia:

Utensíliosv  Frascosdecultura:

Utensíliosv  Suportesparatubosdeensaio

v  Pinças,bisturis

v  Bandejas

v  Frascosparaáguaeparareagentes

v  Béquer,erlenmeyer,proveta,pipeta,placadepetri

v  Outrosmateriais:papeltoalha,alumínio,filmeplásVco,eVquetas

Segurançaemlaboratóriov  Regrasaseremrigorosamenteseguidas

v  Evitaracidentes

v  Evitarprejuízoshumanosemateriais

Segurançaemlaboratóriov  Usodeguarda-pódealgodão

v  Usodecalçadosfechados

v  Lavarasmãoscomdetergenteantesdoiníciodostrabalhos

v  Laboratóriosemprefechadoelimpo

v  Nãocomerenãobebernolaboratório

Segurançaemlaboratóriov  Nuncausarmaterialeutensíliosdo

laboratórioparacomerouparabeber

v  Substânciasinflamáveisdevemsermanipuladaslongedefontesdeaquecimento

v  Semprequeusarpipetas,uVlizarpipetadores

Segurançaemlaboratóriov  Antesdemanipularqualquerreagente,

informar-sesobreatoxicidade,inflamabilidadeeexplosividadedomesmo

v  Cuidadosespeciaisaomanipularsubstânciascompotencialcarcinogênico

v  UsarosEPIsadequados:guarda-pó,luvas,máscaras,óculosdesegurança

Segurançaemlaboratóriov  Reagentesesoluções:

v  ClaramenteidenVficados

v  Concentração

v  Responsávelpelopreparo

v  Datadopreparo

v  Todasassubstânciassãotóxicasdependendodasuaconcentração

Segurançaemlaboratóriov  Cuidadosnomanuseiodeequipamentos:

v  CerVficar-sesempredavoltagemcorreta

v  Lerasinstruçõesdeuso

v  Emcasodedúvida,perguntaraotécnicoresponsável

Segurançaemlaboratóriov Cuidados:

v  Cortecomvidrosquebradosoubisturi

v  Queimadurascommaterialdaautoclave

v  Incêndiocomálcool(lamparinaouassepsia)

Organizaçãodotrabalhov  Cadernodelaboratório

v  Fontedeinformações

v  TentardescreveraomáximoasaVvidades

v  Deveficarnolaboratório

Organizaçãodotrabalhov  EspaçomulVusuário

v  Necessidadedeprogramaçãopara:v  Preparodemeio

v  Autoclavagem

v  Câmaradefluxolaminar

Segurançaemlaboratóriov  Biossegurança:

v  Conjuntodemedidasdesegurança

v  CTNBio(Comissãotécnicadebiossegurançanacional)

v  hop://ctnbio.mcV.gov.br

v  OGMs

Segurançaemlaboratóriov  Biossegurança:

v  CIBio(comissãointernadebiossegurança)

CQB:0114/99SetordeCiênciasAgrárias-UFPRCNPJ: 75.095.679/0001-49 ENDEREÇO:DepartamentodeFitotecniaeFitossanitarismo-RuadosFuncionários,1540CIDADE:CuriVbaUF:PRCEP:80035-050TELEFONES:(41)3350-5716FAX:(41)3350-5684PRESIDENTE:JoãoCarlosBespalhokFilhoEMAIL:bespa@ufpr.brMEMBROS:FlávioZaneoe;FrancineLorenaCuquel;MargueriteG.G.Quorin;LuizAntônioBiasiOBSERVAÇÕES:

Segurançaemlaboratóriov  Biossegurança:

v  CQBCerVficadodeQualidadeemBiossegurançav  credenciamentoqueaCTNBioconcedeàs

insVtuiçõesparadesenvolverprojetoscomOrganismosGeneVcamenteModificados(OGM)

Processo:01200.002080/1999-76Protocolo:23/07/1999CQB:0114/99InsVtuição:SetordeCiênciasAgráriasdaUniversidadeFederaldoParaná-UFPRSituaçãoCQB:ATIVOResponsávelLegal:LuizAntonioBiasiFinalidade:ENSINO;PESQUISAEMREGIMEDECONTENÇÃOAVvidades:PLANTAS;MICROORGANISMOS

MeiodeCultura

Componentesv  Água

v  Macronutrientes

v  Micronutrientes

v  Vitaminas

v  Carboidratos

v  Reguladoresdocrescimento

v  Ágarououtrosgelificantes

v  pH

Componentesv Macronutrientes:

v  Nitrogênio(N)

v  Fósforo(P)

v  Potássio(K)

v  Cálcio(Ca)

v  Magnésio(Mg)

v  Enxofre(S)

Componentesv  Micronutrientes:

v  Ferro(Fe)v  Manganês(Mn)v  Zinco(Zn)v  Boro(Bo)v  Cobre(Cu)v  Molibdênio(Mo)v  Outros

v CobaltoeIodo

Componentesv  VitaminaseInositol

v  Tiamina

v  ÁcidoNicoYnico

v  Piridoxina

v  Glicina

v  MioInositol

Componentesv  Carboidratos

v  Sacarose

Componentesv  Reguladoresdocrescimento

v  Auxinasv AIA,AIB,2,4-D,ANA

v  Citocininasv CIN,BAP,TDZ,2iP,Zea

v  Giberelinasv GA3

v  ÁcidoAbscísicov ABA

Componentesv  Agentesgelificantes

v  Ágarv 6a10g/L

v  Gelrite/phytagelv 1a2g/L

Componentesv  pH

v  Deveficarnafaixade5a5,8

v  AjustarpHadicionandosoluçãodeNaOH(base)ouHCl(ácido)

v  pHinfluencia:v  Disponibilidadedenutrientes

v  Consistênciadogel

MeioMSv MurashigeeSkoog(1962)

v  MaisuVlizadonaculturadetecidos

v  Ricoemnitrogênio

MeioMS-composição

Preparov  Soluçõesestoque:preparoe

armazenamento

Preparov  Preparodomeiodecultura

v  Adiçãodassoluçõesestoquev  Completarovolumedesejadocomáguav  Adiçãodasacarose,mioinositolv  Adiçãodoreguladordecrescimentov  ControledopHv  Adiçãodeágaresolubilização

v  Distribuiçãonosfrascos,fechamento

v  Autoclavagemdomeio

Assepsia

Assepsiav Eliminaçãodemicroorganismospresentesnotecidovegetal,medianteaplicaçãodeagentesquímicose~sicos,semdanificarestestecidos.

Assepsia

Assepsiav Lavagemcomáguacorrente

Assepsiav Imersão:

v HipocloritodeSódio(NaClO)v Etanolv CloretodeMercúrio(HgCl2)v Detergentes(Twin20)v Dentrodacâmara

Assepsiav Lavagemcomáguaesterilizada(dentrodacâmaradefluxolaminar)

Assepsiav Asconcentraçõesvariamdeacordocomotempoqueomaterialseráexpostoaoproduto

ConcentraçãoTempo

AssepsiadaAmora-pretav  Exemploexperimentodeassepsia

v  segmentosnodais1,5cmv  soluçãoetanol(70%)+Tween20(0,1%):30segundosv  tratamentos:

v  semimersãoemhipocloritodesódio(0,5%)(testemunha)v  10minutosdeimersãoemNaOCl(0,5%)v  20minutosdeimersãoemNaOCl(0,5%)

v  30minutosdeimersãoemNaOCl(0,5%)

v  3lavagensemáguadeionizadaeesterilizadav  meioMS+5µMBAPv  duração:60dias

AssepsiadaAmora-preta

TRATAMENTOS NÚMERO DE OBSERVAÇÕES (nº)

CONTAMINAÇÃO (%)

Sem imersão 60 96,7b (1)

10 minutos 60 83,3a

20 minutos 60 78,3a

30 minutos 60 66,7a

Coeficiente de variação (%) 11,78 (1) Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem estatisticamente entre si a 5% de

probabilidade pelo teste de Tukey.

RotasMorfogênicas

RotasMorfogênicasv Organogênese

v Formaçãodeumórgão

v Embriogênesev Formaçãodeumembrião

Organogênese

Organogênesev ProcessodeformaçãodeumórgãoaparVrdeumtecidov  Gema/Brotov  Raiz

DiretaouIndiretav Direta

v Semformaçãodecalo

v Indiretav Formaçãodecalo(massacelularnão

diferenciada)

Fatoresqueafetamaorganogênese

v  Espécie/genóVpo

v  Explantev  JuvenilxMaduro

v Meiodeculturav  Reguladordecrescimentov  Tipoeconcentraçãov  Gemas:citocininas(BAP,cineVna)v  Formaçãoderaízes:auxinas

Aplicaçõesdaorganogênese

v Micropropagação

v Organogênesedireta

v TransformaçãogenéVca

EmbriogênesesomáVca

EmbriogênesesomáVca

v ProcessodeformaçãodeumembriãoaparVrdeumtecidosomáVco

v EmbriãosomáVcoébipolarv  Ápicecaulinarv  Radicular

EmbriogênesesomáVca

v Embriogênesediretav Semformaçãodecalo

EmbriogênesesomáVca

v Embriogêneseindiretav Comformaçãodecalo

Estágiosdedesenvolvimento

v Globular,cordiforme,torpedoecoVledonar

Estágiosdedesenvolvimento

v Indução(indireta)v Auxinas(2,4-D)–desdiferenciação–

formaçãodocaloembriogênico

v Formaçãodoembriãov ReVrada/Diminuiçãoda

concentraçãodeauxinas

Fatoresqueafetam

v  Espécie/genóVpo

v  Explante

v Meiodeculturav  Altaconcentraçãodesais,

principalmenteNitrogênio

v  Luzv  Induçãogeralmenteéfeitanoescuro

Aplicações

v SementessintéVcas

v TransformaçãogenéVca

Muito obrigada! carolina.sschu@gmail.com.com