Anais da V Semana de Biotecnologia 1 - uel.br da V Semana de... · têxtil por Pleurotus ostreatus Eliane S. Otaguiri; Emanuele C. M. Altran & Suely M. O. Doi 12 Caracterização

Anais da V Semana de Biotecnologia 1 - 2009 Departamento de Bioquímica e Biotecnologia - Universidade Estadual de Londrina

Disponível em http://www.uel.br/eventos/semanabiotec/?content=trabalhos.htm

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V Semanade BiotecnologiaV Semanade Biotecnologia

ANAIS DA V SEMANA DE

BIOTECNOLOGIA

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LISTAGEM DE RESUMOS PUBLICADOS

TÍTULO AUTORES PÁGINA

Análise da variação das seqüências nucleotídicas das regiões its1, 5.8s e its2 do DNA ribossomal de fungos patogênicos para o homem

Tavares, E.R.; Venancio, E.J.; & Deganello, J.

5

Atividade de -glicosidase em diferentes leguminosas

Rafael Fernandes Santos; Luciana Carvalho Grade & Mara Lucia Luiz Ribeiro

6

Autenticação e caracterização fenotípica de estirpes mantidas na coleção de microrganismos do laboratório de microbiologia de solos do IAPAR

Ana Garcia de Novaes; Juscélio Donizete Cardoso; Maria Aparecida Matos; Orazilia França Dorigo & Diva Souza Andrade

7

Avaliação da distribuição do teor de carbono, no solo total e na fração argila obtida por ultrasonificação

Babujia, L.C.; Carrara, R; Schiavon, l. A.; Franchini, J.C. & Hungria, M

8

Avaliação da microestrutura em compósitos biodegradáveis de amido reforçados com fibras da cana-de-açúcar para uso futuro em nanotecnologia

Flávia Debiagi & Suzana Mali

9

Avaliação da produção de lipase e lacase por ascomicetos do gênero botryosphaeria em óleo de mamona como fonte de carbono

Bauermeister, A; Messias, J.M.; Dekker, R.F.H.; Barbosa, A.M. & Rezende, M.I.

10

Avaliação quantitativa da biomassa microbiana em diferentes sistemas de manejo e profundidades do solo

Babujia, L.C.; Carrara, R; Schiavon, l. A.; Franchini, J.C. & Hungria, M

11

Biodegradação de efluentes da indústria têxtil por Pleurotus ostreatus

Eliane S. Otaguiri; Emanuele C. M. Altran & Suely M. O. Doi

12

Caracterização metabólica de isolados microbianos ativos na utilização de petróleo como fonte de carbono

Marcelino, P. R. F.; Vida, R. C. dos S. & Oliveira, A. L. M.

13

Caracterização reológica parcial da levana de Bacillus subtilis (NATTO)

Leandro F. dos Santos; Elaine C. Moreno & Maria A. P. C. Celligoi

14

Comparação das tortas de soja, mamona e milho como fonte de carbono para a produção de lipase por B. ribis EC-01, com e sem adição de meio mínimo de Vogel

Tiago Zaminelli; Heitor M. R. Dias; Milena M. Andrade; Josana M. Messias; Maria I. Rezende; Robert F. H. Dekker & Aneli M. Barbosa

15

Diversidade de estirpes de rizóbio isoladas de nódulos de feijoeiro com base no perfil de plasmídeo

Juscélio Donizete Cardoso; Douglas Fabiano Gomes; Priscila Maria Pigatto & Diva Souza Andrade

16

Efeitos da adição de dejetos de suínos no solo sobre a comunidade microbiana

Maria Aparecida de Matos; Orazília F. Dorigo; Gisele Milani Lovato; Juscélio Donizete Cardoso & Diva Souza Andrade

17

Efeitos do tratamento com sibutramina na histologia gonadal e no desempenho reprodutivo de ratos machos wistar, não obesos

Cibele S. Borges & Isabel C. C. Camargo

18



3

Efeitos metabólicos da fisetina sobre o metabolismo hepático

Mariana de Kássia Cardoso Ono; Rodrigo Polimeni Constantin; Cristiane Vizioli de Castro; Adelar Bracht & Nair Seiko Yamamoto

19

Estudo da microencapsulação de Lactobacillus acidophilus por spray dryer

Menezes, C.R.; Calderón, L.P.P.; Chavez, G.M; Michelini, R.P.; Cardozo, G.M.B.Q.; Silva, R.A.; Antunes, A.E.C; Liserre, A.M. & Moreno, L.

20

Estudo de diferentes condições de fermentação para a produção de exopolissacarídeo por Bacillus subtilis NATTO

Márcio Cilião Filho & Maria A. P. C. Celligoi.

21

Hidrólise do farelo de mandioca por tratamento ácido termopressurizado

Freitas, A.C;. Oliveira, F. & Oliva-Neto, P.

22

Identificação e caracterização de clones BAC de Coffea arabica L. HT 832/2 contendo o gene NADPH M6PR

Silva, N.V.; Cação, S.B.; Pereira, L.F.P. & Vieira, L.G.E.

23

Isolamento e seleção de microrganismos diazotróficos com potencial de inoculante

Karina M.L.Milani; Paula Cerezini; Gisele M. Lovato; Alexandra Scherer & Elcio Liborio Balota

24

Isotermas de adsorção de umidade e permeabilidade ao vapor de água de filmes de amido de mandioca e goma xantana produzidos por extrusão

Isabela C.P.F.Santos; Cristina P. B. de Melo; Suzana Mali; Maria V.E. Grossmann & Fabio Yamashita

25

Leveduras isoladas de uvas do norte do paraná: seleção de produtoras de beta-glucanases e comparação de botriosferana e biomassa micelial como fontes indutoras

Bauermeister, A; Amador, I.R; Rezende, M.I. ; Dekker, R.F.H.; Pérez, A.I.B. & Barbosa, A.M.

26

Microestrutura de filmes combinando amido de mandioca e goma xantana produzidos por extrusão

Cristina P. B. de Melo, Suzana Mali, Maria V.E. Grossmann & Fábio Yamashita

27

Monitoramento do processo industrial na produção de etanol combustível por meio de técnicas moleculares

Lopes, D. D.; Martins, P. F.; Andrade -Nóbrega, G.M.A. & Paccola-Meirelles, L.D.

28

Pré-hidrólise ácida de material lignocelulósico do bagaço de cana-de-açúcar com solvente Organosolv

Lorraine P.P.Calderon & Pablo G. Kiiper

29

Preservação de culturas bacterianas por liofilização

Orazília França Dorigo; Juscélio Donizete Cardoso; Aderson Lima Filho; Maria Aparecida de Matos & Diva Souza Andrade

30

Produção de quitinase por Trichoderma harzianum e sua atividade antagonista

Luciano N. Aoyagi, Leonardo C. Alves & Suely M. O. Doi

31

Produção de levana por Bacillus subtilis NATTO, em meio de caldo de cana-de-açúcar e com sacarose

Marques, A. T.; Filho, M.C; Cenedesi N. V.; Celligoi, M.A.P.C.

32

Seleção de microrganismos isolados da mata atlântica produtores de lipase tolerante a solventes e extremos de pH

Bruno H. Oliveira; Pedro O. Neto & Valéria M. G. Lima

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4

Seleção de microrganismos solubilizadores de fosfato para produção de inoculante agrícola

Paula Cerezini; Karina M. L. Milani; Gisele M. Lovato, Alexandra Scherer & Elcio Liborio Balota

34

Síntese de ésteres metílicos por transesterificação utilizando lipase de Fusarium sp. isolado da mata atlântica

Bruno H. Oliveira & Valéria M. G. Lima

35

Transformação genética de citrumelo “SWINGLE” com o gene aiia que codifica a enzima AHL-lactonse

Juliana Deganello; Gislaine V. de Souza; Eliandro R.Tavares & Luiz Gonzaga E.Vieira

36

Uso de subprodutos do processo de refino de óleos vegetais na produção de lipases de Beauveria bassiana CG 432

Michele C.B.Cruz; Vanessa H. Sugahara; Juliana G.Tolentino; Polyana M. Melo & Geni Varéa-Pereira

37

Utilização dos oligonucleotídeos pc04 e gh20 como controle interno de uma reação de pcr para detecção do fungo Paracoccidioides brasilienses

Tavares, E.R.; Venancio, E.J.; & Deganello, J.

38

Variação de cor em compósitos biodegradáveis a base de amido de mandioca, álcool polivinílico e fibras de cana-de-açúcar para uso potencial em nanotecnologia

Flávia Debiagi & Suzana Mali

39

Viscosidade de soluções filmogênicas de amido de mandioca e goma xantana puros e em mistura

Fernando de O. Faria; Vitor Almeida Marengo; Cristina P.B. de Melo & Suzana Mali

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5

ANÁLISE DA VARIAÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS DAS REGIÕES ITS1, 5.8S E ITS2 DO DNA RIBOSSOMAL DE

FUNGOS PATOGÊNICOS PARA O HOMEM

Tavares, E.R. 1; Venancio, E.J. 1; Deganello, J2.

1 Departamento de Ciências Patológicas- CCB/UEL 2 Instituto Agronômico do Paraná - IAPAR

As infecções por fungos são a principal causa de morbidade e mortalidade em

pacientes imunocomprometidos. A identificação de agentes causadores destas infecções é bastante complexa, devido ao grande numero de espécies responsáveis por parasitar hospedeiros imunocomprometidos. O diagnóstico das infecções deve ser rápido, pois é fundamental para o tratamento adequado do paciente e tem um impacto profundo no prognóstico da doença. O diagnóstico é, geralmente, feito pela observação direta do fungo, pela cultura celular, por testes sorológicos ou por análises histopatológicas. Para auxiliar no diagnóstico, diversas técnicas moleculares de detecção do fungo têm sido desenvolvidas. As técnicas moleculares têm como principais vantagens a alta sensibilidade e a especificidade, em comparação com os métodos rotineiramente utilizados. Além disso, os métodos moleculares têm a capacidade de detecção da infecção mesmo antes do aparecimento dos primeiros sinais clínicos e, por isso, podem ser utilizados no acompanhamento de pacientes de risco, como transplantados. Em fungos, os genes que codificam para os RNAs ribossomais são constantemente utilizados para o desenvolvimento de reações de detecção molecular. Os genes ribossomais estão presentes em todos os organismos e em grande número de cópias, característica esta que contribui para o aumento da sensibilidade da reação de PCR. O DNA ribossomal dos fungos é formado pelos genes da subunidade maior (28S), subunidade menor (18S) e 5.8S, separados por regiões internal transcribed spacer (ITS1 e ITS2). As regiões ITS1 e ITS2 são regiões de importância particular para o diagnóstico, por possuir seqüências altamente conservadas e altamente variáveis tornando-se ideal para o desenvolvimento de oligonucleotídeos específicos para a identificação de espécies fúngicas. Neste trabalho analisamos a variabilidade nucleotídica das regiões ITS1, 5.8S e ITS2 do DNA genômico de P. brasiliensis, H. capsulatum, B. dermatitides, C. immitis e S. schenckii. Foram obtidas 149 seqüências nucleotídicas com as regiões ITS1, 5.8S rDNA e ITS2 de 5 espécies de fungos patogênicos, sendo 41 de Paracoccidioides brasiliensis, 73 de Histoplasma capsulatum, 6 de Blastomyces dermatitides, 11 de Coccidioides immitis e 18 de Sporothrix schenckii. As seqüências foram obtidas do banco de dados (GenBank) disponível no sítio http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Estas seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalW com os seguintes parâmetros: gap initiation penalty=3; gap extension penalty=1; base match score=2; base mismatch penalty=1. Uma seqüência consenso para cada espécie foi deduzida utilizando o programa BioEdit usando a seguinte configuração: threshold frequency for inclusion in consensus – 95%; treat gaps like residues. As cinco espécies analisadas apresentaram uma maior variabilidade nas regiões ITS1 e ITS2, quando comparada com a região 5.8S do rDNA. As regiões analisadas mostraram que poderão ser utilizadas para o desenho de oligonucleotídeos específicos para espécies diferentes de fungos e para o desenvolvimento de uma PCR padrão, permitindo um diagnostico rápido e preciso desses organismos.



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ATIVIDADE DE -GLICOSIDASE EM DIFERENTES LEGUMINOSAS

Rafael Fernandes Santos1; Luciana Carvalho Grade1; Mara Lucia Luiz Ribeiro2.

1 Mestrado em Biotecnologia – Depto. Bioquímica e Biotecnologia/CCE/UEL

2 Docente Depto. Bioquímica e Biotecnologia/CCE/UEL – C.P. 6001, CEP 86.051-990, Londrina – PR, e-mail: [email protected]

As -glicosidases (-D-glicosídeo glicohidrolase, EC 3.2.1.21) são enzimas capazes de clivar as ligações -glicosídicas de di e/ou oligosacarídeos, ou outros conjugados glicosídicos, liberando glicose. É encontrada em vegetais com inúmeras funções endógenas. Estas enzimas hidrolisam as isoflavonas β-glicosídias (genistina, daidzina e glicitina) e liberam as isoflavonas agliconas (genisteína, daidzeína e gliciteína) que apresentam ação benéfica na saúde humana. Assim, podem ser aplicadas em produtos não fermentados de soja, produzindo alimentos funcionais com teor elevado de agliconas. Este trabalho teve como objetivo determinar a atividade de β-glicosidase em grãos de oito espécies de leguminosas. Amostras de feijão preto nacional, feijão fradinho, lentilha Canadá, ervilha, feijão-fava rajado vermelho, grão de bico, soja verde e soja BRS 213, obtidas de fonte comercial, foram previamente selecionadas. A partir de uma amostra de 100 g foram formados três blocos, cujas seqüências de preparo e análises foram sorteadas ao acaso para cada bloco. As amostras foram moídas para obtenção de farinha integral que continha casca, hipocótilo e cotilédone. A extração de -glicosidase para determinação da atividade foi realizada em tubos de ensaio com 200 mg de farinha integral em 3 mL de tampão citrato 0,05 M, contendo NaCl 0,1 M e pH 4,5 por uma hora a temperatura ambiente e agitados em intervalos de 15 min. Após centrifugação (4000 g, 20 min a 4ºC), os sobrenadantes foram utilizados para determinação de atividade, utilizando o substrato sintético ρ-nitrofenil--D-glucopiranosídeo (ρ-NPG) conforme procedimento descrito por Matsuura e Obata (1993). Uma unidade de atividade da enzima (UA) foi definida como a quantidade de -glicosidase que liberou 1 M de ρ-NP min1, nas condições de ensaio. Os resultados, expressos em níveis de atividade de -glicosidase, ou seja, UA g1 de farinha integral, foram submetidos ao teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade para a comparação das médias. Os níveis de atividade de -glicosidase foram superiores no feijão-fava rajado vermelho, no grão de bico e na soja BRS 213. O feijão-fava rajado vermelho apresentou níveis de atividade da enzima dez vezes superior a soja BRS 213 (894,72 e 91,15 UA g1 de farinha integral, respectivamente). Considerando a importância da -glicosidase na obtenção de alimentos funcionais, o feijão-fava rajado vermelho apresentou-se como uma excelente fonte desta enzima. Apoio financeiro: CAPES



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AUTENTICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE ESTIRPES MANTIDAS NA COLEÇÃO DE MICRORGANISMOS

DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DE SOLOS DO IAPAR

ANA GARCIA DE NOVAES1, JUSCÉLIO DONIZETE CARDOSO2, MARIA APARECIDA MATOS3, ORAZILIA FRANÇA DORIGO3, DIVA SOUZA ANDRADE4.

1Graduanda de Ciências Biológicas Bolsista CEE/IAPAR; 2Colaborador em Microbiologia do solo; 3Profissional de Ciência e Tecnologia, Laboratório de

Microbiologia do Solo, IAPAR; 4PhD. Pesquisadora em Microbiologia do Solo, ASO, IAPAR. [email protected]

Entre os sistemas biológicos envolvendo planta e microorganismos, a simbiose leguminosa-rizóbio é a de maior expressão econômica com a comercialização de inoculantes contendo estirpes de rizóbio selecionadas. Para a obtenção de estirpes eficientes rizóbio é necessária a formação e manutenção de coleções de trabalhos de pesquisa. A formação do nódulo na raiz da planta de onde foi isolada é o parâmetro utilizado para autenticar a estirpe de rizobio. Esse trabalho teve como objetivo autenticar e caracterizar fenotipicamente 21 isolados bacterianos de nódulos de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L) para inclusão na Coleção de Microrganismos do Laboratório de Microbiologia de Solos do IAPAR. Esses isolados rizobianos estavam preservados por criopreservação e, então, foram crescidos em meio cultura com extrato de levedura, manitol e agar (ELMA) por um período de três dias a 27 ºC. Esses isolados foram transferidos para o meio liquido (ELM), incubados por três dias a 27 ºC até crescimento de uma densidade óptica entre 0,6 a 0,9 leitura a 600 nm. Uma alíquota de 5 mL dessa suspensão foi inoculada em sementes de feijão (IAPAR 81 e IPR Siriri) desinfestadas com hipoclorito, pré-germinadas e plantadas em vasos contendo solução nutritiva completa sem nitrogênio. Duas estirpes recomendadas para a produção de inoculantes para cultura do feijoeiro: SEMIA 4080 e SEMIA 4088 foram incluídas como controle positivo. Esse experimento de autenticação dos isolados de rizóbios foi conduzido em câmara de crescimento de plantas com temperatura, umidade e luminosidade controladas. Após um período de 20 dias foram avaliadas a presença e ausência de nódulos nas raízes das plantas. Dos 21 isolados analisados 17 apresentaram nódulos na raiz do feijoeiro, portanto sendo autenticados como rizóbios. Esses isolados foram identificados como estirpes IPR Pv- de acordo com a nomenclatura utilizada na Coleção de Microrganismos no Laboratório de Microbiologia de Solos do IAPAR, liofilizadas e mantidas na coleção. Após a autenticação, as estirpes IPR Pv- foram caracterizadas morfologicamente quanto ao tamanho, forma, textura, absorção de corante, produção de goma, elevação, bordos, estrutura, brilho, cor e transparência das colônias formadas em meio ELMA e, também, fisiologicamente quanto à produção de melanina e pH em meios de cultura específicos. Os dados da caracterização fenotipica foram incluídos no banco de informações da Coleção com link para o Brazilian Microbial Resource Center- (BRMC, http:/ww.bmrc.lncc.br).



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AVALIAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DO TEOR DE CARBONO, NO SOLO TOTAL E NA FRAÇÃO ARGILA OBTIDA POR

ULTRASONIFICAÇÃO

BABUJIA, L.C.1; CARRARA, R.2; SCHIAVON, L. A.3; FRANCHINI, J.C.4; HUNGRIA, M.4;

1- Mestranda em Biotecnologia UEL; 2- Estudante de graduação do Curso de Química da UNOPAR; 3- Estudante de graduação do Curso de Biologia da UNIFIL; 4-

EMBRAPA SOJA. A matéria orgânica do solo (MOS) desempenha funções fundamentais para os processos físicos, químicos e biológicos do solo, esta é a principal responsável pela formação e estabilidade de agregados, que por sua vez, determinam maior resistência do solo à erosão e uma estrutura mais adequada para o estabelecimento e desenvolvimento das culturas. O manejo inadequado, com excessivo revolvimento, pode causar uma rápida deterioração da estrutura devido à desorganização do ambiente do solo e o conseqüente aumento ou a diminuição de macro e micronutrientes presentes no solo, este trabalho teve como objetivo avaliar o acumulo de carbono presente na fração argila, comparando-o com a fração total. A dinâmica de agregação foi avaliadas em experimento estabelecidas na fazenda experimentais da Embrapa Soja e amostradas os tratamentos sob plantio direto contínuo (DIR), plantio direto com arado cruzador a cada três anos (DCR), cruzador (CR) e plantio direto novo (DIN) e arado de discos (AD), sempre cultivados com a sucessão soja/trigo e coletadas amostras de solo nas camadas 0-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60 e 60-70 cm. Foram realizadas nas amostras análises de rotina do solo inclusas o carbono total, e em seguida selecionadas amostras de solos da camada superficial (0-5, 5-10 e 10-20 cm) para analise densimétrica através de ultra-som. Foram pesados 15g de solo, adicionados 100 mL de água as amostras foram agitadas e sonificadas, utilizando-se um aparelho de ultra-som, operando a uma potência de 250 J/s, com um tempo de sonificação de 180 s. Após a sonificação, as amostras foram passadas em uma peneira de 0,053 mm e transferidas para uma proveta de 1 litro e o volume completado com água destilada, permanecendo em repouso por 17 horas para separação da argila. A distribuição do C presente na fração total do solo apresentou variações quantitativas em sistemas de plantio direto e em profundidades de 0-5 cm, sendo que na fração argila o teor de carbono permaneceu constante. O comportamento do sistema de plantio direto demonstra que este contribuiu para a recuperação da estabilidade de agregados antes mesmo que ocorressem alterações significativas em seus teores de C. Esse comportamento pode estar associado com as alterações no ambiente físico e biológico que contribuem para a estabilização dos agregados por mecanismos não afetados diretamente pelo carbono, como a estabilização por hifas de fungos e raízes. Portanto, quantitativamente, de forma clara houve a possibilidade de observar que a variação do teor de carbono da fração total não esta distribuída na argila, conseqüentemente essa variação esta presente em macroagregados do solo e a quantidade de carbono é diretamente afetada pela intensidade de revolvimento do solo e tem relação direta com a conservação do C na fração argila.



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AVALIAÇÃO DA MICROESTRUTURA EM COMPÓSITOS BIODEGRADÁVEIS DE AMIDO REFORÇADOS COM FIBRAS DA

CANA-DE-AÇÚCAR PARA USO FUTURO EM NANOTECNOLOGIA

Flávia Debiagia; Suzana Malib

a – Estagiária de Iniciação Científica, BBTEC, CCE, UEL. b – Docente do Departamento de Bioquímica e Biotecnologia, Centro de Ciências

Exatas, Universidade Estadual de Londrina. [email protected] Na segunda metade do século XX os materias plásticos colaboraram de forma significativa para o desenvolvimento humano. Sua utilização foi progressiva e, atualmente, encontram-se na maioria dos materiais utilizados pelo homem. Em contrapartida, devido a esse aumento exponencial no consumo das resinas plásticas, o destino para esses resíduos sólidos tornou-se um grande problema devido ao seu destino final incerto, pois a maioria destes são encaminhados a lixões a céu aberto, causando sérios problemas ambientais. As embalagens biodegradáveis a base de amido de mandioca podem ser uma boa alternativa para substituir as embalagens convencionais, no entanto as mesmas apresentam algumas desvantagens, como um alto custo, baixa flexibilidade e sensibilidade à umidade, necessitando de alguns tratamentos adicionais, como a adição de fibras, plastificantes e outros aditivos. Diante desse panorama o presente trabalho teve como objetivo caracterizar a microestrutura de compósitos biodegradáveis a base de amido de mandioca, álcool polivinílico (PVA) e fibras da cana-de-açúcar. As proporções de cada variável foram determinadas em ensaios preliminares, com os teores de amido variando de 60 a 100%, de fibras de 0 a 40% e de PVA de 0 a 40%. Os compósitos foram produzidos a partir das proporções determinadas no delineamento, e ainda, foram adicionados glicerol (20%) e água (suficiente para que o teor de umidade fosse de 18% antes da extrusão). Em seguida, as formulações foram extrusadas em extrusora mono-rosca de laboratório marca BGM modelo EL-25 com temperatura de 120°C nas quatro zonas, rotação de 75 rpm e matriz cilíndrica de 2,8mm de diâmetro. Foram recolhidos compósitos cilíndricos, que foram analisados quanto à sua microestrutura através de Microscopia Eletrônica de Varredura (Microscópio Eletrônico FEI Quanta 200 - Oregon - USA). Nas formulações com uma maior quantidade de amido e PVA, os compósitos apresentaram uma maior expansão o que é visto pela maior quantidade de bolhas, enquanto que os compósitos com uma maior quantidade de fibras expandiram menos. As maiores proporções de álcool polivinílico levaram a uma melhor homogeneidade na superfície das amostras. Portanto, pode-se concluir que a adição de PVA influenciou positivamente na homeogeneidade e expansão dos compósitos produzidos e, que o teor de fibras deve ser controlado a fim de evitar efeitos indesejáveis, como a baixa expansão. Além da introdução de fibras, estes compósitos têm grande potencial de melhoria se reforçados com nanoargilas, o que se pretende a seguir para dar continuidade a este trabalho. Agradecimentos: CNPq pelo auxílio financeiro (Projetos CNPq 577146/2008-4 e 478109/2008-3) e Bolsa de Iniciação científica.



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AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE LIPASE E LACASE POR ASCOMICETOS DO GÊNERO Botryosphaeria

EM ÓLEO DE MAMONA COMO FONTE DE CARBONO

Bauermeister, A1, Messias, J.M.1; Dekker, R.F.H.2, Barbosa, A.M.1 Rezende, M.I.1 1Depto de Bioquímica e Biotecnologia, CCE, Universidade Estadual de Londrina, CEP

86051-990, CX Postal 6001, Londrina-PR, Brasil. 2Biorefining Research Initiative, Lakehead University, Thunder Bay, Ontario, Canada

P7B 5E1, * e-mail: [email protected]

O crescente interesse na produção de enzimas está especialmente relacionado ao grande potencial biotecnológico que elas apresentam, no entanto, os altos custos de produção destes biocatalisadores restringem, muitas vezes, sua utilização. Os fungos filamentosos são valorizados para a produção de enzimas extracelulares, como as lipases e lacases, pela fácil recuperação destas do meio de fermentação. Lipases catalisam reações de hidrólise total ou parcial de triacilgliceróis produzindo diacilgliceróis, monoacilgliceróis, glicerol e ácidos graxos livres. As lacases são glicoproteínas, classificadas como fenol oxidases ou multi-cobre oxidases e catalisam reações de oxidoredução em diferentes substratos como fenóis e outras substâncias aromáticas. A utilização de resíduos oleosos ou fenólicos como substrato na produção de lipases ou lacases, respectivamente, além de agregar valor a materiais de baixo custo no mercado, pode vir a reduzir muito o preço final da enzima. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de lipase e lacase pelos ascomicetos: Botryosphaeria rhodina, Botryosphaeria ribis e seis anamorfos do gênero Botryosphaeria, os Lasiodiplodia theobromae isolados de pinha, manga fruto, manga folha, graviola, berinjela e eucalipto. Todos os microrganismos foram crescidos na presença de óleo de mamona como única fonte de carbono e mantidos em meio de batata dextrose ágar (BDA). Os cultivos em meio líquido foram desenvolvidos em meio mínimo de Vogel contendo 1 % de óleo de mamona, os frascos Erlenmeyers de 125 mL foram incubados a 28 ºC, com e sem agitação (180 rpm). O inóculo consistiu de quatro esferas, de 0,7 cm de diâmetro contendo hifas homogêneas, crescidas em meio de Vogel sólido acrescido de glucose 1 % (m/v) por cinco dias a 28 °C. Os extratos enzimáticos foram utilizados como fonte de enzimas e foram obtidos pela remoção do micélio por centrifugação. A atividade enzimática foi determinada por espectrofotometria a 410 nm e baseada na hidrólise do éster palmitato de p-nitrofenila (pNPP) a 30 °C por 2 min para lipase e na oxidação do ABTS 2,2-azino-bis(3-ethylbenthiazoline) a 50 °C por 5 min para lacase. A biomassa microbiana foi determinada por gravimetria. O Botryosphaeria ribis se destacou na produção de lipase e lacase, 8,3U/mL e 0,75 U/mL, respectivamente, ambos em meio aerado. Foi observado ainda que a variação de pH final dos extratos dos cultivos foi entre 5,5 e 7,0.



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AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA BIOMASSA MICROBIANA EM DIFERENTES SISTEMAS DE MANEJO E PROFUNDIDADES DO

SOLO

BABUJIA, L.C.1; CARRARA, R2; SCHIAVON, L. A.3; FRANCHINI, J.C.4; HUNGRIA, M.4;

1- Mestranda em Biotecnologia UEL; 2- Estudante de graduação do Curso de Química da UNOPAR; 3- Estudante de graduação do Curso de Biologia da UNIFIL; 4-

EMBRAPA SOJA. A diversidade microbiana presente no solo é extremamente sensível a qualquer impacto ambiental por esse motivo são essenciais analises que reflitam realmente a nível quantitativo e qualitativo o impacto em um determinado ambiente. Um exemplo é os indicadores microbiológicos que contribuem para as condições dos manejos atuais e a regulagem dos processos ecológicos do solo, refletindo inteiramente sobre as praticas agrícolas. Dentre os indicadores de qualidade do solo capazes de representar a população microbiana, a biomassa microbiana do solo (BM), destaca-se devido à sua relação com a matéria orgânica, a ciclagem de nutrientes e o fluxo de energia. Esse trabalho tem por objetivo avaliar os teores de carbono e nitrogênio da biomassa microbiana através de métodos quantitativos pelas analises de fumigação-extração (teores de C e N microbiano) e fumigação-incubação, analises de respiração basal, respiração induzida por substrato e o quociente metabólico (teor de C através do CO2 liberado pela atividade microbiana) em diferentes sistemas de manejo e profundidades nas camadas de 0-5; 5-10; 10-20; 20-30; 30-40; 40-50 e 50-60 cm e verificar se estas práticas afetam a atividade dos microrganismos existentes. O ensaio de campo foi estabelecido, na estação experimental da Embrapa Soja, o delineamento experimental foi em blocos ao acaso pelos diferentes sistemas de manejo, plantio direto (PD) e convencional (PC), sob sucessão soja/trigo, com quatro repetições. Os valores obtidos foram submetidos à análise de Variância e teste de Tukey com nível de significância de 0,05. De acordo com os resultados obtidos pode-se concluir que em relação aos teores de carbono e nitrogênio da biomassa microbiana avaliada pelo método de fumigação-extração, observou-se que o sistema plantio direto foi superior ao convencional e quanto maior a profundidade menor os teores tanto de carbono como de nitrogênio, resultado já esperado. O teor de carbono pelo método de fumigação-incubação através da respiração basal os sistemas apresentaram resultados semelhantes ao método anterior, porém, em relação à profundidade a biomassa maior está nas profundidades maiores, esses resultados precisam de uma analise qualitativa para melhor entendimento dessa dinâmica. Com relação aos resultados da respiração induzida, observaram-se os maiores valores para o sistema plantio direto e para profundidades menores. O quociente metabólico e quociente metabólico induzido pela sacarose apresentaram comportamento semelhante para os dois sistemas de manejo e quanto maior as profundidades menores são os quocientes.



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BIODEGRADAÇÃO DE EFLUENTES DA INDÚSTRIA TÊXTIL POR Pleurotus ostreatus

Eliane Saori Otaguiri (Estágio Voluntário/UEL), Emanuele Caroline Macedo Altran

(Estágio Voluntário /UEL), Suely Mayumi Obara Doi (Orientador) e-mail: [email protected]

Universidade Estadual de Londrina/Centro de Ciências Exatas Departamento de Bioquímica e Biotecnologia/Londrina – PR

As indústrias têxteis, de cosméticos, de papel e de alimentos são responsáveis pela liberação de efluentes corados ao meio ambiente. Muitos desses corantes são estáveis a luz, temperatura e ataque microbiano, tornando-se compostos recalcitrantes, tóxicos e cancerígenos. Os fungos da podridão branca, por produzirem uma ampla variedade de enzimas ligninolíticas, como lacases, lignina peroxidases e manganês peroxidases, envolvidas na biodegradação de substratos lignocelulósicos estáveis, têm sido considerados de grande interesse biotecnológico, e sua aplicação nos processos de descoloração de efluentes investigada. Além de Phanerochaete chrysosporium, freqüentemente empregado na degradação de corantes sintéticos, devido, principalmente, à sua capacidade de mineralizar além da lignina, outros poluentes resistentes a degradação, outros fungos, como Pleurotus ostreatus e Trametes versicolor tem sido também estudados. Este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade do fungo Pleurotus ostreatus em descolorir efluentes e corantes da indústria têxtil e determinar sua atividade de lacase. Os experimentos foram realizados em meios de Vogel (2%) suplementado com glucose (0,5%), extrato de levedura (0,2%) e 12,5mL de efluente corado (0,02%) em volume final de 25mL, em erlenmeyer de 125 mL, incubados a 28C e 180 rpm de agitação durante 10 dias ou até se observar a descoloração. Os resultados indicaram que a descoloração do Efluente 1 (cor vermelha) chegou a aproximadamente 62,31%, enquanto que o Efluente 2 (cor azul) sofreu 96,51% de descoloração quando tratado por Pleurotus ostreatus. Nos testes realizados com o corante Remazol Brilliant Blue a descoloração alcançou cerca de 100%, enquanto que a descoloração dos corantes Preto Intenso, Remazol Brilliant Orange, Remazol Brilliant Amarelo ficou em torno de 90%. Observou-se também, que a produção de lacase foi maior no processo de tratamento do Remazol Brilliant Blue e do Efluente 2 do que nos demais efluentes e corantes . Assim, concluiu-se que todos os corantes e efluentes têxteis com exceção do Efluente 1 Vermelho sofreram descoloração por Pleurotus ostreatus em meio líquido acima de 90%, demonstrando a eficácia do uso do basidiomiceto Pleurotus ostreatus na biodegradação de corantes e efluentes têxteis.



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CARACTERIZAÇÃO METABÓLICA DE ISOLADOS MICROBIANOS ATIVOS NA UTILIZAÇÃO DE PETRÓLEO COMO

FONTE DE CARBONO

Marcelino, P. R. F..(IC)1, Vida, R. C. dos S. (PG)1, Oliveira, A. L. M.(PQ)1 1 Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Bioquímica e Biotecnologia,

Cx. Postal 6001, CEP 86055-900, Londrina - PR e-mail: [email protected]

A biorremediação apresenta-se como uma importante ferramenta na descontaminação ou atenuação de compostos xenobióticos nos diferentes ecossistemas. Esta técnica consiste na otimização dos processos catabólicos pelos microrganismos nativos do ambiente afetado (ATLAS et al., 1993). Neste contexto, a prospecção de microrganismos ativos em processos de biorremediação e sua caracterização morfofisiológica e bioquímica, permitem identificar bactérias e fungos que apresentam potencial interesse biotecnológico. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar morfofisiologicamente e bioquimicamente bactérias e fungos do solo contaminado por petróleo. Três isolados microbianos obtidos de acordo com Marcelino et al., 2007 foram utilizados neste estudo. As provas bioquímicas foram realizadas conforme o Manual de Microbiologia. A detecção da atividade lipásica foi baseada na interação de Rhodamina B com os ácidos graxos liberados na hidrólise enzimática do óleo de soja. Os três isolados microbianos, sendo 2 bactérias e 1 fungo, foram parcialmente caracterizados por testes bioquímicos e morfofisiológicos. O fungo foi submetido somente aos testes de atividade lipásica e emulsificação e estabilidade de biossurfactantes. Através dos testes bioquímicos e morfofisiológicos realizados, foi possível identificar o isolado fúngico 4B como o de maior atividade lipásica e uma elevada produção de biossurfactante com alta estabilidade emulsificante, sendo um candidato promissor para aplicações biotecnológicas. A identificação filogenética dos isolados está sendo realizada por métodos moleculares. Apoio Financeiro: Fundação Araucária/PIBIC



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CARACTERIZAÇÃO REOLÓGICA PARCIAL DA LEVANA DE Bacillus subtilis (NATTO)

Leandro F. dos Santos1, Elaine C. Moreno2, Maria A. P. C. Celligoi3

1 Mestrando em Biotecnologia, BBTEC, CCE, UEL 2 Apoio técnico/ Solabia

3 Docente do Departamento de Bioquímica e Biotecnologia (BBTEC), CCE, UEL

A levana é um polissacarídeo extracelular constituída predominantemente por resíduos de D-frutose unidos por ligações glicosídicas β-(26); podendo ainda apresentar pontos de ramificações β-(21) e um resíduo de glucose terminal. A levana apresenta ampla aplicabilidade em diferentes setores da economia. Grande destaque para indústria alimentícia; aonde é utilizada como estabilizante, fixador de sabores, cores e espessante para vários alimentos. A caracterização reológica da levana torna-se imprescindível para ampliação e eficiência da sua aplicabilidade industrial, principalmente na área alimentícia. Existem poucos dados na literatura sobre a caracterização reológica da levana produzida pelo bacillus isolado do natto. Levana, produzida pelo Bacillus subtilis isolado do natto, foi caracterizada quanto ao seu comportamento reológico em função da taxa de cisalhamento em solução 33,1 % baseada no peso da levana não liofilizada. As condições de fermentação foram: temperatura de 37°C, 16 h, a 150 rpm em mesa agitadora. O meio apresentava 400 g de sacarose, o pré-inóculo foi padronizado em 0,2 g.L-1. O processo fermentativo foi realizado em batelada em frascos Erlenmeyer de 2 L com volume de trabalho de 500 mL de meio de fermentação a pH 7,0. A levana produzida foi precipitada do sobrenadante com etanol absoluto (1:3 v/v). Após lavagem e secagem foi confeccionada uma solução a 33,1% baseada no peso da levana não-liofilizada. Para determinação da viscosidade, foi utilizado um viscosímetro modelo LVDV-I+ - Brookfield ®. A melhor viscosidade apresentada foi no spindle S 1: 546,5 de viscosidade (cP) com 50 rpm e 90,0% de torque. A taxa de cisalhamento foi ainda variada de 0,5 à 50 rpm. As viscosidades permaneceram aproximadamente constantes durante a variação da taxa de cisalhamento (539,9; 569,9; 599,9; 575,9; 569,9; 563,9; 557,9; 557,9 e 546,5 cp.). A levana, produzida pelo Bacillus subtilis isolado do natto, apresentou um comportamento Newtoniano (viscosidade independente da taxa de cisalhamento).



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COMPARAÇÃO DAS TORTAS DE SOJA, MAMONA E MILHO COMO FONTE DE CARBONO PARA A PRODUÇÃO DE LIPASE POR B. ribis EC-01, COM E SEM ADIÇÃO DE MEIO MÍNIMO DE

VOGEL

Tiago Zaminelli1, Heitor M. R. Dias1, Milena M. Andrade2, Josana M. Messias1, Maria Inês Rezende1, Robert F. H. Dekker3 e Aneli M. Barbosa1*

1Departamento de Bioquímica e Biotecnologia e 2Departamento de Química, CCE,

Universidade Estadual de Londrina - PR, CEP: 86051-990. *[email protected] 3Biorefining Research Initiative, Lakehead University, Thunder Bay, Ontario,

Canada P7B 5E1 As lipases são glicerol éster hidrolases (E.C. 3.1.1.3) que catalisam a hidrólise de acilgliceróis de cadeia longa, liberando diglicerídeos, monoglicerídeos, ácidos graxos livres e glicerol. Estas enzimas possuem amplas aplicações nas indústrias de polpa e papel, detergentes, alimentos, podendo também ser utilizadas na produção de biodiesel. O Botryosphaeria ribis EC-01 foi previamente selecionado como produtor de lipase, dentre nove isolados de Botryosphaeria. Neste trabalho foram comparados os resíduos agroindustriais torta de soja, mamona e milho como fontes de carbono para a produção de lipase pelo referido fungo, através de fermentação submersa, com e sem adição do meio mínimo de Vogel. Os cultivos foram desenvolvidos em quadruplicatas, em frascos de Erlenmeyer de 125ml (proporção ar/meio 5:1) contendo 1,0% (m/v) das respectivas fontes de carbono, com e sem adição dos sais de Vogel, durante 5 dias, sob agitação constante a 180 rpm, e mantidos a 28 ºC. Os sobrenadantes obtidos após centrifugação foram utilizados como extrato enzimático. A atividade de lipase foi determinada por espectrofotometria, utilizando-se o palmitato de p-nitrofenila (pNPP) como substrato a pH 8,0 e 55 oC, por 2 min, a 410nm. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade em µmol de pNP (p-nitrofenol) liberado por minuto da solução de enzima. Os títulos mais elevados de lipase foram obtidos em torta de soja (14,1 ± 1,5 U/mL), seguido da torta de mamona (12,6 ± 0,7 U/mL). A torta de milho foi a fonte de carbono que proporcionou menor produção de lipase pelo B. ribis EC-01 (1,0 ± 0,4 U/mL). Nos cultivos aos quais foram adicionados os sais de Vogel e torta de soja ou mamona, observou-se forte inibição da síntese da lipase, 99,3% (0,1 ± 0,1 U/mL) e 93,7% (0,8 ± 0,1 U/mL), respectivamente. Entretanto, o meio de Vogel estimulou a síntese de lipase nos cultivos com a torta de milho (4,4 ± 0,2 U/mL). Portanto, a composição destes resíduos agroindustriais favorece ou não a síntese da lipase por B. ribis e as tortas de soja e mamona foram os substratos selecionados para dar continuidade à pesquisa, visto que proporcionaram os maiores títulos enzimáticos com a adição de apenas água destilada ao resíduo. Agradecimentos: Fundação Araucária, PROPPG-UEL (Projeto Nº 05730), CNPq-PIBIC e IC-UEL.



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DIVERSIDADE DE ESTIRPES DE RIZÓBIO ISOLADAS DE NÓDULOS DE FEIJOEIRO COM BASE NO PERFIL DE

PLASMÍDEO

JUSCÉLIO DONIZETE CARDOSO1, DOUGLAS FABIANO GOMES2, PRISCILA MARIA PIGATTO3, DIVA SOUZA ANDRADE4

1Colaborador no Laboratório de Microbiologia do solo, IAPAR, 2Mestrando em Biotecnologia, Universidade Estadual de Londrina. 3Graduanda de Ciências

Biológicas Bolsista CEE/IAPAR, 4PhD. Pesquisadora em Microbiologia do Solo, ASO, IAPAR, Londrina-Pr.

E-mail: [email protected]

Os plasmídeos são material genético extra cromossomal que desempenham um papel importante na interação da bactéria do gênero Rhizobium com as plantas. Os rizóbios de crescimento rápido carregam plasmídeos relacionados aos genes para a fixação de nitrogênio e para a nodulação em leguminosas. O objetivo deste trabalho foi analisar e agrupar estirpes de rizóbio isoladas de nódulos de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L) com base no perfil de plasmídeo para estudar a diversidade genética. Foram analisadas 10 estirpes provenientes da Coleção de Microrganismos de Interesse do Agronegócio do Laboratório de Microbiologia do Solo do IAPAR, isoladas de raízes de feijoeiro (IPR-Pv-). As estirpes de rizóbios foram cultivadas em meio de cultura com extrato de levedura, manitol e agar (ELMA) por 72 h a 28 ºC e transferidas para tubos contendo 5 mL de meio TY e mantidas em agitação por 48 h a 28 ºC. A seguir, retiraram–se 20 µL da suspensão bacteriana e foram inoculados nos tubos de ensaio contendo 10 mL de meio TY, esses foram mantidos estáticos por 20 h. As suspensões bacterianas foram centrifugadas durante 5 min a 5000 g, e o precipitado lavado com 1 mL de TBE 1X gelado, centrifugado novamente e ressupenso em uma solução mista (Tris-ficoll, Liozima, RNase e TBE 1X). Em seguida aplicado no gel de agarose de 0,5% com uma barra de acrílico (0,6 mm de espessura) anterior ao pente, sendo que após a remoção da barra de acrílico o espaço foi preenchido com gel de agarose 0,5% e SDS 15%. A lise celular ocorreu na cuba eletroforetica por 30 min a 25 V e os plasmídeos separados a 100 V por 4 h e o gel corado com brometo de etídio. A estirpe CFN 42 de Rhizobium etli foi utilizada com marcador de referência. As 10 estirpes (IPR Pv-) foram analisadas de acordo com os perfis de plasmídeos obtidos e agrupadas e foi observado que existe uma diversidade elevada entre essas estirpes.



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EFEITOS DA ADIÇÃO DE DEJETOS DE SUÍNOS NO SOLO SOBRE A COMUNIDADE MICROBIANA

MARIA APARECIDA DE MATOS1, ORAZÍLIA FRANÇA DORIGO1, GISELE MILANI

LOVATO2, JUSCÉLIO DONIZETE CARDOSO3, DIVA SOUZA ANDRADE4

1Profissional de Ciência e Tecnologia, Laboratório de Microbiologia do Solo, IAPAR 2Mestre em Microbiologia, Laboratório de Microbiologia do Solo, IAPAR;

3Colaborador em Microbiologia do solo, IAPAR; 4PhD. Pesquisadora em Microbiologia do Solo, ASO, IAPAR

Na constituição do solo ocorrem modificações qualitativas e quantitativas de acordo com os diferentes tipos de manejo aplicado. A incorporação de resíduos ao solo pode determinar favoravelmente ou não o estabelecimento de diferentes grupos microbiano. Avaliaram-se os efeitos da aplicação de dejetos de suínos na comunidade microbiana do solo. As amostras de solo (Latossolo Vermelho Distroférrico), textura argilosa, foram coletadas em dezembro de 2007, de um experimento conduzido desde 1997, na Estação Experimental de Palotina do Instituto Agronômico do Paraná. Os tratamentos avaliados foram aplicações das doses de dejetos de suínos de 0, 30, 60, 90 e 120 m3

ha-1 ano-1 e profundidade de 0-10, 10-20, 20-40 e 40 a 60 cm de solo. As comunidades de bactérias e fungos foram determinadas pelo número mais provável (NMP) de acordo com o método de plaqueamento em gotas. A partir de suspensões de solo foram preparadas diluições decimais em meio de cultura agar nutriente, para bactéria e meio de Martin para fungo em banho-maria. Alíquotas das diluições de solo foram transferidas para placa de petri em gotas formando arranjos de cinco diluições e cinco repetições, incubadas a 28ºC. A estimativa do NMP para os dois grupos microbianos foi realizada utilizando tabelas de probabilidades de ocorrências. Nas quatro profundidades o número de bactérias e fungos variou entre 4,8 a 6,3 UFC g solo e 1,9 a 5,2 UFC g de solo, respectivamente. Para os dois grupos microbianos não foi constatado diferenças significativas com a aplicação de dejetos de suínos no solo em todas as profundidades. Comparando-se entre as profundidades, observaram-se maiores valores médios do número de microrganismos na rizosfera, constatando-se que houve diferenças significativas no NMP entre a profundidade de 0-10 cm com as demais profundidades. A aplicação de dejetos de suínos no solo em sistema de plantio direto não alterou a comunidade de bactérias e fungos.



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EFEITOS DO TRATAMENTO COM SIBUTRAMINA NA HISTOLOGIA GONADAL E NO DESEMPENHO REPRODUTIVO

DE RATOS MACHOS WISTAR, NÃO OBESOS

Cibele S. Borges1, Isabel C. C. Camargo2.

1 Aluna de graduação em Engenharia Biotecnologica e Bolsista Iniciação Científica (FAPESP), Faculdade de Ciências e Letras de Assis, UNESP.

2 Docente do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências e Letras de Assis, UNESP.

Obesidade é uma doença metabólica comum em humanos, sendo um dos principais fatores de risco para várias patologias. O uso de drogas anorexígenas é freqüente para o tratamento de obesidade, destacando-se o fármaco sibutramina. Várias pessoas que apresentam Índice de Massa Corpórea (IMC) adequado, mesmo sem precisarem fazem uso da sibutramina. Embora há relatos na literatura que a droga promove elevação da pressão sangüínea e freqüência cardíaca, não foram obtidas informações relacionadas aos efeitos colaterais na reprodução. Assim, o estudo teve como objetivo investigar os efeitos da administração experimental de sibutramina na histologia gonadal e no desempenho reprodutivo de ratos machos, não obesos. Foram utilizados 32 ratos adultos da linhagem Wistar, divididos em dois grupos experimentais (n=16/grupo): controle (2,0 mL de água destilada) e grupo tratado (sibutramina na dose de 5mg/kg de peso corpóreo, em volume de suspensão aquosa de 2,0 mL). Os tratamentos foram efetuados através de dose única, via oral, durante 30 dias. Ao final do período de tratamento, 8 machos de cada grupo experimental foram sacrificados, para avaliação histológica gonadal em microscopia de luz. Os animais restantes de cada grupo foram acasalados com fêmeas, não tratadas, para avaliação do desempenho reprodutivo e produtos de gestação. Os resultados demonstraram que não houve diferença significativa no peso testicular dos dois grupos experimentais, no entanto, o peso corpóreo foi significativamente (p<0,05) reduzido nos animais tratados com sibutramina. A droga não promoveu alterações na estrutura histológica gonadal, e os parâmetros fetais não foram afetados pelo tratamento com a sibutramina. Concluiu-se que, nas condições experimentais e na dose terapêutica, a sibutramina não promoveu efeitos tóxicos na estrutura gonadal dos ratos e nos parâmetros fetais.



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EFEITOS METABÓLICOS DA FISETINA SOBRE O METABOLISMO HEPÁTICO

Mariana de Kássia Cardoso Ono (PIBIC-CNPq-FA-UEM); Rodrigo Polimeni Constantin; Cristiane Vizioli de Castro; Adelar Bracht; Nair Seiko Yamamoto

(Orientadora), email: [email protected]

Universidade Estadual de Maringá/ Departamento de Bioquímica – Maringá – PR.

A fisetina (3,7,3”, 4’-trahidroxiflavona) é um flavonóide encontrado na planta Cotinus coggyria e é também distribuída em frutas e vegetais, tais como morango, maçã, uva, cebola e pepino. Exibe uma ampla variedade de propriedades biológicas, incluindo efeitos neurotróficos, antioxidantes, antiinflamatórios, antidiabéticos, antiangiogênicos e anticarcinogênicos. O efeito biológico mais conhecido dos flavonóides é sua ação antioxidante, entretanto, os efeitos potencialmente tóxicos da fisetina e outros flavonóides têm que ser levados em consideração, desde que tem sido demonstrado que em doses elevadas, os flavonóides podem atuar como agentes mutagênicos, prooxidantes e também como inibidores de enzimas envolvidas no metabolismo energético e hormonal. O presente trabalho foi planejado para investigar a ação da fisetina sobre o metabolismo da glicose em fígados perfundidos isolados de ratos. Algumas atividades de enzimas reguladoras do metabolismo da glicose também foram avaliadas. A fisetina não alterou significativamente o consumo de oxigênio de fígados perfundidos isolados de ratos alimentados, mas inibiu a liberação de glicose, lactato e piruvato a partir de glicogênio endógeno. A máxima inibição da glicogenólise (49%) e glicólise (59%) foram obtidas com a concentração de 200 µM. Os efeitos glicogenolíticos do glucagon e do 2,4-dinitrofenol foram inibidos pela fisetina 300 µM. Não foram encontradas diferenças significativas nos conteúdos celulares de ATP, ADP e AMP. A fisetina aumentou os conteúdos celulares de glicose 6-fosfato e inibiu a atividade da enzima glicose 6-fosfatase. A gliconeogênese a partir de lactato e piruvato foi inibida pela fisetina em uma maneira dose-dependente. A inibição já era evidente na concentração de 50 µM e foi quase completa com 300 µM. A transformação de frutose em glicose também foi inibida. A carboxilação do piruvato em mitocôndrias intactas foi inibida (IC50 = 163.10 ± 12.28 M), mas este efeito não foi observado em mitocôndrias rompidas. Concluiu-se que a fisetina inibe a liberação de glicose em fígados de ratos alimentados e jejuados. A inibição do transporte de piruvato na mitocôndria e a redução do potencial redox NADH-NAD+ citosólico parecem ser as principais causas da inibição da gliconeogênese. Uma possível ação inibitória da fisetina sobre a atividade da glicogênio fosforilase em fígados de ratos alimentados não pode ser excluída.



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ESTUDO DA MICROENCAPSULAÇÃO DE Lactobacillus acidophilus POR SPRAY DRYER

Menezes, C.R.1, Calderón, L.P.P.1*, Chavez, G.M1, Michelini, R.P1, .Cardozo, G.M.B.Q.

2, Silva, R.A.2 Antunes, A.E.C.1 ,Liserre, A.M.1* , Moreno, I1 1Instituto de Tecnologia de Alimentos-Tecnolat, Av. Brasil, 2880, Campinas-SP; 2Instituto de Tecnologia de Alimentos- CCQA, Av. Brasil, 2880, Campinas-SP.

* e-mail: [email protected]

A microencapsulação de bactérias consiste em uma tecnologia que pode aumentar a resistência de microrganismos probióticos, garantindo a viabilidade celular em alimentos e também durante a sua passagem pelo suco gástrico e entérico. Devido à crescente demanda e consumo de produtos probióticos no Brasil, o estudo de técnicas e materiais que aumentem a eficiência da microencapsulação de probióticos é importante. Este trabalho teve por objetivo desenvolver e avaliar microcápsulas contendo a cultura probiótica Lactobacillus acidophilus utilizando o método de microencapsulação por spray drying, e avaliar a estabilidade das microcápsulas em diferentes condições de pH. A cepa utilizada de Lactobacillus acidophilus na concentração de 1x1010 UFC/g foi submetida à microencapsulação com CAP, ou seja, acetato ftalato de celulose, maltodextrina, glicerol, inulina, Tween 80 e leite reconstituído. Procedeu-se então com a secagem no spray dryer nas condições de temperatura de entrada de 110ºC, fluxo do ar a 439 L/h e vazão a 6 ml/min. Realizou-se posteriormente o teste de dissolução das cápsulas em tampões com pH 4,5; 6,0 e 7,5 retirando-se alíquotas após 60, 120 e 180 minutos. A análise das cápsulas foram obtidas através de imagens capturadas utilizando câmera OLY-200 acoplada ao microscópio óptico Olympus CX41 e software de análise de imagem - Image-Pro® Plus - version 4.0 for WindowsTM from Media Cybernetics. Os microrganismos encapsulados analisados por microscopia óptica apresentaram visualização uniforme das partículas geradas, com boa distribuição e morfologia. Os resultados demonstraram que a liberação da cultura probiótica em pH 4,5 não ultrapassou a 2,3 x 105 UFC/g na contagem em placa, durante os 180 minutos de dissolução, isso demonstrou que as cápsulas foram pouco dissolvidas pela solução com pH ácido. Já para os testes em pH 6,0 e 7,5 observou-se uma liberação de 2,01 x 108 UFC/g, demonstrando uma boa viabilidade da cultura no pós-processamento. Estudos realizados por Fávaro-rindade e Grosso (2004) demonstraram resultados muito similares. Portanto, devido à alta viabilidade da cultura probiótica após o processamento, a secagem em spray dryer mostrou-se uma técnica altamente eficiente para a formulação de partículas a base de CAP e adicionadas de bactérias probióticas. Apoio Financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.



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ESTUDO DE DIFERENTES CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO PARA A PRODUÇÃO DE EXOPOLISSACARÍDEO POR Bacillus

subtilis NATTO.

Márcio Cilião Filho1, Maria A. P. C. Celligoi 2.

1 – Aluno do curso de Especialização em Bioquímica Aplicada, BBTEC, CCE, UEL. 2 – Docente do Departamento de Bioquímica e Biotecnologia (BBTEC), CCE, UEL.

Exopolissacarídeos (EPS) são carboidratos secretados extracelularmente no meio de cultivo por microrganismos, os quais apresentam diferentes aplicações industriais. Entre os diversos tipos de EPS destaca-se a levana, um polímero de frutose com ligações (2-6), que tem aplicações como fixador de cores e sabores, agente imunomodulador, antitumoral, estabilizantes, espessante entre outras. Devido as importantes perspectivas de aplicações deste biopolimero e a habilidade dos microrganismos de produzi-lo, este trabalho visou estudar as diferentes condições de fermentação para a produção de EPS (levana) por Bacillus subtilis NATTO variando a concentração de açúcar no caldo de cana, o tempo de cultivo, a temperatura e agitação, mantido o pH em 6,0. Foi utilizado um delineamento fatorial 24 para selecionar as melhores variáveis na produção de levana por B. subtilis NATTO. A maior produção de levana (85,58gL) ocorreu em 300g/L de açúcar em caldo-de-cana a 40ºC, sob agitação de 100rpm, tendo seu tempo de cultivo estabelecido em 24h. A concentração de açúcares e o tempo de cultivo foram as variáveis que mais afetaram a biossintese de levana. A concentração de açúcares do caldo foi significativa e maior, indicando que maior concentração favorecem a produção. As variáveis, temperatura e tempo foram importantes para a produção e a agitação foi o que menos influenciou no processo. O Bacillus subtilis NATTO se mostrou promissor para a produção de levana.



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HIDRÓLISE DO FARELO DE MANDIOCA POR TRATAMENTO ÁCIDO TERMOPRESSURIZADO

Freitas, A.C.1*, Oliveira, F.2 & Oliva-Neto, P.

1Dpto. de Ciências Biológicas, FCL - Unesp, CEP 19806-900, Assis/SP, Brasil; 2Dpto. de Ciência de Alimentos, FEA – Unicamp, CEP 13035-388, Campinas/SP,

Brasil. * [email protected]

A aplicação de bioprocessos em resíduos agro-industriais não só contribui para minimizar o impacto ambiental como atribui um valor econômico a esses substratos. As fecularias geram, em média, para cada tonelada de raiz processada, 254 Kg de fécula com cerca de 10% de umidade e 928 Kg de farelo de mandioca (subproduto) com 85% de umidade. Este trabalho teve por objetivo realizar e avaliar a eficiência do processo de hidrólise do amido do farelo de mandioca, por meio de tratamento ácido termopressurizado, para posterior fermentação e produção de bioetanol. O farelo seco, doado pela fecularia Halotek Fadel Ltda., foi analisado quanto às características bromatológicas e físico-químicas, apresentando 13,74% de umidade, 67,20% de carboidratos, 60,48% de amido e 20,01% de fibra bruta. Foi elaborado uma suspensão de farelo e água (50 g / 1000 mL), acidificada com solução de H2SO4 (9,14 M) e homogeneizada em liquidificador. Os tratamentos foram realizados em autoclave (121 2ºC). As variáveis analisadas foram pH (0,5 e 1,0) e tempo de reação (30 e 60 min). As amostras, sem tratamento e hidrolisadas, foram caracterizadas quanto a concentração de glicose pelo método Glucox (Doles Ltda.). Observou-se que a maior taxa de hidrólise ocorreu em pH 0,5 apresentando 2,57% de glicose em 30 min. de reação. Porém, em pH 0,5 e 60 min. de tratamento a concentração de glicose reduziu em 0,20%. As amostras em pH 1,0 apresentaram 2,06% e 1,06% de glicose nos tempos 30 e 60 min., respectivamente. A porcentagem de glicose diminuiu com o aumento do tempo de reação, possivelmente, devido à degradação das moléculas de glicose e formação de furfurais e 5-hidroximetilfurfurais (HMF). Assim, verificou-se que o caráter ácido influenciou positivamente e o tempo de reação negativamente na conversão do amido em glicose. Agradecimentos: Fapesp / Capes



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IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CLONES BAC DE COFFEA ARABICA L. HT 832/2 CONTENDO O GENE

NADPH M6PR

Silva, NV1,2 *; Cação,SB1; Pereira,LFP1,3; Vieira,LGE1

1Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), Londrina, PR. 2Universidade Estadual de

Londrina (UEL) - Londrina, PR.3Embrapa – Café, Brasília,DF, *e-mail:

[email protected].

Devido às mudanças climáticas a tolerância a estresses abióticos como estresse hídrico e salino têm tido cada vez maior importância na agricultura. Plantas com alta produção de manitol apresentam elevado grau de tolerância ao sal e déficit hídrico. Em plantas superiores, a enzima chave na produção de manitol é a NADPH-manose dependente -6- fosfato redutase (M6PR), que converte manose-6-fosfato em manitol-1-fosfato. Visando a identificação de regiões genômicas de Coffea arabica relacionadas à tolerância a estresse, esse trabalho iniciou a identificação de clones de Cromossomo Artificial de Bactéria (BAC), contendo gene de M6PR. Foi utilizada uma biblioteca BAC de café contendo 55.000 clones representando 5X o genoma do Coffea arabica Híbrido Timor 832/2. Para seleção de BACs de interesse através de PCR, os clones BACs, distribuídos em placas de 384 poços, foram agrupados por placa, formando um pool de 384 clones para extração de DNA. O DNA de cada 15 pools foi agrupado para formação de um superpool. Cada superpool representa 15 pools de placa, ou 5760 clones BACs. A identificação de clones BACs na biblioteca foi feita em duas etapas: a primeira, através da seleção em superpools e pools por PCR e posteriormente por hibridização em filtros de membrana de colônia. O gene NADPH M6PR foi identificado em cinco superpools. Os superpools foram desmembrados em pools de placa o que permitiu identificar sete pools de placa contendo o gene. Foi realizada hibridização de filtro de colônias em quatro das sete placas selecionadas para detectar diretamente o clone de interesse. Esta estratégia possibilitou a identificação até o momento de 3 clones BACs de NADPH M6PR em um total de 55.000 clones de maneira rápida e eficiente. Os clones identificados foram submetidos a PCR individualmente e confirmaram a presença do gene. As pontas dos BACs estão sendo seqüenciadas e será realizado o fingerprinting que fornecerá dados para formação de contigs e mapeamento físico. Através da identificação de BACs de C. arabica Hibrido Timor contendo genes de NADPH M6PR será possível realizar a caracterização genômica do gene, e auxiliar o mapeamento físico desta espécie, para características de interesse agronômico como a tolerância a estresses abióticos. Agradecimentos: PIBIQ-CNPq; CBP&Café, Embrapa MP2



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ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS DIAZOTRÓFICOS COM POTENCIAL DE INOCULANTE

Karina Maria Lima Milani1, Paula Cerezini2, Gisele Milani Lovato3, Alexandra Scherer4,

Elcio Liborio Balota5

1 Acadêmica de Biologia, UENP-FAFICOP, Bolsista da Fundação Araucária CNPq / IAPAR. [email protected]

2 Acadêmica de Biologia, UENP-FAFICOP, Bolsista do CEE/IAPAR. 3Mestre em Microbiologia, pesquisadora FAPEAGRO/IAPAR.

4Doutora em Agronomia, bolsista do consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café, FUNAPE/IAPAR.

5 Pesquisador Área de Solos, IAPAR.

Laboratório de Microbiologia do Solo, IAPAR – Londrina. Muitos estudos têm evidenciado a ocorrência e a importância das bactérias diazotróficas no solo em diversas culturas. Existe a ocorrência generalizada de vários microrganismos presentes no solos que realizam a fixação biológica de nitrogênio (FBN) associados às culturas tanto na região da rizosfera, como endofiticamente em várias partes da planta. Das bactérias rizosféricas o gênero mais estudado é o Azospirillum, enquanto que com relação às endofíticas, uma das mais estudadas pertence ao gênero Gluconacetobacter. Entretanto, muitos estudos evidenciaram que a promoção do crescimento de plantas pela inoculação de bactérias diazotróficas se devem não somente à FBN, mas a outros efeitos como produção de fito-hormônios, por exemplo, o ácido indol acetico (AIA). Dentro desse contexto o objetivo desse estudo foi o de isolar e selecionar bactérias diazotróficas pela sua capacidade de produzir ácido indol acético, acumular nitrogênio (N) em meio isento de N e promover o crescimento das plantas. Foram isolados microrganismos diazotróficos a partir de amostras de solo da rizosfera, raízes e folhas de diferentes espécies vegetais. As amostras foram diluídas e inoculadas em meios semi-sólido seletivo LGI-P para Gluconacetobacter e NFB para Azospirillum. Após a formação de película característica, as culturas foram repicadas objetivando sua purificação. Foram realizadas as seguintes avaliações: quantificação de AIA pelo método colorimétrico; capacidade de acumular N in vitro, determinada através do método de Kjeldhal; e teor de proteína segundo o método de Bradford. Com relação ao Azospirilum, verificou-se que todos os isolados foram capazes de produzir AIA. Entre as estirpes de Gluconacetobacter, os quatro isolados testados produziram menor quantidade de AIA que a padrão. Quanto à produção de N total o isolado de Azospirillum, IPRA-13 apresentou maior valor que outros isolados sendo superior ao padrão BR11001, entretanto com relação ao teor de proteína os maiores valores, entre os isolados, foram produzidos pela IPRA-21 que foi superior a BR11001 e inferior a BR11080. Entre os isolados de Gluconacetobacter o isolado IPRG-62 apresentou maiores valores com relação ao teor de proteina sendo superior ao padrão BR 11281. Todos os isolados testados produziram AIA em meio com e sem triptofano. Os isolados de Azospirillum IPRA-13 e IPRA-21 produziram maior quantidade de AIA que os padrões utilizados. Os isolados de Gluconacetobacter testados não produziram AIA nos níveis apresentados pela estirpe padrão utilizada. O acúmulo de N total in vitro pelos isolados foram similares aos apresentados pelas estirpes padrões utilizadas.



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ISOTERMAS DE ADSORÇÃO DE UMIDADE E PERMEABILIDADE AO VAPOR DE ÁGUA DE FILMES DE

AMIDO DE MANDIOCA E GOMA XANTANA PRODUZIDOS POR EXTRUSÃO

Isabela C.P.F.Santos1, Cristina P. B. de Melo1, Suzana Mali1*, Maria Victória E. Grossmann2,

Fabio Yamashita2 1 Universidade Estadual de Londrina – UEL – Departamento de Bioquímica, Centro de

Ciências Exatas – Londrina – PR – [email protected]

2 Universidade Estadual de Londrina – UEL – Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias – Londrina –PR

Dentre os polímeros naturais estudados para a produção de embalagens biodegradáveis, o amido é bastante promissor por apresentar ampla disponibilidade e baixo custo. Apesar disso, filmes compostos somente por amido apresentam baixa resistência à umidade, o que torna seu uso limitado como substituinte dos polímeros convencionais. A associação entre amido e goma xantana apresenta comprovada ação sinérgica de melhora de propriedades mecânicas e diminuição da instablidade e envelhecimento de produtos de amido. Neste trabalho foram estudados filmes formulados com amido, glicerol e goma xantana, produzidos via extrusão e sopro, com o objetivo de avaliar o potencial da goma xantana de diminuir a sensibilidade à umidade de filmes de amido. Os filmes plásticos a base de amido foram obtidos com adição de goma xantana em seis diferentes proporções (0, 20, 40, 60, 80 e 100 g / kg) e 200 g glicerol / kg em todas as formulações. Para determinação das isotermas de adsorção, amostras destes filmes (40 x 40 mm) foram desidratadas por 7 dias a 0% UR, sendo então submetidas à armazenamento em incubadora B.O.D, a 25oC, por 1 semana sob diferentes condições de UR (32; 47; 60; 78 e 89%). A adsorção de umidade das amostras foi determinada gravimetricamente e o modelo de Guggenhein, Anderson e Bôer (GAB) foi utilizado para representar os dados das isotermas. A permeabilidade ao vapor de água (PVA) foi determinada gravimetricamente, de acordo com as normas da ASTM E96-00 com algumas modificações. Através das isotermas de adsorção, observou-se um aumento das umidades de equilíbrio dos filmes à medida que se aumentou a UR de armazenamento e, que, a adição de goma xantana não influenciou a capacidade de adsorção de água quando adicionada em mistura aos filmes de amido. Para os valores de água de monocamada (m0), calculada a partir do modelo de GAB, quase não houve variação quando comparou-se as formulações com e sem goma xantana. A PVA das amostras variou de 1,40 a 2,28 x 10-10gm-1s-1Pa-1 e, os maiores valores foram obtidos nas formulações com os maiores teores de goma xantana, embora as diferenças tenham sido pequenas. Assim como observado nas isotermas de adsorção, a goma xantana não exerceu efeito esperado de diminuir a afinidade pela água. Agradecimentos: Ao CNPq pelo auxílio financeiro (Projeto 478109/2008-3) e aos professores e técnicos do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da UEL pelo apoio através do uso da extrusora.



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LEVEDURAS ISOLADAS DE UVAS DO NORTE DO PARANÁ: SELEÇÃO DE PRODUTORAS DE BETA-GLUCANASES E

COMPARAÇÃO DE BOTRIOSFERANA E BIOMASSA MICELIAL COMO FONTES INDUTORAS

Bauermeister, A1, Amador, I.R1, Rezende, M.I.1 , Dekker, R.F.H.2, Pérez, A.I.B.3,

Barbosa, A.M.1 1Depto de Bioquímica e Biotecnologia, CCE, Universidade Estadual de Londrina, CEP

86051-990, CX Postal 6001, Londrina –PR, Brasil. 2Biorefining Research Initiative, Lakehead University, Thunder Bay, Ontario, Canada P7B 5E1, , 3Castilla-La Mancha University, Depto de Química Analítica e Tecnologia de Alimentos, Av. Camilo Cela,

s/n. 13071, Ciudad Real, Espanha. * e-mail: [email protected]

Beta-glucanases (EC 3.2.1.6) e beta-glicosidases (EC 3.2.1.21) são hidrolases

que podem ser aplicadas no processo de vinificação, visto que hidrolisam ligações entre o monômero de glucose e os grupamentos agliconas de compostos fenólicos e aromáticos voláteis, contribuindo para melhorar as características organolépticas do vinho.

Foram isoladas noventa e nove leveduras de mosto e de oito variedades de uvas viníferas e de mesa coletadas em propriedades rurais do norte do Paraná. Quinze cepas de leveduras isoladas de vinícolas espanholas foram concomitantemente avaliadas através de uma técnica de zimograma para detectar a produção qualitativa de beta-glucanases, utilizando-se o EPS botriosferana como fonte de substrato. As leveduras foram também cultivadas em meio líquido em frascos de Erlenmeyer (50 mL), contendo meio mínimo de Vogel (10 mL) e 0,1 % (v/v) do EPS como fonte de carbono, sob agitação constante a 180 rpm e 28 °C, durante 96 horas. O inóculo consistiu de 1 x 107 células, retiradas de placas de YEPD (extrato de levedura, peptona e glucose) com 96 horas de cultivo. Nos extratos livres de células (ECF) foram determinadas as atividades de ambas enzimas. A atividade de beta-glucanase foi determinada utilizando-se laminarina como substrato enquanto que a de beta-glicosidase o p-NPG (Giese et al., 2005)

Para selecionar a melhor fonte de carbono para a produção de ambas as enzimas, a levedura que produziu maiores títulos de ambas as hidrolases (1WA1) foi cultivada em botriosferana, em biomassa micelial de Botryosphaeria rhodina, previamente esterilizada e desidratada (desnaturada) e não esterilizada e desidratada (in-natura). Maior produção de ambas as enzimas foi obtida nos cultivos com biomassa micelial “in natura” (2,1 U/mL). Cultivos com diferentes concentrações (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 3,0 % m/v) desta última fonte de carbono liofilizada e pulverizada foram desenvolvidos e 1,0 % (m/v) foi a concentração que proporcionou maiores níveis de atividade específica (1,7 U/mg). Ensaios da atividade da beta-glucanase foram desenvolvidos em pH 3,5 em tampão citrato e em citrato-fosfato, na presença de 15 % (v/v) de etanol simulando o valor de pH e concentração de etanol do vinho. A beta-glucanase da levedura selecionada não foi inibida nas referidas condições de ensaio citadas.

Agradecimentos: Fundação Araucária (Projeto No 13056), CAPES/DGU/Projeto No153/08



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MICROESTRUTURA DE FILMES COMBINANDO AMIDO DE MANDIOCA E GOMA XANTANA PRODUZIDOS POR EXTRUSÃO

Cristina P. B. de Melo1, Suzana Mali1*, Maria Victória E. Grossmann2, Fabio Yamashita2

1 Universidade Estadual de Londrina – UEL – Departamento de Bioquímica, Centro de Ciências Exatas – Londrina – PR – [email protected]

2 Universidade Estadual de Londrina – UEL – Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias – Londrina –PR

O amido apresenta vantagens para aplicação em filmes biodegradáveis como a

plasticidade, abundância e baixo custo; mas também apresenta limitações, dentre as quais a baixa resistência à umidade e a variação das propriedades mecânicas sob diferentes condições de armazenamento. Assim sendo, a confecção de embalagens utilizando amido exige a introdução de aditivos, que apresentem o potencial de melhoria das suas propriedades funcionais. Embora poucos estudos tenham sido realizados empregando a goma xantana como coadjuvante na produção de filmes de amido por extrusão, esse hexopolissacarídeo biodegradável e de fonte renovável apresenta bom potencial de utilização como aditivo devido às seguintes características: arranjo molecular que lhe confere capacidade de formação de filmes com boa resistência, especialmente quando submetida ao processo de extrusão e comprovada ação sinérgica com o amido como espessante e estabilizante em alimentos e veículos para medicamentos. O objetivo deste trabalho foi produzir filmes à partir de misturas de amido de mandioca e goma xantana, pelo processo de extrusão e caracterizá-los quanto microestrutura, adsorção de umidade e propriedades de barreira. Pellets de seis combinações de amido de mandioca e goma xantana (Tabela 1) foram obtidos em extrusora laboratorial monorosca, marca BGM modelo EL-25 e em seguida, foram alimentados à mesma extrusora, acoplada a uma torre de balão para a elaboração de filmes tubulares por sopro. Amostras, previamente secas, destes filmes foram fraturadas em nitrogênio líquido e, em seguida, novamente secas e cobertas por uma película de ouro. As imagens foram registradas por microscópio eletrônico de varredura FEI QUANTA 200 (Oregon - EUA), utilizando um acelerador de voltagem 20 kV. Os filmes contendo somente amido e glicerol apresentaram-se contínuos e homogêneos. Os filmes contendo goma xantana apresentaram superfície bastante irregular e reticulada e, à medida que se aumentou a concentração de xantana, esta característica se tornou mais pronunciada. As fraturas não apresentaram os mesmo filamentos rugosos presentes na superfície. De acordo com dados de literatura, quando a xantana é submetida à extrusão, que combina o estresse mecânico, as altas pressões e temperaturas, isto resulta em uma mudança da estrutura helicoidal das moléculas, promovendo uma aproximação das cadeias laterais e cadeia principal, causando a quebra das ligações intermoleculares originais. Durante a fase de resfriamento, ao sair da extrusora, é formada uma rede contínua, mantida por estruturas helicoidais de diferentes comprimentos intercaladas por uma grande proporção de material amorfo não helicoidal. Estas observações se harmonizam com as imagens da superfície dos filmes.

Agradecimentos: Ao CNPq pelo auxílio financeiro (Projeto 478109/2008-3) e aos professores e técnicos do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da UEL pelo apoio através do uso da extrusora.



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MONITORAMENTO DO PROCESSO INDUSTRIAL NA PRODUÇÃO DE ETANOL COMBUSTÍVEL POR MEIO DE

TÉCNICAS MOLECULARES

LOPES, D. D.1, MARTINS, P. F.2, ANDRADE-NOBREGA, G.M.A3. PACCOLA-MEIRELLES, L.D.3

Laboratório de Genética de Microrganismos, Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina. Campus

Universitário. 1 Estudante Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular. 2 Estudante de Graduação, 3 Docente Departamento de Biologia Geral.

[email protected]

Leveduras são organismos amplamente encontrados na natureza que possuem grande importância econômica por participarem de diversos processos industriais de fermentação. O gênero Saccharomyces é o mais utilizado na indústria produtora de fermentados que tem como produto final o álcool, seja para o uso como biocombustível ou para obtenção de bebidas alcoólicas. Linhagens de Saccharomyces cerevisiae geneticamente melhoradas tem sido utilizadas como inóculo na produção de álcool combustível. No entanto, devido à facilidade de contaminação, a levedura fermentadora propagada no inicio da safra é rapidamente substituída por leveduras selvagens contaminantes as quais são mais adaptadas ao processo causando decréscimo da produtividade e, consequentemente, consideráveis prejuízos á indústria. Assim é necessário o monitoramento do processo industrial, para correção de problemas que possam gerar baixa produtividade. Atualmente este monitoramento tem sido feito por meio de cariotipagem eletroforética, que permite diferenciar as linhagens fermentadoras daqueles contaminantes. No entanto a técnica demanda alto custo. Desta forma, o isolamento e caracterização morfológica e genética de leveduras fermentativas industriais, são importantes para a economia do país, visto que objetivam identificar as linhagens de maior produtividade, bem como os indesejáveis contaminantes. Normalmente estes contaminantes são também do gênero Saccharomyces, o que dificulta a identificação devido as suas características semelhantes com as leveduras de interesse. O presente trabalho teve por objetivo encontrar uma metodologia rápida e eficiente na identificação das leveduras do processo e seus contaminantes. Para isso, a técnica de RFLP do DNA mitocondrial foi empregada. O DNA mitocondrial de amostras de leveduras coletadas em usinas de álcool da região de Londrina foi extraído e digerido com enzima de restrição HinfI. Após a digestão, a amostra foi submetida à eletroforese em gel de agarose e o perfil de bandas analisado. Grande polimorfismo foi observado entre diferentes linhagens utilizadas na produção de etanol e os contaminantes. Resultados obtidos demonstram que há uma alta incidência de contaminantes no processo industrial, que prejudicam a produtividade, e a técnica empregada revela-se promissora para ser utilizada no monitoramento deste processo, com baixo custo.



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PRÉ-HIDRÓLISE ÁCIDA DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM SOLVENTE

ORGANOSOLV

Lorraine P.P.Calderon1, Pablo G. Kiiper2 1,2UNESP, Departamento de ciências Biológicas, Av. Dom Antônio, Assis – SP

Email: [email protected]

A biomassa representa um dos únicos recursos energéticos renováveis, ecologicamente corretos e candidatos a substituição de combustíveis fósseis. Neste contexto, a hidrólise ácida destaca-se pela sua busca de novas fontes de açúcares para fermentação alcoólica e conseqüentemente aumento na produção de bioetanol Desta forma, a otimização do processo anterior à hidrólise é necessária para que ocorra um aumento no rendimento do processo (MARTIN, 2002). O presente estudo propôs a utilização de organosolv etanol/acetona com diferentes tempo de reação e concentração ácida, para que assim houvesse a viabilidade de uma hidrólise ácida. Durante o pré-tratamento ácido utilizou-se 500mL de solvente Organosolv (água/etanol 92º+acetona: v/v) , 500mL de água, 1.25g de sulfato de ferro III, ácido sulfúrico nas concentrações de 0, 0.5, 1 e 2% e, finalmente, 50g de bagaço. Acondicionou-se então o material em autoclave 120º C. Após o pré-tratamento, os frascos foram retirados da autoclave e o volume líquido medido. Todas as concentrações ácidas foram realizadas utilizando 30, 60 e 120 minutos para determinar qual o melhor tempo de reação para preparar o bagaço para hidrólise ácida. Os resultados a seguir demonstram que, quanto maior a concentração - entre 0,0% e 2,0% de H2SO4 - e maior o tempo de reação - entre 0 e 120 minutos - maior é o rendimento de açúcares redutores obtido. Sabe-se que o organosolv tem alta eficiência na deslignificação e Rosa (1997) demonstrou que a utilização de acetona promove ainda uma maior solubilização de lignina extraída durante o pré-tratamento. A utilização de organosolv, portanto, mostrou-se eficaz na com 1,0% de H2SO4 com 60 minutos de tempo de reação, pois a textura e o volume do bagaço são drasticamente modificados, tornando-o mais fácil de processar e preparar para a hidrólise. Devido à concentração de açúcares obtida ser alta, podemos afirmar que o hidrolisado tem concentração significativa de açúcar obtido da hidrólise da porção de hemicelulose do bagaço.



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PRESERVAÇÃO DE CULTURAS BACTERIANAS POR LIOFILIZAÇÃO

ORAZÍLIA FRANÇA DORIGO1, JUSCÉLIO DONIZETE CARDOSO2, ADERSON LIMA

FILHO3, MARIA APARECIDA DE MATOS1, DIVA SOUZA ANDRADE4.

1Profissional de Ciência e Tecnologia, Laboratório de Microbiologia do Solo, IAPAR 2Colaborador em Microbiologia do solo, IAPAR;

3Graduanda de Ciências Biológicas Bolsista CEE/IAPAR 4PhD. Pesquisadora em Microbiologia do Solo, ASO, IAPAR

Todo laboratório de Microbiologia tem preocupação de como preservar os microrganismos por períodos prolongados, garantindo a sobrevivência, estabilidade e pureza das culturas por um tempo necessário para seu estudo, constituindo assim uma Coleção de Culturas. Os métodos de preservação de culturas bacterianas são vários, sendo que, a criopreservação e liofilização são os mais utilizados. A liofilização é um método que consiste em congelar e, então, desidratar, pela remoção de água por sublimação, as culturas bacterianas e fechar a vácuo os frascos, por exemplo, as ampolas, conservando as culturas por longo período. O objetivo neste trabalho é descrever os procedimentos utilizados no método da liofilização para preservação e manutenção das culturas bacterianas, fixadoras de nitrogênio em leguminosas, da Coleção de Microrganismos do Laboratório de Microbiologia do Solo do IAPAR. Após a obtenção dos isolados de rizóbios através do isolamento bacteriano de nódulos de raízes de leguminosas os mesmos são autenticados nas respectivas plantas de origem e preservados para manutenção na Coleção de microrganismos. A metodologia consiste em obter uma cultura bacteriana pura em meio sólido contendo manitol como fonte de carbono, extrato de levedura e sais minerais. Uma porção dessas colônias bacterianas com volume aproximado de 100 µL é transferida para tubos contendo soluções esterilizadas de peptona 10% e sacarose 20%. Algumas gotas dessa suspensão de colônias bacterianas são transferidas para ampolas de vidro identificadas e previamente autoclavadas. Essas ampolas são congeladas a -18 ºC e acopladas ao aparelho liofilizador e mantidas por no mínimo 6 horas sob vácuo que deve estar abaixo de 150µHg. Após esse tempo as ampolas são lacradas sob vácuo com auxílio de um maçarico. Por precaução recomenda-se liofilizar pelo menos cinco ampolas ou frascos de cada estirpe. Após a liofilização ampolas representativas de cada lote são testadas para verificar a viabilidade das células. O armazenamento das ampolas pode ser em pastas de papel identificadas e mantidas em arquivos a temperatura ambiente, desde que não ultrapasse 30 ºC. Há algumas vantagens na utilização dessa técnica de preservação, pois permite armazenar culturas bacterianas por vários anos, evitando problemas com o novo isolamento dos microrganismos ou sua perda, economizando tempo, mão de obra e materiais. Nesse processo ocorre a vedação total das amostras garantindo longa viabilidade. Ás ampolas não requer armazenamento especial, somente ao abrigo da luz. Devido ao pouco espaço que as ampolas ocupam fica fácil o armazenamento de um grande número de espécime. Outras vantagens são a fácil distribuição no transporte, estabilidade elevada em muitas espécies bacterianas e produção em larga escala.



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PRODUÇÃO DE QUITINASE POR Trichoderma harzianum E SUA ATIVIDADE ANTAGONISTA

Luciano Nobuhiro Aoyagi1, Leonardo Cardoso Alves1 , Suely Mayumi Obara Doi 2

1Estagiário Voluntário, 2Departamento de Bioquímica e Biotecnologia,

Centro de Ciências Exatas, Universidade Estadual de Londrina - e-mail: [email protected]

O controle biológico empregando microrganismos para prevenir doenças em vegetais tornou-se uma alternativa para reduzir a contaminação indesejável do ecossistema, resultante do acúmulo de resíduos de agrotóxicos de elevada estabilidade. Dentre os mecanismos envolvidos neste processo, destaca-se o uso de enzimas hidrolíticas, como as quitinases, que exercem um importante papel no controle biológico de fungos fitopatogênicos, pois degradam a quitina, um dos componentes da parede celular fúngica.O Trichoderma harzianum é um dos principais fungos produtores de quitinase, com atividade em diferentes condições ambientais e eficaz na inibição de muitos fitopatógenos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de quitinase por Trichoderma harzianum em meio líquido empregando diferentes fontes de carbono e verificar sua atividade antagonista contra fungos fitopatogênicos. O Trichoderma harzianum foi cultivado em meio líquido de Vogel (v/v) suplementado com extrato de levedura (0,2 %) e uma das fontes de carbono (quitina coloidal, quitina em flocos, quitina em pó, casca de camarão moído ou micélio fúngico) (1,0%). O pH do meio foi corrigido para 6,5. Os cultivos foram realizados em erlenmeyer de 125 mL , contendo 25 mL de meio líquido e inoculados com 3 discos de micélio fúngico ( 0,5 cm de diâmetro ), a 28°C , com agitação de 180 rpm durante 5 dias. Após esse período o cultivo foi interrompido e o sobrenadante resultante foi coletado após centrifugação a 4°C, sendo denominado de extrato bruto. As atividades quitinásicas foram, então, determinadas. A atividade antagonista foi realizada através da inoculação de 1 disco de micélio de Trichoderma harzianum no centro de uma placa de ágar batata dextrose e de 2 discos de micélio de fungos patogênicos nas laterais. A atividade antagonista foi verificada através da inibição do crescimento micelial dos fungos patogênicos após incubação a 28°C, durante 7 dias.Os resultados indicaram que o micélio fúngico foi a fonte de carbono que melhor induziu a produção de quitinase pelo Trichoderma, seguido de quitina em pó e casca de camarão. A quitina em flocos e coloidal induziram a produção de baixos níveis de quitinase por este fungo. A cepa de Trichoderma harzianum avaliada apresentou atividade antagonista contra Fusarium moniliforme.



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PRODUÇÃO DE LEVANA POR Bacillus subtilis Natto, EM MEIO DE CALDO DE CANA-DE-AÇÚCAR E COM SACAROSE

Marques, A. T.1*, Filho, M.C2, Cenedesi N. V.3, Celligoi, M.A.P.C.4

1(PIBIC/CNPq/UEL), 2(Especialização em Bioquímica Aplicada/UEL), 3(BITEC/CNPq/UEL), 4(Docente do Departamento de Bioquímica e Biotecnologia/UEL)

* [email protected] Os exopolissacarídeos são produzidos por diferentes microrganismos, sendo a levana um polímero de frutose, que é produzida em grande quantidade com condições de cultivo adequadas. Bacillus subtilis Natto tem sido utilizado para síntese de diferentes nutrientes, dentre esses podemos destacar a produção de levana e ácido poli-glutâmico. A biossíntese da levana pela enzima levanassacarase utilizando sacarose como substrato, ocorre por reações características de hidrólise da sacarose, polimerização da frutose e introdução de ramificações, formando assim o polímero. Esse exopolissacarídeo apresenta diferentes aplicações biotecnológicas, sendo principalmente utilizado em indústrias farmacêuticas, de alimentos e do ramo cosmético. Considerando as inúmeras aplicações dos exopolissacarídeos nas indústrias biotecnológicas, a possibilidade de utilização de sacarose e do caldo-de-cana de açúcar, substratos de baixo custo, conciliado ao potencial produtivo da bactéria, Bacillus subitilis Natto este trabalho teve como objetivo estudar diferentes condições de cultivo para conhecer a produção e produtividade de levana. B. subtilis Natto foi isolado de grão de soja fermentado no Departamento de Bioquímica e Biotecnologia/UEL e identificado pela Fundação de Culturas Tropicais: André Tosello. A produção de levana ocorreu variando-se o tempo de fermentação (24, 36 e 48 horas), a concentração de açúcares no meio de sacarose e caldo de cana-de-açúcar (100, 200 e 300 g.L-1), temperatura (30, 35 e 40°C) e agitação (100, 150 e 200 rpm). Os inóculos foram padronizados em 0,2 g.L-1. O processo fermentativo foi em batelada em frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 25 mL dos meios de fermentação, em pH 7. Após os tempos, as fermentações foram interrompidas por centrifugação em 9000 rpm, por 10 minutos em 4°C. Dos sobrenadantes foi precipitada a levana produzida com etanol absoluto (1:3 v/v) e quantificada por unidades de frutose segundo Ananthalakshmy & Gunasekaran (1999). A maior produção de levana no meio com sacarose foi de 170,13 g.L-1 (300 g.L-1 de sacarose, 48 horas de fermentação, 30°C e 100 rpm de agitação). No caldo de cana-de-açúcar a maior produção foi de 62,19 g.L-1 (300 g.L-1 de sacarose, 48 horas de fermentação, 40°C e 200 rpm de agitação). As fermentações em caldo de cana-de-açúcar apresentaram uma menor produção de levana, comparada as mesmas condições no meio com sacarose. Provavelmente, essas menores produções são ocasionadas pela presença de sais no caldo de cana-de-açúcar, que inibem a produção de levana. Observou-se em ambos os meios, maiores produções de levana nas maiores concentrações de sacarose (300 g.L-1). Ananthalakshmy & Gunasekaran (1999) também verificaram a influência da concentração inicial dos açúcares do meio de cultivo na produção de levana.



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SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS ISOLADOS DA MATA ATLÂNTICA PRODUTORES DE LIPASE TOLERANTE A

SOLVENTES E EXTREMOS DE pH

Bruno H. Oliveira, Pedro O. Neto, Valéria M. G. Lima Laboratório de Biotecnologia Industrial, Departamento de Ciências Biológicas,

Faculdade de Ciências e Letras, UNESP Campus de Assis – SP

Lipases catalisam hidrólise ou síntese de acilgliceróis de cadeia longa e devido às suas propriedades bioquímicas despertam interesse em vários segmentos. Entretanto, podem não suportar as condições de aplicação em biocatálise. A Mata Atlântica dispõe de uma enorme biodiversidade ainda por ser estudada, o que possibilita o isolamento de microrganismos que possam produzir lipases com propriedades especiais. O presente trabalho teve como objetivo selecionar microrganismos da Mata Atlântica produtores de lipases estáveis a solventes orgânicos e ativas em pHs extremos. Foram estudadas 50 cepas de fungos filamentosos isolados da Mata Atlântica ainda sem identificação taxonômica mantidas no Lab. de Biotecnologia Industrial (UNESP-Assis/SP). Os fungos foram selecionados pela capacidade de formação de halo fluorescente a 350 nm quando cultivados em meio BDA (39 g/L), Rodamina b 0,001% (m/v), óleo de oliva 1% (v/v) e Tween 80 (2 gotas), 5 dias a 29 C. A fermentação submersa foi realizada em meio contendo óleo de oliva 1% (m/v), Tween 80 1,5% (m/v) e extrato de levedura 0,5% (m/v), a 180 rpm e 29 °C. A cada 24 h o cultivo foi filtrado, a biomassa medida por gravimetria e a atividade enzimática acompanhada pela hidrólise do palmitato de p-nitrofenila (pNPP), a 37 °C e 410 nm. A estabilidade aos solventes orgânicos foi determinada pela incubação do sobrenadante em 20 a 90% (v/v) de etanol, metanol e isopropanol, 1h a 30 °C. O efeito do pH na atividade foi estudado variando-o entre 2,6 e 10 e acompanhando a liberação de p-nitrofenol por 7 min a 37°C. Das 50 cepas cultivadas em placas, 14 apresentaram halo fluorescente e foram cultivadas em fermentação submersa para quantificação da atividade enzimática. A cepa identificada como MA 41 apresentou atividade máxima de 4,96 U/mL em 72 h de cultivo. Após 1 h de incubação com diferentes solventes verificou-se maior estabilidade frente a metanol do que com isopropanol ou etanol. Em até 60% de metanol a perda de atividade enzimática é de no máximo 30%. A atividade enzimática mantém-se estável a até 20% de etanol. Após incubação em 20% de isopropanol verificou-se 88% da atividade inicial e entre 60 e 90% não se observou mais que 30% de atividade residual. Em pH ácido não foi verificada atividade enzimática, porém em pH alcalino foram obtidos altos valores de atividade. Embora a atividade mais alta tenha sido obtida em pH 8, em pH 9 e 10 obteve-se ainda 75% e 65% dessa atividade, respectivamente. A atividade lipolítica detectada nos cultivos com a cepa MA 41 apresenta estabilidade na presença de metanol e atividade em pH alcalino. Estas propriedades são importantes para, por exemplo, aplicação em reações de transesterificação para produção de biodiesel ou para a indústria de detergentes.



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SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FOSFATO PARA PRODUÇÃO DE INOCULANTE AGRÍCOLA

Paula Cerezini1, Karina Maria Lima Milani2, Gisele Milani Lovato3, Alexandra Scherer4,

Elcio Liborio Balota5

1Acadêmica de Biologia, UENP-FAFICOP, Bolsista do CEE/IAPAR. [email protected]

2Acadêmica de Biologia, UENP-FAFICOP, Bolsista da Fundação Araucária CNPq / IAPAR.

3Mestre em Microbiologia, pesquisadora FAPEAGRO/IAPAR. 4Doutora em Agronomia, bolsista do consórcio Brasileiro de Pesquisa e

Desenvolvimento do Café, FUNAPE/IAPAR. 5Pesquisador Área de Solos, IAPAR.

Laboratório de Microbiologia do Solo, IAPAR – Londrina.

O fósforo é um macronutriente do solo essencial para o metabolismo e desenvolvimento dos organismos ali presentes. O teor de fósforo total do solo é alto, entretanto grande parte se encontra indisponível para as plantas, porque ele está ligado a componentes orgânicos e inorgânicos, podendo causar limitações no desenvolvimento das plantas afetando a produção agrícola. Com isso, o uso de altas doses de fertilizantes fosfatados é imprescindível para suprir essa deficiência, encarecendo a produção. A solubilização de fosfato por microrganismos presentes no solo é um importante processo para a disponibilização de fósforo às plantas, através dos processos de mineralização e solubilização desse elemento. Dentro deste contexto o objetivo deste trabalho foi selecionar microrganismos com capacidade de solubilizar fosfato in vitro, em meio sólido e em meio líquido. Os microrganismos foram isolados a partir de amostras de solo e raízes de solo de diferentes espécies vegetais e de regiões do Paraná. As amostras foram submetidas a diluições sucessivas, inoculadas em meio sólido para solubilizador de fosfato (Sylvester-Bradley et al. 1982) e caracterizados pela formação de um halo transparente formado ao redor das colônias. A avaliação da capacidade de solubilização de fosfato in vitro foi feita através da avaliação do diâmetro do halo e pela solubilização do fosfato em meio líquido. Os microrganismos que apresentaram maior diâmetro de halo foram selecionados para avaliar sua capacidade de solubilização em meio líquido, onde foram avaliados os seguintes parâmetros: pH, teores de P solúvel e fosfatase ácida. Foram obtidos 35 isolados com capacidade de solubilizar fosfato, dos isolados testados foi verificado que todos apresentaram capacidade de solubilização de fosfato em meio sólido, evidenciando que eles não perderam esta capacidade no processo de purificação e armazenagem. O isolado IPRS-090 apresentou maior diâmetro de halo. Dos 6 isolados selecionados para a avaliação em meio líquido, todos acidificaram levemente o meio, com decréssimo de até 25% do pH com relação ao branco. A capacidade de solubilização in vitro pelos microrganismos solubilizadores de fosfato (MSF) diferiu entre os isolados. Os isolados IPRS-082 e IPRS-090 apresentaram valores de P-solúvel superior em 309% e 276%, respectivamente, com relação ao IPRS-107. Todos isolados apresentaram alta atividade da fosfatase ácida em relação ao branco, sendo que a maior atividade foi apresentada pelo IPRS-074. Todos os isolados obtidos mantiveram sua capacidade de solubilizar o fosfato em meio sólido. Os isolados IPRS-74, IPRS-82 e IPRS-090 apresentaram potencial para futuramente serem utilizados para a produção de inoculante microbiano.



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SÍNTESE DE ÉSTERES METÍLICOS POR TRANSESTERIFICAÇÃO UTILIZANDO LIPASE DE Fusarium sp.

ISOLADO DA MATA ATLÂNTICA

Bruno H. Oliveira, Valéria M. G. Lima Laboratório de Biotecnologia Industrial, Departamento de Ciências Biológicas,

Faculdade de Ciências e Letras, UNESP Campus de Assis – SP

Lipases são responsáveis pela hidrólise de acilgliceróis de cadeia longa e também são capazes de catalisar outros tipos de reações, como transesterificação, em ambientes aquo-restritos. Biodiesel, produzido através da transesterificação de óleos vegetais, tem surgido como uma alternativa atraente ao petróleo. A atual produção de biodiesel depende de catalisadores químicos que criam inconvenientes de poluição e exige alta quantidade de energia. As lipases podem ser uma alternativa à catálise química por atuarem em condições brandas e por liberar, além do biodiesel, glicerol com alto grau de pureza. O objetivo do presente projeto foi estudar a capacidade de transesterificação da lipase produzida por uma cepa selvagem de Fusarium sp. isolada da Mata Atlântica. O microrganismo foi cultivado em fermentação submersa em meio contendo óleo de oliva 1% (m/v), Tween 80 1,5% (m/v) e extrato de levedura 0,5% (m/v), a 180rpm e 29 °C por 72h, as células foram separadas por filtração e o sobrenadante liofilizado a -80 °C por 20h para garantir meio reacional livre de água. Foram estudados dois sistemas de transesterificação: palmitato de p-nitrofenila (pNPP) e metanol ou óleo de soja e metanol. Para a primeira metodologia utilizou-se 170mg de lipase liofilizada, 10mL de pNPP (10mM em hexano), iniciando a reação com adição de 60µL de metanol. A mistura foi incubada sob agitação orbital a 250rpm, 28 °C por 1h. Após o tempo de reação 1mL da mistura foi adicionado a 1mL de NaOH 0,1M e a fase alcalina aquosa lida a 412nm contra um branco sem enzima. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a liberação de 1µmol.min-1.g-1. Para a segunda metodologia, a transesterificação foi realizada em erlenmeyer de 50mL contendo óleo de soja (5g), razão molar óleo-metanol (3:1) e lipase de Fusarium sp. (0,2g) a 28 °C e agitação de 180rpm. A conversão de triacilgliceróis a ésteres metílicos foi acompanhada por cromatografia de camada delgada (CCD) realizada em cromatoplacas analíticas (técnica manual) como fase estacionária e uma mistura éter de petróleo, éter etílico e ácido acético (80:19:1) como fase móvel, o cromatograma foi revelado por imersão da placa em atmosfera de iodo, retirando-se amostras com 1, 4, 6 e 24h de incubação. Após 1h de reação frente ao pNPP e metanol observou-se atividade de 0,52U.g-1. Acompanhando-se a transesterificação do óleo de soja por CCD, verificou-se aumento crescente da formação de éster metílico com o tempo, com o máximo em 24 h. Os resultados obtidos sugerem que a lipase produzida pelo fungo Fusarium sp. pode ser utilizada como biocatalisador de baixo custo para produção de biodiesel a partir de óleo de soja. Além disso, etapas de alto custo envolvidas no processo químico podem ser evitadas com a utilização da enzima.



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TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE CITRUMELO “SWINGLE” COM O GENE aiiA QUE CODIFICA A ENZIMA AHL-LACTONSE

Juliana Deganello; Gislaine Vasquez de Souza; Eliandro Reis Tavares; Luiz

Gonzaga Esteves Vieira

Universidade Estadual de Londrina, Caixa Postal 6001, CEP 86051-990, Londrina- PR. A importância da citricultura para o agronegócio nacional é indiscutível, sendo o Brasil considerado o maior produtor e exportador de suco concentrado de laranja do mundo. Embora sua relevância social e econômica, os citros estão sujeitos a sérios problemas sanitários, representados por pragas e doenças que afetam a qualidade e produção. Dentre essas doenças, podemos destacar o huanglongbing (HLB), o cancro cítrico e a clorose variegada dos citros (CVC), todas causadas por bactérias. Como modo de sanar os problemas relacionados a doenças bacterianas que atingem a citricultura, a transformação genética têm se mostrado uma ferramenta auxiliar com grande potencial na produção de variedades resistentes. Trabalhos anteriores realizados com batata e tabaco demonstraram que plantas transformadas com o gene aiiA, o qual codifica a enzima AHL- lactonase, tiveram significativa resistência a bactérias causadoras de doenças. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi a obtenção de plantas transgênicas de citrumelo “Swingle” expressando o gene aiiA, sobre o controle do promotor CaMV 35S. A enzima transcrita por esse gene inativa as acil homoserinas lactonas (AHLs) que são produzidas pelas bactérias. Desse modo, o mecanismo de comunicação imprescindível na expressão da patogenicidade bacteriana, o quorum sensing, é inativado. Segmentos de epicótilos foram transformados via Agrobacterium tumefaciens estirpe EHA 105, e selecionados em meio de cultura suplementado com canamicina. Para a detecção do gene aiiA nas plantas transformadas foi utilizada a reação da polimerase em cadeia (PCR), que demonstrou a inserção do gene de interesse em duas das plantas testadas. No presente momento, análises de Southern e Northern Blot estão sendo realizadas para identificar o número de inserções do gene no genoma da planta e a sua expressão.



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USO DE SUBPRODUTOS DO PROCESSO DE REFINO DE ÓLEOS VEGETAIS NA PRODUÇÃO DE LIPASES DE Beauveria

bassiana CG 432

Michele C.B.Cruz1; Vanessa H. Sugahara1; Juliana G.Tolentino2; Polyana M. Melo2;

Geni Varéa-Pereira3

1 Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia; 2 Graduação em Farmácia, 3Dep. Bioquímica e Biotecnologia da Universidade Estadual de Londrina - PR C.P. 6001,

CEP 86051-990, Londrina-PR, Brasil. [email protected] As lípases (EC 3.1.1.3, triacilglicerol hidrolases) são definidas como

carboxilesterases, catalisadores tanto da hidrólise como da síntese de acilgliceróis de cadeia longa. São enzimas largamente presentes na natureza, sendo encontradas em animais, vegetais e microrganismos. O fungo entomopatogênico Beauveria bassiana, muito utilizado para o controle biológico apresenta ampla distribuição na natureza e de fácil produção em laboratório. O objetivo deste trabalho foi utilizar substratos de baixo custo como os óleos vegetais e resíduos oleosos, avaliando suas influências em relação ao crescimento fúngico e na produção de lipases de Beauveria bassiana CG 432. A produção de lipases foi realizada através da fermentação submersa cujo o meio de cultura foi constituído (p/v) por 1% de glucose, 0,5% de extrato de levedura; 0,16% de NaNO3; 0,11 de Na2HPO4.7H2O; 0,10% KCl; 0,06% de MgSO4.7H2O; 0,036% de KH2PO4; 0,1% de CaCl2; e foi suplementado com 3% de óleo de oliva. Foram avaliados também os efeitos de diferentes substratos oleosos (óleos refinados de girassol, de soja e de oliva e resíduos oleosos como os óleos bruto e semi-destilado de algodão e desodorizados de canola e soja) com 3% de concentração. Para determinar o tempo de crescimento fúngico, os cultivos foram realizados em triplicata e um cultivo controle (estéril) em Frascos Erlenmeyer de 250mL contendo 25mL de meio de cultura. Foram inoculados aos meios de cultura 1x108 conídios/mL e os frascos foram incubados em shaker orbital por 180 rpm a 28°C por 8 dias. Para testar a influência dos demais substratos oleosos, os cultivos foram realizados nas mesmas condições anteriores, durante 5 dias. A determinação de biomassa foi realizada por gravimetria até obter peso constante em estufa a 70°C e o sobrenadante foi dialisado em papel celofane contra tampão fosfato 50mM pH 7, obtendo-se o extrato livre de células (ELC) sendo este, destinado a determinação da atividade lipolítica. A atividade de lípases foi determinada nos ELC dos cultivos interrompidos do 1° ao 8° dia através da medida de absorvância a 410nm do p-nitrofenol liberado pela ação das lípases sobre o substrato p-nitrofenila a 37°C durante 2 minutos. A maiores produções de lipases e de biomassa fúngica com os resíduos oleosos foram com os desodorizados dos óleos de canola e de soja (aproximadamente 19,5U/mL e 189mg/mL) e com o óleo semi-destilado de algodão (19,5U/mL e 220mg/mL). Considerando os resultados obtidos, pode-se concluir que a adição de óleos vegetais refinados e desodorizados dos óleos de canola e de soja e o semi-destilado de algodão no meio de cultura, são uma alternativa viável e de baixo custo para a produção da enzima, pois, aumentaram consideravelmente o crescimento fúngico e a produção de lípases de Beauveria bassiana CG432.



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UTILIZAÇÃO DOS OLIGONUCLEOTÍDEOS PC04 E GH20 COMO CONTROLE INTERNO DE UMA REAÇÃO DE PCR PARA DETECÇÃO DO FUNGO Paracoccidioides brasilienses

Tavares, E.R. 1; Venancio, E.J. 1; Deganello, J2.

1 Departamento de Ciências Patológicas- CCB/UEL

2 Instituto Agronômico do Paraná - IAPAR Paracoccidióides brasilienses é um fungo termo-dimórfico e agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica que ocorre principalmente em homens entre 30 e 50 anos. O diagnóstico da PCM pode ser feito por exames laboratoriais como análise direta de amostras clínicas e análise histopatológica de biópsias. Atualmente vem sendo desenvolvidas técnicas de diagnósticos rápidos e específicos como é o caso da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), técnica capaz de amplificar seqüências especificas de DNA e RNA. Na PCR, além da utilização de oligonucleotídeos específicos para a detecção do agente etiológico é desejável a utilização de oligonucleotídeos adicionais como controle interno da reação, com o objetivo de minimizar a ocorrência de resultados falso-negativos. Neste trabalho foi investigada a utilização dos oligonucleotídeos PC04 e GH20, específicos para o gene da -globulina humana, como controle interno numa reação de PCR para a detecção do fungo P. brasiliensis. Para a utilização dos oligonucleotídeos PC04 e GH20, como controle interno da reação de detecção de P. brasiliensis, a PCR para P. brasiliensis foi otimizada e os melhores resultados foram obtidos nas seguintes condições. Em um volume final de 25 µl contendo tampão para a Taq DNA Polimerase 1x, 1,5 mM de Mg+2, 0,25 mM de desoxinucleotídeos, 0,2 µM dos oligonucleotídeos PC04 e GH20 e 1U de Taq DNA Polimerase foram adicionados 2,5 µl de DNA humano com concentração de 35 ng/µl como molde. O DNA usado neste estudo foi obtido a partir de amostra de sangue humano, com o Kit GFX Genomic Blood DNA Purification (Amershan Biociences). A PCR foi feita por uma desnaturação inicial de 95 °C por 2 minutos e 35 ciclos com 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C, e 1 minuto a 72 °C. Ao final manteve-se a temperatura a 72 °C por 5 min. O produto da amplificação foi separado por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% e corado com nitrato de prata a 0,15%. Como esperado foi observado um fragmento de 268 pb correspondento ao gene da beta-globulina humana. Não foram observados fragmentos inespecíficos. Os resultados obtidos mostram que os oligonucleotídeos PC04 e GH20 podem ser utilizados como controle interno de uma reação para a detecção de Paracoccidióides brasilienses.



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VARIAÇÃO DE COR EM COMPÓSITOS BIODEGRADÁVEIS A BASE DE AMIDO DE MANDIOCA, ÁLCOOL POLIVINÍLICO E FIBRAS DE CANA-DE-AÇÚCAR PARA USO POTENCIAL EM

NANOTECNOLOGIA

Flávia Debiagia; Suzana Malib

a – Estagiária de Iniciação Científica, BBTEC, CCE, UEL. b – Docente do Departamento de Bioquímica e Biotecnologia, Centro de Ciências

Exatas, Universidade Estadual de Londrina. [email protected]

O Brasil produz de 240 a 300 mil ton/dia de lixo, os quais são abandonados em lixões a céu aberto e, na maioria das vezes, desprovidos de tratamento. Como alternativa, as embalagens a base de biopolímeros podem substituir as embalagens convencionais, porém necessitam de um tratamento especial, como a adição de fibras vegetais, pois não apresentam boa flexibilidade e resistência à umidade, formando-se os compósitos. As fibras de cana-de-açúcar, por exemplo, deixam os compósitos tão resistentes quanto às embalagens convencionais, porém acabam influenciando principalmente na coloração dos compósitos, o que interfere na sua qualidade e aceitação pelo consumidor. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar a cor de compósitos a base de amido de mandioca, alcool polivinílico e cana-de-açúcar. Foi empregado um delineamento experimental de misturas ternárias simplex centróide ampliado, com 10 experimentos, utilizando-se como variáveis independentes o amido de mandioca (x1), as fibras de cana-de-açúcar (x2) e o álcool polivinílico - PVA (x3). As proporções de cada variável foram determinadas em ensaios preliminares, com os teores de amido variando de 60 a 100%, de fibras de 0 a 40% e de PVA de 0 a 40%. Os compósitos foram produzidos a partir das proporções determinadas no delineamento, e ainda, foram adicionados glicerol (20%) e água (suficiente para que o teor de umidade fosse de 18% antes da extrusão). Em seguida, as formulações foram extrusadas em extrusora mono-rosca de laboratório marca BGM modelo EL-25 com temperatura de 120°C nas quatro zonas, rotação de 75 rpm e matriz cilíndrica de 2,8mm de diâmetro. Foram recolhidos compósitos cilíndricos, que foram analisados quanto aos parâmetros de cor a*, b* e L* em um colorímetro Minolta (CR10 - Japão). O parâmetro de cor de cor L* varia de 0 (preto) a 100 (branco), o parâmetro a* de verde (-a) a vermelho (+a) e o b* de azul (-b) a amarelo (+b). De acordo com os resultados obtidos, o parâmetro a* sofreu aumento na sua resposta nos maiores níveis de fibra, indicativo de uma tendência de cor vermelha para os compósitos. O parâmetro b* também sofreu aumento nos maiores níveis de fibras, indicando que estas levam ao amarelamento das amostras. A luminosidade das amostras foi maior quando foram empregados maiores níveis de PVA e amido, ou seja, nestes casos as amostras ficaram mais claras. Resultados de literatura comprovam que a introdução de fibras escurece os compósitos extrusados a base de amido e, que teores de até 15% são suficientes para melhorar as propriedades dos compósitos sem interferir significativamente na cor. Além da introdução de fibras, estes compósitos têm grande potencial de melhoria se reforçados com nanoargilas, o que se pretende a seguir para dar continuidade a este trabalho. Agradecimentos: CNPq pelo auxílio financeiro (Projetos CNPq 577146/2008-4 e 478109/2008-3) e Bolsa de Iniciação científica.



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VISCOSIDADE DE SOLUÇÕES FILMOGÊNICAS DE AMIDO DE MANDIOCA E GOMA XANTANA PUROS E EM MISTURA

Fernando de Oliveira Faria; Vitor Almeida Marengo; Cristina P. B. de Melo; Suzana

Mali

Departamento de Bioquímica e Biotecnologia, Centro de Ciências Exatas, Universidade Estadual de Londrina. E-mail: [email protected]

A potencialidade do uso de biopolímeros nos mais diversos ramos industriais é um consenso na literatura existente. Observa-se uma contínua substituição dos polissacarídeos convencionais por produtos de origem microbiana. Dentre as maiores vantagens dos biopolímeros microbianos em relação aos polissacarídeos convencionais são as propriedades físico-químicas reprodutíveis, além do baixo custo e da existência de fontes de suprimentos estáveis. A goma xantana é o polissacarídeo atualmente existente no mercado com a mais ampla estabilidade e induz à formação de soluções aquosas de alta viscosidade. Devido a isto, vem sendo amplamente utilizada em vários setores industriais, podendo ser empregada como agente espessante, estabilizante e emulsificante, possibilitando a criação de novos produtos com texturas únicas. Neste trabalho, foram preparadas soluções de amido de mandioca com a adição de goma xantana em diferentes proporções (2, 4, 6, 8 e 10%), além de uma solução de goma xantana pura, com o objetivo de se obter soluções filmogênicas, a serem desidratadas, para posterior produção de filmes biodegradáveis, uma grande tendência de estudos na atualidade. Em seguida, foi medida a viscosidade destas soluções em viscosímetro rotacional Brookfield LV-DVII (Massachusetts-EUA) empregando-se diferentes velocidades de rotação (3, 6, 12, 30 e 60 rpm). As características e propriedades da interação xantana-amido já tem sido estudadas por alguns autores, inclusive para a produção de filmes biodegradáveis. Filmes a base de amido, se beneficiam da adição de goma xantana como agente de brilho e melhorador das propriedades mecânicas, como, por exemplo, o aumento da percentagem de elongação dos filmes. Foi atribuída também à xantana a propriedade de diminuir a velocidade de cristalização e envelhecimento de filmes à base de amido. As soluções filmogênicas a base de amido foram as que apresentaram a menor viscosidade e, à medida que se aumentou a concentração de goma xantana nas amostras, a viscosidade aumentou. Em todas as amostras analisadas, a viscosidade decresceu à medida que se aumentou a velocidade de rotação do equipamento. Estes resultados estão de acordo com dados de literatura, que relatam um aumento na viscosidade de soluções de amido em mistura com a goma xantana. Agradecimentos: CNPq pelo auxílio financeiro (Projeto CNPq 478109/2008-3)

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Anais da V Semana de Biotecnologia 1 - uel.br da V Semana de... · têxtil por Pleurotus ostreatus Eliane S. Otaguiri; Emanuele C. M. Altran & Suely M. O. Doi 12 Caracterização