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Algumas das técnicas mais utilizadas em análise de alimentos
Técnicas cromatográficas
A cromatografia baseia-se na distribuição ou partição de um soluto (amostra) entre
uma fase móvel e uma fase estacionária.
As técnicas cromatográficas em análise de alimentos incluem: Cromatografia gasosa
(GC), Cromatografia líquida de elevada eficiência (HPLC) e cromatografia de fluidos
supercríticos (SFC). A cromatografia líquida (LC) e a cromatografia de fluidos
supercríticos são métodos cromatográficos mais adequados para a análise de
aminoácidos, péptidos açúcares e vitaminas.
As técnicas cromatográficas, quando acopladas a outros instrumentos que servem
como detectores (ex: espectrómetro de massa) são utilizadas como método de
separação. 1 QMAA/UBI/AM@2009
Cromatografia gasosa (GC)
É aplicada a substâncias voláteis que são estáveis termicamente.
A CG é útil para a análise de compostos apolares, apesar de poder ser utilizada na
análise de compostos polares se estes forem previamente derivatizados.
O isolamento do analito a partir da matriz da amostra é particularmente importante
em GC para evitar respostas falsas de produtos de degradação da matriz. Os métodos
por técnica de ‘Headspace’ incluem a amostragem directa do headspace, destilação e
extracção por solventes.
Os detectores incluem condutividade térmica (que não é específica), ionização de
chama (para a maioria dos compostos orgânicos), captura electrónica (principalmente
para resíduos de pesticidas) e fotometria de chama (para pesticidas e compostos de
enxofre). As aplicações mais comuns em análise de alimentos por GC incluem glúcidos,
medicamentos, lípidos e pesticidas. 2 QMAA/UBI/AM@2009
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Um dos avanços na GC é a cromatografia gasosa bidimensional, GC GC, que consiste
numa coluna de alta resolução com uma fase estacionária não polar, um modulador
para separar o eluído em muitas pequenas fracções, e uma segunda coluna curta,
estreita e polar. Esta técnica já foi aplicada a ácidos gordos, aromas e pesticidas.
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5.3 Cromatografia líquida de alta resolução (ou eficiência) (HPLC)
A HPLC (High performance liquid chromatography) tem sido utilizada para
determinar componentes não voláteis dos alimentos.
Em HPLC de fase normal, a fase estacionária é um adsorvente polar e a fase móvel é
um solvente não polar, sendo utilizada por exemplo para vitaminas liposolúveis e
glúcidos.
A HPLC de fase reversa, tem a fase estacionária não polar e a fase móvel polar,
apresentando mais aplicações práticas.
HPLC de troca iónica, com uma coluna com resina orgânica funcionalizada, é usada
para a detecção de iões inorgânicos e análise de glúcidos e aminoácidos. A técnica de
análise por HPLC é a técnica analítica mais usada para análise de alimentos, e é
sobretudo usada para aminoácidos, glúcidos, fármacos, lípidos e proteínas.
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Uma aplicação bidimensional desta técnica é a cromatografia líquida (LC) GC.
Deste modo, os triglicéridos podem ser primeiro separados de acordo com o nº
de ligações duplas e depois com o número de carbonos. Um exemplo é o das
impressões digitais de azeite obtidas em diferentes regiões, conforme a
composição das classes de mono-, di- e triglicéridos, assim como de esteróis,
ésteres e outras classes de compostos.
5.4 Cromatografia de fluidos supercríticos (SFC).
O dióxido de carbono supercrítico é utilizado como fase móvel, onde uma coluna
tubular aberta ou uma coluna empacotada é utilizada como fase estacionária, e é
usado qualquer detector de GC ou LC.
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6. Técnicas espectroscópicas
A espectroscopia é baseada nas interacções da matéria com a radiação
electromagnética. As interacções podem tomar a forma de absorção e emissão,
podendo ser detectada através de experiências de emissão, transmissão e reflexão. As
regiões do espectro mais utilizadas pela ciência alimentar são o Ultravioleta (UV),
Visível (Vis), Infravermelho (IV), rádio (Ressonância magnética nuclear, NMR) e
microondas (Ressonância electrónica de spin (ESR). As técnicas espectroscópicas
podem ser utilizadas em análises quantitativas e qualitativas.
6.1 UV, Vis, e Fluorescência
A espectroscopia de fluorescência trata da radiação emitida e pode ser três vezes
mais sensível que as espectroscopias de UV e IV. Como muitas moléculas orgânicas,
incluindo pesticidas, apresentam fluorescência, em assim como bactérias, a técnica
pode ser utilizada para detectar contaminantes em alimentos.
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6.2 Infravermelho (IR)
Os espectrómetros de Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
podem ser utilizados em linhas de produção para a determinação de
concentrações de lípidos, proteínas e humidade. Esta técnica tem a vantagem
de a amostra não necessitar de ser submetida a tratamentos de qualquer tipo,
nomeadamente extracção.
A Reflectância total atenuada (ATR) trata com a reflexão interna da luz IR,
sendo utilizada para analisar açúcares e ácidos gordos trans. Foram
desenvolvidas células de ATR para altas pressões e temperaturas. Esta técnica
pode ser melhorada usando Reflexão interna múltipla (Mir).
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6.3 Raman
A espectroscopia de Raman é uma técnica complementar à espectroscopia de
Infravermelho. A absorção no Infravermelho depende de alterações no momento
dipolar dos analitos, significando que os grupos polares apresentam respostas fortes
no IV. A difusão de Raman verifica-se devido à polarizabilidade dos grupos funcionais,
pelo que grupos não polares produzem respostas intensas. As proteínas e os
aminoácidos prestam-se bem a esta espectroscopia, se bem que glúcidos, lipídos e
outros componentes minoritários dos alimentos também possam ser estudados por
esta técnica.
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6.4 Absorção atómica e emissão atómica
A Espectroscopia de absorção atómica (Atomic absorption spectroscopy, AAS),
baseia-se na absorção de radiação UV-Vis por minerais atomizados, enquanto que a
Espectroscopia de emissão atómica (Atomic emission spectroscopy, AES), usa a
emissão de radiação por uma amostra. De um modo geral, as amostras devem ser
reduzidas a cinzas, que são dissolvidas em água (ou ácido diluído), e vaporizadas. Em
AAS, as amostras são atomizadas por um nebulizador e queimador (AAS de chama), ou
por uma câmara de grafite (AAS electroquímica). Esta última variante usa amostras
menores e tem limites de detecção muito mais baixos que a AAS de chama, mas é
mais cara e menos precisa.
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Em AES, a atomização e a excitação pode ser realizada por chama ou por plasma
indutivo (Inductively coupled plasma, ICP), onde as amostras são aquecidas acima de
6000 K na presença de Árgon. Tanto AAS como AES medem concentrações vestigiais de
metais em matrizes complexas com excelente precisão e exactidão. A AAS é uma
técnica mais desenvolvida, mas a Espectroscopia de emissão atómica com plasma
indutivo (ICP-AES) pode ser usada para medir mais de um elemento numa amostra e
pode medir compostos estáveis a altas temperaturas.
Ambos os métodos, AAS e AES, suplantaram os métodos clássicos na detecção de
minerais nos alimentos.
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6.5 Espectrometria de massa
A Espectrometria de massa (Mass spectrometry, MS) tem sido utilizada para a
identificação e análise de compostos complexos desde o início dos anos 60. O
acoplamento de técnicas de separação a MS, ultrapassou o principal problema
analítico das técnicas cromatográficas – a ambiguidade sobre a identidade do analito.
A MS é habitualmente usada em combinação com GC, HPLC, ICP e electroforese
capilar e existem instrumentos tandem MS-MS. Existem três técnicas novas de
ionização utilizadas na análise de alimentos. Na ionização por electrospray
(electrospray ionization, ESI) são produzidos iões com cargas múltiplas através da
formação repetida, e explosão, de gotículas carregadas.
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As técnicas de MS têm sido usadas para analisar em toda a extensão os componentes de alimentos, incluindo antioxidantes, compostos do aroma, glúcidos, resíduos de medicamentos, lípidos, peptídeos e proteínas, toxinas e vitaminas.
Na técnica de MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization),
Ionização/Dessorção de Matriz Assistida por Laser, a amostra é cristalizada numa
matriz de pequenas moléculas aromáticas e o cristal é sujeito a pulsos de laser
ultravioleta que fragmenta as moléculas.
Na técnica de Ionização química a pressão atmosférica – nebulizador aquecido
(heated nebulizer-atmospheric pressure chemical ionization, HN-APCI), onde um
processo de reacção em fase gasosa entre ião e molécula permite às moléculas
de analito serem ionizadas sob pressão atmosférica.
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6.6 Ressonância Magnética Nuclear e Ressonância Electrónica de Spin
A Ressonância Magnética Nuclear (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) é um
método espectroscópico em que os núcleos atómicos que são orientados por um
campo magnético absorvem frequências características na região das ondas de rádio.
Na Ressonância Electrónica de Spin (Electron Spin Resonance, ESR) o que está em
causa são electrões e frequências de microondas.
Estas técnicas apresentam várias vantagens, nomeadamente: são não destrutivas;
geralmente não requerem separação ou extracção de amostra, e podem analisar o
interior de uma amostra. As desvantagens incluem menor sensibilidade e selectividade
que outras técnicas. As experiências de NMR são realizadas usando ondas contínuas (o
campo magnético é mantido constante enquanto a frequência oscilante é variada ou
vice-versa) ou métodos de pulsos (curto espaço de tempo, grande amplitude). Em ESR
utiliza-se uma onda contínua.
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A Ressonância Magnética Nuclear é frequentemente usada para examinar as
propriedades físicas tais como fusão, cristalização, polimorfismo e composição
de óleos. A Ressonância Electrónica de Spin é usada para detectar radicais
livres produzidos em processos físicos e químicos.
Os aparelhos disponíveis de NMR incluem os de baixa resolução (para análise
de humidade ou óleos); alta resolução líquida (análise da fase líquida); alta
resolução sólida (análise em fase sólida), e ressonância magnética imagética
(visão tridimensional de cortes de secções de alimentos).
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6.7. Outras técnicas espectroscópicas
Os consumidores confiam na cor, aroma, sabor e textura para determinar a
qualidade do alimento. Os colorímetros são usados para avaliar a cor dos alimentos,
qualitativa e quantitativamente, com base na matiz, suavidade e saturação, sendo
frequentemente usados em conjunção com estudos sensoriais e de longevidade do
produto (exemplo: fruta).
A refractometria baseia-se na variação da velocidade da luz pelo analito. As medições
do índice de refracção são úteis na determinação de concentrações em bebidas,
molhos e outros alimentos líquidos. A técnica é muitas vezes utilizada em detectores
acoplados a equipamentos de HPLC.
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A polarimetria é bastante aplicada na medição de óleos na indústria dos aromas,
açúcares e amidos.
O dicroísmo circular e a dispersão óptica rotatória (d.o.r.) baseiam-se na interacção de
luz polarizada circularmente com espécies opticamente activas.
Enquanto que o dicroísmo circular depende do comprimento de onda, a d.o.r.
depende da absortividade molar. Estas técnicas são aplicadas frequentemente a
aminoácidos, péptidos, proteínas e produtos naturais complexos.
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Sensores ultrasónicos têm sido aplicados à determinação da composição e textura
medindo a velocidade das ondas de ultrasons através da amostra de alimento. A
imagem de ultra-sons é utilisada para examinar a estrutura nos alimentos, mas é
muito demorada para inspecções de rotina.
7. Técnicas Físicas
7.1 Electroquímica
A técnica electroquímica mais comum é a de medição de pH. Uma alternativa a AAS
e AES consiste na utilização de eléctrodos selectivos de iões que são sensíveis a um ião
particular. Esta técnica é simples, rápida e relativamente barata. Infelizmente, os
eléctrodos não são 100% específicos, uma vez que outros iões, para além dos
desejados, podem interferir na medição.
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A electroforese em gel, consiste na separação de moléculas carregadas quando é
aplicado um campo eléctrico. A electroforese pode ser realizada sob condições não
desnaturantes, onde a separação é realizada de acordo com a carga, forma e tamanho.
Sob condições desnaturantes ou eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de
dodecil sulfato de sódio (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,
SDS-PAGE), a separação é principalmente feita de acordo com o peso molecular.
Na focagem isoeléctrica, a separação é feita pela carga.
Na electroforese bidimensional, as separações são feitas em direcções
perpendiculares consecutivas, sendo primeiro a amostra submetida a uma focagem
isoeléctrica e depois uma SDS-PAGE. Em todos os casos, as características do gel (ex:
porosidade) podem ser variadas de modo a optimizar separações de proteínas e
ácidos nucleicos.
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A electroforese capilar (Capillary electrophoresis (CE), usa um tubo capilar e
detecção fotométrica. As técnicas de CE incluem electroforese capilar de zona
(capillary zone electrophoresis) para analitos carregados e cromatografia micelar
electrocinética (micellar electrokinetic chromatography) para analitos neutros.
A Electroforese capilar tem sido aplicada à análise de aminoácidos, glúcidos, proteínas,
vitaminas, aditivos, toxinas naturais e resíduos de antibióticos e pesticidas. Os limites
de detecção são relativamente altos, tendo em conta o baixo volume de amostra.
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7.3 Flavor e cheiro
Geralmente são utilizados painéis de provadores que promovem análises sensoriais
aos alimentos. Contudo, têm sido desenvolvidas técnicas instrumentais para chegar ao
mesmo objectivo. Cerca de 7000 compostos responsáveis por aromas já foram
identificados por GC-MS. O carácter sensorial de compostos aromáticos individuais é
frequentemente investigado por cromatografia gasosa-olfactometria (Gas
chromatography-olfactometry, GC-O). Esta técnica apareceu quando os analistas
aspiraram os compostos à medida que estes eram eluídos do GC. A espectroscopia de
massa-ionização a pressão atmosférica (Atmospheric pressure ionization-mass
spectroscopy, API-MS) mede a concentração de compostos voláteis à medida que são
inalados, dando informação sobre a libertação do flavor. Um desafio a ser
ultrapassado ao caracterizar flavors e odores é o de os componentes individuais serem
analisados separadamente da matriz do alimento e portanto fora de contexto.
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7.4 Análise de partículas
Muitos alimentos processados contêm partículas produzidas durante a secagem,
moagem, trituração, ou outras operações. A aparência e forma das partículas é
examinada por microscopia óptica, e a uniformidade do tamanho é medida por
instrumentos que medem o tamanho das partículas com base na difracção laser e
dipersão da luz (light scattering).
7.5 Reologia e textura
A reologia consiste no estudo do fluxo e deformação da matéria e a textura trata da
percepção da reologia pelos consumidores. A reologia é um factor importante em
engenharia de processos alimentares, vida do alimento na prateleira e controlo de
qualidade. Os alimentos exibem tanto comportamento elásticos como viscosos, que
podem ser medidos por viscosimetria, cisalhamento oscilatório, compressão,
extensão, torção e outros testes.
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7.6 Estrutura
A estrutura dos alimentos é estudada por microscopia óptica, microscopia
electrónica de varrimento, Scanning electron microscopy, (SEM), microscopia
electrónica de transmissão, Transmission electron microscopy (TEM), e microscopia
confocal de varrimento laser, Confocal laser scanning microscopy (CLSM). A
microscopia óptica até amplificações de 2000 é utilizada para pesquisar detalhes
estruturais. A microestrutura superficial é examinada através de SEM, enquanto que a
estrutura interna é visualisada por TEM. A CLSM que requer menos preparação da
amostra e é usada para obter imagens tridimensionais.
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7.7 Propriedades térmicas
As transições térmicas nos alimentos, tais como fusão, decomposição e transição
vítrea, são observadas usando calorimetria de varrimento diferencial (Dfferential
scanning calorimeter, em que uma amostra é aquecida e a quantidade de calor
absorvido relativamente a uma referência é medido.
A técnica pode ser aplicada a proteínas, amidos e açúcares, sendo especialmente útil
na observação da fusão de lípidos, que apresentam relativamente altos calores de
fusão. Os calorímetros de bomba são utilizados para determinar o valor calórico de um
alimento levando-o à combustão numa atmosfera de oxigénio e medindo a variação de
temperatura na água circundante. Contudo, muitos produtores obtêm os valores
calóricos através de cálculos simples, partindo das percentagens de cada ingrediente e
dos valores calóricos para a gordura, glúcidos e proteína.
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8.1 Sensores enzimáticos e microbianos
Os biossensores consistem num elemento biológico de reconhecimento que
quando em contacto com o analito, produz uma resposta quantificável num elemento
transdutor do sinal.
Os biossensores enzimáticos usam enzimas para produzir produtos que são
detectados por trandutores acústicos, electroquímicos, ópticos e fototérmicos.
Os biossensores microbianos usam microrganismos geneticamente modificados que
são imobilizados numa membrana ou presos numa matriz, consistindo o mecanismo
de transdução num eléctrodo de pH ou de Oxigénio, ou num luminómetro se for
utilisada luciferina. Um transdutor óptico muito utilisado devido à sua sensibilidade é
a ressonância plasmónica de superfície (Surface plasmon resonance).
Os biossensores na área alimentar podem ser utilizados na detecção de
contaminantes tais como herbicidas, pesticidas, patogéneos e toxinas, assim como
componentes dos alimentos como glúcidos ou aminoácidos. Procura-se melhorar o
tempo de resposta, sensibilidade e especificidade dos diferentes biossensores.
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8.2. Imunosensores
Os Imunossensores são biossensores em que os elementos de reconhecimento
biológico são anticorpos que são ligados a um suporte sólido e que ligam a um
antigénio particular, ou anticorpo na amostra. O imunoensaio mais comum é o ensaio
imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay), no
qual um anticorpo ligado a enzima é aplicado depois da ligação do antigénio ou do
anticorpo. Adiciona-se depois o substrato para produzir uma reacção secundária que
tem um produto colorido que é medido espectroscopicamente. A interacção
antigénio/ anticorpo é suficientemente específica para permitir a detecção de espécies
presentes inicialmente. O método pode ser utilizado para detectar alergenos, a
inactivação enzimática, organismos geneticamente modificados, contaminação
microbiana e toxinas.
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