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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
LEANDRO DIAS DA SILVA
ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS EM GENÓTIPOS DE
Jatropha curcas L. SUBMETIDOS AO DEFICIT HÍDRICO
ILHÉUS – BAHIA - BRASIL
FEVEREIRO 2013
i
LEANDRO DIAS DA SILVA
.
ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS EM GENÓTIPOS DE Jatropha
curcas L. SUBMETIDOS AO DÉFICIT HÍDRICO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Produção Vegetal, da
Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC,
como parte dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Produção Vegetal.
Linha de Pesquisa: Cultivos em Ambiente Tropical Úmido Orientador: Prof. Dr. Fábio Pinto Gomes Co-orientadores: Prof. Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida Prof. Dr. Márcio Gilberto Cardoso da Costa
ILHÉUS – BAHIA
FEVEREIRO 2013
ii
iii
Ofereço
“A minha
querida mãe Gal Dias,
que é a razão
do meu viver”
Dedico
“A minha irmã Lilian pelo carinho.
À minha avó, pelo apoio e confiança”
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, por mais uma conquista em minha vida.
À minha mãe, que sempre me incentivou e acreditou em meu potencial, esta vitória também é
sua!
À minha avó pela importante contribuição na minha formação e pelo amor dedicado.
À Lilian e Matheus, que mesmo longe, deram-me forças para seguir em frente.
Aos tios e primos que sempre me apoiaram e confiaram em mim.
Aos “amigos” do grupo Jatropha: Ilana, Michelle, Priscila e Tessio pelo convívio. E também
aos colaboradores: Alayana e Martielly, todos vocês são muito importante para mim!
À Romária pela contribuição.
À amiga Flavia, pela amizade e convívio.
Às minhas pequenininhas Karine e Naiara pela confiança.
Aos amigos que conquistei no Mestrado, em especial a Andressa, Carol, Luciano, Patrícia,
Ueslei, Viviane Barazetti e Walter.
Às amigas Bel, Deise e Mai, pela força.
Aos meus amigos da UFRB: Camila, Cris, Daiara, Filipe, Gogo, Joedson, Lica, Lígia,
Liliane, Marcelo, Mari, Milene, Pedro, Simara, Vitor e Viviane.
Aos amigos Sanfelipenses pelo apoio.
Ao Dr. Fábio Gomes um profissional exemplar, um amigo acima de tudo. Uma pessoa de
caráter e de grande competência. Agradeço pela confiança depositada, pela paciência,
esforço e dedicação para as melhores condições de trabalho e por tornar meus dias de
trabalho em alegria.
Aos meus co-orientadores Dr. Alex-Alan Almeida e Dr. Márcio Gilberto da Costa pela
contribuição e disposição para a realização desta pesquisa.
À banca examinadora: Drª Luana Gomes e Dr. Marcelo Pompelli pela colaboração.
À EMBRAPA-Agroenergia na pessoa do Dr. Bruno Laviola, pelas sementes cedidas.
Ao Dr. Carlos Priminho pela ajuda.
À EMBRAPA- Mandioca e Fruticultura Tropical em especial ao Dr. Carlos Ledo, Dr.
Emanuel e Tailan pela disposição nas análises.
A Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC) – Setor de Fisiologia
Vegetal, em especial ao Sr. Waldemar e Nadja Jaguarível pelo auxílio nas realizações das
análises.
v
À Universidade Estadual de Santa Cruz, em especial ao Programa de Pós Graduação em
Produção Vegetal pela oportunidade.
À secretária do curso, Carol Tavares pelo auxílio.
Ao incansável Marcelo da casa de vegetação, por toda ajuda cedida.
A CAPES pela bolsa concedida e ao CNPq pelo apoio financeiro.
A todas as pessoas que de alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho.
Meus sinceros agradecimentos!
vi
SUMÁRIO
SIMBOLOS E ABREVIAÇÕES ................................................................................ VII
RESUMO................................................................................................................. VIII
ABSTRACT ............................................................................................................... IX
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1
2. REFERENCIAL TEÓRICO ...................................................................................... 3
2.1. Jatropha curcas L. ................................................................................................ 3
2.2. DEFICIÊNCIA HÍDRICA ....................................................................................... 5
2.3. AJUSTAMENTO OSMÓTICO E ACÚMULO DE SOLUTOS COMPATÍVEIS ....... 6
2.4. ENZIMAS ANTIOXIDANTES ................................................................................ 9
2.5. ÁCIDO ABSCÍSICO ........................................................................................... 10
3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 12
3.1. MATERIAL VEGETAL E CONDIÇÕES DE CULTIVO........................................ 12
3.2. MICROCLIMA .................................................................................................... 12
3.3. RELAÇÕES HÍDRICAS ...................................................................................... 13
3.4. DETERMINAÇÕES BIOQUÍMICAS ................................................................... 14
3.5. ATIVIDADES ENZIMÁTICAS ............................................................................. 15
3.6. ÁCIDO ABSCÍSICO ........................................................................................... 17
3.7. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................... 17
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO (EXPERIMENTO I) ............................................. 18
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO (EXPERIMENTO II) ............................................ 28
6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 41
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 42
vii
LISTA DE ABREVIAÇÕES
Abreviação Variável/Parâmetro (unidade)
[ABA] Concentração de ácido abscísico (ng g-1 matéria seca)
AO Ajustamento osmótico (Ψs = (Ψs (controle) – Ψs (estressada), MPa)
AST Açúcares solúveis totais (mg g-1)
CAT Catalase (µmol H2O2 kg-1 MS min-1)
CC Capacidade de campo
DAIT Dias após imposição ao tratamento
DH Deficiência hídrica
EROs Espécies reativas de oxigênio
K+ Potássio (g kg-1)
Ψw Potencial hídrico foliar (MPa)
Ψam Potencial hídrico foliar "ante manhã" (MPa)
Ψmd Potencial hídrico foliar ao meio-dia (MPa)
Ψs Potencial osmótico (MPa)
POD Peroxidase (mmol h-1 kg-1 MS)
PRO Prolina livre
RFA Radiação fotossinteticamente ativa (mol fótons m-2 s-1)
SOD Superóxido dismutase (U/kg MS)
T Temperatura do ar (°C)
TRA Teor relativo de água na planta (%)
U Umidade relativa do ar (%)
viii
SILVA, Leandro Dias da, M.Sc. Universidade Estadual de Santa Cruz, fevereiro de 2013. Alterações Fisiológicas e Bioquímicas em genótipos de Jatropha curcas L. submetidos ao déficit hídrico. Orientador: Fábio Pinto Gomes. Co- orientadores: Alex-Alan de Almeida Furtado e Márcio Gilberto Cardoso da Costa
RESUMO
Jatropha curcas L. pertencente à família Euphorbiaceae, é uma planta perene e encontra-se em processo de domesticação. Parte do interesse pelo cultivo dessa espécie está relacionada ao uso de sua semente que apresenta teor de óleo entre 35 e 40%. Com o objetivo de avaliar a capacidade de ajustamento osmótico, solutos compatíveis e mecanismos enzimáticos relacionados em diferentes genótipos de Jatropha curcas L. sob déficit hídrico, dois experimentos foram conduzidos em condições de casa de vegetação no campus da Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC, Ilhéus, Bahia. Aos 15 dias após a semeadura (DAS) realizou- se o desbaste deixando apenas uma planta por vaso e o tratamento de deficiência hídrica foi iniciada estendendo por um período de 110 dias em ambos os experimentos. Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial, com 2 condições hídricas x 3 genótipos para o experimento I, e 3 condições hídricas x 2 genótipos para o experimento II, ambos com 4 repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), testes F e Tukey a 5% de probabilidade. No experimento I as plantas controle foram mantidas, durante todo o período experimental, irrigadas próximo à capacidade de campo (-7,4 a -9,8 kPa), as demais plantas foram mantidas sob deficiência hídrica, com faixa entre -98,6 e -33,5 kPa. Pôde-se observar que, o potencial hídrico foliar (Ψw) não apresentou diferença significativa (p<0,05) entre os genótipos bem como entre os tratamentos. Foram observados incrementos nos conteúdos de prolina e açúcares solúveis totais quando submetidos ao déficit hídrico. Não houve alterações no conteúdo de K+ entre genótipos, bem como nos tratamentos. Em relação ao ABA, as folhas apresentaram uma menor concentração quando comparadas às raízes, foram observadas também diferenças significativas entre os genótipos bem como para os tratamentos na concentração do ABA. No experimento II as plantas controle foram mantidas, durante todo o período experimental, irrigadas próximo à capacidade de campo (-8,9 a -33,1 kPa), as plantas submetidas à seca moderada, com faixa entre -49,5 a -409,2 kPa e as plantas submetidas à seca severa entre -59,48 e -1465,19 kPa. Houve diferença significativa entre os tratamentos para as variáveis fisiológicas aos 55 dias após a imposição do tratamento (DAIT), o mesmo não aconteceu aos 6 dias após a reidratação (DAR). Não foram observadas diferenças no conteúdo de prolina, açúcares solúveis totais e K+ aos 55 DAIT, bem como aos 6 DAR. Em ambos os experimentos durante a fase de estresse, foram verificados um aumento significativo na atividade das enzimas do sistema antioxidativo superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POD) e catalase (CAT) quando as plantas foram submetidas ao déficit hídrico. O genótipo CNPAE 183 apresentou um mecanismo de tolerância mais eficiente através da maior produção de ABA e na atividade de enzimas como a SOD, POD e CAT. Palavras chave: Pinhão manso, relações hídricas, compostos orgânicos, enzimas antioxidantes, ácido abscísico.
ix
SILVA, Leandro Dias da, M.Sc. Universidade Estadual de Santa Cruz, fevereiro de 2013. Physiological and Biochemical Changes in genotypes of Jatropha curcas L. subjected to water deficit. Advisor: Fábio Pinto Gomes. Coadvisor: Alex-Alan de Almeida Furtado e Márcio Gilberto Cardoso da Costa
ABSTRACT
Jatropha curcas L. belonging to the family Euphorbiaceae, is a perennial plant and is in the process of domestication. Part of the interest in the cultivation of this species is related to the use of a seed that has oil content between 35 and 40%. Aiming to evaluate the ability of osmotic adjustment, compatible solutes and enzyme mechanisms related to different genotypes of Jatropha curcas L. under water deficit, two experiments were conducted in a greenhouse on the campus of the Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC, Ilhéus, Bahia. At 15 days after seeding (DAS) was held thinning leaving only one plant per pot and the water stress treatment was initiated for a period of 110 days in both experiments. The experiments were conducted in a completely randomized design (DIC) in factorial, with 2 water conditions x 3 genotypes for the experiment I, and 3 water conditions x 2 genotypes for the experiment II, both with 4 repetitions. Data were subjected to analysis of variance (ANOVA), tests F and Tukey at 5% probability. In experiment I control plants were maintained throughout the experimental period, irrigated close to field capacity (-7.4 to -9.8 kPa), the remaining plants were kept under water stress, ranging between -98.6 and -33.5 kPa. It was observed that the leaf water potential (Ψw) showed no significant difference (p <0.05) between genotypes and between treatments. An increase was observed in the contents of proline and total soluble sugars when subjected to water deficit. There were no changes in the K+ content of between genotypes as well as in treatment. Regarding the ABA sheets had a lower concentration when compared to the roots, were also observed significant differences between genotypes and for the concentration of ABA treatments. In experiment II control plants were maintained throughout the experimental period, irrigated close to field capacity (-8.9 to -33.1 kPa), plants subjected to moderate drought, ranging from -49.5 to -409.2 kPa and plants subjected to severe drought between -59.48 and -1465,19 kPa. There were significant differences among treatments for physiological variables, 55 days after the imposition of treatment (DAIT), the same did not happen at 6 days after rehydration (DAR). No differences were observed in proline content, soluble sugars and K+ at 55 AITD, as well as at 6 DAR. In both experiments during the stress phase, were observed a significant increase in the activity of enzymes of the antioxidant superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) when plants were subjected to water deficit. The CNPAE 183 genotype showed a tolerance mechanism more efficient through increased production of ABA and activity of enzymes such as SOD, POD and CAT. Keywords: Physic nut, water relations, organic compounds, antioxidant enzymes, abscisic acid
1
1. INTRODUÇÃO
Com a crescente preocupação com as questões ambientais, em especial o
aquecimento global, surgem os bicombustíveis como uma alternativa de fontes
renováveis, seguras e não poluentes, onde apresentam vantagens em relação aos
óleos petrolíferos, por apresentarem uma menor emissão de dióxido de carbono
(CO2). Biocombustíveis são derivados de biomassa renovável que podem substituir,
parcial ou totalmente combustível de petróleo e gás natural em motores à
combustão ou em outro tipo de geração de energia (ANP, 2012).
O Brasil apresenta potencial para produção de biocombustíveis em grande
parte de sua extensão territorial. Suas características edafoclimáticas,
biodiversidade, disponibilidade de área e de mão-de-obra, bem como comprovada
competência técnica no campo da ciência agrícola contribuem para esta condição
(DIAS et al., 2008).
Dentre as espécies vegetais produtoras de sementes oleaginosas com grande
potencial para a produção de biodiesel, o pinhão manso (Jatropha curcas L.) vem se
destacando nos últimos anos. É uma espécie que apresenta alto teor de óleo (DIAS
et al., 2007), desenvolvimento em áreas de baixa pluviosidade (MAES et al., 2009) e
não apresenta competição com o setor alimentício (POMPELLI et al., 2011)
Jatropha curcas L., pertencente à família Euforbiaceae, com centro de
diversidade presumível no México, presente em regiões tropicais é uma espécie
perene de porte arbóreo-arbustivo, de crescimento rápido, apresenta frutos do tipo
trilocular, carnudo, indeiscente, contendo uma semente em cada lóculo. O teor de
óleo nas sementes, que é facilmente convertido em biocombustível, varia de 33 a
38% (DIAS et al., 2007; HELLER, 1996).
Apesar de muitos trabalhos trazerem uma abordagem mais clássica ao
problema do déficit hídrico (experimentos de campo), um grande número de
publicações enfatiza a importância de estudos abordando a fisiologia, a bioquímica,
2
a capacidade de ajustamento osmótico, os aspectos moleculares e a natureza
envolvidos na resposta da planta a tal estresse abiótico (COSTA et al., 2007;
PÉREZ-PEREZ et al., 2007; SAYAR et al., 2008).
A água é o elemento mais abundante da crosta da Terra, tendo grande
importância para as plantas sendo responsável pela dissolução e transporte de íons
e moléculas influenciando na estrutura de proteínas, ácidos nucléicos,
polissacarídeos e outros constituintes da membrana celular. Promove um ambiente
no qual ocorre à maioria das reações celulares e participa diretamente em muitas
reações bioquímicas (TAIZ; ZEIGER, 2009).
O déficit hídrico determinou o ajustamento osmótico em muitas espécies
(CHIMENTI et al., 2006). A capacidade de ajuste osmótico e a natureza de solutos
que mais contribuem para esse ajuste é significativamente diferente entre espécies,
cultivares e variedades (BAJJI et al., 2001). Estes solutos podem ser sintetizados no
vacúolo ou no citosol. Possuem função osmoprotetora, o que mantém o equilíbrio
hídrico e preserva a integridade celular de proteínas, enzimas e membranas, para a
continuidade das atividades vitais. Constitui uma das estratégias adaptativas
vegetais aos múltiplos efeitos causados pelos estresses (ABDUL JALEEL et al.,
2007).
Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a
capacidade de ajustamento osmótico, solutos compatíveis e mecanismos
enzimáticos relacionados em diferentes genótipos de J. curcas L. com o intuito de
verificar o grau de tolerância desses materiais ao déficit hídrico.
3
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. Jatropha curcas L.
Jatropha curcas L., conhecido popularmente como pinhão-manso pertence à
família das Euforbiáceas, que compreende cerca de 8000 espécies (Figura 1). Assim
como Manihot esculentae Crantz, Ricinus communis L. e a Hevea brasiliensis Willd
ex Adr. de Juss. Muell. Arg., J. curcas é de porte arbóreo-arbustivo e tem sido
apontada como uma das mais promissoras oleaginosas para a produção de
Biodiesel (ARRUDA et al., 2004; KUMAR; SHARMA, 2008).
Figura 1: Planta de Jatropha curcas L. aos 40 dias.
Fonte: Arquivo pessoal
Embora seja uma planta conhecida e cultivada no continente americano
desde a época pré-colombiana e esteja disseminada em todas as regiões tropicais e
até em algumas áreas temperadas, trata-se de uma espécie em domesticação
(ACHTEN et al., 2010). A viabilidade de cultivo ainda depende do desenvolvimento
de tecnologia agronômica e do cultivo para obtenção de altas produtividades nas
diferentes regiões do Brasil (FREITAS et al., 2011; LAVIOLA et al., 2012).
4
É um arbusto de crescimento rápido, cuja altura podendo atingir até 6 metros,
possuindo cinco raízes, sendo uma central e quatro periféricas, isto é, raízes laterais
desenvolvem-se a partir da raiz central (POMPELLI et al., 2010). Com folhas verdes,
esparsas e brilhantes, largas e alternas, em forma de palma, apresentam floração
monóica na mesma planta, mas com sexo separado, caule liso, de lenho mole e
medula desenvolvida, mas pouco resistente a ventos e com longos canais laticíferos
que se estendem até as raízes, nos quais circulam o látex (ARRUDA et al., 2004). A
primeira inflorescência é cimeira, seu tronco é dividido desde a base, em compridos
ramos, com numerosas cicatrizes produzidas pela abscisão das folhas na estação
seca, que ressurgem após as primeiras chuvas (SATURNINO et al., 2005).
Os frutos maduros apresentam o epicarpo com coloração externa marrom-
escura e os frutos secos apresentam o epicarpo de coloração preta e em fase de
deiscência, mesocarpo seco e sementes de coloração preta, com presença de
estrias (NUNES et al., 2008). O fruto é capsular ovóide com diâmetro de 1,5 a 3,0
cm, é trilocular com uma semente em cada cavidade, formado por um pericarpo e
lenhosa, indeiscente, inicialmente verde, passando a amarelo, castanho e por fim
preto, quando atinge o estádio de maturação, contém de 53 a 62% de sementes e
de 38 a 47% de casca (DIAS et al., 2007; MAES et al., 2009).
Além disso, o pinhão-manso cresce e se desenvolve bem em solos de baixa
fertilidade, mas deve preferencialmente ser cultivado em solos profundos, bem
estruturados e pouco compactados, para que o sistema radicular possa se
desenvolver adequadamente, explorando um maior volume de nutrientes no solo
(ARRUDA et al. 2004). Assim, o pinhão-manso produz, no mínimo, duas toneladas
de óleo/hectare ano-1, apresentando rendimento de 4 a 5 kg de frutos por planta e
teor de óleo na semente de 35% a 40% (CARNIELLI , 2003). Segundo Severino et
al. (2007) o pinhão manso desenvolve-se sob condições climáticas diversas, desde
regiões tropicais muito secas às úmidas, tolerando precipitações pluviométricas
entre 600 e 1.500 mm ano-1.
No Brasil, com o advento do Programa Brasileiro de Biodiesel e o surgimento
de grande demanda por óleos vegetais, o pinhão-manso tem sido divulgado como
uma alternativa para fornecimento de matéria-prima. Esta escolha se baseia na
expectativa de que a planta tenha baixo custo de produção e seja resistente ao
estresse hídrico, o que seria uma vantagem significativa principalmente na região
5
semi-árida do país (BELTRÃO et al., 2006). No entanto, os plantios comerciais ainda
estão em fase inicial de implantação e domesticação de espécies. Espera-se que a
cultura deixe de ser um potencial e passe a ser efetivamente uma matéria-prima
para o mercado de biodiesel brasileiro (ANDRÉO-SOUZA et al., 2010).
2.2. Deficiência hídrica
As plantas cultivadas estão constantemente sujeitas a vários fatores abióticos,
os quais podem causar algum tipo de estresse ambiental. O estresse é considerado
um desvio significativo das condições ótimas para a vida, que induz mudanças e
respostas nos níveis funcionais dos organismos, as quais são reversíveis a princípio,
podendo se tornar permanente (LARCHER, 2006).
Dentre os diversos fatores abióticos limitantes ao desenvolvimento das
culturas, a água é considerada como o fator mais restritivo. Em situações de déficit
hídrico, as plantas têm seus processos metabólicos alterados. Após a estagnação
do crescimento da parte aérea devido ao estresse, ocorre uma consequente
diminuição na demanda de fotoassimilados, que podem ser alocados na parte
subterrânea, favorecendo o crescimento de raízes na busca de locais mais úmidos
do solo (TAIZ; ZEIGER, 2009).
O déficit hídrico afeta diversos processos fisiológicos das plantas, geralmente
aumentando a resistência estomática, reduzindo a transpiração e,
consequentemente o suprimento de CO2 para a realização do processo de
fotossíntese, bem como alterando a produção de ácido abscísico (ABA), a abscisão
foliar e as características osmóticas das plantas (GOMES; PRADO, 2007). Déficit
hídrico moderado tende a reduzir primeiramente a condutância estomática (gs) antes
de reduzir a taxa fotossintética. Assim, é possível que a planta assimile mais
moléculas de CO2 para cada unidade de água transpirada, sendo mais eficiente na
utilização da água disponível (TAIZ; ZEIGER, 2009).
Segundo Nogueira et al. (2005), os vegetais respondem aos efeitos causados
pela deficiência hídrica por meio de vários processos adaptativos complexos.
Quando submetidas à deficiência hídrica, as plantas apresentam inibição no
crescimento; alteração na razão raiz e parte aérea, promovendo aumento na
alocação de biomassa para as raízes em detrimento da parte aérea (BARGALI;
6
TEWARI, 2004); modificações na área e comprimento do sistema radicular, para
explorar um maior volume de solo (TAIZ; ZEIGER, 2009) e melhorar a absorção de
água e nutrientes (GUO et. al., 2010; KOZLOWSKI; PALLARDY, 2002). Algumas
espécies reduzem o potencial hídrico interno das suas células através do acúmulo
de solutos compatíveis que favorecem a absorção de água do solo, ou
simplesmente fecham os estômatos nos horários de maior demanda evaporativa
para manter o equilíbrio hídrico dentro da célula (NOGUEIRA et. al., 2005;
PIMENTEL, 2004).
2.3. Ajustamento osmótico e acúmulo de solutos compatíveis
O ajustamento osmótico (AO) é definido como a diminuição do potencial
hídrico (Ψw) da planta devido ao acúmulo líquido de solutos em resposta ao estresse
hídrico, servindo como um mecanismo de tolerância à seca em várias espécies
vegetais (BLUM, 1989; CHIMENTI et al., 2002; ZHANG et al., 2001; WANG et al.,
2003). Tem sido frequentemente sugerido que o objetivo do AO é a manutenção do
crescimento devido à capacidade de manter o turgor em baixos potenciais osmóticos
externos (MARTINEZ et al., 2004). O AO permite a absorção de água, crescimento
de plantas e expansão da turgescência foliar durante o estresse hídrico, associado à
abertura parcial dos estômatos, permitindo a assimilação de CO2 em baixos
potenciais de água, que são de outra maneira inibitória (ALVES; SETTER, 2004).
Para avaliar o grau de deficiência hídrica de uma planta, é comum utilizar
variáveis que possam ser medidas em folhas, como o teor relativo de água e o
potencial hídrico foliar, sendo este último o mais utilizado em estudos fisiológicos
(ANGELOCCI, 2002). O teor relativo de água (TRA) é um dos indicadores das
relações hídricas das plantas, que corresponde à quantidade de água no tecido,
num dado instante, comparando com a máxima quantidade de água que ele poderá
reter (CAIRO, 1995). O potencial hídrico foliar (Ψw), por sua vez, corresponde ao
estado de energia da água nas plantas, o qual é mensurado por uma metodologia
descrita por Scholander et al. (1965). O Ψw, em plantas sob efeito da deficiência
hídrica, tende a decrescer, seja pela desidratação dos tecidos ou pela hidrólise dos
compostos de reserva (CAIRO,1995). Entretanto, com a diminuição da
disponibilidade de água no solo, a planta responde osmoticamente com o aumento
7
dos teores de alguns solutos orgânicos, visando ajustar-se ao ambiente com
deficiência hídrica.
Apesar de ser considerado um importante mecanismo de tolerância ao déficit
hídrico, o AO pode não favorecer ao aumento da produtividade das plantas, mas
possibilita a continuação do desenvolvimento em condições de estresse (SERRAJ;
SINCLAIR, 2002). O aumento na concentração de compostos orgânicos solúveis no
citoplasma de plantas cultivadas e submetidas ao déficit hídrico tem sido
considerado como um mecanismo utilizado pelas plantas para balancear os
potenciais osmóticos entre o citoplasma e o vacúolo, evitando danos aos sistemas
enzimáticos (MUNNS, 2002). Silva et al. (2010) demonstraram que plantas jovens de
Jatropha curcas L. exibiram um ajuste osmótico eficiente em resposta à seca,
acumulando açúcares solúveis como os seus principais osmólitos.
Geralmente metabólitos de baixo peso molecular como a prolina (PEREZ-
PEREZ et al., 2009) e glicina betaína (BAJJI et al., 2001) são comumente
observados como respostas metabólicas de plantas superiores ao déficit hídrico. Do
mesmo modo, as alterações no teor de potássio podem contribuir significativamente
para a osmorregulação (SHABALA; CUIN, 2007) e pode ocorrer em consenso com
as mudanças no conteúdo de açúcares e aminoácidos (PEREZ-PEREZ et al.,
2009). Em alguns casos, no entanto, as alterações no conteúdo de açúcares,
aminoácidos ou ácidos orgânicos não foram acompanhadas por alterações nas
concentrações de potássio (SLAMA et al., 2007).
De um modo geral, a prolina livre está presente em pequenas quantidades
nas plantas, aproximadamente entre 1 a 5 μmol g-1 de massa seca (NOGUEIRA et
al., 2001) e, devido à sua importância no ajustamento osmótico, é o composto mais
estudado em plantas sob estresses abióticos (KAVIKISHOR et al., 2005). A prolina é
considerada osmólito-chave para o AO de plantas sob estresses abióticos, atuando
como soluto compatível acumulando-se nas células, com função osmoprotetora
(GIANNAKOULA et al., 2008; SHARMA; DUBEY, 2005). Ocorre assim, a proteção
das membranas contra os efeitos deletérios causados pelas espécies reativas de
oxigênio (EROs), prevenindo a desnaturação de proteínas, preservando a estrutura
de enzimas (SHARMA; DUBEY, 2005). Age ainda como tampão para regular o
potencial redox celular (ASHRAF; FOOLAD, 2007) e inibe a agregação de proteínas
(SRINIVAS; BALASUBRAMANIAN, 1995).
8
A síntese de prolina e sua degradação mostra-se ser altamente
correlacionada com o ambiente osmótico. Contudo em algumas espécies vegetais, o
acúmulo de prolina não está relacionado diretamente com a tolerância ao estresse
salino. Apenas é resultado de distúrbios generalizados no metabolismo de
aminoácidos associado com o aumento do catabolismo de proteínas, a senescência
induzida pela salinidade ou outros distúrbios metabólicos provocados pelo sal
(LUTTS et al., 1999; ROCHA, 2003; SILVEIRA et al., 2003).
O aumento nos teores de prolina pode ativar várias funções celulares: reserva
de carbono e nitrogênio utilizado no crescimento para restabelecimento após
estresse; desintoxicação do excesso de amônia; estabilizador de proteínas e
membranas; e eliminadores de radicais livres (KAVIKISHOR et al., 2005). Evidências
mostram que a biossíntese desse aminoácido pode estar associada à regulação do
pH citosólico ou mediação do incremento da razão NADP+/NADPH, influenciando o
fluxo de carbono devido à via oxidativa da pentose fosfato, podendo ainda ser
induzida pelo aumento de poliaminas, arginina, ornitina, e, desta maneira, alterar o
metabolismo de aminoácidos sob estresse (SILVEIRA et al., 2002).
O acúmulo de açúcares solúveis em plantas em resposta ao estresse hídrico
é bem documentado, tendo importante papel no ajustamento osmótico (BAJJI et al.,
2001; HARE et al., 1998). Uma forte correlação entre o acúmulo de açúcares e a
tolerância ao estresse osmótico também é extensamente relatada em plantas
(STREETER et al., 2001; TAJI et al., 2002). Diversos estudos fisiológicos sugerem
que existe uma correlação entre hidratos de carbono mono estruturais e condições
de déficit hídrico, sugerem, ainda, que estes se acumulam embora o grau de
concentração varie em diferentes espécies de plantas (PHILLIPS et al., 2002).
Entretanto, é consenso que o aumento das concentrações de açúcares resulta,
maioria das vezes, da hidrólise do amido, que requer atividade de enzimas
hidrolíticas. As plantas recuperadas do estresse e as sementes de muitas plantas
superiores são exemplos de relação positiva entre acúmulo de hidratos de carbono,
principalmente sacarose, e resposta de tolerância ao estresse (HOEKSTRA et al.,
2001).
O potássio (K+) é um dos nutrientes minerais mais requeridos pelas plantas
em grandes quantidades, sendo, assim, o cátion mais abundante nas células
vegetais (LEBAUDY et al., 2007). Entretanto, a distribuição desse nutriente nos
9
diferentes órgãos das plantas é uniforme, uma vez que o conteúdo de K+ nas raízes
e caules muitas vezes é inferior ao encontrado nas folhas (CABOT et al., 2005).
As funções biológicas desempenhadas pelo K+ nas plantas envolvem
processos celulares e fisiológicos diversos. Nessas células, este elemento atua na
manutenção do potencial da membrana plasmática, no balanço das cargas
negativas do citosol e na manutenção da pressão osmótica do vacúolo (LEBAUDY
et al., 2007). Além disso, diversas enzimas da fotossíntese, da respiração, e da
biossíntese de proteínas dependem do K+ como cofator (GIERTH et al., 2007).
Alguns trabalhos mostram que alterações no conteúdo de açúcares, aminoácidos ou
ácidos orgânicos não foram acompanhados por mudanças nas concentrações de
potássio (SLAMA et al., 2007). Considerando a planta completa, a acumulação de K+
nos elementos de vaso do xilema mantém a pressão radicular que movimenta a
seiva das raízes para as folhas na ausência da transpiração. Outros movimentos
também dependem do K+, como os tropismos, nastismos, e movimentos dos
estômatos (LEBAUDY et al., 2007).
2.4. Enzimas antioxidantes
O sistema de defesa antioxidativo enzimático das plantas inclui diversas
enzimas antioxidantes nos diferentes compartimentos celulares. Dentre as principais
enzimas são citadas as peroxidases (POD; EC 1.11.1.1), a superóxido dismutase
(SOD; EC 1.15.1.1) e a catalase (CAT; EC 1.11.1.6) que juntamente com outras
enzimas, protegem as células dos efeitos tóxicos das espécies reativas de oxigênio
(EROs) (CAVALCANTI et al., 2004). A SOD é considerada a primeira barreira
enzimática contra o estresse oxidativo, atuando na dismutação do radical
superóxido, transformando em peróxido de hidrogênio e oxigênio (O2•− → H2O2 + O2)
(BLOKHINA et al., 2003; GRATÃO et al., 2005). O produto da dismutação do
superóxido pela SOD, o H2O2, deve ser removido da célula a fim de evitar sua
conversão em radicais mais reativos, como o OH− (PERL-TREVES; PERL, 2002).
SODs são classificadas em 4 tipos, baseado no seu cofator metal: Fe-SOD
(cloroplasmático), Mn-SOD (mitocondrial), Cu/Zn-SOD (cloroplasmático,
peroxissomos e citosol) e Ni-SOD (cloroplasmático). A atividade de isoenzimas da
SOD pode ser detectada através de coloração negativa e identificada com base na
10
sua sensibilidade à KCN e H2O2. A Mn-SOD é resistente a ambos os inibidores;
Cu/Zn-SOD é sensível a ambos os inibidores ao passo que, Fe-SOD é resistente a
KCN e sensível a H2O2 (GILL; TUTEJA, 2010; KARUPPANAPANDIAN et al ., 2011).
As PODs oxidam compostos fenólicos somente na presença de H2O2. Sua
detecção, por espectrofotometria, é baseada na oxidação de guaiacol + água
oxigenada gerando diferentes graus de coloração. O complexo peroxidase –
peróxido é baseado na oxidação do substrato incolor utilizado (guaiacol - H2O2);
gerando um produto final colorido (tetraguaiacol) (ARAÚJO, 2004). PODs estão
presentes na parede celular ou vacúolo. PODs do apoplasto ligam-se com polímeros
da parede celular. São enzimas que participam de diferentes processos fisiológicos,
como na via de biossíntese de lignina e em mecanismos de defesa contra estresses
bióticos e abióticos (GILL; TUTEJA, 2010; KARUPPANAPANDIAN et al, 2011).
A CAT é uma enzima que catalisa reações de dismutação do H2O2 em H2O e
O2 e atua na eliminação das EROs durante condições de estresse. CAT apresenta
uma das maiores taxas de recuperação de todas as enzimas, sendo capaz de
converter aproximadamente 6 000.000 (seis milhões) de moléculas de H2O2 em H2O
e O2 por minuto (GILL; TUTEJA, 2010). A CAT é tem uma importante função na
remoção de H2O2 gerado em peroxissomos durante a β-oxidação de ácidos graxos,
fotorrespiração e catabolismo da purina (GILL; TUTEJA, 2010;
KARUPPANAPANDIAN et al., 2011).
2.5. Ácido Abscísico (ABA)
O ABA pertence ao grupo dos fitormônios que são, estruturalmente, pequenas
moléculas independentes e fundamentais na integração de respostas da planta a
diversos estímulos ambientais. Atuam na regulação de mecanismos fisiológicos,
bioquímicos e moleculares, sendo como um mensageiro endógeno nas respostas ao
estresse (CHRISTMANN et al., 2006). Essa complexidade é refletida pela
contribuição da síntese, transporte e vias de sinalização dos hormônios e pela
diversidade de interações para controlar o crescimento vegetativo (TAIZ; ZEIGER,
2009).
Quando as plantas são submetidas à deficiência hídrica no solo, há
alterações na concentração de ABA em nível celular e um incremento na síntese de
11
ABA nas raízes (WILKINSON; DAVIES, 2002). Ao ser transportado para a parte
aérea, ABA estimula uma série de alterações na planta: (i) induz o fechamento dos
estômatos; (ii) reduz a perda de água da planta por transpiração; (iii) inibe o
crescimento da parte aérea; (iv) aumenta o comprimento ou área das raízes, em
busca de água em regiões mais profundas do solo; (v) regula a expressão gênica
nas vias dependentes de ABA;(vi) despolarização das células-guarda e (vii) efluxo
de K+ (BLATT, 2000; MACROBBIE, 2000; SCHROEDER et al., 2001).
12
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material vegetal e condições de cultivo Foram conduzidos dois experimentos em casa de vegetação, no campus da
Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), localizada em Ilhéus, BA (14°47'00"
S, 39°02'00" W). O primeiro, no período entre 04/07/2011 a 14/11/2011 e o segundo
entre 14/06/2012 a 01 /10 /2012.
Sementes de Jatropha curcas L., dos genótipos CNPAE 126, 137, 139, 183 e
191 oriundas do banco de germoplasma da Embrapa Agroenergia - DF, foram
colocadas para germinar em vasos (seis por vaso), contendo 50 L de uma mistura
solo:areia (2:1), previamente preparado segundo análise química do substrato. Após
15 dias da germinação realizou-se o desbaste, deixando apenas uma planta por
vaso. Imediatamente os vasos foram cobertos com papel alumínio para evitar a
evaporação e o aquecimento do solo, iniciando assim, o tratamento de deficiência
hídrica, sendo mantido por um período de 110 dias em ambos os experimentos. No
experimento I os tratamentos consistiram em dois regimes hídricos medidos em
percentagem de capacidade de campo (CC): plantas controle (100% da CC) e
plantas submetidas à deficiência hídrica (70% da CC) e três genótipos (CNPAE 126,
137 e 139). Durante o experimento I as plantas controle foram mantidas, todo o
período experimental, irrigadas próximo à capacidade de campo (-7,4 a -9,8 kPa), as
demais plantas foram mantidas sob deficiência hídrica, com faixa entre -98,6 e -33,5
kPa. Durante o experimento II os tratamentos consistiram em três regimes hídricos:
plantas controle (100% da CC), seca moderada (60% da CC) e seca severa (corte
total da irrigação) e dois genótipos (CNPAE 183 e 191). As plantas controle foram
mantidas, durante todo o período experimental, irrigadas próximo à capacidade de
campo (-8,9 a -33,1 kPa), as plantas submetidas à seca moderada ficaram em torno
de -49,5 a -409,2 kPa e as plantas submetidas à seca severa entre -59,48 e -
1465,19 kPa.
3.2 . Microclima
Durante os experimentos, a radiação fotossinteticamente ativa (RFA) foi
monitorada por meio de sensores quânticos S-LIA-M003, a temperatura e umidade
13
relativa do ar foram monitoradas utilizando-se sensores microprocessados Hobo H8
Pro Series (Onset, USA). Essas variáveis foram medidas e armazenadas
permanentemente por coletores de dados Hobo Micro Station Data Logger (Onset,
USA).
3.3 Relações Hídricas
Para a determinação do potencial osmótico (Ψs) foram coletados cinco discos
foliares (5 mm de diâmetro) do terço médio da parte aérea da planta. Foi utilizado o
psicrômetro de termopar (Câmara C-52, Wescor), conectados a um microvoltímetro
de ponto de orvalho (Psy-PRO, Wescor, Logan, USA). Os discos foliares foram
congelados em nitrogênio líquido, e após descongelamento e estabilização da
temperatura foram colocados na câmara para a obtenção das leituras do Ψs (Figura
2A). Os valores de Ψs foram corrigidos pelo método de Wilson et al. (1979) e o
ajustamento osmótico pela diferença no Ψs entre plantas com e sem estresse.
Foram avaliados semanalmente o potencial hídrico foliar (Ψw) antes do
amanhecer às 4:00 h e ao meio dia. Utilizou-se a câmara de pressão 1000 (PMS
Instrument Company, EUA), segundo a metodologia de Scholander et al. (1965) com
algumas modificações. Logo após a colocação da folha no cilindro, utilizou-se
algodão levemente pressionando no local da incisão, para extrair o excesso de látex.
Posteriormente, foi injetado o gás no cilindro para induzir a saída da seiva e registrar
a pressão exercida para essa saída (Figura 2B).
Figura 2: (A) Psicrômetro (câmara C-52, Wescor) conectado ao microvoltímetro (Psy-PRO, Wescor, Logan, USA) utilizado para determinar o Ψs e (B) Câmara de pressão utilizada na determinação do Ψw. Fonte: Arquivo pessoal.
(A) (B)
14
O teor relativo de água (TRA) foi medido somente no experimento II, em
folhas maduras que foram coletadas e imediatamente pesadas (P1), depois
colocadas para hidratar no escuro por 24 horas. Foram, então, novamente pesadas
(P2) e colocadas em estufa de ventilação forçada de ar a 75 oC por 48 h para a
obtenção do peso da matéria seca (P3). O TRA foi calculado como: [TRA = ((P1-
P3)/(P2-P3))x100]. As medições foram realizadas sempre às 8 h.
3.4 . Determinações bioquímicas
Foram coletadas amostras de folhas, retiradas da terceira folha
completamente expandida e madura que, imediatamente, foram congeladas em
nitrogênio líquido, liofilizadas e armazenadas em freezer (-20 °C) para a
quantificação de solutos orgânico, inorgânico e atividade enzimática. Essas
determinações foram realizadas em ambos os experimentos bioquímicos.
3.4.1. Prolina
Foram analisados, nos tecidos foliares, os teores de prolina pelo método da
ninhidrina ácida (BATES et al., 1973). Aproximadamente 50 mg de tecido foliar
previamente macerados em nitrogênio líquido foram homogeneizados em 6 mL de
ácido sulfossalicílico 3 % (p/v). Após centrifugação (8.000 g) por 10 min, coletou-se 2
mL do extrato, nos quais se adicionou mais 2 mL de solução ácida de ninhidrina
(1,25 g de ninhidrina; 30 mL de ácido acético glacial; 20 mL de ácido fosfórico 6 M) e
2 mL de ácido acético glacial. As amostras foram incubadas a 100 ºC por 1 h e em
seguida colocadas em gelo para finalizar a reação. Foram adicionados na solução 2
mL de tolueno, seguindo de agitação por 20 s para a completa extração da prolina.
Após o repouso, a parte menos densa (cromóforo) foi aspirada com uma pipeta
Pasteur para a leitura em espectrofotômetro a 520 ƞm, utilizando-se o tolueno como
branco. As absorbâncias foram comparadas à curva-padrão de prolina (0 a 100 μg
mL-1) e as análises realizadas em quadriplicata, com os resultados obtidos
expressos em micromol de prolina por grama de massa seca (μmol g MS-1).
3.4.2. Açúcares solúveis totais
15
A quantificação dos açúcares solúveis totais (AST) foi realizada de acordo
com a metodologia de Clegg et al. (1956). Foram extraídos homogeneizando-se 100
mg do material liofilizado com 5 mL de etanol a 80 % fervente, seguido de agitação e
subsequente repouso por 5 minutos. Foram adicionados mais 5 mL do etanol,
centrifugando por 10 minutos a 5.000 g. O sobrenadante foi transferido para um
balão volumétrico com capacidade para 50 mL e o resíduo lavado com soluções
etanólica e centrifugado mais três vezes. Os sobrenadantes foram combinados e o
volume completado para 25 mL com solução etanólica 80 %. Posteriormente, os
extratos foram despigmentados com clorofórmio e evaporados em placa de
aquecimento a 60 ºC. O resíduo resultante foi dissolvido em 5 mL de água destilada.
Desse extrato alíquotas foram separadas para a quantificação dos açúcares solúveis
totais, sendo feitas leituras de absorbância em 490 ƞm em espectrofotômetro,
utilizando-se como padrão a glicose e água como branco, usando-se o mesmo
volume que o extrato.
3.4.3 Potássio
O osmólito inorgânico K+, foi determinado de acordo coma metodologia
descrita por Viégas et al. (2001). Utilizou-se 50mg do material moído onde foi
submetido à digestão nitroperclórica aquecidos gradualmente até 250°C. O extrato
foi diluído em água na proporção de 1:5. A determinação foi realizada por fotometria
de chama (Fotômetro de chama B462 Micronal).
3.5. Atividades Enzimáticas
3.5.1. Peroxidases (POD; EC 1.11.1.1)
A atividade da POD foi determinada de acordo com o método de Rehem et al.
(2011). Utilizou-se 200 mg de amostra foliar macerada em nitrogênio líquido,
adicionando tampão fosfato (50 mmol L-1, pH 6,0), com posterior ultrasonicação (8
pulsos de 10 s cada, amplitude de 70 - 80 %, com 10 s de intervalo) em processador
ultrassônico (Ultrasonic processor Gex 130, 130 W) em gelo até o rompimento dos
tecidos, Logo após centrifugou-se as amostras por 10 min a 15.000 g.
Foram utilizadas microplacas com 96 poços com capacidade para 300 µL,
contendo 140 µL de tampão de reação POD 2x [40 mmol L-1 de guaiacol, H2O2 a
16
0,06% e fosfato de sódio (20 mmol L-1, pH 6,0)],139 µL de tampão fosfato (50 mmol
L-1, pH 6,0) e 1 µL de extrato enzimático, previamente diluído. A variação da
absorbância a 470 ƞm foi monitorada durante 60 s de reação a 25 °C, em
espectrofotômetro leitor de microplacas (VERSAmax). A atividade de peroxidases foi
expressa com o aumento do consumo de guaiacol em µmol s-1 g -1 de biomassa
liofilizada. A conversão dos dados obtidos em valores de absorvância a 470 ƞm min-1
g-1 de matéria seca para consumo de guaiacol em mmol h-1 g-1 de matéria seca foi
feita com o uso da equação y=0,1284x + 0,0189 (R2=0,99), originada a partir de uma
curva padrão para POD-guaiacol.
3.5.2. Superóxido dismutase (SOD; EC 1.15.1.1)
Neste ensaio, uma unidade de atividade enzimática (UA) de SOD é
considerada como a quantidade de enzima necessária para obter 50 % de inibição
da redução do nitro azul de tetrazólio (NBT) pela SOD contida no extrato enzimático.
Alíquotas de 100 μL da extração enzimática foram então transferidas para tubos de
ensaios protegidos da luz, contendo tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,8, 0,1
mM de EDTA, 13 mM de L-metionina e 75 μM de NBT. A reação foi iniciada pela
adição de 2 μM de Riboflavina e a concomitante transferência dos tubos para uma
câmara iluminada por uma lâmpada fluorescente circular de 30 Watts, durante um
período de 15 min. Em seguida, leituras de absorbância a 560 ηm foram realizadas
em espectrofotômetro. Foram considerados como brancos da reação, os tubos sem
extrato, expostos e não expostos à luz. A atividade foi determinada pelo cálculo da
quantidade de extrato que inibiu 50 % da redução de NBT (BEAUCHAMP;
FRIDOVICH, 1971) e expressa em UA kg-1 MS.
3.5.3. Catalase (CAT; EC 1.11.1.6)
A atividade da enzima CAT foi determinada de acordo com a metodologia
descrita por Madhusudhan et al. (2003), cuja atividade é definida pela quantidade de
enzima necessária para catalisar a decomposição do H2O2. Para o ensaio,
adicionou-se, em 20 μL do extrato enzimático, 0,98 mL de tampão fosfato de sódio
0,05 M pH 7,0, H2O2 0,0125 M suplementado com peróxido de hidrogênio a uma
concentração final de 12,5 mM. As leituras foram realizadas em cubetas de quartzo
17
com a reação iniciada pela adição de 20 μL de extrato bruto. A atividade de CAT foi
determinada pela medição na redução da absorvância das amostras a 240 ηm,
consequência do consumo de H2O2, usando-se o coeficiente de extinção molar de
36 M-1 cm-1.
3.6. Ácido abscísico (ABA)
A extração de ABA foi feita segundo método descrito por Kato et al. (2006).
Amostras de 400 mg de folhas e raízes foram maceradas em nitrogênio líquido, e
ressuspendido em 1,5 mL de acetona 80 % (v/v), contendo 100 mg L-1 de BHT
(hidroxidotolueno butilado) e 100 mg L-1 BHA (hidroxianisol butilado). A purificação
baseou-se na utilização de uma alíquota do extrato (750 μL), com adição de tampão
TBS (tampão tris salino), pH 7,5, até volume final de 5,0 mL. Este tampão contém:
6,0 g de TRIS (hidroximetil amino metano); 0,2 g de MgCl2; 8,8 g de NaCl; 0,1 g de
NaN3 (azida sódica) e 0,5 mL de TWEEN 20 para cada litro. O pH foi ajustado para
7,5 com HCl concentrado. A amostra foi centrifugada por 10 minutos, a 10.000 g e
filtradas em membranas de nylon (0,22 μm). A quantificação do ABA nos extratos foi
feita através do teste ELISA, usando kit comercial (Phytodetek® ABA Test Kit), de
acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida procedeu-se a leitura da
densidade ótica (OD) através de espectrofotômetro leitor de microplacas (Biotek,
ELX 800 Instruments, Inc, Winooski, VE, USA) utilizando o comprimento de onda de
405 ƞm.
3.7. Delineamento experimental e análise estatística
O experimento I foi conduzido em um delineamento inteiramente casualizado
em esquema fatorial 2 x 3, formado por dois níveis de disponibilidade hídrica e três
genótipos de J. curcas (CNPAE 126, 137 e 139), com quatro repetições por
tratamento. Já o experimento II foi conduzido em delineamento inteiramente
casualizado em esquema fatorial 3 x 2 formado por três níveis de deficiência hídrica
(controle, seca moderada e seca severa) por dois genótipos (CNPAE 183 e 191)
com quatro repetições. Os resultados foram submetidos ao teste F a 5 % de
significância, por ANOVA fatorial e, quando indicado, a comparações de médias pelo
teste de Tukey no mesmo nível de significância.
18
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Experimento I
4.1. Microclima
Durante o experimento foram feitas medições entre as 06:00 e 18:00 h com
variações na radiação fotossinteticamente ativa (RFA) que teve como valor médio
de 12 ± 0,6 mol de fótons m-2 dia-1. A temperatura (T, ºC) média para o período do
experimento foi de 25 ºC, variando entre 22 e 28 ºC, dentro da casa de vegetação e
a umidade relativa (UR) entre 53 % até 96 %. (Tabela 1).
Tabela 1: Variação na radiação fotossinteticamente ativa (RFA - mol fótons m-2 dia-1), temperatura do ar (T - °C) e umidade relativa (UR - %) dentro da casa de vegetação durante o período experimental. Os valores correspondem à média (erro padrão da média), máximo e o mínimo diário.
4.2. Água no substrato de cultivo
O teor do substrato de cultivo foi mensurado através de pesagens de
amostras desse substrato (método gravimétrico). Na tabela 2, são apresentados os
níveis de umidade do substrato durante os 110 dias em que as plantas foram
submetidas ao tratamento de deficiência hídrica (DH).
Tabela 2: Valores do teor gravimétrico de umidade (%) e potencial mátrico do solo (Ψm, kPa), durante o período experimental (110 dias). Os valores correspondem às médias (erro padrão da média), máximo e mínimo.
Umidade do solo (%) Ψm (-kPa)
Tratamentos Média Máximo Mínimo
Média Máximo Mínimo
Controle 9,75 (0,22) 11,40 8,11 7,92 (0,18) 9,80 9,17
DH 6,32 (0,12) 6,70 5,71 33,47 (7,7) 98,57 50,59
Média Máximo Mínimo
RFA 11,7 (0,63) 24,2 4,7
T 25,1 (0,20) 27,8 22,2
UR 77,1 (1,39) 96,1 52,8
19
A umidade do substrato foi mantida em torno de 9,75 % para as plantas
controle, enquanto que nas plantas sob deficiência hídrica (DH) foram mantidas em
torno de 6,3 %. O potencial mátrico (Ψm) do substrato foi calculado usando a curva
de retenção de água característica para o substrato utilizado (Tabela 2).
4.3. Água na planta
Os genótipos não diferiram significativamente em relação ao Ψw aos 66 dias
após imposição ao tratamento (DAIT). Os valores médios do potencial hídrico foliar
antemanhã (Ψam) variaram entre -0,55±0,05 MPa nas plantas sob DH e -0,47±0,04
MPa nas plantas controle e para o potencial hídrico foliar ao meio dia (Ψmd)
-0,95±0,01 MPa nas plantas sob DH e -0,72±0,06 nas plantas controle (Tabela 3).
Tabela 3: Valores de potencial hídrico antemanhã (Ψam) e ao meio dia (Ψmd) medidos aos 66 dias após a imposição do tratamento (DAIT). Valores médios de 4 a 5 repetições (± erro padrão, n = 4-5).
Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e letras minúsculas comparação entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05).
A não variação do Ψw em plantas de J. curcas pode estar relacionada com a
disponibilidade de água no caule suculento, a qual é redistribuída para evitar a
desidratação dos tecidos. Esse resultado sugere que a presença de caule suculento
em J. curcas é favorável para o fornecimento e retenção de água de modo a adotar
uma tolerância ao déficit hídrico, como demonstrado por Maes et al. (2009).
4.4. Ajustamento osmótico e potencial osmótico
O potencial osmótico (Ψs) nas folhas de J. curcas variou de -2,40±1,26 a
-1,34±0,15 MPa durante o período experimental de 110 dias (Tabela 4). Os valores
(-2,40±1,26 MPa) revelaram que as plantas controle do genótipo CNPAE 126
apresentaram um Ψs menor (mais negativo), não havendo ajuste osmótico para esse
GENÓTIPOS ψam (-MPa)
ψmd (-MPa)
Controle DH
Controle DH
CNPAE 126 0,47±0,04 Aa 0,50±0,08 Aa
0,72±0,06 Aa 0,75±0,09 Aa
CNPAE 137 0,45±0,05 Aa 0,46±0,13 Aa
0,81±0,04 Aa 0,87±0,06 Aa
CNPAE 139 0,46±0,03 Aa 0,55±0,05 Aa
0,75±0,08 Aa 0,95±0,01 Aa
20
genótipo, já que J. curcas durante o experimento I não perdeu muita água na folha
das plantas sob DH. A menor absorção de nutrientes via transpiração levou a um
conteúdo de nutrientes e açúcares menor nas folhas. No entanto, outros estudos
têm indicado que o acúmulo de solutos orgânicos, em condições ambientais
adversas, deve estar mais relacionado a distúrbios metabólicos do que ao
ajustamento osmótico (LUTTS et al., 1999).
Tabela 4: Valores do potencial osmótico (Ψs) e ajustamento osmótico de folhas de Jatropha curcas L. submetidas ao déficit hídrico aos 66 DAIT. Valores médios de 5 repetições (± erro padrão, n = 5).
Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e letras minúsculas comparação entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05)
Houve uma variação no ajuste osmótico em ambos os genótipos CNPAE 137
e 139, com valores de 0,30 e 0,02, respectivamente. O ajustamento osmótico (AO) é
definido como a diminuição do potencial hídrico da planta devido à acumulação
líquida de solutos em resposta ao déficit hídrico, podendo servir como um
mecanismo de tolerância à seca em diversas espécies vegetais (CHIMENTI et al.,
2002; WANG et al., 2003; ZHANG et al., 2001).
4.5. Prolina, açúcares solúveis totais e potássio
Verificou-se que não houve diferença significativa (p<0,05) entre os genótipos
de J. curcas para o conteúdo de prolina durante os 66 dias após imposição ao
tratamento (DAIT). As variações do conteúdo de prolina apresentaram um padrão de
acúmulo em função do déficit hídrico em relação às plantas controle. Já o tratamento
de DH há um acréscimo significativo (58 %) de prolina nas plantas em relação ao
controle (Figura 3A).
GENÓTIPOS Ψs (- MPa) AO
CNPAE 126 Controle 2,40±1,26 Aa
DH 1,60±0,31 Aa -0,80±0,10 b
CNPAE 137
Controle 1,34±0,15 Ba DH 1,64±0,12 Ba 0,30±0,03 a
CNPAE 139
Controle 1,41±0,14 Ba DH 1,43±0,10 Ba 0,02±0,07 a
21
Aa AaAaAa Aa
Aa
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
CNPAE 126 CNPAE 137 CNPAE 139
K+
(g K
g-1
)
Aa
Aa
Aa
Ab
AaAa
0
50
100
150
200
250
300
AS
T (
mg
.g-1
)
Em relação ao controle, o conteúdo de açúcares solúveis totais (AST)
aumentaram devido ao déficit hídrico em 49 %. Observa-se na figura 3B, que o
genótipo CNPAE 126 foi o único que apresentou diferenças significativas (p<0,05)
entre os tratamentos, onde as plantas controle tiveram um maior acúmulo (160 mg
g-1) quando comparadas com as plantas submetidas à DH (94,5 mg g-1).
Não foram observadas diferenças significativas (p<0,05) para o conteúdo de
K+ em folhas de J. curcas (Figura 3C).
Figura 3: Conteúdo de PRO (A), AST (B) e K+ (C) em folhas de Jatropha curcas L. submetidas ao déficit hídrico aos 66 DAIT. As colunas são valores médios (n = 4-5) e as barras representam o erro padrão da média. Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e minúsculas entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05).
(A)
(B)
(C)
22
Em geral, as plantas exibem um aumento no conteúdo de prolina sob
estresse abiótico, como a salinidade, déficit hídrico ou calor (SILVA et al., 2009b
SILVEIRA et al., 2009). A prolina pode desempenhar diferentes papéis em resposta
ao estresse abiótico, tais como a eliminação de radicais livres, protegendo as
estruturas celulares contra danos oxidativo e desnaturação (GIRIJA et al., 2002).
Além disso, a prolina pode também servir como uma fonte de carbono e de
nitrogênio para o crescimento das plantas, após o estresse (SILVEIRA et al., 2003).
A elevação no conteúdo dos AST nas folhas pode estar ligada à indução do
ajustamento osmótico da célula e consequente manutenção do nível de água da
folha (LACERDA et al., 2001). O acúmulo de açúcares solúveis em plantas em
resposta ao estresse hídrico é bem documentada e tendo sido considerado ter um
importante papel no ajustamento osmótico (BAJJI et al., 2001; HARE et al., 1998). O
acúmulo de AST nas folhas de J. curcas dos genótipos CNPAE 137 e 139, ocorreu,
provavelmente, para evitar a perda de água pela célula.
O K+ é conhecido por ser muito solúvel e por desempenhar um papel de
osmorregulador chave em células guarda e também na manutenção do turgor
(SHABALA; CUIN, 2007). Os resultados aqui apresentados estão de acordo com os
obtidos por Patakas et al. (2002), que relatou a importância do K+ no ajuste
osmótico das plantas de videira sob estresse hídrico. Silva et al. (2010), estudando
plantas jovens de pinhão manso submetidas a diferentes regimes hídricos,
observaram que o conteúdo de K+ não foi significativamente alterado nas folhas,
mas o mesmo contribuiu para o ajuste osmótico das plantas em todos os
tratamentos.
4.6. Mecanismos enzimáticos
Foram observadas diferenças significativas entre os genótipos bem como
entre os tratamentos, em relação à SOD. O genótipo CNPAE 137 diferiu dos demais,
apresentando uma menor atividade desta enzima. O maior valor médio encontrado
para o genótipo CNPAE 137 foi no tratamento de DH (0,06 U/kg MS) e o menor no
tratamento controle (0,04 U/kg MS) (Figura 4A).
Houve diferença significativa (p<0,05) na atividade de POD para os genótipos
CNPAE 126, 137 e 139, em relação ao tratamento de DH, onde apresentaram um
23
incremento na atividade de 25 %, 35 % e 2 %, respectivamente, quando
comparadas com o controle (Figura 4B). O genótipo CNPAE 137 apresentou uma
maior atividade no tratamento de DH (0,690 mmol h-1 kg-1 MS), quando comparados
com CNPAE 126 e 139 (0,598 e 0,604 mmol h-1 kg-1 MS), respectivamente.
Para a atividade da CAT, houve diferença significativa (p<0,05) entre os
genótipos, bem como entre os tratamentos. O genótipo CNPAE 126 diferiu dos
demais genótipos, com valor de 0,032 µmol H2O2 kg-1 MS min-1 para o tratamento de
DH e 0,023 µmol H2O2 kg-1 MS min-1 para o controle, havendo um incremento da
CAT de 39 % para o tratamento de DH em relação ao controle.
24
Figura 4: Atividades das enzimas dismutase do superóxido (SOD, A), peroxidase (POD, B) e catalase (CAT, C) em folhas de três genótipos de Jatropha curcas L. submetidas ao déficit hídrico aos 66 DAIT. As colunas são valores médios (n = 4) e as barras representam o erro padrão da média. Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e minúsculas entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05).
Ab
Bb
Ab
Aa
Ba
Aa
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
SO
D (
U/k
g M
S)
CONTROLE DH
AbBb
Bb
Aa
Ba Ba
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
CNPAE 126 CNPAE 137 CNPAE 139
CA
T (μ
mol
H2O
2 k
g-1
MS
min
-1)
Cb
Ab
BbCa
Aa
Ba
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
PO
D (
mm
ol
h-1
kg
-1M
S)
A atividade de uma ou mais enzimas antioxidantes geralmente aumenta em
plantas expostas a condições de estresse e esta atividade correlaciona-se com
aumento da tolerância ao estresse (PILON et al., 2006). Alguns estudos relataram
(A)
(B)
(C)
25
que o déficit hídrico produz estresse oxidativo como consequência do aumento das
EROs e também que muitas plantas são capazes de lidar com este ativando as
enzimas antioxidantes (SIMOVA-STOILOVA et al., 2009).
Nesta pesquisa, o tratamento de DH estimulou um aumento de 56 % em
média na atividade da SOD em relação ao controle em plantas de J. curcas. O
genótipo CNPAE 137 obteve uma menor atividade desta enzima, o que se pode
inferir que os genótipos CNPAE 126 e 139 foram mais eficientes na remoção tóxica
de radicais O2˙¯ (Figura 4A). Vários autores relataram que o déficit hídrico induz o
aumento da regulação da presente enzima (FAÍZE et al., 2011; FRANÇA; PANEK,
2007; PANDEY et al., 2010). Estudando genótipos de Triticum durum Desf.
submetidos ao déficit hídrico, Zaefyzadeh et al. (2009), encontram um aumento de
27 % na atividade de SOD. Gil; Tutteja, (2010) relataram que vários estresses
abióticos conduzem frequentemente ao aumento da geração de EROs, em que a
SOD tem sido uma importante enzima na tolerância ao estresse de plantas,
fornecendo a primeira linha de defesa contra os efeitos tóxicos dos níveis elevados
de EROs.
A atividade da POD aumentou em média 20 % em plantas submetidas à DH,
em relação às plantas controle. Tem sido relatado que a atividade de POD em J.
curcas é sensível ao déficit hídrico (KUMAR et al., 2008). Estudos relatam que a
resposta de atividade de POD para o déficit hídrico pode variar entre as espécies de
plantas e entre os diferentes tecidos (PASSARDI et al., 2005). Seu aumento em J.
curcas, pode ser suficiente para proteger as proteínas, clorofila e lipídios contra o
ataque das EROs. Em outras espécies, o aumento da atividade de POD está
associada a uma maior retenção de água, como em Nicotiana tabacum (MERCADO
et al., 2004) e folhas de trigo (SELOTE; KHANNA-CHOPRA, 2006). Isto significa que
os genótipos estudados mantêm maior atividade de POD em folhas de plantas sob
DH, ocasionando assim, uma maior retenção de água e tolerância ao déficit hídrico.
Os dados revelam um aumento em média de 32 % da CAT em plantas
submetidas à DH, quando comparadas com o controle. A enzima antioxidante CAT
tem como função remover o H2O2 gerado em peroxissomos por oxidases envolvidas
na β-oxidação de ácidos graxos, fotorrespiração, catabolismo da purina e durante o
estresse oxidativo (VELLOSILLO et al., 2010). Em trabalhos com outras espécies,
há relatos de aumento na atividade da CAT sob déficit hídrico, como em trigo, milho
26
(NAYYA; GUPTA, 2006) e arroz (REDDY et al., 2004). Estes resultados indicam que
as enzimas antioxidantes (SOD, POD e CAT), estão envolvidas no mecanismo de
defesa de J. curcas contra o estresse oxidativo durante o déficit hídrico.
4.7. Ácido abscísico
Houve diferença significativa entre os genótipos para a concentração de ABA
([ABA]) na folha, sendo o CNPAE 126 o que apresentou maior [ABA] (100,42 ng g-1
MS) para o tratamento de DH (Figura 5A). As raízes de J. curcas apresentaram uma
menor [ABA] quando comparadas às folhas, apresentando valores médios de 11,14,
13,19 e 10,09 ng g-1 MS para os genótipos CNPAE 126, 137 e 139, respectivamente
(Figura 5B). Houve um acréscimo em média de 9 % na [ABA] nas raízes quando
comparadas com as folhas para o tratamento de DH ao final do experimento.
(A)
(B)
Figura 5: Concentração de ABA em folhas (A) e raízes (B) em três genótipos de Jatropha curcas L. submetidas ao déficit hídrico aos 66 DAIT. As colunas são valores médios (n = 4) e as barras representam o erro padrão da média. Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e minúsculas entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05).
27
O ABA é sintetizado nas raízes e na parte aérea em resposta a vários
estresses, incluindo baixas temperaturas e secas (CHAVES et al., 2003). Os
processos fisiológicos controlados sob estas condições incluem a regulação do
crescimento, da abertura estomática e a condutividade hidráulica, bem como a
dormência da semente (FINKELSTEIN et al., 2002; LEUNG; GIRAUDATS, 1998).
Seu acúmulo em função do déficit hídrico pode ser pelo aumento da própria síntese
e/ou pelo decréscimo na partição (BRAY, 1997). Vários autores afirmam que, além
do tipo de estresse e do material amostrado, a época do ano (KAWAMATA et al.,
2002), o horário de avalição (CHAVES et al., 2009), a intensidade luminosa, o pH
(WILKINSON; DAVIES, 2002) e a temperatura (WILKINSON et al., 2001), podem
influenciar na [ABA] na planta.
Cerqueira (2011) estudando folhas de Vitis vinifera L. verificou um aumento
na concentração de ácido abscísico quando as plantas foram submetidas à DH
durante 90 dias após o tratamento. Isto pode estar relacionado com um acúmulo de
K+ nas células guardas, elevando assim o potencial osmótico, consequentemente,
aumentando o controle estomático (REGINA; CARBONNEAU, 1997). As plantas
podem detectar a disponibilidade de água ao redor das raízes e responder através
do envio de sinais químicos para a parte aérea provocando assim, várias respostas
adaptativas, tais como diminuição da expansão foliar e fechamento dos estômatos
(WILKINSON; DAVIES, 2002).
Uma vez dentro da raiz o ABA pode ser translocado pelo simplasto e, então,
armazenado ou degradado, ou ainda pode ser transferido a partir de uma célula a
outra para os vasos do xilema, ou transportado pelo apolplasto com o fluxo de
transpiração para o xilema (WILKINSON; DAVIES, 2002). Além disso, o ABA em si
pode aumentar o fluxo de água para dentro e através da raiz (HOSE et al., 2000).
28
Experimento II
5.1. Microclima
Os valores da RFA (mol fótons m-2 dia-1), temperatura do ar (T - °C) e umidade
relativa (UR - %) encontram-se na tabela 5.
Tabela 5: Variação na radiação fotossinteticamente ativa (RFA – mol fótons m-2dia-1), temperatura do ar (T - °C) e umidade relativa (UR - %) dentro da casa de vegetação durante o período experimental. Os valores correspondem à média (erro padrão da média), máximo e o mínimo diário.
Verifica-se que a RFA média foi de 11,4 mol fótons m-2 dia-1, onde variou entre
2,81 a 20,3 mol fótons m-2 dia-1, a T média do período experimental foi de 25,2 °C,
variando entre 21,9 a 28,4 °C. No período experimental a UR atingiu a máxima de
97,7 % e mínima de 57 %, tendo em média 76,8 %.
5.2. Água no substrato de cultivo
Os valores médios do teor gravimétrico do solo e do potencial mátrico do solo, encontram- se na tabela 6. Tabela 6: Umidade gravimétrica do solo e potencial mátrico do solo (Ψm).
A umidade do substrato foi mantida em torno de 8 % para as plantas controle
(C), 6,4 % para as plantas sob seca moderada (SM) e 5,3 % para as plantas sob
seca severa (SS). O potencial mátrico (Ψm) do substrato foi calculado usando a
curva de retenção de água no solo.
Média Máxima Mínima
RFA 11,4 (0,66) 20,3 2,81
T 25,2 (0,22) 28,4 21,9
UR 76,8 (0,90) 97,9 57,0
Umidade do substrato (%) Ψm do solo (- kPa)
Tratamentos Médio Médio
C 8,0 (0,50)
47,13 (24,0)
SM 6,4 (0,51)
148,21(29,1)
SS 5,3 (0,78) 332,24 (49,4)
29
5.3. Água na planta
Não houve diferença entre os genótipos nos valores de potencial hídrico
antemanhã (Ψam) aos 55 após a imposição ao tratamento (DAIT), bem como aos 6
dias após a reidratação (DAR). Os valores do Ψam variaram entre -0,38±0,02 em
plantas controle a -0,68±0,04 MPa em plantas submetidas à seca severa (Tabela 7).
Aos 6 DAR não houve diferença significativa entre os tratamentos para os dois
genótipos.
Tabela 7: Valores de potencial hídrico antemanhã (Ψam) em folhas de Jatropha curcas L. medidos aos 55 dias após a imposição do tratamento (DAIT) e aos 6 dias após a reidratação (DAR).Valores médios de 4 a 5 repetições (± erro padrão, n = 4-5)
Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e letras minúsculas comparação entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05)
A diminuição do Ψw em função do déficit hídrico tem sido relatado em diversos
trabalhos (BERGONCI et al., 2000; ENNAHLI; EARL, 2005; LAWLOR; CORNIC,
2002; SANTOS et al., 2008; WU et al., 2008). O Ψw é uma variável fisiológica
indicadora do „status‟ hídrico foliar, e é severamente afetado por estresses que
alteram a condutância estomática das plantas, como seca (KHANNA-CHOPRA;
SELOTE, 2007).
Na tabela 8, são apresentados os dados do teor relativo de água (TRA, %)
aos 55 DAIT e após 6 DAR. Verificou-se que nestes períodos não foram observadas
diferenças significativas entre os genótipos. Aos 55 DAIT, observou-se que as
plantas submetidas à seca moderada (SM) diferiram das plantas controle, obtendo
GENÓTIPOS Ψam (-MPa)
55 DAIT 6 DAR
CNPAE 183
C 0,38±0,02 Ab 0,38±0,15 Aa
SM 0,48±0,02 Ab 0,35±0,03 Aa
SS 0,68±0,04 Aa 0,47±0,03 Aa
CNPAE 191
C 0,46±0,04 Ab 0,45±0,07 Aa
SM 0,51±0,02 Ab 0,37±0,03 Aa
SS 0,65±0,06 Aa 0,47±0,08 Aa
30
valores de 79 e 83 % do TRA para os genótipos CNPAE 183 e 191,
respectivamente. Resultados semelhantes foram encontrados para as plantas de
limoeiro expostas a seca por 15 dias (PEREZ-PEREZ et al., 2009).
Tabela 8: Teor relativo de água (%) em folhas de pinhão manso (Jatropha curcas L.) submetidas ao déficit hídrico após 55 DAIT e após 6 DAR. Valores médios de 5 repetições (± erro padrão, n = 5).
GENÓTIPOS TRA (%)
55 DAIT 6 DAR
CNPAE 183
C 75±0,96 Ab 77±3,33 Aa
SM 79±0,44 Aa 72±1,63 Aa
SS 76±3,31 Aab 79±3,81Aa
CNPAE 191
C 74±1,36 Ab 74±2,58 Aa
SM 83±1,69 Aa 71±2,58 Aa
SS 81±2,60 Aab 80±5,58 Aa
Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e letras minúsculas comparação entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05)
A redução da condutância estomática nos genótipos estudados sob um
estresse moderado favoreceu a manutenção de seu status hídrico, evitando assim a
desidratação foliar ao longo do dia quando comparado ao controle. Tal resposta
pode significar o início da regulação estomática, mesmo sob um alto TRA
(ARCOVERDE et al., 2011).
5.4. Ajustamento osmótico e potencial osmótico
Verifica-se que houve diferença significativa entre os genótipos aos 55 DAIT,
onde o CNPAE 191 apresentou menor Ψs em relação ao CNPAE 183. Os valores do
Ψs variaram entre -0,74±0,21 e -1,95±0,16 MPa (Tabela 9). Quando comparados os
tratamentos de seca severa em relação às plantas submetidas à seca moderada aos
55 DAIT, houve um aumento no Ψs de 51 e 12 % para os genótipos CNPAE 183 e
191, respectivamente. Aos 6 DAR não foram observadas diferenças significativas
entre os genótipos, bem como entre os tratamentos.
31
Tabela 9: Valores do potencial osmótico (Ψs) e ajustamento osmótico de folhas de Jatropha curcas L. submetidas ao déficit hídrico aos 55 DAIT e 6 DAR. Valores médios de 5 repetições (± erro padrão, n = 5).
GENÓTIPOS Ψs (- MPa) AO
55 DAIT 6 DAR 55 DAIT 6 DAR
CNPAE 183
C 0,74±0,21 Bc 1,25±0,12 Aa
SM 1,18±0,06 Bb 1,26±0,06 Aa
0,43±0,05 Ab 0,04±0,09 Ab
SS 1,78±0,10 Ba 1,43±0,20 Aa
1,03±0,05 Aa 0,18±0,08 Aa
CNPAE 191
C 1,25±0,12 Ac 1,37±0,10 Aa
SM 1,74±0,15 Ab 1,43±0,08 Aa
0,49±0,06 Bb 0,06±0,02 Ab
SS 1,95±0,16 Aa 1,55±0,06 Aa 0,70±0,07 Ba 0,18±0,02 Aa
Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e letras minúsculas comparação entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05).
Analisando o AO nesses genótipos, verificou-se que as plantas de J. curcas
tem um mecanismo eficiente em relação ao déficit hídrico. Aos 55 DAIT observou-se
que houve diferença significativa (p<0,05) entre os genótipos e tratamentos. O AO
variou entre 0,43 e 1,03 para o genótipo CNPAE 183 e 0,49 e 0,70 para o CNPAE
191. Quando as plantas foram submetidas à reidratação, verifica-se que não houve
diferença entre os genótipos, mas há diferenças significativas entre os tratamentos.
No entanto, com reidratação progressiva, o conteúdo de prolina e o potencial
osmótico da planta pode ter sido regulada por uma acumulação líquida de outros
hidratos de carbono e solutos iónicos como relatado por Wu et al. (2007) em plantas
de citros. As plantas que tiveram um maior AO também foram capazes de manter
um potencial hídrico foliar e TRA mais elevados. Babita et al. (2010) estudando
híbridos de Ricinus communis L. (DCH 177 e 48-1) relataram que os mesmos foram
capazes de manter um potencial hídrico foliar crescente, o que facilitou a
manutenção da turgescência quando submetidas ao déficit hídrico. Silva et al. (2010)
encontraram valores de Ψs variando entre -0,85 e -1,10 MPa em folhas de pinhão
manso durante 10 dias sob deficiência hídrica, onde essas plantas foram capazes de
exibir um AO eficiente.
32
5.5. Prolina, açúcares solúveis totais e potássio
Em relação ao aminoácido prolina, houve diferença significativa entre os
genótipos aos 55 DAIT. O CNPAE 191 apresentou um maior conteúdo quando
comparado com o CNPAE 183 (Figura 6A). Em relação aos tratamentos não houve
diferença significativa para o conteúdo de prolina. Na figura 6B observa-se que o
conteúdo de prolina teve um decréscimo quando as plantas foram reidratadas, não
apresentando diferenças entre os genótipos. Já para os tratamentos, as plantas
submetidas à seca severa apresentaram um acúmulo de prolina de 3,35 e 2,92
mmol/ g MS para os genótipos CNPAE 183 e 191, respectivamente.
Os processos de síntese e degradação da prolina são tidos como benéficos
às plantas quando submetidas a condições adversas. A biossíntese de prolina é
ativada e seu catabolismo é inibido durante a desidratação, enquanto que na
reidratação desencadeia a regulação oposta, sua degradação pode fornecer
redutores necessários para o suporte de transporte de elétrons mitocondrial e a
geração de ATP para a recuperação e reparação dos danos induzidos pelo estresse
(SZABADOS; SAVOURE, 2010).
O acúmulo de prolina livre nas folhas das plantas é uma resposta comumente
observada ao estresse hídrico (SCHAFLEITNER et al., 2007). Ele pode atuar como
Figura 6: Conteúdo de PRO em folhas de Jatropha curcas L. submetidas ao déficit hídrico aos 55 DAIT (A) e aos 6 DAR (B). As colunas são valores médios (n = 4) e as barras representam o erro padrão da média. Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e minúsculas entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05).
(A) (B)
33
um soluto osmorregulador para minimizar os danos causados por estresses
ambientais (ASHRAF; FOOLAD, 2007). A prolina pode funcionar com um recurso
para a desintoxicação das EROs, protegendo e estabilizando as enzimas e ativar
vias de desintoxicação alternativas (SZABADOS; SAVOURE, 2010). Babita et al.
(2010) estudando plantas de Ricinus communis L. sob déficit hídrico por 50 dias,
verificaram um acréscimo no acúmulo de prolina e açúcares solúveis em um
genótipo considerado tolerante à seca. Além disso, uma correlação positiva entre o
acúmulo de prolina e a tolerância ao déficit hídrico tem sido demonstrado em
diferentes espécies (CLAUSSEN, 2005; GUO et al., 2010; VALLIYODAN; NGUYEN,
2006).
Os açúcares solúveis totais não diferiram entre os genótipos aos 55 DAIT e
nem aos 6 DAR. Quando comparados os tratamentos aos 55 DAIT, as plantas
submetidas à seca severa do genótipo CNPAE 191 apresentaram maior acúmulo de
AST (40,02 mg/g-1) em relação aos tratamentos de seca moderada (28,58 mg/g-1 ) e
controle (34,27 mg/g-1) (Figura 7A). Resultados semelhantes foram obtidos por Silva
et al. (2010), quando os AST contribuíram para o ajustamento osmótico em J. curcas
com um aumento de 8 a 22 % em plantas submetidas ao déficit hídrico. Sousa et
al. (2012) estudando plantas de J. curcas submetidas a diferentes tratamentos de
déficit hídrico com água residuária e salinidade encontraram resultados do aumento
no conteúdo de AST. Aos 6 DAR não encontraram diferenças significativas em
relação aos tratamentos em ambos os genótipos (Figura 7B).
Figura 7: Conteúdo de AST em folhas de Jatropha curcas L. submetidas ao déficit hídrico aos 55 DAIT (A) e aos 6 DAR (B). As colunas são valores médios (n = 4) e as barras representam o erro padrão da média. Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e minúsculas entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05).
(A) (B)
34
O acréscimo no conteúdo de AST pode ter sido desencadeado com o
aumento de sua síntese e com a redução da hidrólise do amido, na sua utilização,
devido à restrição de translocação ou redução como fonte de carbono (SILVA et al.,
2010). McCormick et al. (2009) relataram que o acúmulo de açúcares solúveis é
uma consequência da disfunção metabólica que afeta a composição e a
translocação de açúcares nas folhas. Eles também sugeriram que esta resposta
pode contribuir para a inibição da fotossíntese durante o déficit hídrico. Com isso, o
acúmulo de PRO e AST deve ser provavelmente, ao fato que ambos atuem como
reguladores osmóticos, em plantas com baixo potencial hídrico foliar.
Aos 55 DAIT não foram observadas diferenças significativas para os
genótipos quando submetidos ao déficit hídrico para o osmolito inorgânico (K+). As
plantas submetidas à seca severa tiveram um maior acúmulo de K+ (8,7 g.kg-1) para
o genótipo CNPAE 183 e (8,3 g.kg-1) para o CNPAE 191 (Figura 8A). O conteúdo de
K+ não foi alterado significativamente quando submetidos aos tratamentos de déficit
hídrico aos 6 DAR (Figura 8B).
Silva et al. (2010) estudando plantas de J. curcas sob diferentes níveis de
concentrações de NaCl verificaram que nas plantas controle, esse soluto mostrou
contribuição de aproximadamente 50 % no ajustamento osmótico, enquanto nas
plantas tratadas com 100 mmol L-1 de NaCl, essa contribuição foi de apenas 5%. O
Figura 8: Conteúdo de K+ em folhas de Jatropha curcas L. submetidas ao déficit hídrico aos 55 DAIT (A) e após 6 DAR (B). As colunas são valores médios (n = 4) e as barras representam o erro padrão da média. Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e minúsculas entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05).
(A) (B)
35
íon K+ é conhecido por ser muito solúvel e por desempenhar um papel de
osmorregulador chave em células guarda e manutenção do turgor (SHABALA;
CUIN, 2007).
5.6. Mecanismos enzimáticos
Acréscimos na atividade da SOD foram encontrados em folhas de J. curcas
submetidos à seca severa aos 55 DAIT quando comparados com o controle em
ambos os genótipos, apresentando assim, 193 e 200 % para o CNPAE 183 e 191,
respectivamente (Figura 9A). Aos 6 DAR, houve um decréscimo na atividade da
SOD para todos os tratamentos, onde as plantas submetidas à seca severa diferiu
dos demais (p<0,05). A atividade da SOD em folhas de plantas submetidas à seca
severa foi, em média, 0,020 U/kg MS o que representa um acréscimo de 50 %
quando comparado com o controle que apresentou em média 0,014 U/kg MS e 16 %
para as plantas submetidas à seca moderada, o que representa em média de 0,016
U/kg MS (Figura 9B).
Aumentos na atividade de POD foram significativos, tanto para os genótipos
quanto para os tratamentos. O tratamento submetido à seca moderada no genótipo
CNPAE 183 diferiu dos demais tratamentos, apresentando assim um acréscimo de
84 % em relação ao controle e 97 % para a seca severa. Já o CNPAE 191,
apresentou um acréscimo de 140 % em relação ao controle e 60 % comparado com
as plantas submetidas à seca severa (Figura 9C). Aos 6 DAR houve um decréscimo
significativo na atividade de POD para os dois genótipos (Figura 9D).
Para atividade da CAT houve diferenças significativas para os genótipos,
onde o CNPAE 183 apresentou uma maior atividade em relação ao CNPAE 191. As
plantas submetidas à seca severa apresentaram maior atividade (0,034 e 0,029
µmol H2O2 kg-1 MS min-1) para os genótipos CNPAE 183 e 191, respectivamente.
(Figura 9E). Aos 6 DAR houve um aumento significativo para todos os tratamentos ,
onde as plantas submetidas à seca severa diferiu dos demais apresentando um
aumento de 95 % em relação ao controle e 26,5 % em relação às plantas
submetidas à seca moderada para o genótipos CNPAE 183. Já para o genótipo
CNPAE 191, a seca severa apresentou um acréscimo de 58 % em relação ao
36
controle e 21,7 % quando comparado com as plantas submetidas à seca moderada
(Figura 9F).
(C) (D)
(E)
(B) (A)
(F)
Figura 9: Atividade da SOD, POD e CAT em folhas de Jatropha curcas L. submetidas ao déficit hídrico aos 55 DAIT (A), (C), (E) e aos 6 DAR (B), (D), (F) respectivamente. As colunas são valores médios (n = 4) e as barras representam o erro padrão da média. Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e minúsculas entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05).
37
O estresse oxidativo é definido como um sério desequilíbrio entre a produção
de EROs e de defesa antioxidante, além disso, esta situação pode causar danos a
macromoléculas celulares, incluindo em proteínas, lipídios, carboidratos e ao DNA
(GILL; TUTEJA, 2010). As EROs podem ser simplesmente descritas como altamente
reativas e formas parcialmente reduzidas de oxigênio. Elas incluem o radical
superóxido (O2˙¯), oxigênio singleto (1O2), radical hidroxila (OH˙), radical
hidroperoxila (HO2˙), peróxido de hidrogênio (H2O2). São produzidas não só durante
o metabolismo, mas em compartimentos de plantas, incluindo cloroplastos,
mitocôndrias, peroxissomos, membranas plasmática, apoplasto, retículo
endoplasmático, e parede celular. Também EROs são como um resultado de fatores
de estresses ambientais induzidas (SEN, 2012). EROs são gerados em células
vegetais através do metabolismo celular normal ou devido a condições
desfavoráveis ambientais, como seca, salinidade, metais pesados, herbicidas,
deficiência de nutrientes, ou radiação. As produções são controladas por diversos
sistemas de defesa enzimáticos incluindo SOD, POD e CAT (GILL; TUTEJA, 2010;
KARUPPANAPANDIAN et al, 2011).
Em situação de déficit hídrico, a atividade mais elevada da SOD pode
desempenhar um papel de limpeza do radical superóxido (O2˙¯) e gerando assim,
H2O2, o qual pode ser depois transformado em água por POD e CAT (LIU, 2006).
Aumentos na atividade da SOD em folhas de plantas sob estresse foi amplamente
relatado (WANG; LI, 2008). Silva et al. (2012), estudando plantas de J. curcas
submetidas a diferentes déficits hídricos, relataram um ligeiro aumento (20 %) na
atividade da SOD. Isso pode indicar que SOD desempenhou um importante papel na
regulação da limpeza do O2-, quando as plantas sofreram estresse hídrico. Após 6
DAR houve redução da atividade da SOD. Essa redução pode estar relacionada
com a alteração de síntese e acúmulo de enzimas menos ativas (BASU et al., 2010).
Durante o período de déficit hídrico 55 DAIT, os genótipos apresentaram uma
alta atividade de POD (Figura 9C). Entretanto, a atividade de POD nas folhas de J.
curcas não foram recuperadas aos 6 DAR (Figura 9D). Além disso, os dados
apresentados sugerem que a atividade desta enzima pode estar envolvida na
biossíntese e parede celular, ao invés da proteção dos tecidos vegetais contra o
dano oxidativo causado por H2O2 (CAVALCANTI et al., 2004). Gholami et al. (2012)
relataram que variedades de Ficus carica L. sob déficit hídrico por 14 dias obtiveram
38
um aumento na atividade da POD em relação às plantas controle. Aumento similar
na POD também foi relatado em outras pesquisas (NAZARLI et al, 2011;
RATNAYAKA et al., 2003). Resultados semelhantes foram obtidos por Bai et al.
(2009) estudando plantas de Reaumuria soongorica (Pall.) Maxim verificaram que a
após a reidratação a atividade da POD também não foi recuperada totalmente,
podendo assim está relacionada com a biossíntese da parede celular, ao invés de
proteção dos tecidos.
A atividade de CAT promove a dismutação de H2O2 obtendo H2O e O2, sendo
uma enzima efetiva em combater EROs (MILLER et al., 2008). A CAT foi estimulada
sob condições de seca moderada, já as plantas submetidas à seca severa
apresentaram uma maior atividade 101 e 78 % para os genótipos CNPAE 183 e 191,
respectivamente, quando comparadas com as plantas controle aos 55 DAIT (Figura
9E). O aumento da atividade da CAT sob condições de deficiência hídrica também
foi observado por Pompelli et al. (2010) em plantas de pinhão manso, onde foi
verificado que este acréscimo da atividade estava relacionado com o aumento de
H2O2. Aos 6 DAR houve um aumento significativo na atividade de CAT em todos os
tratamentos, bem como entre os genótipos. A atividade de CAT em período de
recuperação foi elevada de forma significativa em duas variedade de figo (Siah e
Shah) submetidos a 14 dias ao déficit hídrico. Costa (2009) observou um acréscimo
de 50 % na atividade da CAT em plantas de Carapa guianensis (Aubl.) submetidas a
dois regimes hídricos (controle: plantas irrigadas próximas à capacidade de campo;
e déficit hídrico: onde houve o corte da irrigação progressivamente). Os aumentos
na atividade das enzimas SOD, POD e CAT, sugerem que a espécie J. curcas
recorre efetivamente aos mecanismos enzimáticos de proteção para evitar danos à
célula.
5.7. Ácido abscísico
A [ABA] diferiu significativamente entre os genótipos, bem como entre os
tratamentos (p<0,05). As plantas submetidas à seca severa aos 55 DAIT
apresentaram um aumento de 89 e 27 % quando comparadas ao controle para os
genótipos CNPAE 183 e 191, respectivamente (Figura 10A). Aos 6 DAR houve um
decréscimo significativo para os tratamentos de ambos os genótipos, mesmo assim,
39
as plantas submetidas à seca severa apresentaram uma maior [ABA] (Figura 10B).
A [ABA] nas raízes diferiram entre os genótipos, bem como nos tratamentos (Figura
10C). As plantas apresentaram um maior acúmulo de ABA nas raízes devido ao
tratamento de seca severa (5,94 e 5,30 ng g-1 MS), para os genótipos CNPAE 183 e
191, respectivamente.
Figura 10: Concentração de ABA em dois genótipos de Jatropha curcas L. submetidas ao déficit hídrico em folhas aos 55 DAIT (A) e 6 DAR (B) e em raízes aos 110 DAS (C). As colunas são valores médios (n = 4) e as barras representam o erro padrão da média. Letras maiúsculas indicam comparação entre genótipos e minúsculas entre regimes hídricos pelo teste Tukey (p<0,05).
(A)
(B)
(C)
40
O ABA tem sido sugerido como uma molécula de sinalização importante na
resposta das plantas ao déficit hídrico. Quando o solo seca, o ABA é produzido nas
extremidades das raízes e transportado pelo fluxo de transpiração para a folha,
reduzindo a condutância estomática (WILKINSON; DAVIES, 2002). Estudos
mostram a participação das EROs, como o H2O2, atuando no fechamento
estomático, em processo mediado pelo ABA (DESIKAN et al., 2004; NEILL et al.,
2003; PEI et al., 2000).
Nesta pesquisa, a [ABA] nas folhas foi maior em relação às raízes (Figura
10C). Alves; Setter, (2004) estudando folhas de Manihot esculenta, Crantz
encontraram aumento na concentração de ABA submetida ao déficit hídrico. Sauter
et al. (2001) relata que além do ABA, outros sinais, como a redistribuição de íons
inorgânicos e pH, parecem desempenhar um papel importante na sinalização de
longa distância entre as raízes e as partes aéreas.
41
CONCLUSÕES
Os osmolitos orgânicos foram bons indicadores ao déficit hídrico. Sugere-
se que o acúmulo desses osmolitos esteja mais relacionado a funções de
osmoproteção do que osmorregulação.
O aumento da atividade das enzimas SOD, POD e CAT durante o período
de maior estresse demostra que existem mecanismos de desintoxicação
efetiva em combater as espécies reativas de oxigênio (EROs).
O mecanismo de tolerância do genótipo CNPAE 183 apresentou-se mais
eficaz quando sob estresse por deficiência hídrica no solo, com o
acréscimo na concentração do ABA e aumento na atividade das enzimas
antioxidantes.
A concentração de ácido abscísico em Jatropha curcas L. foi maior nas
folhas em relação às raízes em resposta a reduzida disponibilidade de
água no solo.
A manutenção da turgescência foliar, verificada nas plantas submetidas
ao déficit hídrico, pode ser um indicativo de um eficiente mecanismo
protetor constituído de ajuste osmótico, redução da transpiração e
condutância estomática.
Novas pesquisas ainda são necessárias com J. curcas, inclusive em
condições de campo, com o propósito de avaliar o desempenho desta
espécie em condições não controladas.
42
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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