i

JANDERSON TEIXEIRA RODRIGUES

ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DA EXPRESSÃO DE MARCADORES INFLAMATÓRIOS E DE

REPARO TECIDUAL EM CISTOS PERIRRADICULARES INFLAMATÓRIOS PRÉ E

PÓS DESCOMPRESSÃO

2016

ii

JANDERSON TEIXEIRA RODRIGUES

ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DA EXPRESSÃO DE MARCADORES INFLAMATÓRIOS E DE REPARO TECIDUAL EM CISTOS

PERIRRADICULARES INFLAMATÓRIOS PRÉ E PÓS DESCOMPRESSÃO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Odontologia da Universidade Estácio de Sá, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Odontologia (Endodontia).

ORIENTADOR: Prof. Dr. Fábio Ramôa Pires

UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ

RIO DE JANEIRO 2016

iii

Aprendi através da experiência amarga a suprema lição: controlar minha ira e torná-la como o calor que é convertido em energia. Nossa ira controlada pode ser convertida numa força capaz de mover o mundo.

(Mahatma Gandhi)

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por me conceder a coragem e a vontade de

mudar o mundo em minha volta.

À minha família: pai, mãe, irmãos, primos e tios que sempre me

incentivaram e me apoiaram em todos os sentidos, estiveram sempre à

disposição para dar suporte às viagens e rotinas. Amo todos vocês.

Ao meu grande mestre e orientador, Prof. Dr. Fábio Ramôa Pires, pelo

exemplo de profissional, pela dedicação para comigo e pela paciência de

sempre. Pelas oportunidades que me ofertou e pelos ensinamentos clínicos

que levarei por toda a vida.

À eterna e querida Profa. Dra. Luciana Armada Dias, pelas lições de

vida, pelo exemplo como pessoa e profissional, pela disponibilidade constante

e pelo incentivo de sempre. Parte do que sou e parte do que sonho ser, devo à

você.

Aos grandes professores do PPGO, em especial ao Prof. Dr. José

Freitas Siqueira Junior, que não medem esforços para levantar a bandeira da

Odontologia e nos levam ao cenário internacional como referências no ensino e

pesquisa em Endodontia.

Aos amigos do Rio de Janeiro, Camila Sampaio, Arthur Valente, Victor

Figueiredo, Tissi Nazário e Thaís Medeiros, que estiveram sempre de braços

abertos para me receber e faziam me sentir novamente em casa.

v

Aos amigos do Ceará, que compreenderam sempre minha ausência,

apoiavam minha dedicação ao curso e me faziam esquecer dos problemas

quando necessitava.

Aos amigos de trabalho da SMS Crateús por darem total apoio durante

todo o curso, possibilitando meu afastamento do trabalho durante os períodos

de aula e assumindo parte da minha responsabilidade como membro da

gestão.

Aos meus maravilhosos amigos do PPGO, que sempre estiveram unidos

e firmes para apoiar um ao outro, que nunca faltaram com palavras de carinho

e incentivo e que eu levarei para o resto da vida como os famosos da “Elite

PPGO”.

À nossa secretária do PPGO e amiga, Angélica, pela amizade e amor

por todos os alunos do programa.

vi

ÍNDICE

RESUMO vii

ABSTRACT viii

LISTA DE FIGURAS ix

LISTA DE TABELAS x

LISTA DE ABREVIATURAS xi

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO DA LITERATURA 3

3 JUSTIFICATIVA 19

4 HIPÓTESE 20

5 OBJETIVO 21

6 MATERIAIS E MÉTODOS 22

7 RESULTADOS 27

8 DISCUSSÃO 36

9 CONCLUSÃO 41

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 42

11 ANEXOS 49

vii

RESUMO

Objetivo: avaliar a expressão de marcadores inflamatórios e de reparo tecidual

em cistos perirradiculares inflamatórios pré e pós descompressão cirúrgica.

Materiais e Métodos: participaram do estudo 9 pacientes que apresentavam

cistos perirradiculares inflamatórios e que foram submetidos ao procedimento

de descompressão cirúrgica antes da enucleação final. As amostras coletadas

foram submetidas à análise imuno-histoquímica para os marcadores IL-1β,

TNFα, TGFβ1, MMP9, Ki-67 e EGFR. A expressão de cada marcador foi

classificada em positiva, focal ou negativa; para o marcador Ki-67 foi calculado

o índice de proliferação celular. Os resultados obtidos foram comparados com

as informações clínicas e com as tomografias pré e pós descompressão.

Resultados: as análises tomográficas pré e pós-descompressão mostraram

que todas as lesões apresentaram redução no seu volume total, entretanto,

não foi observado um padrão de expressão dos marcadores pró-inflamatórios e

de reparo tecidual quando comparadas as expressões nos espécimes

cirúrgicos pré e pós-descompressão. Conclusões: a descompressão cirúrgica

mostrou-se útil na redução do volume dos cistos perirradiculares antes da

remoção cirúrgica final. A análise imuno-histoquímica dos espécimes iniciais e

pós-descompressão cirúrgica não mostrou um padrão de redução dos

marcadores pró-inflamatórios nem um aumento dos fatores associados ao

reparo tecidual na amostra de cistos perirradiculares inflamatórios avaliada.

Palavras-chave: Cisto perirradicular inflamatório; descompressão cirúrgica;

imuno-histoquímica.

viii

ABSTRACT

Objective: to evaluate the expression of inflammatory and tissue repair markers

in periradicular inflammatory cysts before and after surgical decompression.

Materials and Methods: the sample included 9 patients with inflammatory

periapical cysts managed by decompression previously to surgical enucleation.

The surgical specimens were analyzed through immunohistochemistry against

IL-1β, TNFα, TGFβ1, MMP9, Ki-67 and EGFR. The expression of each of the

studied markers was classified in positive, focal or negative; Ki-67

immunoexpression was calculated as a cell proliferation index. Data were

compared with the clinical information and the pre- and post decompression

computed tomographic analysis. Results: the computed tomographic analysis

pre- and post-decompression showed that all cysts presented a reduction of

their volume after the procedure. However a specific pattern of

immunoexpression of the studied pro-inflammatory and tissue repair markers

was not observed when comparing the pre- and post decompression

specimens. Conclusions: surgical decompression was useful in reducing the

volume of the inflammatory periapical cysts before surgical enucleation. The

immunohistochemical analysis of the specimens obtained previously to and

after surgical decompression did not show a standard pattern of decreasing of

pro-inflammatory markers or increasing of tissue repair markers on the

periapical cysts included in the studied sample.

Keywords: Inflammatory periapical cyst; surgical decompression;

immunohistochemistry.

ix

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1. Vista panorâmica de tomografia computadorizada cone

beam do caso 3, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a

imagem pós-descompressão, com redução de 81% do volume do CP

após 9 meses de descompressão.

29

Figura 2. Vista axial de tomografia computadorizada cone beam do

caso 8, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a imagem pós-

descompressão.

30

Figura 3. Vista panorâmica de tomografia computadorizada cone

beam do caso 5, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a

imagem pós-descompressão, com redução de 68,5% do volume do

CP após 10 meses de descompressão.

31

Figura 4: Expressão de IL1β no revestimento epitelial e nas células

inflamatórias de um CP antes (A, HE 20x) e depois (B, HE 20x) da

descompressão.

32

Figura 5: Expressão de TGFβ1 na cápsula de tecido conjuntivo

fibroso de um CP antes (A, HE 20x) e depois (B, HE 20x) da

descompressão.

33

Figura 6: Expressão de MMP9 na cápsula de tecido conjuntivo

fibroso de um CP antes (A, HE 20x) e depois (B, HE 20x) da

descompressão.

33

Figura 7: Expressão de EGFR no revestimento epitelial de um CP

antes (A, HE 20x) e depois (B, HE 20x) da descompressão.

34

Figura 8: Expressão de Ki-67 em menos de 1% das células epiteliais

do revestimento de um CP antes (A, HE 20x) e depois (B, HE 20x) da

descompressão (detalhe das células positivas nos boxes).

34

x

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1. Anticorpos primários utilizados no estudo com seus

respectivos clones, fabricantes e diluições.

25

Tabela 2. Dados demográficos e clínicos da amostra. 27

Tabela 3. Dados referentes ao volume tomográfico, percentual de

redução tomográfica dos CP e dentes associados aos CP nos casos

estudados.

28

Tabela 4. Resultados da imunoexpressão dos marcadores avaliados

no estudo nos fragmentos de descompressão e da enucleação final

dos cistos perirradiculares.

35

xi

LISTA DE ABREVIATURAS

CP: Cisto perirradicular inflamatório

EGF: Fator de crescimento epidérmico

EGFR: Receptor do fator de crescimento epidérmico

IL: Interleucina

LP: Lesão perirradicular inflamatória

LPS: Lipopolissacarídeo

MMP: Metaloproteinase de matriz

MTA: Agregado trióxido mineral

PBS: Solução salina tamponada com fosfato

PG: Prostaglandina

TGF-β: Fator transformante de crescimento beta

TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa

TOQ: Tumor odontogênico queratocístico

1

1 INTRODUÇÃO

As lesões perirradiculares inflamatórias (LP) são doenças de caráter

inflamatório e etiologia infecciosa que se estabelecem a partir da existência de

uma infecção no sistema de canais radiculares, que deve ser combatida pelo

cirurgião dentista através de estratégias antimicrobianas incluídas no

tratamento endodôntico. O sucesso da terapia endodôntica depende

diretamente do estabelecimento do diagnóstico correto e da escolha de

métodos antimicrobianos que visem reduzir a carga microbiana presente nos

canais, devolvendo então a capacidade de reparo dos tecidos perirradiculares.

Desta forma, para se obter reparo e a remissão das LP, deve-se inicialmente

combater os agentes infecciosos presentes no sistema de canais radiculares

(SIQUEIRA et al., 2012).

O cisto perirradicular inflamatório (CP) é um dos tipos de LP que se

origina na porção perirradicular de dentes com polpa necrótica.

Radiograficamente apresenta-se como uma área radiolúcida habitualmente

bem delimitada circundada por um halo radiopaco, associada ao periápice de

dentes desvitalizados. Na maioria das vezes apresentam pequenas dimensões,

no entanto, podem atingir tamanhos maiores, causando importantes

transtornos locais (SIQUEIRA et al., 2010; BRAVE et al., 2011).

Histopatologicamente caracteriza-se por uma cavidade preenchida por

conteúdo líquido e restos celulares, circundaa por um epitélio pavimentoso

estratificado, envolto por tecido de granulação e mais externamente por uma

cápsula de tecido fibroso (SIQUEIRA et al., 2010).

2

De forma geral, além do tratamento endodôntico convencional, os CP

podem ser tratados por meio de cirurgias perirradiculares com ou sem

apicetomia associada ou com a exodontia do elemento afetado com simultânea

enucleação total da lesão (MARTINS-FILHO et al., 2009). A descompressão

seguida da enucleação cirúrgica do CP é considerada uma boa opção

terapêutica em casos de CP de grandes proporções, visando preservar

estruturas nobres e limitar o tamanho da cirurgia (POZZER et al., 2011). No

entanto, pouco se conhece sobre os fenômenos pró-inflamatórios e pró-reparo

que modulam este processo.

3

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Cistos perirradiculares inflamatórios (CP)

Os CP são lesões odontogênicas reacionais crônicas que acometem a

região perirradicular de dentes comprometidos endodonticamente, podendo

surgir na região mais apical ou lateralmente à raiz quando na existência de

canais laterais. A origem da palavra "cisto" vem do grego Kystis, que significa

bexiga, e faz alusão à morfologia da lesão (NAIR, 1998). Os CP são os cistos

intraósseos mais comuns dos maxilares e podem representar entre 6 e 58%

das lesões perirradiculares inflamatórias diagnosticadas em laboratórios de

Patologia Oral (NAIR, 1998; RICUCCI et al., 2006; BECCONSALL-RYAN et al.,

2010; JOHNSON et al., 2014).

Os CP resultam de uma proliferação tecidual que ocorre em resposta a

uma infecção endodôntica de longa duração, sendo decorrentes da presença

de microrganismos no sistema de canais radiculares, quase sempre

relacionados a lesões cariosas, que se instalam e se multiplicam nos canais

após a necrose da polpa (SIQUEIRA et al., 2010). Estes agentes infecciosos

produzem substâncias irritantes que induzem uma resposta inflamatória que se

estende aos tecidos que circundam o dente (NAIR et al., 1990; LIAPATAS et

al., 2003).

A patogênese do CP envolve mecanismos imuno-inflamatórios e

acredita-se que seja originada a partir da existência prévia de um granuloma

perirradicular, que sofreu processo de epitelização por meio do estímulo

inflamatório à proliferação dos restos epiteliais de Malassez. Estas estruturas

são embriologicamente derivadas da degeneração da bainha epitelial radicular

4

de Hertwig e podem permanecer quiescentes no ligamento periodontal na vida

adulta (SANTOS et al., 2006). Quando estimulados por citocinas e outros

produtos derivados do processo inflamatório, proliferam formando ninhos de

células epiteliais que, após degeneração de sua porção central, dão origem ao

epitélio de revestimento dos CP, circundando a cavidade central preenchida

por material líquido ou semi-sólido (MÁRTON & KISS, 2000; SANTOS et al.,

2011).

Dessa forma, os CP caracterizam-se histopatologicamente pela

presença de uma cavidade central preenchida por conteúdo líquido ou semi-

sólido, contendo principalmente células inflamatórias, hemorragia e restos

epiteliais provenientes da descamação do epitélio cístico, que é classificado

como pavimentoso estratificado não queratinizado, possuindo espessura

variável (MOREIRA et al., 2000; PIATTELLI, et al., 2004). Na parede de tecido

conjuntivo que circunda externamente o epitélio há presença de tecido de

granulação, com predomínio de macrófagos, linfócitos, plasmócitos e

neutrófilos polimorfonucleares. Podem ser encontradas, eventualmente, fendas

negativas de cristais de colesterol, as quais podem ser adicionalmente

encontradas no lúmen cístico (SIQUEIRA et al., 2014). Circundando todo este

conteúdo e separando a lesão do tecido ósseo adjacente, existe uma cápsula

de tecido conjuntivo fibroso denso, rico em fibras colágenas (SIQUEIRA et al.,

2010).

Os CP mostram discreta predileção por homens na quarta e quinta

décadas de vida, localizando-se preferencialmente na maxila anterior.

Radiograficamente apresentam-se como áreas radiolúcidas uniloculares

5

perirradiculares, geralmente de forma circular ou ovoide, com bordas bem

delimitadas por um halo radiopaco, associadas a dentes com lesões cariosas

ou restaurações extensas (NAIR, 1998; KUC et al., 2000; BECCONSALL-

RYAN et al., 2010; SIQUEIRA et al., 2010; JOHNSON et al., 2014).

O tratamento dos CP inicialmente é baseado na desinfecção do sistema

de canais radiculares fazendo uso de instrumentação e irrigação com agentes

antimicrobianos, seguida por medicação intracanal e obturação destes canais,

objetivando perpetuar o estado de desinfecção (MURPHY et al., 1991;

SIQUEIRA et al., 2010). Acredita-se que com as manobras clínicas

habitualmente utilizadas no tratamento endodôntico conservador, alguns CP

possam regredir, em especial aqueles nos quais a porção radicular encontra-se

projetada no interior da cavidade cística (cistos "baía") em contraste com

aqueles nos quais a cavidade cística encontra-se completamente fechada,

separada da porção radicular ("cistos verdadeiros") (NAIR, 1998).

No entanto, em alguns casos os CP podem persistir a despeito da

intervenção endodôntica, mesmo que esta siga padrões de qualidade, e

continuar crescendo, atingindo grandes dimensões e causando transtornos

locais significativos, tais como aumento de volume, dor e infecção secundária

(por vezes associada a drenagem de material purulento), deslocamento dos

dentes adjacentes e rompimento das corticais ósseas (RAMAKRISHNA &

VERMA, 2006). Nesses casos há indicação de procedimentos cirúrgicos para o

tratamento dos CP, os quais podem incluir a remoção do dente associado e do

CP por meio de enucleação ou curetagem cirúrgica (nos casos nos quais não

há possibilidade de aproveitamento dos dentes associados) ou cirurgias

6

paraendodônticas (REES, 1997; LUSTIG et al., 1999; KADAM et al., 2014). No

entanto, em algumas situações, em virtude do tamanho da lesão e/ou de sua

íntima relação com estruturas anatômicas adjacentes (por exemplo fossa nasal,

seio maxilar, e canal mandibular) o procedimento cirúrgico pode acarretar

considerável aumento do risco de morbidade ao paciente (NEAVERTH &

BURG, 1982). Dentre as opções cirúrgicas terapêuticas adicionais, a

descompressão mostra-se a menos invasiva, havendo risco mínimo de

danificar estruturas anatômicas nobres (MARTIN, 2007).

2.2 Descompressão cirúrgica

A descompressão cirúrgica, por vezes confundida com a

marsupialização, é uma técnica pouco invasiva utilizada no tratamento de

lesões císticas que acometem os ossos gnáticos. Consiste na remoção de uma

janela da cavidade cística, preservando o restante da lesão, estabelecendo um

contato entre o cisto e a cavidade oral. A técnica objetiva diminuir a pressão

intracística e assim acelerar o processo de cicatrização óssea (MARKER et al.,

1996; BODNER et al., 2003; ELLIS, 2005; NAWAZ et al., 2011). A diferença

entre as técnicas de descompressão e marsupialização consiste basicamente

na utilização de dispositivos próprios para manter a abertura da cavidade

cística na descompressão, em contraste com a marsupialização, na qual esta

abertura é mantida apenas pela sutura realizada prendendo a mucosa oral ao

restante da membrana cística (NEAVERTH & BURG, 1982).

A descompressão pode ser utilizada como terapia única, resultando na

regressão total da lesão, ou pode ser utilizada como etapa preliminar à uma

7

enucleação, visando a diminuição da lesão anterior a sua remoção total (ELLIS,

2005; TORRES-LAGARES et al., 2011). O procedimento tem mostrado bons

resultados quando aplicado ao tratamento de lesões odontogênicas de

morfologia cística, incluindo CP, podendo inclusive ser aplicada em pacientes

pediátricos com dentição mista, buscando resultados mais conservadores de

tratamento com a preservação dos dentes permanentes próximos às lesões

(MARKER et al., 1996; DELBEM et al., 2003; SUN et al., 2009); ou no

tratamento de pacientes na idade adulta, apresentando dentição permanente

(SAMUELS, 1965; WONG, 1991; TANDRI, 2010); ou ainda em pacientes

totalmente edêntulos (SAKKAS et al., 2007).

ULOOPI et al. (2015) discutiram uma série de 4 casos de CP de grandes

dimensões acometendo crianças com dentição mista, tratados de forma

conservadora a partir da técnica de descompressão. Os autores demonstraram

que a descompressão é uma terapia bem indicada nos casos de CP extensos,

justificando-se pela menor morbidade, preservação de estruturas anatômicas

importantes, conservação de elementos dentários, formação de tecido ósseo

que facilita uma abordagem cirúrgica posterior, tendo bons resultados de

reparo principalmente em crianças, graças a alta capacidade regenerativa em

pacientes jovens. Estas vantagens em pacientes jovens e pediátricos têm sido

demonstradas em outros estudos, que mostraram adicionalmente neoformação

óssea mais acelerada em CP, quando comparados a outros cistos

odontogênicos (GAO et al., 2014; ALLON et al., 2015).

Os critérios utilizados na seleção dos casos submetidos a

descompressão/marsupialização levam em consideração a proximidade da

8

lesão com estruturas anatômicas nobres, a facilidade do acesso cirúrgico, a

idade e a capacidade cognitiva do paciente, a extensão cirúrgica, o tamanho da

lesão cística e o transtorno que será produzido pelo procedimento cirúrgico

convencional, incluindo o dano aos dentes adjacentes (DELBEM et al., 2003;

ELLIS, 2005). A maior vantagem da descompressão consiste na sua pequena

invasividade, tornando-se um procedimento que gera baixa morbidade ao

indivíduo, preservando estruturas anatômicas importantes e sendo um

procedimento cirúrgico pouco complexo. Entre as principais desvantagens,

apontam-se o fato do tecido patológico permanecer in situ, deixando o

diagnóstico histopatológico restrito à análise apenas do fragmento removido, e

o desconforto gerado ao paciente, tendo em vista que estes precisam redobrar

os cuidados com a higiene oral, para impedir a ocorrência de processos

infecciosos no local operado no período durante o qual a abertura cirúrgica

estará presente na boca (GUNRAJ, 1990; ELLIS, 2005; ANAVI et al., 2011).

Embora existam evidências clínicas de que a descompressão seja uma

técnica útil no manejo de CP de grandes dimensões (ULOOPI et al., 2015),

pouco se conhece sobre os mecanismos imuno-inflamatórios pelos quais passa

a lesão ao longo do processo.

2.3 Inflamação e Reparo tecidual nas LP

Define-se como inflamação uma resposta imunológica ao nível da

microcirculação, estimulada por agentes agressores e que repercute na

movimentação de células e componentes moleculares, que atravessam os

vasos para chegar aos tecidos agredidos, com a finalidade de eliminar o

9

agressor. Este processo é complexo e envolve mecanismos importantes para a

compreensão da trajetória que seguem as doenças inflamatórias. A inflamação

pode ser classificada como aguda ou crônica e apresentará rotineiramente os

mesmos mecanismos, variando apenas a intensidade e a persistência destas

etapas (SIQUEIRA et al., 2010).

Em situações fisiológicas normais, o organismo apresenta mecanismos

de defesa, barreiras e processos que impedem ou diminuem os danos

provenientes de uma agressão externa, seja ela física, química ou biológica. O

organismo humano possui a capacidade de identificar, diferenciar e responder

à agressores como os microrganismos. Porém, em determinadas situações, a

própria defesa do organismo acaba gerando danos teciduais indiretos,

resultando no surgimento de doenças inflamatórias. Os microrganismos são

sabidamente os agentes etiológicos das alterações patológicas da polpa e dos

tecidos perirradiculares, no entanto, para que os CP se estabeleçam, é

necessário o desenvolvimento de mecanismos inflamatórios, que envolvem

respostas celulares e moleculares (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS,

2000).

O objetivo principal da resposta inflamatória nestas situações é eliminar

o agente agressor, deixando o organismo em condições adequadas para o

reparo tecidual. Caso a missão seja alcançada com êxito, ocorrerá o reparo,

que será dependente da extensão, intensidade e persistência da agressão,

além do tipo de tecido que foi afetado, podendo se realizar através dos

processos de cicatrização ou regeneração. Em alguns casos, este mecanismo

inflamatório é suficiente para eliminar o agressor, havendo uma recuperação

10

natural dos tecidos, sem que haja uma intervenção profissional. No entanto,

tratando-se de resposta inflamatória proveniente de infecções odontogênicas,

em quase todos os casos deve haver uma intervenção do profissional através

da remoção mecânica de parte dos microrganismos ou, se necessário, uma

associação farmacológica de agentes antimicrobianos (SIQUEIRA-JÚNIOR &

SABÓIA-DANTAS, 2000; ABBAS et al., 2012).

Na existência de infecção no sistema de canais radiculares, são

liberadas substâncias moleculares nos tecidos perirradiculares que acabam por

induzir um quadro imuno-inflamatório. Quando há o reconhecimento por parte

do sistema imune do hospedeiro de moléculas sinalizadoras, como os

lipopolissacarídeos (LPS) presentes na parede celular de bactérias Gram

negativas, é desencadeada a liberação de inúmeros mediadores químicos

inflamatórios, substâncias como as aminas vasoativas, citocinas inflamatórias e

quimiocinas, que desempenham papel importante nos efeitos histológicos do

quadro inflamatório (MEDZHITOV, 2008; SIQUEIRA et al., 2010).

O principal efeito desencadeado por estes mediadores inflamatórios é a

formação de um exsudato composto basicamente por leucócitos e plasma

proveniente dos vasos sanguíneos mais próximos à área afetada. As principais

células envolvidas nesta resposta são os macrófagos e os neutrófilos, que são

os primeiros à atuar no combate à agressão tecidual, dando espaço

posteriormente à chegada de linfócitos que serão responsáveis por uma

resposta imune adaptativa, que se caracteriza pela maior complexidade de

processos celulares e moleculares, bem como pela maior especificidade

(BARTON & KAGAN, 2009).

11

2.4 Interleucina 1 beta

A Interleucina 1 (IL-1) é um mediador químico inflamatório e pode ser

codificada em duas formas diferentes (IL-1α e IL-1β), cada qual possuindo

sequências de bases nitrogenadas distintas, tendo apenas 35% de homologia

em sua sequência de aminoácidos. Possuem ainda diferencial de ponto

isoelétrico, tendo ambas peso molecular aproximado de 17kDa e receptor

celular em comum. Os macrófagos são as principais células envolvidas na

síntese da IL-1, podendo ser estimulados pela presença da própria IL-1 ou de

diferentes mediadores como o fator de necrose tumoral α (TNF-α) e o interferon

gama. Há uma discrepância em relação às quantidades produzidas dos dois

subtipos, sendo que a síntese de IL-1β pode ser cerca de cinco vezes maior

que a de IL-1α (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; TAKEUCHI &

AKIRA, 2010).

Sua atividade na resposta inflamatória está ligada principalmente a

ativação de fagócitos como os macrófagos, também estimulando-os a sintetizar

prostaglandinas (PG), possuindo assim ligação indireta com o estado febril,

tendo em vista o efeito das PG sobre hipotálamo; funciona ainda como citocina

quimiotática para neutrófilos e participa dos mecanismos de reabsorção óssea

(LADER & FLANAGAN, 1998; SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000).

Os mecanismos celulares envolvidos na atividade da IL-1β frente à

reabsorção óssea estão relacionados à capacidade desta molécula em

estimular a replicação e maturação de células hematopoiéticas precursoras de

osteoclastos, além de estimular a atividade fagocítica destas células quando

maduras (SIQUEIRA et al., 2010). Esta citocina possui atividade inibitória da

12

síntese óssea, semelhante ao paratormônio, sendo correlacionada com os

achados clínicos de reabsorção óssea dos quadros de doenças periodontais e

lesões perirradiculares. Apresenta ainda capacidade de induzir a proliferação

epitelial, contribuindo para o crescimento e desenvolvimento do epitélio dos CP

(MEGHJI et al., 1996; SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000).

2.5 Fator de necrose tumoral alfa

O TNF-α, também denominado de linfotoxina, é um mediador químico da

inflamação sintetizado principalmente por monócitos, macrófagos ativados e

linfócitos T. Possui importante papel dentro do quadro inflamatório, tendo efeito

nas etapas de migração de células de defesa através dos vasos sanguíneos,

pois o mesmo estimula a expressão de moléculas de adesão nas células

endoteliais (SIQUEIRA et al., 2010). Atua ainda na estimulação do hipotálamo,

tendo ligação direta com os quadros de febre; na estimulação de atividade

citotóxica de neutrófilos e monócitos; na indução da síntese de outras citocinas

(como a IL-1 e a IL-6); e influencia na atividade osteoclástica (SIQUEIRA-

JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; AGGARWAL, 2003).

O estudo realizado por JURISIC et al. (2008) avaliou a relação da

concentração de TNF-α com achados histopatológicos de 43 CP coletados no

Laboratório de Patologia da Universidade de Belgrado (Sérvia). As maiores

concentrações de TNF-α encontravam-se em lesões de tamanho reduzido, com

fluído cístico rico em conteúdo proteico e paredes da cavidade cística bem

espessas, e foi encontrada íntima relação entre a quantidade deste marcador e

a intensidade de infiltrado inflamatório em alguns CP. TEIXEIRA-SALUM et al.

13

(2010) também encontraram expressão positiva de TNF-α em CP, ressaltando

a importância desta citocina na sua patogênese.

2.6 Metaloproteinase de matriz 9

As metaloproteinases de matriz (MMP) são um grupo de enzimas

envolvidas nos mecanismos de remodelação tecidual e estão diretamente

ligadas aos processos de degradação da matriz extracelular do tecido

conjuntivo durante as agressões microbianas, sendo importantes

imunomoduladores, inclusive nos casos de lesões perirradiculares

(BRINCKERHOFF & MATRISIAN, 2002; SILVEIRA et al., 2007). São

subdivididas em 25 tipos de enzimas, que são classificadas em 5 grupos:

gelatinases (MMP-2 e 9), colagenases (MMP-1, 8 e 13), estromelisinas (MMP-

3, 10 e 11), tipo-membrana e outras, incluindo a matrilisina (KUMAMOTO et al.,

2003). O nome metaloproteinase está relacionado com a necessidade que

estas enzimas possuem de ter associação com o Zinco para que ocorra sua

ativação. Apresentam bastante homologia entre seus subtipos, sendo

diferenciados apenas pela especificidade que apresentam para cada substrato

molecular (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000). A síntese destas

moléculas ocorre pelas próprias células que compõem o tecido conjuntivo

como osteoblastos, osteoclastos, macrófagos e células endoteliais. Quando

circulantes, encontram-se em seu estado inativo (pró-peptídeo), sendo

necessária uma ligação entre o seu aminoácido cisteína e uma molécula de

Zinco para efetuar a ativação (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000).

14

A MMP-9 apresenta peso molecular aproximado de 92 kDa e é

responsável pela clivagem da elastina, sendo produzida por neutrófilos,

macrófagos, fibroblastos e osteoclastos (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-

DANTAS, 2000). As células do epitélio de revestimento dos cistos

odontogênicos e os fibroblastos e miofibroblastos da cápsula são capazes de

sintetizar MMPs, que participam ativamente da clivagem das fibras colágenas e

da degradação da matriz óssea (HENRIQUES et al., 2011). A MMP-9 facilita a

migração dos leucócitos em meio ao tecido conjuntivo, tendo em vista que

provoca o rompimento de fibras colágenas do tipo IV (GOETZL, 1996).

Em estudo avaliando a expressão de MMP-9 em CP e outros cistos e

tumores odontogênicos, HENRIQUES et al. (2011) identificaram expressão

difusa deste marcador no tecido epitelial e mesenquimal do CP, havendo

marcação em todas as camadas do epitélio de 90% dos CP avaliados pelo

estudo. Estes autores associam a presença da MMP-9 em CP com o grau de

destruição tecidual encontrado.

2.7 Ki-67

Na patogênese do CP, assim como no desenvolvimento de outros cistos

odontogênicos, existe um potencial de proliferação celular, que pode ser

avaliado por meio de marcadores imuno-histoquímicos que identificam

proteínas envolvidas no ciclo celular. Marcadores como o Ki-67 são baseados

em anticorpos monoclonais que identificam as fases ativas do ciclo celular

(AGARAM et al., 2004), sendo o mais amplamente utilizado atualmente para

observar este tipo de marcação. Este marcador pode ser associado a fase S do

15

ciclo celular, assim como nas fases G2 na intérfase e durante a mitose

priopriamente, onde atinge seu pico de expressão, vindo a diminuir sua

intensidade logo após o término da mitose (SLOOTWEG, 1995; MACLUSKEY

et al., 1999; MENDES et al., 2011). Devido sua íntima relação com a atividade

proliferativa, vem sendo utilizado nos estudos que visam entender melhor o

desenvolvimento de neoplasias e outras lesões reacionais que envolvem

proliferação celular (MACLUSKEY et al. 1999).

NADALIN et al. (2011) realizaram estudo avaliando CP e outros cistos e

tumores odontogênicos, objetivando observar o papel do Ki-67 na patogênese

destas lesões. Os autores identificaram marcação positiva para Ki-67 em 60%

dos CP avaliados, estando esta expressão restrita, na grande maioria das

vezes, às camadas basais do epitélio, mostrando a íntima relação deste

marcador com a atividade proliferativa. MARTINS et al. (2011) encontraram

positividade de Ki-67 em CP e cistos dentígeros, observando maior expressão

nas camadas basais do epitélio dos cistos e uma maior expressão do marcador

nas lesões com infiltrado inflamatório mais exuberante.

2.8 Receptor do fator de crescimento epidérmico

O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) é um receptor

celular que se liga a fatores que regulam o crescimento e proliferação celular,

como o fator de crescimento epidérmico (EGF). Este receptor caracteriza-se

por apresentar uma porção extra e outra intracelular, sendo que este

posicionamento em relação a membrana plasmática tem relação direta com a

capacidade e velocidade proliferativa das células que o possuem. Observa-se

16

que as células que possuem o EGFR expresso em sua porção externa

apresentam alto padrão de proliferação (OLAYIOYE et al., 2000; HERBST &

SHIN, 2002; SERGINA & MOASSER, 2007).

A presença deste marcador em células do epitélio de lesões

odontogênicas pode ter relação direta com o seu crescimento e

desenvolvimento (HERBST, 2004; GULKESEN et al., 2001). Este marcador

pode estar presente tanto em células do epitélio de desenvolvimento do germe

dentário, como no tecido epitelial de cistos odontogênicos (LI et al., 1997;

TANIKAWA & BAWDEN, 1999). GONÇALVES et al. (2012) avaliaram amostras

de CP utilizando métodos de imuno-histoquímica para compreender a

expressão de EGFR, tendo sido possível observar a expressão deste receptor

em todas as camadas epiteliais dos casos analisados.

2.9 Fator transformante do crescimento beta

O Fator transformante do crescimento beta (TGF-β) é uma citocina

encontrada no tecido ósseo e no tecido conjuntivo, sendo produzida

principalmente por macrófagos, linfócitos T e plaquetas. Apresenta ação

estimuladora da função dos osteoblastos, tendo influência no crescimento e

diferenciação destas células. Atua ainda inibindo a ação osteoclástica, por

possuir mecanismos de inibição dos precursores destas células e por diminuir a

atividade das mesmas quando maduras (TACHI et al., 2011). Por se tratar de

um fator estimulador de células reparadoras, está diretamente ligado aos

processos de reparo tecidual e tem sido demonstrado que esta citocina possui

17

a capacidade de estimular a formação de fibras colágenas (SIQUEIRA-JÚNIOR

& SABÓIA-DANTAS, 2000; HEINEMEIER et al., 2007).

MORAES et al. (2014) realizaram um estudo avaliando a expressão

imuno-histoquímica de TGF-β em CP e cistos dentígeros, observando intensa

marcação deste mediador em células do epitélio do CP, havendo presença de

TGF-β tanto no citoplasma, quanto no núcleo das células das camadas mais

basais do tecido. Quando estes mesmo autores avaliaram a cápsula fibrosa do

CP, observaram intensa expressão de TGF-β no citoplasma de fibroblastos,

neutrófilos e macrófagos, chegando a conclusão de que a presença deste

marcador pode estar ligada diretamente com a atividade osteogênica. No

entanto, outros estudos não identificaram expressão em células do epitélio do

CP, havendo positividade apenas em células do estroma (TYLER et al., 1999;

PIATTELLI et al., 2004). FUKADA et al. (2009) e TEIXEIRA-SALUM et al.

(2010) compararam a expressão deste mediador em CP e granulomas

perirradiculares, observando índices semelhantes de expressão imuno-

histoquímica desta citocina.

2.10 Imuno-histoquímica e descompressão

Avaliando uma série de 10 casos de tumor odontogênico queratocístico

(TOQ), SUYAMA et al. (2008) observaram a expressão imuno-histoquímica de

IL-1α e seus receptores antes e após estas lesões serem submetidas ao

tratamento com descompressão, identificando marcação positiva deste

mediador em todos os espécimes antes do procedimento, havendo expressão

principalmente nas células epiteliais, células endoteliais e fibroblastos. Na

18

segunda amostra dos casos, momento pós-descompressão, foram verificadas

marcações significativamente reduzidas de IL-1α e seu receptor nos cistos,

havendo uma alteração na concentração deste mediador inflamatório após a

terapêutica cirúrgica escolhida.

Também avaliando uma amostra composta por TOQ submetidos à

descompressão cirúrgica, AUGUST et al. (2003) utilizaram métodos imuno-

histoquímicos para avaliar a expressão de citoqueratina 10 em amostras pré e

pós descompressão. Levando em consideração a redução de tamanho das

lesões avaliadas através de radiografias panorâmicas, NAKAMURA et al.

(2002) avaliaram a expressão de Ki-67 em 24 casos de TOQ que tiveram a

descompressão como terapia cirúrgica parcial, sendo realizadas análises de

fragmentos removidos durante a descompressão e os resíduos de cisto

removidos na enucleação final. A comparação pré e pós em relação à

expressão de Ki-67 apresentou pouca diferença, não havendo significância

estatística.

Estudos avaliando os efeitos teciduais da descompressão por meio de

imuno-histoquímica ainda são escassos na literatura, não havendo sido

previamente realizados em amostras de CP.

19

3 JUSTIFICATIVA

CP refratários ao tratamento endodôntico convencional ou de grandes

dimensões são habitualmente tratados por meio de enucleação ou curetagem

cirúrgica. Estes procedimentos, entretanto, podem causar considerável

morbidade aos pacientes e a descompressão tem sido indicada como opção de

manejo em alguns casos, em virtude de suas características conservadoras. A

despeito do sucesso clínico, pouco se conhece acerca dos fenômenos imuno-

inflamatórios e de reparo tecidual pelos quais passam os tecidos componentes

do CP durante este processo.

20

4 HIPÓTESE

Espera-se encontrar menor expressão de fatores pró-inflamatórios e

maior expressão de fatores associados ao reparo tecidual em amostras de CP

submetidos a descompressão em comparação com as amostras teciduais pré-

descompressão.

21

5 OBJETIVO

Comparar a expressão imuno-histoquímica de marcadores pró-

inflamatórios e de reparo tecidual em CP antes e após o procedimento de

descompressão cirúrgica.

22

6 MATERIAIS E MÉTODOS

A amostra foi composta por 9 CP submetidos a procedimentos de

descompressão, realizada como forma parcial de tratamento, divididos em dois

grupos de análise: um composto pelos fragmentos removidos durante a

realização da descompressão e outro com as peças cirúrgicas completas após

a enucleação cirúrgica dos respectivos CP. Todos os 9 casos apresentavam

tratamento endodôntico satisfatório realizados pelo mesmo profissional. As

informações clínicas (localização da lesão, presença de alterações clínicas e

presença de sintomas), demográficas (idade, sexo e cor da pele dos

pacientes), radiográficas e tomográficas (tamanho e volume da lesão,

delimitação das bordas, relação com dentes e estruturas adjacentes,

rompimento de corticais) de todos os casos foram obtidas a partir dos registros

laboratoriais vinculados aos espécimes e pelas fichas clínicas dos pacientes.

Por ser um estudo retrospectivo, todas as lâminas histológicas e os

blocos de parafina utilizados foram provenientes do Laboratório de Patologia

Bucal da Universidade Estácio de Sá (localizado na Av. Alfredo Baltazar da

Silveira, 580 cobertura, Recreio dos Bandeirantes, Rio de Janeiro/RJ, Brasil).

Todos os casos incluídos no estudo foram submetidos ao tratamento cirúrgico

pelo mesmo profissional, seguindo a mesma técnica cirúrgica, e todos os

espécimes obtidos foram acondicionados em formol tamponado a 10% em

frascos adequados para submissão ao laboratório. Realizou-se a técnica de

descompressão fazendo uso de anestesia local, incisão com lâmina de bisturi,

osteotomia até acessar a cavidade cística e colocação de um dispositivo para

23

manter a abertura da janela óssea, que tinha tamanho variável de acordo com

a localização anatômica e dimensões da cavidade cística. O tempo de

reabertura foi estabelecido individualmente de acordo com o tamanho da lesão,

a resposta ao tratamento e o envolvimento de estruturas anatômicas nobres. A

enucleação cirúrgica final foi realizada segundo o mesmo protocolo em todos

os casos: anestesia local, realização de um retalho intra-sulcular com apenas

uma relaxante, descolamento muco-periosteal, osteotomia, curetagem

completa da lesão residual, apicectomia, retro-peparo e retro-obturação

utilizando agregado trióxido mineral (MTA). Nenhum dos pacientes incluídos no

estudo apresentou intercorrências pós-cirúrgicas no período de observação,

tais como infecções secundárias, fraturas patológicas, parestesia ou

fechamento da abertura da descompressão.

Todos os pacientes eram sistemicamente saudáveis, não relatando na

história médica pregressa e atual doenças relevantes, e não estavam fazendo

uso de anti-inflamatórios não esteroidais ou drogas imunosupressoras. Todos

os casos foram previamente analisados por meio de radiografias convencionais

(panorâmicas e periapicais) e tomografias computadorizadas obtidas pela

técnica volumétrica (cone-beam) no momento inicial e no momento pré-

enucleação cirúrgica. Foram mensurados os volumes tomográficos das lesões

pré e pós descompressão, multiplicando as medidas disto-mesial

(comprimento), apico-incisal (altura) e vestíbulo-lingual (profundidade) e

obtendo resultado em mm³. Posteriormente foram calculados os percentuais de

redução do volume destas lesões durante o período de descompressão.

24

A partir dos blocos de parafina foram realizados cortes de 5 µm, que

foram corados em hematoxilina e eosina para posterior análise histológica

utilizando um microscópio óptico de luz contendo uma câmera digital acoplada

(Microscópico Leica, modelo DM500, Alemanha). Posteriormente, para os

ensaios imuno-histoquímicos, foram realizados cortes 3 µm a partir dos blocos

de parafina. Os cortes foram dispostos em lâminas previamente sinalizadas

com 3-aminopropil-trietoxi-silano (Sigma, ST. Louis, MO, EUA) e a

desparafinização foi feita por meio de dois banhos no xilol por 10 minutos cada

sob temperatura ambiente, sendo realizada posterior hidratação em soluções

com concentração decrescente de etanol (100%, 90%, 70% e 50%), seguida

por lavagem abundante em água corrente. A recuperação antigênica foi

realizada inserindo-se as lâminas em um berço de vidro, que foi imerso em um

recipiente com solução tampão citrato a 10mM (pH 6,0) e levado ao micro-

ondas (Panasonic modelo NN7809BH, 850W) em potência máxima com

duração de 12 minutos. Em seguida, as lâminas foram resfriadas em

temperatura ambiente e foi utilizado o peróxido de hidrogênio a 3% para

inativação da peroxidase endógena, com 5 banhos de 5 minutos cada. Após a

inativação da peroxidase, as lâminas foram lavadas em água corrente e

mergulhadas em leite desnatado durante 5 minutos, seguida pela imersão em

solução salina tamponada com fosfato (PBS).

A técnica seguiu com a incubação dos anticorpos primários, que foram

diluídos em PBS com 1% de albumina sérica bovina (Sigma, ST. Louis, MO,

EUA) e tiveram suas diluições variando de acordo com as indicações e

padronizações do laboratório de imuno-histoquímica da Universidade Estácio

25

de Sá, sendo levados posteriormente a câmara úmida por um período de 16

horas e temperatura de 4°C. Foram realizados controles positivos (tecidos

sabidamente reativos) e negativos (omissão do anticorpo primário) em todas as

reações. A tabela 1 mostra os anticorpos primários que foram utilizados, com

suas respectivas especificidades e fabricantes.

Tabela 1. Anticorpos primários utilizados no estudo com seus respectivos clones, fabricantes e diluições.

Anticorpos primários Clone Fabricante Diluição

IL-1 β Policlonal Santa Cruz Biotechnology 1:100

TNF α 2C8 Santa Cruz Biotechnology 1:50

TGF β 1 Policlonal Santa Cruz Biotechnology 1:500

MMP 9 Policlonal Dako 1:500

Ki-67 MIB-1 Dako 1:100

EGFR EGFR.25 Novocastra 1:500

Após o período de 16 horas, as lâminas foram lavadas em 3 banhos de

PBS e posteriormente incubadas com o anticorpo secundário (LSAB, Dako,

Carpinteria, CA, EUA) por 30 minutos à 37°C. Dando sequência, as lâminas

passaram por três banhos de PBS e foram expostas ao sistema estreptavidina-

biotina-peroxidase (LSAB, Dako, Carpinteria, CA, EUA) por um período de 30

minutos a 37oC. Em seguida, após três lavagens com PBS, as reações foram

evidenciadas com solução de tetracloreto de 3,3’ diaminobenzidina (Dako,

Carpinteria, CA, EUA) por 5 minutos a temperatura ambiente. Para finalizar o

26

preparo, os cortes foram lavados em água corrente, contra corados com

hematoxilina de Carazzi e montados com Entelan e lamínulas.

Todas as lâminas provenientes das reações imuno-histoquímicas de

todos os casos foram avaliadas sob microscopia óptica e a marcação foi

categorizada, segundo a intensidade da marcação, em negativa, focal/fraca e

moderada/intensa, descrevendo adicionalmente em quais tipos celulares o

marcador foi encontrado, com exceção do Ki-67, que foi contabilizado de

maneira percentual levando-se em consideração a quantidade de núcleos

epiteliais positivos em relação ao número total de núcleos de células epiteliais

em 2 campos de grande aumento (400x), obtendo-se a média. Todas as

lâminas foram analisadas por dois avaliadores e os casos nos quais existiu

discordância o resultado final foi decidido após discussão em conjunto.

As informações clínicas, demográficas, radiográficas, tomográficas,

histológicas e imuno-histoquímicas foram tabuladas e analisadas de forma

descritiva e comparativa, buscando avaliar a importância do procedimento de

descompressão na expressão dos marcadores pró-inflamatórios e de reparo

tecidual.

O estudo foi submetido a apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Estácio de Sá, tendo sido aprovado sob o parecer número

1.242.574 de 24 de setembro de 2015 (ANEXO).

27

7 RESULTADOS

Dos 9 pacientes incluídos no estudo, 5 eram do sexo masculino e 4 do

sexo feminino, com idade média de 39,2 anos, com variação de 15 a 68 anos.

Quanto à etnia, 2 pacientes (22%) eram melanodermas e 7 (78%) eram

feodermas. Seis pacientes (67%) relataram a presença de sintomas, incluindo

dor, edema, flutuação, mobilidade ou aumento de volume), associados aos CP.

Todos os casos estavam situados na maxila anterior e apresentavam sinais

clínicos e/ou tomográficos de abaulamento e rompimento das corticais. O

tempo médio de descompressão foi de 7,8 meses (Tabela 2).

Tabela 2. Dados demográficos e clínicos da amostra.

Caso Sexo Idade Cor da pele Sintomas Localização Tempo de descompressão

1 F 56 Feoderma SIM Maxila anterior 8

2 F 45 Feoderma NÃO Maxila anterior 7

3 M 16 Melanoderma SIM Maxila anterior 9

4 M 49 Melanoderma NÃO Maxila anterior 7

5 F 36 Feoderma SIM Maxila anterior 10

6 F 15 Feoderma SIM Maxila anterior 6

7 M 68 Feoderma SIM Maxila anterior 9

8 M 34 Feoderma NÃO Maxila anterior 7

9 M 34 Feoderma SIM Maxila anterior 7

28

A média de volume inicial dos CP obtida por meio dos exames

tomográficos foi de 7.845,5 mm³, variando de 1.260 e 32.480 mm³. Após a

descompressão a média do volume tomográfico dos CP foi de 2.298,6 mm3,

variando de 720 a 6.160 mm3. O percentual médio de redução do volume

tomográfico foi de 54%, com menor redução de volume no caso 6 (10%) e

maior redução no caso 3 (81%) (Tabela 3).

Tabela 3. Dados referentes ao tamanho e ao volume tomográfico, percentual de redução

tomográfica dos CP e dentes associados aos CP nos casos estudados.

Caso Espécime Tamanho ** Volume *** % **** Dentes

associados

1 Inicial 13 X 11 X 9 1287

44 12

PD * 10 X 9 X 8 720 12

2 Inicial 21 X 13 X 15 4095

61,3 11 – 13

PD 18 X 12 X 11 1584 11 – 12

3 Inicial 40 X 29 X 28 32480

81 11 – 15

PD 22 X 20 X 14 6160 11 – 14

4 Inicial 21 X 13 X 13 3549

18 11 – 15

PD 17 X 10 X 17 2890 11 – 14

5 Inicial 22 X 16 X 13 4576

68,5 11 – 14

PD 16 X 09 X 10 1440 11 – 13

6 Inicial 14 X 10 X 9 1260

10 21 – 22

PD 14 X 9 X 9 1134 21 – 22

7 Inicial 33 X 20 X 18 12068

78,4 11-15

PD 20 X 10 X 13 2600 11-15

8 Inicial 29 X 15 X 17 7395

64,8 11 – 23

PD 20 X 10 X 13 2600 11 – 23

9 Inicial 20 X 15 X 13 3900

60 21-23

PD 12 X 13 X 10 1560 21-23

* PD – pós-descompressão; ** Em milímetros; *** em mm3; **** percentual de

redução do volume tomográfico da lesão pós-descompressão.

29

As figuras 1 a 2 mostram imagens tomográficas em cortes panorâmicos

(figura 1) e axiais (figura 2) do caso 8. A figura 3 mostra a imagem tomográficas

em corte panorâmico do caso 5.

Figura 1. Vista panorâmica de tomografia computadorizada cone beam do caso 3, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a imagem pós-descompressão, com redução de 81% do volume do CP após 9 meses de descompressão.

30

Figura 2. Vista axial de tomografia computadorizada cone beam do caso 8, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a imagem pós-descompressão.

31

Figura 3. Vista panorâmica de tomografia computadorizada cone beam do caso 5, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a imagem pós-descompressão, com redução de 68,5% do volume do CP após 10 meses de descompressão.

A análise da expressão imuno-histoquímica dos marcadores analisados

mostrou que apenas um espécime de descompressão e três espécimes

cirúrgicos finais foram focalmente positivos para TNFα, sendo todos os demais

negativos. A expressão de IL1β foi marcante em todos os espécimes, sendo

negativa apenas em um fragmento oriundo de descompressão (Figura 4). A

expressão de TGFβ1 também foi marcante em todos os espécimes, sendo

32

negativa apenas em um fragmento oriundo de descompressão e em um

espécime cirúrgico final de enucleação de CP (Figura 5). A expressão de MMP-

9 esteve presente em todos os espécimes, à exceção de apenas um fragmento

oriundo de descompressão (Figura 6). Já a expressão de EGFR, embora tenha

se mostrado focal em alguns casos, também foi encontrada em todos os casos,

à exceção de um espécime oriundo da remoção final de um CP (Figura 7). A

imunoexpressão de Ki-67 mostrou-se semelhante em todos os espécimes,

sempre revelando índice de proliferação celular abaixo de 1% (Figura 8). Não

foi observado padrão de imunoexpressão distinto dos marcadores avaliados

quando foram comparados os fragmentos oriundos da descompressão e os

fragmentos oriundos da enucleação final do CP (Tabela 4).

Figura 4: Expressão de IL1β no revestimento epitelial e nas células inflamatórias de um CP antes (A, Imunoperoxidase 20x) e depois (B, Imunoperoxidase 20x) da descompressão.

33

Figura 5: Expressão de TGFβ1 na cápsula de tecido conjuntivo fibroso de um CP antes (A, Imunoperoxidase 20x) e depois (B, Imunoperoxidase 20x) da descompressão.

Figura 6: Expressão de MMP9 na cápsula de tecido conjuntivo fibroso de um CP antes (A, Imunoperoxidase 20x) e depois (B, Imunoperoxidase 20x) da descompressão.

34

Figura 7: Expressão de EGFR no revestimento epitelial de um CP antes (A, Imunoperoxidase 20x) e depois (B, Imunoperoxidase 20x) da descompressão.

Figura 8: Expressão de Ki-67 em menos de 1% das células epiteliais do revestimento de um CP antes (A, Imunoperoxidase 20x) e depois (B, Imunoperoxidase 20x) da descompressão (detalhe das células positivas nos boxes).

35

Tabela 4. Resultados da imunoexpressão dos marcadores avaliados no estudo nos fragmentos de descompressão e da enucleação final dos cistos perirradiculares.

Caso Espécime TNFα IL1β TGFβ1 MMP9 EGFR KI-67

1 Inicial - + + + + < 1%

PD * - Foc + + - < 1%

2 Inicial Foc ** + + + + < 1%

PD - + + Foc + < 1%

3 Inicial - + + + Foc < 1%

PD - + + Foc Foc < 1%

4 Inicial - - - Foc Foc < 1%

PD foc + + + + < 1%

5 Inicial - + Foc - - < 1%

PD - + - + + < 1%

6 Inicial - + Foc + + < 1%

PD - + + + + < 1%

7 Inicial - + + + + < 1%

PD Foc + + + + < 1%

8 Inicial - + + + + < 1%

PD - + + + + < 1%

9 Inicial - + + + Foc < 1%

PD Foc + + + Foc < 1%

* PD – pós-descompressão; ** Foc – focal.

36

8 DISCUSSÃO

Embora a literatura sustente a utilidade da descompressão como

procedimento adjuvante no manejo cirúrgico de CP extensos (GAO et al., 2014;

ALLON et al., 2015; ULOOPI et al., 2015), pouco se conhece sobre os efeitos

que este procedimento produz nos tecidos. Supostamente, a descompressão

teria como princípio básico a diminuição da pressão intracística, que viria à

favorecer o reparo ósseo e a diminuição do quadro inflamatório. Desta forma,

os estudos imuno-histoquímicos podem ser úteis na identificação de

fenômenos celulares e moleculares envolvidos na resposta inflamatória e no

reparo tecidual destas lesões. Como demonstrado pela revisão da literatura,

não existem estudos na literatura que façam a comparação dos achados

histológicos e imuno-histoquímicas antes e após a terapia de descompressão

cirúrgica em casos de CP.

Alguns estudos já foram realizados utilizando esta metodologia para

avaliar a resposta tecidual frente à descompressão cirúrgica em TOQ,

utilizando apenas um marcador imuno-histoquímico por estudo (IL-1α, Ki-67 ou

citoqueratina 10, por exemplo), e mostrando poucos resultados

estatisticamente significativos (NAKAMURA et al., 2002; AUGUST et al., 2003;

SUYAMA et al., 2008).

A IL-1β é um importante mediador inflamatório envolvido nas atividades

de quimiotaxia, estando intimamente ligada também com a atividade osteolítica

desempenhada por osteoclastos, já que atua estimulando células

hematopoiéticas precursoras de osteoclastos. Tem importante atividade

também sobre a proliferação epitelial e acredita-se que exista relação direta da

37

presença do IL-1β na patogênese das LP e no crescimento e desenvolvimento

dos CP (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; SIQUEIRA et al.,

2010). A expressão desta IL foi encontrada na grande maioria das amostras,

tanto antes como depois da terapia de descompressão. Mesmo diante do

procedimento cirúrgico com objetivo de redução da pressão intracística, ainda

existe atividade inflamatória presente nos tecidos, sendo possivelmente a

explicação para tal achado imuno-histoquímico. GUNRAJ (1990), ELLIS (2005)

e ANAVI et al. (2011) apontam entre as principais desvantagens da técnica de

descompressão é o risco aumentado de infecção secundária na área operada.

E mesmo diante de ausência de sinais clínicos sugestivos de infecção, podem

haver irritantes locais nos tecidos, levados à cavidade através da abertura

cirúrgica, que continuem a induzir um quadro inflamatório.

O TNF-α é um mediador relevante nas etapas da diapedese, tendo em

vista que estimula a expressão de moléculas de adesão endoteliais. Além

disso, é um importante mediador envolvido na reabsorção óssea, tanto pela

atividade estimuladora direta de osteoclastos como pela indução da liberação

de outros mediadores (IL-1 e IL-6) envolvidos na osteoclastogênese

(SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; AGGARWAL, 2003;

SIQUEIRA et al., 2010). Os resultados encontrados neste estudo não

sustentam a participação do TNF-α como principal citocina envolvida na

reabsorção óssea associada ao crescimento dos CP, em contraste com outros

estudos da literatura (JURISIC et al., 2008; TEIXEIRA-SALUM et al., 2010).

A MMP-9 é uma metaloproteinase da matriz envolvida na clivagem da

elastina, estando diretamente ligada na destruição de fibras colágenas e

38

consequentemente, na degradação de tecidos conjuntivos. Tem atuação

comprovada na patogênese das LP e representa um importante mediador

envolvido na destruição tecidual encontrada nos CP, sendo expressa

principalmente pelas células do epitélio que reveste a cavidade cística e na

cápsula de tecido conjuntivo que envolve estas lesões (SIQUEIRA-JÚNIOR &

SABÓIA-DANTAS, 2000; SILVEIRA et al., 2007; HENRIQUES et al., 2011). Os

resultados encontrados no presente estudo reforçam a importância da

expressão de MMP9 no epitélio e no tecido conjuntivo dos CP, à semelhança

dos resultados encontrados em outros estudos (ANDRADE-SANTOS et al.,

2011; HENRIQUES et al., 2011). Acreditamos que não houve diferença na

imunoexpressão de MMP9 nas amostras pré e pós descompressão em nosso

estudo, provavelmente pela persistência do estímulo inflamatório nos CP

mesmo pós-descompressão.

O EGFR é o receptor do EGF e tem comprovada relação com a

atividade proliferativa das células do epitélio dos cistos odontogênicos. Se

localiza de maneira estratégica na porção externa ou interna da membrana

plasmática de células com capacidade mitótica, havendo relação entre este

posicionamento do receptor e a capacidade proliferativa (HERBST & SHIN,

2002; HERBST, 2004; SERGINA & MOASSER, 2007; GULKESEN et al.,

2011). No presente estudo, 8 das 9 amostras pré descompressão

apresentaram imunoexpressão de EGFR, resultados semelhantes aos

encontrados por GONÇALVES et al. (2012). As análises dos fragmentos pós

descompressão também apresentaram o mesmo resultado percentual de

marcação positiva, achado provavelmente relacionado com a manutenção do

39

estímulo a expressão deste fator de crescimento em virtude da persistência de

um infiltrado inflamatório nos CP mesmo com a abertura cirúrgica.

O KI-67 é um marcador de proliferação celular expresso nas células do

epitélio cístico que se encontram em atividade proliferativa, principalmente nas

fases G2 e M da interfase. Pelo fato da patogênese do CP envolver

proliferação de células epiteliais, este anticorpo se torna importante no estudo

imuno-histoquímico destas lesões, auxiliando a compreensão de seus

mecanismos evolutivos (SLOOTWEG, 1995; MACLUSKEY et al., 1999;

MENDES et al., 2011). Nadalin et al. (2011) encontraram imunomarcação de

Ki-67 na maioria dos CP avaliados e, embora nossos resultados também

tenham encontrado imunomarcação para este antígeno, a mesma foi

encontrada em menos de 1% das células do revestimento epitelial dos cistos,

tanto pré quanto pós-descompressão. NAKAMURA et al. (2002), avaliando

casos de TOQ, também não encontraram diferenças estatisticamente

significativas em amostras pré e pós-descompressão. Possivelmente o

procedimento de descompressão e a diminuição da pressão intra-cística não

interfiram no potencial proliferativo intrínseco dos TOQ e dos CP.

De forma geral, um dos objetivos da terapia endodôntica, seja

convencional ou com auxílio de técnicas cirúrgicas, é devolver a saúde aos

tecidos perirradiculares, e esta condição depende de mecanismos de reparo

tecidual. O reparo é alcançado quando há diminuição dos estímulos nocivos

aos tecidos e envolve série de células e mediadores químicos que participam

de forma ativa do processo de formação tecidual. Dentre estes mediadores,

destaca-se a participação do TGF-β, que é encontrado principalmente no tecido

40

ósseo e no tecido conjuntivo e tem papel essencial na estimulação dos

osteoblastos, contribuindo assim com a neoformação óssea, sendo importante

nos processos envolvidos na patogênese e na recuperação dos tecidos

afetados pelos CP (HEINEMEIER et al., 2007; SIQUEIRA et al., 2010; TACHI

et al., 2011). Os resultados do presente estudo mostraram imunoexpressão de

TGF-β1 em quase todos os casos, tanto em espécimes pré quanto pós-

descompressão, reforçando sua importância junto à patogênese do CP, como

anteriormente demonstrado por outros autores (FUKADA et al., 2009;

TEIXEIRA-SALUM et al., 2010; MORAES et al., 2014).

41

9 CONCLUSÃO

O perfil imuno-histoquímico da expressão de TNFα, IL1β, TGFβ1, MMP9

e EGFR e o índice de proliferação celular mensurado pela expressão de Ki-67

é semelhante em espécimes teciduais derivados de CP pré e pós-

descompressão cirúrgica.

42

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11 ANEXOS

Parecer do Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Estácio de Sá.

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