FLÁVIO ROBERTO GUERRA SEABRA

ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS

METALOPROTEINASES DA MATRIZ (MMP-1, MMP-2 E

MMP-9) NA DOENÇA PERIODONTAL

NATAL - RN

2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

CURSO DE DOUTORADO EM PATOLOGIA ORAL

ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS

METALOPROTEINASES DA MATRIZ (MMP-1, MMP-2 E

MMP-9) NA DOENÇA PERIODONTAL

Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte, como parte dosrequisitos para a obtenção do Grau de Doutor emPatologia Oral.

Doutorando: Flávio Roberto Guerra SeabraOrientadora: Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz

NATAL/RN

2006

3

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Setorial de Odontologia

Seabra, Flávio Roberto Guerra . Análise imuno-histoquímica das metaloproteinases da matriz ( MMP-1,MMP-2 eMMP-9) na doença periodontal / Flávio Roberto Guerra Seabra. –Natal,RN,2006.

100f.

Orientador: Lélia Maria Guedes Queiroz.

Tese (Doutorado em Patologia Oral) –. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro deCiências da Saúde. Departamento de Odontologia.

1. Doença periodontal - Tese. 2.Periodontite- Tese. 3. Metaloproteinases da matriz imuno-histoquímica -Tese. I. Queiroz,Lélia Maria Guedes. II. Título.

Black D64RN/UF/BSO

4

Dedicatória

5

DEDICATÓRIAS

A DEUS,Por demonstrar tão claramente sempre estar presente nos momentos mais

importantes da minha vida, não permitindo que eu Te esqueça,

A meus pais, Eduardo e Zélia,

Pelos seus exemplos de conduta que me fizeram quem eu sou

A Bárbara,

Pelo constante apoio em todos os momentos da minha vida e decisões

importantes que tomamos juntos, pela ajuda direta em vários momentos deste

trabalho e pelo amor que temos um pelo outro que me faz dizer que por você...

A João Victor,

Pessoa mais importante e ao mesmo tempo mais divertida da nossa vida. Por tudo

o que tem nos ensinado nos últimos quatro anos e por ser tão inteligente, alegre e

companheiro.

6

Agradecimentos

7

AGRADECIMENTOS

A meus sogros Nogueira e Marialba e meus cunhados Diego e Lucas pelaconvivência de constante amizade e respeito.

À minha orientadora Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, pela constantedisposição em ajudar e orientar.

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Dra. LéliaBatista de Souza, Dra. Roseana de Almeida Freitas, Dr. Leão Pereira Pinto,Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão,

À Profa. Dra. Rejane Andrade de Carvalho pelo incentivo.

Aos professores Tasso Gadelha, Lecy Fernandes e Maria Alice Fuscella,diretores do Curso de Odontologia da Universidade Potiguar durante o períododeste Doutorado, por terem dado condições para que eu pudesse cursá-lo.

Aos Professores da disciplina de Periodontia da UnP, Odilon de Amorim GarciaFilho, Carlos Sarmento, Euler Dantas, José Nazareno Júnior e JanaínaLemos e da Disciplina de Cirurgia, Fernando Maia, Fernando Pinto, MariaAuxiliadora, Lourdes Arruda e José Sandro por entenderem as minhasausências quando necessário.

Às colegas Éricka, pela ajuda de sempre não só nesse trabalho mas em váriosmomentos em que precisei e Ruthinéia, que cedeu material para parte daamostra utilizada neste trabalho

Aos meus colegas de turma, Simone, Manuel e Sormani.

Aos colegas de disciplinas durante o curso, Gustavo, Márcia, Márcio, Rivadávio,Rosilene, Andréa, João, Karuza, Cassiano, Danielle, George, Igor, Fernanda,Carmem, Antônio Luiz, Roberta, Marta e Claudine.

Aos funcionários da Disciplina de Patologia Oral, Gracinha, Sandra, Canindé,Hévio e Idelzuíte.

Aos colegas do CAMS-TRE-RN, Dra. Salete, Dr. Tércio, Dr. Carlos Augusto eDr. Francisco Morais

Aos colegas da Clínica Carlos Alexandre Câmara, Dr. Carlos Alexandre, Dr.Jolber, Dra. Juliana, Dra. Tamara, Edna, Kelly, Márcia e Mônica.

Em especial ao Prof. Damásio, que cedeu as instalações do laboratório deHistologia da UnP para a análise das lâminas utilizadas neste trabalho.

8

Resumo

9

RESUMO

A destruição tecidual observada na doença periodontal é causada, principalmente,

por componentes do hospedeiro que têm sua produção estimulada pelos produtos

liberados pelas bactérias. As Metaloproteinases da Matriz ou MMPs, enzimas

relacionadas à degradação de matriz extracelular em processos tanto fisiológicos

quanto patológicos são consideradas as principais responsáveis pela perda

tecidual característica da doença periodontal, e o entendimento de como isso

ocorre pode ter uma série de implicações benéficas em relação à prevenção, ao

diagnóstico e ao tratamento desta doença. Neste trabalho foi estudada a

expressão imuno-histoquímica da MMP-1, da MMP-2 e da MMP-9 em gengivas

clinicamente diagnosticadas com doença periodontal. A MMP-1 teve expressão

significativamente maior que as outras duas nos casos de gengivite tanto no

epitélio (p=0,0008) quanto no tecido conjuntivo (p=0,0049). Na periodontite, a

MMP-1 e MMP-9 tiveram expressões significativamente maiores que a MMP-2

tanto no epitélio (p<0,0001) quanto no conjuntivo (p=0,0002). A MMP-1 e MMP-9

mostraram maior expressão na periodontite que na gengivite sendo a MMP-1

apenas no tecido conjuntivo (p=0,03) e a MMP-9 no epitélio (p=0,003) e no

conjuntivo (p=0,04). Concluiu-se portanto que a MMP-1 apresenta forte expressão

em todos os estágios da doença peridontal, aumentando no tecido conjuntivo no

caso de progressão para periodontite, podendo portanto ter um papel crucial na

degradação de tecido conjuntivo e perda óssea observada na doença desde os

estágios iniciais de gengivite até a progressão para periodontite. A MMP-9, é

expressa mais na periodontite que na gengivite, tanto no epitélio quanto no

conjuntivo significando que esta enzima pode ter importância na progressão da

gengivite para a periodontite atuando na reabsorção óssea observada na doença

periodontal.

Palavras-chave: Doença periodontal, Periodontite, Metaloproteinases da Matriz,

Imunohistoquímica.

10

Abstract

11

ABSTRACT

The tissular destruction found in periodontal diseases is caused mainly by

components of the host that have its production stimulated by the products of the

microorganisms present on the plaque. Matrix Metalloproteinases (MMPs), a class

of enzymes involved both in physiologic and pathologic extracellular matrix

degradation are considered the main responsible for the characteristic tissular loss

in periodontal disease, and the understanding of how this happens can have a

series of beneficial implications for prevention, diagnosis and treatment of this

illness. The aim of this work was to study the immunohistochemical expression of

MMP-1, MMP-2, and MMP-9 in fragments of gingival biopsies with clinical

diagnose of periodontal disease. MMP-1 has expressed significantly more than the

others MMPs in gingivitis both in the epithelium (p=0,0008) and connective tissue

(p=0,0049). In periodontitis, both MMP-1 and MMP-9 has expressed significantly

more than MMP-2 in the epithelium (p<0,0001) and in the connective tissue

(p=0,0002). MMP-1 and MMP-9 presented more expression in periodontitis than in

gingivitis but MMP-1 only in the connective tissue (p=0,03) and MMP-9 in the

epithelium (p=0,003) and in the connective tissue (p=0,04). In conclusion, these

results indicate that the MMP-1 presents high expression in every stages of the

periodontal diseases, and increases its expression in the connective tissue when

the gingivitis evolves to periodontitis. Therefore, it may have an important role in

connective tissue degradation and bone loss observed in disease, since early, in

gingivitis, until late stages, in periodontitis, of the periodontal disease. MMP-9 has

expressed more in periodontitis than in gingivitis, both in epithelium and in

connective tissue. It means that this enzyme may have some importance in the

progression of gingivitis to periodontitis by acting in bone resorption observed in

this desease.

Key-words: Periodontal disease, Periodontitis, Matrix metalloproteinases,Immunohistochemistry

12

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

Quadro 1 Especificidade, recuperação antigênica, diluição etempo de incubação dos anticorpos utilizados

54

Figura 1 Figura 1. Localização do processo inflamatório emespécimes com diagnóstico clínico de periodontite.Inflamação considerada perivascular e justa-epitelial(A e B) correspondendo a um quadro histológico demenor gravidade que a inflamação difusa (C e D).(H/E, 40x em A e C e H/E, 200x em B e D)

61

Figura 2 Figura 2. Caracterização do tipo celular predominanteno infiltrado inflamatório em lâminas com diagnósticoclínico de periodontite, evidenciando em A uminfiltrado predominantemente Linfocitário e em B umconsiderado Linfo-plasmocitário. (H/E, 200x)

63

Figura 3 Figura 3. Análise da marcação imuno-histoquímicapara as MMP-1 no tecido epitelial de revestimento,onde em A é demonstrada uma marcaçãoconsiderada forte (++) em B uma marcaçãoconsiderada fraca (+) e em C ausência de marcação(-). (SABC, 200x)

65

Figura 4 Figura 4. Análise da marcação imuno-histoquímicapara as MMP-1 no tecido conjuntivo, onde em A édemonstrada uma marcação considerada forte (++)em B uma marcação considerada fraca (+) e em Causência de marcação (-). (SABC, 200x)

66

Figura 5 Figura 5. Análise da marcação imuno-histoquímicapara as MMP-1 evidenciando um neutrófilo marcado(Setas). (SABC, 200x)

68

Figura 6 Figura 6. Análise da marcação imuno-histoquímicapara as MMP-1 evidenciando células endoteliaismarcadas (Setas). (SABC, 400x)

68

Figura 7 Figura 7. Análise da marcação imuno-histoquímicapara as MMP-1 evidenciando plasmócitos (setaverde), linfócitos (seta vermelha), fibroblastos (setapreta) e macrófagos (seta azul) marcados. (SABC,400x)

68

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Total de casos analisados. Natal/ RN, 2006 60

Tabela 2. Associação entre o tipo de doença periodontaldiagnosticada e a localização da inflamação. Natal/ RN,2006.

60

Tabela 3. Associação entre o tipo de doença periodontaldiagnosticada e o tipo de infiltrado inflamatóriopredominante. Natal/ RN, 2006

62

Tabela 4. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-1 no epitélio. Natal/ RN, 2006

64

Tabela 5. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-1 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006

67

Tabela 6. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celularencontrado no tecido conjuntivo gengival para a MMP-1. Natal/ RN, 2006

67

Tabela 7. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-2 no epitélio. Natal/ RN, 2006

69

Tabela 8. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-2 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006

70

Tabela 9. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celularencontrado no tecido conjuntivo gengival para a MMP-2. Natal/ RN, 2006

70

Tabela 10. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-9 no epitélio. Natal/ RN, 2006

71

Tabela 11. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-9 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006

71

Tabela 12. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celularencontrado no tecido conjuntivo gengival para a MMP-9. Natal/ RN, 2006

72

Tabela 13. Média dos postos e significância estatística damarcação imuno-histoquímica para a MMP-1, MMP-2 eMMP-9 em gengivite. Natal/ RN, 2006

72

Tabela 14. Média dos postos e significância estatística damarcação imuno-histoquímica para a MMP-1, MMP-2 eMMP-9 em periodontite. Natal/ RN, 2006

73

14

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

oC Graus Célcius

µm Micrometro

AAP American Academy of Periodontology

ADAMs Adamalisinas

AE Elastase ativa

AMP Adenosina monofosfato

BB-94 Batimastat

bFGF FGF básico

Ca Cálcio

cAMP AMP cíclico

CCN Fator de crescimento de tecido conjuntivo

ConA Concavalina A

Cys Cisteína

E-α-1 PI Complexo Elastase-inibidor de proteinase α-1

EGF Fator de crescimento epitelial

ELISA Enzyme-linked immunossorbent assay

FGF Fator de crescimento para fibroblastos

H2O2 Peróxido de hidrogênio

IFNγ Interferon-γ

IL Interleucina

kDa KiloDálton

LPS Lipopolissacarídeo

MEC Matriz extracelular

ml mililitro

mm milímetro

mM milimolar

MMP Metaloproteinase da Matriz

MMPs Metaloproteinases da Matriz

15

MT-MMP Metaloproteinase da matriz ligadas à membrana

MT-MMPs Metaloproteinases da matriz ligadas à membrana

nm Nanômetro

OPG Osteoprotegerina

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

PGE2 Prostaglandina E2

pH Potencial hidrogeniônico

PMN Polimorfonucleares

RANKL Ligante do receptor ativador do fator nuclear κB

RNA Ácido ribonucléico

RNAm RNA mensageiro

RT-PCR Real-time polymerase chain reaction

SABC Estreptavidina-biotina

SPARC Proteína secretada ácida rica em cisteína

TA Temperatura ambiente

TGF Fator de crescimento transformador

TIMP Inibidor tecidual de metaloproteinases

TIMPs Inibidores teciduais de metaloproteinases

TNF Fator de Necrose Tumoral

TSP Trombospondina

VEGF Fator de crescimento vascular endotelial

Zn Zinco

16

Sumário

17

SUMÁRIO

1 Introdução _________________________________________________ 18

2 Revisão da Literatura ________________________________________ 21

2.1 Doença Periodontal ______________________________________ 22

2.2 Matriz Extracelular _______________________________________ 28

2.3 Metaloproteinases da Matriz (MMPs) ________________________ 31

2.4 MMPs na Doença Periodontal ______________________________ 42

3 Proposição_________________________________________________ 51

4 Material e Métodos __________________________________________ 53

4.1. CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO___________________________ 54

4.2. POPULAÇÃO ___________________________________________ 54

4.3. AMOSTRA______________________________________________ 54

4.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA_________________________________ 55

4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO ___________________________ 55

4.6. MÉTODO DE ANÁLISE DAS CÉLULAS IMUNOMARCADAS _____ 58

4.7. TRATAMENTO ESTATÍSTICO ______________________________ 60

4.8 IMPLICAÇÕES ÉTICAS____________________________________ 60

5 Resultados_________________________________________________ 62

5.1 Resultados clínicos e morfológicos _________________________ 63

5.2. Resultados imuno-histoquímicos __________________________ 67

6 Discussão _________________________________________________ 77

7 Conclusões ________________________________________________ 92

Referências bibliográficas______________________________________ 94

ANEXO 1 ___________________________________________________ 100

ANEXO 2 ___________________________________________________ 101

ANEXO 3 ___________________________________________________ 102

ANEXO 4 ___________________________________________________ 103

ANEXO 5 ___________________________________________________ 104

18

Introdução

19

1 INTRODUÇÃO

A periodontite não é uma doença exclusiva do nosso tempo. Já foram

detectadas reabsorções ósseas em fósseis de humanos que viveram na era

paleolítica e em múmias da civilização egípcia que viveram há 4.000 anos.

(GOLD, 1985)

Considera-se que os microorganismos presentes no biofilme dentário,

principalmente os localizados no ambiente sub-gengival, constituem o principal

agente etiológico extrínseco das doenças periodontais inflamatórias, pois

substâncias produzidas no biofilme dentário têm a capacidade de penetrar na

gengiva saudável através dos epitélios juncional e sulcular devido à relativa

permeabilidade destes.

Na década de 80 os estudos sobre história natural da doença periodontal

nos mostraram que apesar da periodontite sempre ter início com uma gengivite,

em alguns casos a gengivite pode permanecer indefinidamente sem evoluir para a

periodontite. No entanto, a periodontite, quando ocorre, não ocorre de maneira

semelhante em todos os indivíduos e nem mesmo nos dentes de um mesmo

indivíduo. No estabelecimento da periodontite, parecem ter importância outros

fatores que, somados à ação dos microorganismos, determinam a evolução da

condição de gengivite para uma doença periodontal inflamatória que atinge tecidos

de suporte. Esses fatores estão relacionados aos chamados fatores etiológicos

secundários da doença periodontal, assim como à resposta de defesa do

hospedeiro aos agentes agressores provenientes do biofilme dentário.

Podemos descrever a doença periodontal como a reação do organismo, no

intuito de protegê-lo de agressores externos, tentando mantê-los sempre o mais

longe possível do meio interno. Dessa forma, se há o acúmulo de biofilme na

superfície do dente, e este representa um agente com potencial agressor muito

forte, o organismo reage tentando mantê-lo no meio externo. Para isso, lança mão

de meios que o permitam levar o epitélio juncional mais para apical, para

20

distanciar-se do agente agressor, com isso tem lugar todo o processo biológico

que culmina com a reabsorção do osso alveolar e perda do dente.

Isso se dá inicialmente pela destruição do tecido conjuntivo gengival, onde

participam principalmente colagenases como a MMP-1, e pela migração apical do

epitélio juncional, onde se acredita ser necessária a degradação da membrana

basal deste epitélio, papel muito bem desempenhado pelas MMP-2 e MMP-9

semelhantemente ao que foi demonstrado em neoplasias (NABESHIMA et al.

2002).

Assim, considera-se que a destruição que tem lugar no tecido conjuntivo

gengival e no osso alveolar é muito mais causada por componentes teciduais

produzidos pelo próprio hospedeiro que por componentes produzidos e liberados

pelas bactérias do biofilme, sendo esta uma das explicações para o fato da

periodontite ocorrer de forma tão diferente entre os indivíduos.

Sendo as metaloproteinases da matriz (MMPs) as enzimas responsáveis

pela degradação da matriz extracelular e do componente orgânico do osso,

considera-se que estas tenham papel crucial na doença periodontal inflamatória

crônica destrutiva e possivelmente um papel na explicação do por quê nem toda

gengivite evoluirá para uma periodontite. Neste trabalho, estudaremos através de

análise imuno-histoquímica a presença e o papel destas MMPs (MMP-1, MMP-2 e

MMP-9) na doença periodontal, objetivando determinar se a expressão e/ou

distribuição destas enzimas nas diferentes células e tecidos encontrados em

gengivas inflamadas influem na diversidade de apresentação clínica desta doença.

21

Revisão da Literatura

22

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Doença Periodontal

A doença periodontal tem uma alta prevalência na população mundial, com

quase 20% das pessoas de 30 a 39 anos acometidas por periodontite nos Estados

Unidos, chegando a valores próximos a 50% das pessoas na faixa etária de 50 a

59 anos. Na Europa e América do Sul, tem-se valores semelhantes e no Brasil,

1,19% dos indivíduos apresenta bolsas de 4 a 5 mm já na idade de 15 a 19 anos.

(ALBANDAR, 2002; GJERMO et al. 2002; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004;

SHEIHAM; NETUVELI, 2002).

Socransky e Haffajee (2002), descrevem as infecções bacterianas em

várias classes que são as infecções agudas, como os abscessos, as crônicas,

como a tuberculose, as tardias, como a febre reumática e as causadas por

biofilmes bacterianos como a doença periodontal.

Armitage, (1999) e Tunes et al., (2005), descreveram a atual classificação

das doenças periodontais preconizada pela Academia Americana de

Periodontologia (AAP) substituindo a classificação de 1989. As doenças gengivais

são consideradas em duas categorias onde a primeira abrange as doenças

induzidas por biofilme dentário (ou placa bacteriana), ou seja, as gengivites, que

engloba a chamada gengivite induzida exclusivamente por placa, as gengivites

modificadas por fatores sistêmicos, as gengivites modificadas por medicamentos e

as gengivites modificadas por deficiências nutricionais. A segunda categoria das

doenças gengivais inclui as lesões gengivais não induzidas por placa como as de

origem viral, fúngica, genética, relacionadas a desordens sistêmicas como o

líquen-plano (classificada anteriormente como gengivite descamativa) as

traumáticas e outras. As periodontites são classificadas em Periodontite Crônica,

conhecida anteriormente como Periodontite do Adulto, a Periodontite Agressiva,

conhecida anteriormente como Periodontite Juvenil e a Periodontite como

23

Manifestação de Doenças Sistêmicas, que abrange as condições que no passado

eram relacionadas no item Periodontites Pré-puberais.

Sabe-se hoje que a doença periodontal é causada principalmente por

bactérias localizadas no biofilme dentário (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2002;

TODESCAN, 2001; WILLIAMS et al.,1992), e que possui ainda como fatores

etiológicos secundários, várias condições locais como fatores de retenção de

placa, ou sistêmicas, como hábito de fumar e presença de diabetes, que

modificam o curso da doença facilitando a sua instalação e/ou acelerando a sua

progressão (BEZERRA et al., 2003; MALDONADO et al., 2004; PASSANEZI et al.

2005; TODESCAN, 2001; WILLIAMS et al., 1992).

HAAKE et al. (2004), chama a atenção para o fato de que se sabe desde a

década de 70 que, segundo a hipótese da placa específica, a petogenicidade do

biofilme dentário depende da presença e aumento de microorganismos

específicos.

Enquanto na saúde periodontal observa-se maior proporção de bactérias

Gram-positivas, na gengivite, a proporção entre Gram-positivas e Gram-negativas,

assim como entre aeróbios e anaeróbios encontra-se mais equilibrada e na

periodontite já se observa uma alta proporção de anaeróbios, chegando a 90%, e

de Gram-negativos, chegando a 75%. As bactérias mais cultivadas em sítios com

periodontites são: o Porphyromonas gingivalis, a Tannerella forsythia e o

Actinobacillus actinomycetemcomitans (HAAKE et al. 2004b).

Socransky e Haffajee (2002) associam as bactérias encontradas

freqüentemente no biofilme dentário em vários grupos distintos diferenciados por

cores. Os colonizadores iniciais são agrupados nos complexos azul, amarelo,

verde e púrpura e correspondem a bactérias como as Actinomyces, os

componentes do gênero Streptococcus, as espécies de Capnocytophaga, o

Actinobacillus actinomycetemcomitans sorotipo A e a Veilonella parvula, todas

consideradas não patogênicas ou de baixa patoenicidade ao periodonto. Bactérias

que aparecem mais tardiamente, predominantemente anaeróbias e Gram-

24

negativas devido ao consumo do oxigênio disponível pelos colonizadores iniciais,

correspondem aos chamados complexos laranja e vermelho, considerados mais

patogênicas ao periodonto, principalmente as do complexo vermelho que são o

Porphyromonas gingivalis, a Tannerella forsythia, conhecida até recentemente

como Bacteroides forsythus, e a Treponema denticola.

A importância dos fatores secundários foi demonstrada por Albandar (2002)

que encontrou riscos aumentados de doença periodontal em pacientes fumantes e

portadores de diabetes mellitus. Bezerra et al. (2003) através da avaliação dos

prontuários odontológicos de 46 pacientes fumantes e 49 não-fumantes, observou

que as médias dos índices profundidade de sondagem e recessão gengival

vestibular de todos os dentes presentes foi estatisticamente maior nos pacientes

fumantes. Já Maldonado et al. (2004) relataram que a maior prevalência e

severidade de doença periodontal em pacientes diabéticos dos tipos 1 e 2 é bem

documentada por estudos de caráter epidemiológico e atribuída a vários

mecanismos distintos.

O papel do hospedeiro em restringir a infecção aos tecidos periodontais é

de extrema importância para a saúde geral do indivíduo. Mas nesse processo, a

resposta do organismo, que inicialmente tem a intenção de defendê-lo contra o

agressor, acaba também resultando na destruição tecidual local que se conhece

como doença periodontal (GENCO, 1992; SEABRA; SEABRA; BRITO, 2005).

O papel das bactérias parece ser o de estimular células inflamatórias

crônicas presentes na gengiva, assim como fibroblastos a produzirem citocinas

como IL-1, TNF e IL-6, que agem estimulando osteoclastos a reabsorverem o

osso. A formação e a ativação dos osteoclastos se dá pela ação destas citocinas,

que agem na diferenciação dos osteoclastos a partir de seus precursores da

linhagem dos monócitos. O papel da IL-1 na doença está relacionado ao aumento

dos níveis de produção de prostaglandina E2 pelos fibroblastos gengivais,

aumento da produção de RNAm para procolagenases em fibroblastos e estímulo

direto à reabsorção óssea mediada por osteoclastos (GENCO, 1992).

25

Seabra, Seabra e Brito (2005) relatam que uma vez no local da agressão os

leucócitos, no processo inflamatório agudo, irão executar a sua função de

fagocitose. Além de degradar o conteúdo fagocitado, as enzimas proteolíticas do

fagossomo acabam sendo liberadas também na matriz extracelular durante a

fagocitose ou a morte do fagócito causando destruição tecidual. Se o agente

agressor é suficientemente limitado para ser combatido pela inflamação aguda, ou

é removido mecanicamente, os agentes quimiotáticos que atraem os neutrófilos e

que também têm a capacidade de inativar os inibidores de metaloproteinases são

removidos e o dano tecidual cessa. Quando a inflamação aguda não pode ser

resolvida devido à persistência do agente agressor ou distúrbios nos processos

normais de cura o processo evolui para uma inflamação crônica, que se

caracteriza por uma duração mais longa e pela presença de células como

linfócitos, plasmócitos e macrófagos. Ocorre fibrose e destruição tecidual com

tentativas de reparação acontecendo simultaneamente à inflamação.

Os polimorfonucleares são as células mais freqüentemente coletadas no

sulco gengival tanto em situação de saúde gengival quanto na doença periodontal.

Apesar de clara função protetora contra a doença periodontal destrutiva,

evidenciada pelo aparecimento de formas altamente agressivas de periodontite

em pacientes com distúrbios de função e número de neutrófilos, estas células

estão envolvidas no dano tecidual encontrado na periodontite, especificamente

devido às proteinases neutras existentes nos chamados grânulos azurófilos que

são encontrados no fluido gengival de indivíduos com doença periodontal ativa

(KINANE; LINDHE, 1999; MEYER et al. 1997).

PASSANEZI et al. (2005) relatam que a reabsorção óssea resultante da

doença periodontal ocorre de forma intermitente, com episódios de atividade,

intercalados por momentos de inatividade. De acordo com estes autores, os

episódios de atividade de reabsorção são causados pela extensão da inflamação

agudizada para o periodonto de sustentação, de forma que a perda óssea ocorre

de forma rápida e o epitélio juncional migra para apical afastando-se do contato

com o biofilme dentário, cessando então a reabsorção. Outro ciclo semelhante se

26

inicia após a propagação apical do “front” do biofilme, aproximando-se novamente

do epitélio junicional dando origem a nova inflamação gengival agudizada

iniciando novo episódio de atividade de reabsorção.

Além de destruição tecidual demonstrada extensivamente na literatura,

KARIMBUX et al. (1998), estudando a expressão de colágenos I e XII em

gengivas com periodontite observou redução da produção da cadeia α2 do

colágeno tipo I e da cadeia α1 do colágeno tipo XII. O que resulta na baixa

produção de colágenos dos tipos I e XII em pacientes com periodontite.

Williams (1992) e Gonçalves et al. (2005) descrevem os estágios da

patogênese da doença periodontal como descritos por Page e Schroeder, em

1976 da forma como se segue. A doença periodontal divide-se em quatro

estágios, denominados de lesão inicial, lesão precoce, lesão estabelecida e lesão

avançada, que são estágios que descrevem desde o início da inflamação gengival

até a reabsorção óssea.

A doença periodontal se inicia realmente no estágio de lesão inicial, onde a

gengiva ainda é considerada “clinicamente sadia”. Este estágio aparece após 4

dias de acúmulo de biofilme dentário e constitui basicamente uma reação

inflamatória aguda. Os tecidos afetados incluem parte do epitélio juncional e a

porção mais coronal do tecido conjuntivo adjacente. São observados dilatação e

aumento da permeabilidade dos vasos, infiltrado inflamatório que ocupa de 5 a

10% do tecido conjuntivo, com perda de colágeno nesta área e a principal

característica histológica é o aumento na migração de neutrófilos do plexo

vascular gengival para o sulco gengival através do epitélio juncional

(GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS, 1992).

O estágio seguinte é a lesão precoce que é observada após cerca de 7 dias

de acúmulo de biofilme dentário. Neste estágio, ocorre aumento no número de

vasos do plexo gengival, o infiltrado já ocupa 15% da área e a principal

característica é um predomínio de linfócitos e macrófagos com poucos

plasmócitos presentes. Neste estágio a gengivite já começa a se evidenciar

27

clinicamente como uma gengivite leve (GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS,

1992).

Quando o biofilme dentário se acumula por 2 a 3 semanas, tem início o

terceiro estágio, caracterizado clinicamente por uma gengivite de moderada a

severa e denominado de lesão estabelecida. Ocorre aumento na extensão da área

afetada e começa um aumento na proporção de plasmócitos que passam a ocupar

até 30% da área afetada. Linfócitos e macrófagos são ainda detectados no tecido

conjuntivo e neutrófilos no epitélio sulcular. O epitélio juncional aumenta suas

projeções digitiformes em direção ao tecido conjuntivo já iniciada de forma discreta

no estágio anterior, além de iniciar a sua projeção para apical, aprofundando o

sulco gengival clínico (GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS, 1992).

A lesão estabelecida pode permanecer sem evoluir para o estágio seguinte

ou pode evoluir dando lugar ao estágio de lesão avançada que caracteriza

clinicamente a periodontite. Este último estágio é caracterizado principalmente

pelo início da reabsorção óssea acompanhada por uma predominância de até

50% de plasmócitos e mudança nos linfócitos que passam a predominar os do tipo

B ao invés dos do tipo T (GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS, 1992).

Smith et al. (2004) consideraram que a migração para apical do epitélio

juncional é um evento chave na formação da bolsa periodontal e que isso ocorre

às custas de degradação das fibras de Sharpey localizadas mais coronalmente.

Quanto às células que participam deste processo, Lins (2003) estudou o

papel do perfil da resposta imunológica em 42 espécimes teciduais emblocados

em parafina diagnosticados como gengivite crônica (17 casos) e periodontite

crônica (25 casos). A análise imuno-histoquímica mostrou que nos estágios que

correspondem à gengivite, os macrófagos predominam, mas com a evolução da

doença para uma periodontie, tendem a desaparecer sendo substituídos por

linfócitos e plasmócitos. Linfócitos T helper, encontravam-se predominantemente

em situação justa-epitelial provavelmente para interagirem com as células

dendríticas no processo de apresentação antigênica. Já os linfócitos B

28

encontravam-se distribuídos focalmente em posição justa-epitelial ou distantes do

epitélio.

2.2 Matriz Extracelular

Alberts et al. (1997) afirmaram que as células de um tecido normalmente

estão em contato com uma rede complexa de macromoléculas extracelulares

denominada de matriz extracelular (MEC), que atua ajudando a manter células e

tecidos unidos, fornecendo uma estrutura organizada onde as células podem

migrar e interagirem entre si, além de suportar a maior parte do estresse mecânico

infligido àquele tecido.

Pereira et al. (2005), conceituam matriz extracelular (MEC) como um

espaço extracelular, preenchido por um complexo de componentes fibrosos e

protéicos, com proporções variadas de proteínas e polissacarídeos que fornecem

um substrato adequado para o crescimento e diferenciação dos mais variados

tipos celulares do organismo.

A quantidade de matriz extracelular varia grandemente de acordo com o

tecido em questão, sendo mais abundante que as próprias células nos tecidos

conjuntivos e escassa nos tecidos epiteliais. Nos tecidos conjuntivos os

componentes da MEC são secretados por fibroblastos ou por células da família

dos fibroblastos, como condroblastos nas cartilagens e osteoblastos nos ossos

(ALBERTS et al., 1997; MOTT; WERB, 2004).

São duas as classes principais de macromoléculas que compõem a matriz

extracelular, as glicosaminoglicanas e as proteínas (ALBERTS et al., 1997; MOTT;

WERB, 2004).

As glicosaminoglicanas são cadeias polissacarídicas não ramificadas

compostas de unidades repetidas de dissacarídeos. São altamente hidrofílicos e

29

têm a capacidade de atrair água formando géis que ocupam grandes volumes e

resistem bem às forças compressoras exercidas sobre a matriz, assim como

permitem fácil difusão de moléculas hidrossolúveis e migração celular. Quatro

grupos compõem as glicosaminoglicanas, são eles: a hialurona, o mais simples e

os sulfatos de condroitina e de dermatana, o sulfato de heparana e o sulfato de

queratana, que são encontrados ligados covalentemente às proteínas na forma de

proteoglicanas, que então recebem nomes como agrecana, betaglicana, decorina,

perlecana, serglicana e sindecana. Além de fornecer um espaço hidratado, as

proteoglicanas podem servir como filtros bioquímicos para moléculas de tamanhos

diferentes e fornecerem ligação para moléculas sinalizadoras exercerem sua

função e para regulação da ação de algumas proteases. Algumas proteoglicanas

como as sindecanas apresentam seus núcleos protéicos atravessando a

membrana celular atuando como receptores para proteínas estruturais da MEC ou

como co-receptores para moléculas sinalizadoras como FGF e TGF-β (ALBERTS

et al., 1997, BORNSTEIN ; SAGE, 2002).

Os componentes protéicos da matriz extracelular, para Alberts et al. (1997)

são classificados ainda em estruturais, como o colágeno e a elastina, e adesivos

como a fibronectina e a laminina.

Os colágenos são uma família de proteínas características encontradas em

todos os animais multicelulares. São as proteínas mais abundantes nos mamíferos

correspondendo a 25% da massa protéica. Tem como principais características de

sua molécula a estrutura longa e rígida de sua fita-tripla helicoidal, que possui três

cadeias polipeptídicas chamadas cadeias α enroladas umas às outras. Cerca de

25 tipos de cadeias α já foram identificadas com 15 tipos de moléculas de

colágeno encontradas. O colágeno mais comum nos tecidos conjuntivos é o do

tipo I, que junto com os tipos II, III, V e XI compõem os colágenos fibrilares. Estes

possuem estrutura tipo corda já que depois de sintetizadas e secretadas para o

espaço extracelular as moléculas se agrupam em fibrilas colágenas que se

agrupam em fibras colágenas, maiores e mais espessas. Os colágenos IX e XII

são chamados de colágenos associados às fibrilas porque localizam-se na

30

superfícies das fibrilas, ligando-as entre si e a outros componentes da MEC. Há

ainda os colágenos formadores de rede, dos tipos IV e VII. O do tipo IV agrupa-se

em uma camada como um feltro formando a parte principal da lâmina basal e o do

tipo VII forma um dímero que se agrupa em estruturas chamadas fibras

ancoradouras que fazem a ligação da lâmina basal ao conjuntivo subjacente. A

elastina é uma proteína hidrofóbica que corresponde ao principal componente das

fibras elásticas. Estas fornecem elasticidade à matriz extracelular de modo que os

tecidos possam voltar à forma original após uma distensão temporária (ALBERTS

et al., 1997; MOTT; WERB, 2004; van den STEEN et al. 2002).

KARIMBUX et al. (1998), relatam que o tecido conjuntivo periodontal é

composto basicamente de colágenos fibrilares dos tipos I e III e do colágeno

associado a fibrilas do tipo XII sendo que os primeiros são observados já durante

o desenvolvimento do ligamento periodontal e o do tipo XII apenas no ligamento

periodontal e tecido conjuntivo gengival maduros.

Ainda de acordo com Alberts et al. (1997), as proteínas adesivas exercem

papel tanto na organização da matriz como na ligação das células a ela. A

fibronectina é uma glicoproteína encontrada em todos os vertebrados e

corresponde a um dímero composto de duas subunidades cada uma, com vários

domínios funcionalmente diferentes separados por regiões flexíveis. Cada um dos

domínios liga-se a componentes diferentes da própria matriz ou das células como

colágeno e heparana, sendo esta proteína importante para a adesão célula-matriz

e para a migração celular.

Bornstein e Sage (2002) afirmam que formas especializadas de matriz

extracelular, chamadas de membrana basal ou lâmina basal, possuem

propriedades estruturais, mas sem perder a ação de influenciar a função das

células.

A lâmina basal, segundo Aberts et al. (1997) e Smith et al. (2004), é uma

camada delgada (de 40 a 120 nm de espessura) e flexível de matriz extracelular

organizada logo abaixo do epitélio ou envolvendo células musculares, células

31

adiposas e células de Schwann separando-os do tecido conjuntivo adjacente.

Além de determinar a polaridade das células, a lamina basal influencia o

metabolismo celular, organiza as proteínas da membrana celular adjacente, induz

a diferenciação e favorece a migração celular. A lamina basal é sintetizada pelas

células que nela repousam e em alguns tecidos ela é ancorada ao tecido

conjuntivo subjacente através das fibras ancoradouras. A maioria das lâminas

basais contém colágeno tipo IV, a proteoglicana perlecana e as glicoproteínas

laminina e entacina.

Para Bornstein e Sage (2002) um grupo de proteínas extracelulares que

não contribuem diretamente para formação de elementos estruturais da matriz

extracelular, mas agem como moduladores das funções celulares e das interações

célula-matriz extracelular são chamadas de “matricelular”. O termo matriz

pericelular se refere a um compartimento da matriz extracelular, adjacente à

célula, que contém fatores de crescimento, citocinas, proteases e outras

moléculas bioativas que interagem com a superfície celular e, junto com outros

elementos como proteoglicanos, influenciam propriedades das células como

motilidade, proliferação, diferenciação e predisposição a apoptose. As proteínas

matricelulares são a trombospondina-1 e -2 (TSP-1 e TSP-2), a proteína secretada

ácida e rica em cisteína (SPARC) que também é conhecida como osteonectina, a

tenascina-C, a tenascina-X e o fator de crescimento de tecido conjuntivo (CCN).

2.3 Metaloproteinases da Matriz (MMPs)

Segundo Birkedal-Hansen (1993) a degradação da matriz extracelular

envolve mecanismos distintos sendo iniciada pela dissolução mediada por

metaloproteinases da matriz (MMPs) ou pela plasmina.

A regulação do turnover das macromoléculas da matriz extracelular é crítica

para uma série de processos biológicos importantes, sendo realizada por enzimas

32

proteolíticas extracelulares excretadas localmente pelas células que pertencem a

uma de duas classes: as metaloproteases ou as serinoproteases (ALBERTS et al.,

1997; GRENIER; MAYRAND, 2001; PEREIRA et al., 2005; SORSA;

TJÄDERHANE; SALO, 2004).

Sternlicht e Werb (2001) explicam que as enzimas proteolíticas são

classificadas em exopeptidases e endopeptidases quando clivam,

respectivamente, ligações terminais ou internas dos peptídios.

As metaloproteinases são um grupo de endopeptidases, dependentes de

Ca++ ou Zn++ ligados no sítio ativo para possuírem atividade (ALBERTS et al.

1997) classificadas em 5 superfamílias, sendo uma delas a superfamília metzincin

que contém um domínio com 3 histidinas que se ligam ao zinco no sítio catalítico.

A superfamília metzincin é subdividida em 4 famílias: as serralisinas, as astacinas,

as ADAMs (adamalisinas) e as metaloproteinases da matriz (MMPs) (MOTT;

WERB, 2004; STERNLICHT; WERB, 2001).

As MMPs são uma família de enzimas proteolíticas que degradam os

componentes da matriz extracelular como o colágeno, a gelatina e a elastina

(HAAKE et al., 2004). As MMPs dos vertebrados atuam em diversos substratos,

sendo capazes de degradar virtualmente todos os componentes da matriz

extracelular (De SOUZA et al., 2005; STERNLICHT; WERB, 2001).

Como a cada momento são descobertos novos membros da família das

MMPs, é difícil dizer com segurança quantas enzimas existem. Birkedal-Hansen

(1993) afirma que a família dos genes MMP codificam pelo menos nove

endopeptidases metal-dependentes.

Sternlicht e Werb (2001) afirmam que, até aquele ano, foram identificadas

25 MMPs nos vertebrados e 22 homólogos em humanos, além de outras nos

invertebrados. Em 2002, De Souza e Line afirmaram que até aquele momento

existiam pelo menos 16 MMPs humanas caracterizadas.

33

Rundhaug (2003) afirma que as MMPs são uma família de mais de 20

endopeptidases que contém zinco capazes de degradar vários componentes da

matriz extracelular. Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) afirmam que as MMPs

correspondem a uma família 23 de enzimas que degradam componentes da

matriz extracelular, incluindo as membrana basais.

Todas as MMPs são derivadas de um protótipo estrutural com cinco

domínios onde pela adição ou deleção de um ou mais domínios tem-se as

variadas formas de MMP com suas particularidades. Todas as formas contêm um

sítio de ligação para um Zn++ que se acredita que constitua o sítio ativo da enzima

(BIRKEDAL-HANSEN, 1993; De SOUZA et al., 2005; PEREIRA et al., 2005;

REYNOLDS; MEIKLE, 1997; RUNDHAUG, 2003; STERNLICHT; WERB, 2001).

As metaloproteinases são referidas de acordo com nomes específicos ou

por uma numeração e agrupadas de acordo com a sua estrutura (NABESHIMA et

al., 2002).

Cotrim et al., em 2002, as classificam em 4 grupos principais, o das

colagenases intersticiais, o das colagenases tipo IV, o das estromelisinas e o das

MMPs ligadas à membrana.

Segundo Rundhaug (2003) as MMPs existem na forma solúvel (MMP-1, -3,

-8, -10, -12, -13, -19 e -20, por exemplo) e na forma ligada à membrana, com um

domínio trans-membrana e uma curta cauda citoplasmática, sendo então

chamadas de MT-MMPs (MT1-, MT2-, MT3-, MT4- e MT5-MMP).

De Souza e Line (2002) e Pereira et al. (2005) listam algumas das MMPs

humanas catalogadas, de acordo com o substrato em que atuam, como

colagenases (MMP-1, -8 e -13), gelatinases (MMP-2 e -9), estromelisinas (MMP-3

e -10), metaloelastase (MMP-12), enamelisina (MMP-20) e metaloproteinases

ligadas à membrana plasmática (MMP-14, -15, -16, -24, -17, -25 e -23).

Para que a degradação seja controlada rigorosamente, vários mecanismos

de regulação atuam como a secreção das proteases como precursores inativos,

34

pró-enzimas ou zimogênios, a ação de inibidores teciduais de metaloproteases

(TIMPs) e os inibidores de serinoproteases (serpinas) (ALBERTS et al. 1997).

Na maioria dos casos as MMPs não são sintetizadas até serem necessárias

e a sua transcrição pode ser induzida por sinais como citocinas, fatores de

crescimento e estresse mecânico. A ativação das MMPs ocorre por ação de

proteases séricas como plasmina e funina e, como acontece com algumas MMPs,

por ação de outras MMPs que podem ativar outros membros da família como a já

conhecida ativação da MMP-2 pela MT1-MMP que se dá pela remoção de um

pró-domínio resultando em uma forma ativa, geralmente de peso molecular menor

(RUNDHAUG, 2003; SORSA; TJÄDERHANE; SALO, 2004).

Regulação adicional da atividade das MMPs é exercida por inibidores

endógenos como a α2-macroglobulina e os inibidores teciduais de

metaloproteinases (TIMPs). As TIMPs são em número de 4 (TIMP-1, -2, -3 e -4) e

sabe-se que além de exercer atividade de inibição das MMPs, também participam,

em alguns casos, no processo de sua ativação como no caso da TIMP-2 que é

necessária para a ativação da pró-MMP-2 pela MT1-MMP (RUNDHAUG, 2003,

SORSA; TJÄDERHANE; SALO, em 2004).

A inibição das MMPs é também possível através de produtos sintéticos

como os quelantes do íon Zn2+, como batimastat e marimastat, e através do uso

de tetraciclinas que possuem o potencial de inibir as MMPs por mecanismos como

inibição da expressão do RNAm para MMPs, interferir com o processo de ativação

da pró-enzima e tornar a MMP ativada mais susceptível à degradação (SORSA;

TJÄDERHANE; SALO, 2004).

Segundo Birkedal-Hansen (1993) a atividade das MMPs é regulada pelo

próprio processo de transcrição dos genes que as codificam, pela ativação de

precursores, pela diferença na especificidade dos substratos e por inibidores. A

regulação transcricional é mediada por citocinas, como as interleucinas e fatores

de crescimento, e por hormônios como o paratormônio os quais têm a capacidade

de estimular a transcrição de algumas e inibir as de outras. Componentes

35

microbianos como os LPS e lectinas possuem também a capacidade estimular a

transcrição de certos tipos de colagenases. A regulação através da ativação de

precursores se dá pela ruptura da ligação de um resíduo Cys do propeptídio do

sítio ativo contendo o Zn++. Alguns inibidores têm também a capacidade de regular

a ação das MMPs, são eles as α-macroglobulinas e os Inibidores teciduais de

metaloproteinases (TIMPs). As α-macroglobulinas têm a capacidade de capturar

as moléculas de MMP através de ligações específicas. Os TIMPs, formam

complexos bimoleculares não covalentes com formas ativas ou latentes de MMPs.

Diferentes células produzem e liberam MMPs de diferentes maneiras. O padrão de

resposta da MMP dos PMNs é singular devido ao armazenamento em grânulos e

liberação rápida levando a um substancial aumento nos níveis destas enzimas em

questão de minutos, mantendo a resposta pelo recrutamento de novas células se

o estímulo permanece.

Reynolds e Meikle (1997) relatam que a ativação das MMPs é mediada por

fatores como a plasmina, capaz de ativar a colagenase e a estromelisina-1. A

estromelisina também pode participar da ativação de outras MMPs como a MMP-9

(gelatinase-B) e a colagenase. Alguns produtos exógenos como os

lipopolissacarídeos (LPS) liberados pelas bactérias do biofilme dentário podem

ativar colagenases. A MMP ligada a membrana (MT1-MMP ou MMP-14) também

participa no processo de ativação de colagenases.

Sternlicht e Werb (2001) relatam que para exercerem sua função, nos

processos fisiológicos ou patológicos, as MMPs precisam estar presentes no tipo

celular e região pericelular no momento certo, na quantidade certa e precisam ser

ativadas ou inibidas apropriadamente. São, portanto, fortemente reguladas nos

níveis transcricional e pós-transcricional, assim como no nível protéico por

ativadores, inibidores e por sua localização na superfície celular. A maioria das

MMPs são reguladas no nível transcricional e estabilização pós-transcricional do

RNAm. Quanto à secreção, a maioria das MMPs são secretadas tão logo seja

traduzido o seu RNAm, sendo então constitutivas do tecido, no entanto, a MMP-8

e a MMP-9 podem ser sintetizadas por granulócitos na medula óssea sendo

36

armazenadas em grânulos dos neutrófilos circulantes e liberadas quando estes

são ativados por mediadores inflamatórios.

Segundo Birkedal-Hansen (1993) a colagenase dos PMN são liberadas de

grânulos específicos existentes nestas células quando estas são ativadas

enquanto que as dos fibroblastos são transcritas de acordo com a demanda. O

grupo das estromelisinas atuam em diversos substratos como a proteína núcleo

das proteoglicanas, colágeno tipos IV e V, fibronectina e laminina e é expressada

por células estromais mediante estímulos por citocinas como o IL-1, o EGF e o

TNF-α. As gelatinases são talvez as mais distribuídas das MMPs e podem ser

produzidas por fibroblastos, queratinócitos, células endoteliais, monócitos/

macrófagos, osteoblastos e condrócitos. Algumas formas de gelatinases podem

ser expressas por PMNs. Além da proteína gelatina, estas enzimas podem clivar

elastina e colágeno dos tipos IV, V, VII e X.

Segundo Wahl e Corcoran (1993) as lesões inflamatórias crônicas são

povoadas por células mononucleares como monócitos e macrófagos, portanto

estas células podem ser importantes fontes de mediadores da destruição tecidual.

Já foi demonstrado que estas células são capazes de produzir várias

metaloproteinases da matriz como colagenases que degradam colágenos I, II e III,

colagenase de 92 kDa capazes de degradar gelatina e colágenos tipo IV e V e

estromelisina que degrada a fibronectina, as proteoglicanas, e a laminina e os

colágenos IV e V. A produção de metaloproteinases por estas células é

dependente de ativação primária por substâncias como lipopolissacarídeos

bacterianos (LPS), concanavalina A (Con A) e linfocinas que levam à produção de

prostaglandina E2 (PGE2) e AMP cíclico (cAMP) intracelular.

De acordo com De Souza e Line (2002) fibroblastos gengivais,

ceratinócitos, macrófagos e leucócitos polimorfonucleares são capazes de

expressarem MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8 e MMP-9.

37

Tanto a MMP-1 quanto a MMP-8 são colagenases, sendo que a MMP-8 é

liberada por neutrófilos infiltrados enquanto a MMP-1 é expressada por

fibroblastos, monócitos, macrófagos e células epiteliais (HAAKE et al. 2004a).

A MMP-1, ou colagenase 1, é uma enzima com 52 kDa na forma inativa e

41 kDa na forma ativa que é expressa in vivo em áreas de rápida remodelação

tecidual fisiológica ou patológica. É expressa por fibroblastos, ceratinócitos,

condrócitos, monócitos, macrófagos, hepatócitos e uma variedade de células

tumorais. Os substratos já identificados desta enzima são os colágenos dos tipos

I, II, III, VII, VIII e X, além de agrecana, serpins e α2-macroglobulina (NABESHIMA

et al., 2002; WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999). Lynch e Matrisian (2002) relatam

que além destes substratos a MMP-1 ainda degrada o colágeno tipo XI, gelatina,

entacina, fibronectina, laminina, tenacina e vitronectina.

A MMP-1 cliva o colágeno tipo I, que é posteriormente degradado por

outras enzimas (De SOUZA; LINE, 2002), pois após clivado, o colágeno I

desnatura-se formando a gelatina que é degradada pela MMP-2 e MMP-9

(COTRIM et al. 2002; STAMENKOVIC, 2000).

A MMP-8 é uma colagenase que já teve a sua produção atribuída

exclusivamente aos neutrófilos, no entanto sabe-se hoje que outras células têm a

capacidade de produzi-la.

De acordo com Kubota, T. et al. (1996), a MMP-1 e a MMP-8 têm

capacidade de degradar o colágeno tecidual pela clivagem da molécula no

domínio da tripla hélice resistente à proteinase. A MMP-3, ou estromelisina-1 é um

membro da família das metaloproteinases com a capacidade de degradar vários

tipos de substratos como proteoglicanas, fibronectina, laminina e colágenos tipo IV

e XI.

A MMP-2, ou gelatinase A, tem 75 kDa na sua forma inativa e 65 kDa na

forma ativa e a MMP-9, ou gelatinase B, tem 92 kDa na forma inativa e 84 kDa

quanto ativada (STAMENKOVIC, 2000; WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999).

38

A MMP-2 é expressa por uma variedade de células normais ou tumorais

(WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999) e tem a capacidade de degradar gelatina,

colágenos dos tipos IV, V e X na sua forma nativa, além de laminina, TGF-β, e

colágenos dos tipos I, II e III desnaturados (KUBOTA, Y. et al., 2002;

STAMENKOVIC, 2000).

A produção de MMP-2 ocorre na sua forma inativa, ou Pró-MMP-2 e é

necessário para que ocorra a sua ativação a ação da MT1-MMP, com a

participação de uma molécula de TIMP-2 como ponte, formando um complexo

trimolecular (KUBOTA, Y. et al., 2002; NABESHIMA et al., 2002; PATTAMAPUN et

al. 2003).

Kubota, Y. et al. (2002) estudando o efeito da IL-1α na ativação de MMP-2

em fibroblastos isolados de ceratocistos, mostraram que esta citocina tem a

capacidade de aumentar a produção de MT1-MMP nos fibroblastos, fazendo com

que a ativação de MMP-2 seja aumentada. Foi sugerido então neste estudo que a

IL-1α, através do aumento da produção de MT1-MMP com maior ativação de

MMP-2 desempenha um papel crucial no crescimento intra-ósseo do ceratocisto.

De Souza et al. (2005) descrevem a MMP-9, ou gelatinase B como uma

enzima expressa por leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, ceratinócitos e

células endoteliais que atua nos colágenos do tipo IV, V e IX, em proteoglicanas e

na elastina e tem sua expressão controlada por fatores como o TNF-α, a IL-1, o

PDGF e o EGF.

Stamenkovic (2000), relata que a MMP-9 tem a capacidade de degradar

gelatina, colágenos do tipo I, IV, V e X, além de TGF-β na forma latente.

Assim como a MMP-2, a MMP-9 também é produzida na sua forma inativa

no entanto o seu mecanismo de ativação in vivo ainda não está completamente

elucidado (KUBOTA, Y. et al., 2000; KUBOTA, Y. et al., 2002). Van Den Steen et

al. (2002) afirmam que ela é ativada principalmente por outras MMPs.

39

A MMP-9 atua na biologia óssea de maneira a participar na regulação do

turnover ósseo mas quando desregulada na sua síntese, secreção ou ativação

resulta em reabsorção óssea patológica (Van Den STEEN et al., 2002).

Kubota, Y. et al. (2000) estudaram o mecanismo de expansão dos cistos

odontogênicos enfocando os efeitos da IL-1α na secreção e ativação de MMP-9. A

análise zimográfica mostrou a presença da gelatinase de 92 kDa, a forma inativa

da MMP-9 em fluidos coletados de cistos dentígeros e cistos radiculares e de 83

kDa, a MMP-9, ativa principalmente em ceratocistos. Fragmentos cultivados dos

cistos coletados mostraram produção de MMP-9, além de MMP-2, quando

incubados com IL-1α além de ativação de Pró-MMP-9 em MMP-9.

Chang et al. (2002) publicaram trabalho que teve o objetivo de determinar

os efeitos das bactérias Porphyromonas endodontalis e Porphyromonas gingivalis

na produção e secreção de metaloproteinases da matriz em culturas de células do

ligamento periodontal. Células de polpas dentárias e de ligamento periodontal

humanos foram obtidas de terceiros molares retidos e então cultivadas. A análise

zimográfica mostrou que a enzima MMP-2 começou a aumentar a partir do quarto

dia de cultura de células pulpares com P. endodontalis e P. gingivalis e continuou

aumentando até o oitavo dia de forma dose-dependente. A MMP-9 também foi

detectada na análise zimográfica mas em pequena quantidade. Na cultura de

células do ligamento periodontal ocorreu efeito semelhante. Este estudo mostra

que o P. endodontalis e o P. gingivalis, desempenham um importante papel na

destruição tecidual e desintegração da matriz extracelular em lesões pulpares e

periapicais através da indução das células residentes locais a produzirem MMPs.

Shin et al. (2002) realizaram um trabalho com o objetivo de verificar se as

MMP-1, -2 e -3 estariam aumentadas nos tecidos pulpares inflamados e lesões

periapicais e a sua distribuição nestes tecidos. Foram obtidas 12 polpas com

diagnóstico clínico de inflamação aguda, 12 com inflamação crônica, 10 lesões

periapicais e 10 polpas normais como controle. Foram feitas ELISA e análises

imuno-histoquímica com anticorpos anti-MMP-1, anti-MMP-2 e anti-MMP3. Os

40

resultados mostraram que nas polpas com pulpite aguda, a MMP-1 e a MMP-3 se

localizaram predominantemente nos neutrófilos e macrófagos, assim como na

matriz extracelular. As células inflamatórias típicas da inflamação crônica

marcaram fracamente. A MMP-2 expressou fracamente nas células inflamatórias e

fibroblastos de todos os grupos experimentais. A MMP-1, -2 e -3 marcaram em

plasmócitos, linfócitos e macrófagos. Estes resultados sugeriram que a MMP-1 e a

MMP-3 podem ser produzidas por neutrófilos, macrófagos, plasmócitos e

linfócitos. A produção de MMPs foi maior nas pulpites agudas que nos grupos

controle o que pode significar que elas participam na progressão da inflamação

pulpar.

Franchi et al. (2002) avaliaram, em carcinomas de cabeça e pescoço, a

expressão imuno-histoquímica da MMP-1, MMP-2 e MMP-9 correlacionando estes

dados com o estado do gene p53, a atividade da enzima óxido nítrico sintetase e

com a angiogênese. Fragmentos do front de invasão de tumores foram obtidos de

43 pacientes e usados para análise imuno-histoquímica e molecular. Os

resultados mostraram que a expressão das MMPs foi variável e envolveu além

das células neoplásicas as células endoteliais e inflamatórias. A expressão da

MMP-1 foi evidente em 97,6% dos espécimes, com 74,5% demonstrando

distribuição moderada ou difusa nas células neoplásicas. A expressão da MMP-2

foi evidente em 79% com marcação considerada moderada ou difusa em 39,5% e

da MMP-9 foi evidente em 65% com 39,5% mostrando marcação moderada ou

difusa. Tumores com superexpressão de MMP-9 foram associados a maior

freqüência de metástases em linfonodos embora não tenha sido estatisticamente

significante. A densidade vascular correlacionou-se positivamente com a presença

de metástases em linfonodos, com tumores primários de maior tamanho e com

superexpressão de MMP-9. Tumores com mutação de p53 apresentaram maiores

densidades vasculares e maior quantidade de superexpressão para MMP-9. Os

autores chamam a atenção para o fato da expressão de MMPs ter sido encontrada

não só nas células tumorais, como também nas células estromais e nas células

inflamatórias próximas ao tumor e consideram estas células fontes importantes

destas enzimas para os tecidos tumorais concluindo então que existe uma forte

41

correlação entre a expressão de MMP-9, a mutação do gene p53 e a

angiogênese.

O papel das MMPs na angiogênese foi discutido por Haas e Madri (1999). A

angiogênese é dependente da ativação de células endoteliais dando início a

proliferação celular e proteólise das membranas basais permitindo a invasão e

migração das células endoteliais através da matriz extracelular para formar novos

vasos. A degradação da matriz extracelular ocorre pela ação de uma série de

enzimas, incluindo as MMPs. Células endoteliais já demonstraram ser produtoras

de MMP-1, MMP-13, MMP-3, MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP provavelmente tendo

grande importância na angiogênese.

Segundo Rundhaug (2003) as MMPs são importantes no processo de

angiogênese já que o primeiro passo da angiogênese é a degradação da

membrana basal de um vaso pré-existente. Mas as MMPs não contribuem com a

angiogênese somente pela degradação da membrana basal e de outros

componentes da matriz extracelular. Atuam também na liberação de fatores pró-

angiogênicos ligados à matriz extracelular como bFGF, VEGF e TGFβ.

Componentes da matriz extracelular degradados pelas MMPs tormam acessíveis

sítios de ligação para determinadas integrinas como a αvβ3, que podem iniciar

uma sinalização que contribui para a sobrevivência e proliferação endotelial.

Kumamoto et al. (2003) avaliaram a expressão imunohistoquímica das

metaloproteinases MMP-1, -2 e -9 e dos inibidores TIMP-1 e -2 em

ameloblastomas comparando-os com germes dentários no intuito de verificar o

seu papel no processo de invasividade do tumor já que as ação das MMPs e

TIMPs poderiam estar envolvidos no processo de degradação da membrana basal

dos ameloblastomas. Espécimes removidos de 22 pacientes com ameloblastomas

foram analisados imuno-histoquimicamente. Neste estudo, a reatividade das

MMP-2 e -9, associadas à degradação de membrana basal, foi encontrada

preferencialmente nos componentes mesenquimais que nos epiteliais e a sua

expressão pode estar associada à regulação epitélio-mesenquimal em tecidos

42

odontogênicos tanto normais quanto neoplásicos atuando no processo de

invasividade dos ameloblastomas e em processos desenvolvimentais nos germes

dentários.

Ao exercerem sua atividade na degradação da matriz extracelular, as

MMPs liberam fragmentos escondidos e neo-epítopos das macromoléculas. As

MMP-2 e -9, por exemplo, ao degradarem a membrana basal expõem um epítopo

escondido na molécula do colágeno IV capaz de promover angiogênese. A

degradação da laminina-5, outro componente da membrana basal, pela MT1-MMP

libera um fragmento escondido da sua cadeia γ2 que é capaz de induzir migração

epitelial. Também já foi demonstrado que a MMP-9 e, em menor grau a MMP-2,

ao degradarem a matriz extracelular aumentam a biodisponibilidade da VEGF, um

importante fator de crescimento no processo de angiogênese, e do fator de

crescimento TGF-β (MOTT; WERB, 2004).

2.4 MMPs na Doença Periodontal

Segundo Reynolds e Meikle (1997) e Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) a

destruição tecidual característica da periodontite, outrora considerada efeito direto

das bactérias e seus produtos é hoje considerada efeito principalmente dos

produtos do hospedeiro, liberados no local devido à invasão de produtos

bacterianos. Os produtos liberados pelas bactérias são capazes de estimular

respostas inflamatórias e imunológicas altamente ricas em mediadores como

prostaglandinas, IL-1, TNF e outros que por sua vez estão ligados à ativação das

formas latentes em formas ativas de MMPs.

Segundo Kinane e Lindhe (1999) as proteases, tanto as produzidas pelos

microorganismos quanto as do próprio hospedeiro, têm importância fundamental

para o processo destrutivo.

43

De Souza e Line (2002) afirmam que os altos níveis de MMPs nos tecidos

periodontais são os responsáveis pelo desequilíbrio entre produção e degradação

de colágeno causando destruição periodontal.

Fibroblastos, queratinócitos, macrófagos e células endoteliais respondem

de maneira parecida, produzindo e liberando MMPs mediante estímulos de

mediadores catabólicos como IL-1, TNF-α, TGF-α, EGF, bFGF e PDGF e

inflamatórios como a PGE2 (BIRKEDAL-HANSEN 1993; Van DYKE; LESTER;

SHAPIRA, 1993; WAHL; CORCORAN, 1993).

Nishikawa et al. (2002) estudaram o efeito da TNFα e da PGE2 na produção

de MMPs por fibrobastos do ligamento periodontal mantidos em cultura. As

culturas foram tratadas com TNFα e PGE2 e tiveram posteriormente o RNAm

extraído e examinado pelas técnicas do RT-PCR, zimografia e Western blot. Foi

detectada produção de MMP-1, MMP-3 e MMP-13 de forma dose-dependente da

adição de TNFα e aumento da produção das 3 MMPs com o passar do tempo.

Alvares et al. (1995) estudaram a produção de MMP-1 e TIMP-1 por

fibroblastos do ligamento periodontal mediante estímulos de IL-1β, PDGF e TGF-

β. Culturas de fibroblastos do ligamento periodontal foram obtidas e tratadas com

as citocinas e fatores de crescimento citados e então o RNAm produzido na

cultura foi extraído e estudado pela técnica RT-PCR para detecção de RNAm para

MMP-1 e TIMP-1. A IL-1β causou grande aumento na produção de RNAm para

MMP-1, um aumento menos expressivo foi detectado com o PDGF enquanto que

o TGF-β, ao contrário, provocou inibição. Não houve nenhum efeito significativo

em relação à TIMP-1.

Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) afirmaram que fragmentos de gengiva

inflamada apresentam mais colagenase que fragmentos de gengiva sadia,

colagenases detectadas no fluido do sulco gengival estão em quantidade maior

em gengivas com doença periodontal, inclusive sendo correlacionados com

44

severidade aumentada da doença. As MMPs mais comumente detectadas são a

colagenase-2 ou MMP-8, acompanhada da MMP-9.

De acordo com Genco (1992) a degradação do tecido mole na doença

periodontal ocorre devido à ação de enzimas bacterianas e enzimas do

hospedeiro como a plasmina e as metaloproteinases da matriz (MMPs). Haake et

al. (2004) afirmam que as MMPs são consideradas as proteinases primárias

envolvidas na degradação dos tecidos periodontais.

Smith et al. (2004) estudaram a expressão da MMP-9 no epitélio gengival

de indivíduos com doença periodontal para determinar a participação desta na

degradação da membrana basal e inferir sua participação na migração do epitélio

juncional para apical na formação da bolsa periodontal. Uma análise zimográfica

em biópsias gengivais demonstrou que tanto o epitélio quanto o tecido conjuntivo

de amostras de periodontite expressaram capacidade colagenolítica

correspondente à expressão de MMP-2 e MMP-9. Altos níveis de pró-MMP-9

foram encontrados no epitélio da bolsa quando comparados ao epitélio sulcular

normal. A mesma diferença não pôde ser detectada para a pró-MMP-2. A MMP-9

mostrou-se distribuída por todas as camadas epiteliais tanto do epitélio juncional

quanto do epitélio da bolsa e fraca expressão e distribuição no tecido conjuntivo

gengival. Forte marcação para MMP-9 foi detectada em leucócitos

polimorfonucleares. Os ceratinócitos do epitélio gengival foram identificados como

fonte importante de MMP-9 no epitélio gengival inflamado.

Segundo Birkedal-Hansen (1993) a presença das MMPs é muito importante

para o início da reabsorção óssea uma vez que os osteoblastos são capazes de

produzir MMPs quando estimulados por fatores estimuladores de reabsorção

iniciando o processo reabsortivo, já que o osteoclasto não produz estas enzimas

sendo responsável apenas pela dissolução da matriz mineral, o que corrobora o

fato da reabsorção óssea periodontal ser tão sensível à presença de

estimuladores da produção de MMPs como a IL-1 e o TNF-�.

45

Conforme Grenier e Mayrand (2001) na inflamação periodontal causada por

periodontopatógenos, as MMPs são produzidas de maneira descontrolada e

ocorre um desequilíbrio entre a atividade de MMPs e de TIMPs resultando em

degradação tecidual.

Segundo Genco (1992) está claro que as bactérias do biofilme são capazes

de ativar diretamente MMPs ou inibir a ação dos TIMPs, bem como indiretamente

através da estimulação de células do hospedeiro a produzirem citocinas que por

sua vez induzem outras células como fibroblastos e ceratinócitos a produzirem

colagenases.

Enzimas bacterianas, como a protease semelhante à quimiotripsina

produzida pela bactéria Treponema denticola, e outras substâncias liberadas pelas

bactérias Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans e

Fusobacterium nucleatum são capazes de ativar as MMPs assim como as células

do próprio hospedeiro estimuladas por citocinas (BIRKEDAL-HANSEN, 1993;

HAAKE et al., 2004a; HAAKE et al., 2004b; GENCO, 1992; MALDONADO et al.,

2004; WAHL; CORCORAN, 1993).

Nakaya et al. (1997) estudaram em culturas de células de ligamento

periodontal a indução de MMP-3, ou estromelisina-1, pela IL-1β. Foi encontrado

que as células cultivadas apresentaram aumento da produção de MMP-3 na

presença de IL-1β de forma dependente da concentração desta última.

Grenier e Mayrand (2001) realizaram um estudo com o objetivo de

determinar se o Porphyromonas gingivalis possui a capacidade de degradar e/ou

inativar a TIMP-1. A análise em eletroforese mostrou que a Porphyromonas

gingivalis foi capaz de degradar a TIMP-1 em vários fragmentos. Foi demonstrada

inibição de MMP-9 quando adicionada no ensaio TIMP-1 tratada com bactérias

previamente aquecidas para inativação das proteases. A mesma inibição da MMP-

9 não foi observada quando a TIMP-1 adicionada havia sido tratada com bactérias

proteoliticamente ativas, significando que inibição da TIMP-1 pelo P. gingivalis tem

efeito claro sobre a MMP-9 e, portanto, também sobre a degradação da matriz

46

extracelular. Os autores concluem que a degradação periodontal pode ser

favorecida pelo aumento significante de MMPs ativas, causada pela redução dos

seus inibidores (TIMPs), nos sítios onde existe a presença de P. gingivalis.

O Porphyromonas gingivalis, também foi investigado por Pattamapun et al.

(2002) com relação à sua capacidade de induzir ativação de MMP-2 em células do

ligamento periodontal. Culturas de fibroblastos do ligamento periodontal foram

obtidas e então sofreram a adição de sobrenadantes de culturas de P. gingivalis.

Foi demonstrado que o P. gingivalis possui a capacidade de induzir ativação de

MMP-2 em células do ligamento periodontal além de aumentar a expressão de

MT1-MMP detectados pelas técnicas de RT-PCR e Western.

Wahl e Corcoran (1993) demonstraram que, devido à capacidade do

interferon γ (IFNγ) e da interleucina-4 (IL-4) de suprimirem a produção de PGE2

que é um mediador inflamatório envolvido na estimulação de produção de MMPs,

estas citocinas apresentaram-se capazes de reduzir a produção de PGE2 no meio

de cultura, levando à redução da produção de colagenase intersticial e

colagenase/gelatinase 92kDa.

De acordo com Kubota, T. et al. (1996), as principais colagenases

presentes no tecido gengival podem ser a MMP-1 e a MMP-8, tendo a primeira

sido mais relacionada à Periodontite Juvenil e a segunda à Periodontite do Adulto.

Estes autores detectaram níveis de RNAm para MMP-1, MMP-3, MMP-8 e TIMP-1

maiores em gengivas afetadas pela periodontite que em indivíduos saudáveis mas

não os de RNAm para TIMP-2. Fatores como o TGF-� e o FGF básico mostraram-

se capazes de aumentar a produção de TIMP-1. Concluíram que o aumento

sinérgico da produção de MMP-1, MMP-3 e MMP-8 é importante para a destruição

tecidual encontrada na doença periodontal e que o aumento da TIMP-1 pode ser

uma tentativa do organismo de compensar o aumento das metaloproteinases.

Chang et al. (2002) estudaram a influência de IL-1α, TGF-β, e produtos das

bactérias P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans na expressão das MMPs em

culturas de fibroblastos do ligamento periodontal. A análise zimográfica mostrou a

47

presença de MMP-2 e MMP-9 nos meios de cultura adicionados com extratos de

P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans. A IL-1α elevou a produção de MMP-2

ao longo do tempo enquanto a TGF-β causou redução.

A MMP-8 foi demonstrada ser produzida por neutrófilos e por fibroblastos

periodontais em pacientes com síndrome de Down com diagnóstico de gengivite e

periodontite em quantidades maiores que em pacientes com a mesma síndrome

sem doença periodontal (HALINEN et al., 1996).

A MMP-8, foi estudada por Figueredo et al. (2004) em relação à sua

atividade detectada no fluido gengival após tratamento periodontal não cirúrgico.

Em pacientes com periodontite que receberam tratamento periodontal composto

de procedimentos básicos, foi coletado fluido gengival antes do início do

tratamento e no trigésimo dia após o término. Além de melhorias significativas nos

parâmetros clínicos observados, foi observada redução significativa nos níveis de

MMP-8 nos sítios com gengivite e com periodontite de pacientes com diagnóstico

de periodontite.

Meyer et al. (1997) realizaram um estudo que teve como objetivo comparar

os níveis de elastase ativa (AE), um componente dos grânulos primários dos

neutrófilos que causam destruição tecidual (KINANE; LINDHE, 1999), e do

complexo elastase-inibidor de proteinase α-1 (E-α-1 PI) no fluido gengival entre

pacientes com periodontite de progressão rápida e periodontite do adulto. Os

resultados de coleta de fluido gengival demonstraram que os níveis de AE e E-α-1

PI foram considerados insignificantes nos pacientes controle (sulco gengival de

pacientes sem periodontite). Nos pacientes com periodontite, níveis

significativamente aumentados de AE, mas não do complexo E-α-1 PI, foi

encontrado, independentemente do tipo de periodontite, razão pela qual os

autores consideraram esta enzima como um marcador de doença.

Garlet et al. (2004) estudaram a expressão de MMPs e TIMPs, do fator

osteoclastogênico RANKL e da ospeoprotegerina em periodontite agressiva e

periodontite crônica. O RNAm foi extraído de biópsias gengivais e analisado pela

48

técnica RT-PCR em relação à expressão para MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1,

TIMP-2, TIMP-3, RANKL, OPG, TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10. Foi constatado que a

expressão para as MMPs e as TIMPs analisadas no estudo foi significativamente

maior nos casos de periodontite, tanto crônica quanto agressiva, que nos

pacientes controle, sem periodontite, sem diferença significante entre o tipo de

periodontite exceto para a TIMP-1 e TIMP-3 que foram mais expressas em

periodontite agressiva que em periodontite crônica.

Soell, Elkaim e Tenenbaum (2002) estudaram em biópsias gengivais e

fluido do sulco gengival de 11 pacientes com periodontite e 5 pacientes saudáveis

os níveis de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2, além da enzima

Catepsina C. As enzimas e os inibidores em questão foram quantificados e

tiveram suas atividades mensuradas através das técnicas ELISA, Western blot e

análise zimográfica. Todas as MMPs estudadas mostraram níveis maiores em

pacientes com periodontite que nos pacientes controle tanto nas biópsias quanto

no fluido do sulco gengival. As TIMP-1 e TIMP-2 mostraram-se reduzidas nos

pacientes com periodontite. As atividades das MMPs também estavam aumetadas

nos casos de periodontite.

Maldonado et al. (2004) considerando a já conhecida maior prevalência de

periodontite em diabéticos, realizaram um trabalho com o objetivo de estudar a

produção de MMP-1 estimulada por lipopolissacarídeos, em histiócitos

previamente expostos a altas concentrações de glicose. Histiócitos e fibroblastos

gengivais foram cultivados e expostos a concentrações de 5 e 25 mM de glicose,

tidas como normal e excessiva respectivamente e então tratados com

lipopolissacarídeos isolados de Escherichia coli. Os resultados mostraram que a

produção de MMP-1 foi estimulada pela adição de LPS tanto na cultura com

glicose normal quanto na com glicose aumentada, e esse estímulo ocorreu de

uma maneira dependente da concentração. Quando a adição da glicose em alta

concentração foi realizada no mesmo momento da adição do LPS, a expressão de

MMP-1 foi comparável à da cultura com glicose em concentração normal,

diferentemente de quando a adição de altas concentrações de glicose foi realizada

49

previamente. Isso significa que a pré-exposição prolongada à glicose em altas

concentrações é necessária para que a secreção de MMP-1 seja superestimulada

pelo LPS. Foi observado então que a glicose em excesso aumenta a produção de

MMP-1 estimulada por lipopolissacarídeos mais que a expressão de TIMP-1 nos

histiócitos. A expressão de RNAm para MMP-1, MMP-7, MMP-8 e MMP-9 foi

considerada maior nas células expostas a glicose em altas concentrações que em

células com glicose normal, fato encontrado também nas células expostas a

lipopolissacarídeos. O aumento na produção de MMPs nesses casos é devido ao

aumento da expressão do RNAm.

O estudo acima citado conclui então que a pré-exposição de fagócitos

mononucleares a altos níveis de glicose aumentam a expressão de MMP-1

estimulada por lipopolissacarídeos, levando a crer que pacientes diabéticos com

hiperglicemia têm maior susceptibilidade dos seus fagócitos à liberação de

substancias responsáveis pela degradação de tecido periodontal frente à presença

dos principais patógenos periodontais.

Existe um grande potencial clínico nos campos do diagnóstico e tratamento

da doença periodontal com a evolução do entendimento do papel das MMPs

nesse processo (GENCO, 1992; Van DYKE; LESTER; SHAPIRA, 1993).

No diagnóstico, representa a busca por testes que detectem os fatores que

resultarão na perda óssea antes que ela venha a ocorrer ou que forneçam meios

de se acompanhar a atividade de doença ao longo da etapa de controle e

manutenção do tratamento periodontal. Neste sentido, testes que, no futuro,

poderão ser feitos em consultórios ou até em casa, capazes de detectar MMP-8

no fluido do sulco gengival, vem sendo testados com resultados mostrando

diferenças nos seus níveis entre pacientes com ou sem doença periodontal. No

campo do tratamento, inibidores de MMPs com as tetraciclinas e seus derivados

têm sido testados e tem mostrado capacidade de inibir MMP-8, -9 e -14 (SORSA;

TJÄDERHANE; SALO, 2004).

50

De Souza et al. (2005) realizaram um estudo com o objetivo de

correlacionar o polimorfismo na região promotora dos genes MMP-9 e TIMP-2 com

a doença periodontal, o que representaria um importante achado na busca pelo

diagnóstico precoce de indivíduos de risco. Os resultados demonstraram que

pacientes diagnosticados com periodontite crônica não apresentaram associação

com o polimorfismo no gene MMP-9. O genótipo T/T, considerado o de maior

transcrição de MMP-9, não foi encontrado em nenhum paciente com periodontite.

A análise de polimorfismo para o gene TIMP-2 mostrou que 99% dos indivíduos

tinham o mesmo genótipo, não sendo possível fazer qualquer tipo de inferência.

Para Björnsson et al. (2004) uma vez que a associação entre MMPs e

progressão da doença periodontal está estabelecida, esforços devem ser feitos

para inibir estas enzimas. Neste trabalho, os autores fazem uso de um inibidor

sintético das MMPs, o Batimastat (BB-94), que age de forma competitiva, inibindo

reversivelmente a ação da MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9 e MMP-14

em ratos com periodontite induzida por ligaduras. Ratos que receberam o

Batimastat, com ou sem ligaduras, apresentaram perdas ósseas significativamente

maiores que os grupos placebo e controle. Os autores concluíram que o

Batimastat não foi capaz de reduzir a progressão da perda óssea periodontal, e

sim aumentá-la significantemente. Isto pode se dever ao fato do Batimastat ser um

inibidor de MMPs de amplo espectro, portanto inibindo ações essenciais

comandadas por MMPs no reparo de feridas. Outro fato importante é o de que

ratos mutantes deficientes em MMP-14 apresentam doenças degenerativas e

inflamatórias do metabolismo ósseo como osteopenia e artrite generalizada.

Sendo então a MMP-14 essencial para o metabolismo ósseo, e estando os ratos

desta pesquisa em fase de crescimento, a deficiência de MMP-14 devido à

inibição causada pelo Batimastat teria feito destes ratos semelhantes àqueles com

mutação e, portanto, com deficiência no metabolismo ósseo. Portanto, esta

pesquisa demonstra que embora as MMPs participem de forma importante na

perda de inserção periodontal, alguns membros dessa família possuem algum

efeito protetor ainda não identificado.

51

Proposição

52

3 PROPOSIÇÃO

O presente estudo tem como objetivo estudar através de análise imuno-

histoquímica a expressão das enzimas MMP-1, MMP-2 e MMP-9 no tecido

gengival acometido por Gengivite Induzida por Placa e por Periodontite Crônica

bem como identificar os locais de expressão destas metaloproteinases nos tecidos

epitelial e conjuntivo, visando a obtenção de dados que sugiram se a presença

e/ou o grau de expressão destas enzimas estão relacionados com os vários

processos inerentes ao hospedeiro responsáveis pela diversidade na

apresentação da doença periodontal entre os indivíduos.

53

Material e Métodos

54

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1. CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

Este estudo caracteriza-se como uma pesquisa descritiva observacional

baseada na análise e registro do padrão de distribuição e localização das células

imunomarcadas pelos anticorpos anti-MMP-1, anti-MMP-2 e anti-MMP-9 em uma

série de espécimes de gengivite induzida por placa e periodontite crônica.

4.2. POPULAÇÃO

A população deste trabalho consiste de espécimes de tecido gengival com

diagnóstico clínico de doença periodontal registrados e emblocados em parafina,

constantes nos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de

Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN.

4.3. AMOSTRA

Foram utilizados 26 espécimes de tecido gengival diagnosticados

clinicamente como gengivite induzida por placa (13 casos) e periodontite crônica

(13 casos).

Os espécimes utilizados foram oriundos de procedimentos cirúrgicos

periodontais ressectivos para fins estéticos ou curativos como gengivectomias,

55

aumentos de coroa clínica por indicação protética ou restauradora, ou cirurgias

conservadoras como o retalho de Widman modificado com incisão paramarginal

para exérese do tecido gengival acometido pela doença e ainda de exodontias

quando da necessidade de remoção da papila gengival para melhor coaptação

das bordas na sutura e para possibilitar a regularidade do rebordo a fim de

favorecer o melhor assentamento de prótese muco-suportada. Todos os

espécimes foram fixados em formol a 10%. As cirurgias foram realizadas em

consultórios particulares, nas clínicas de Periodontia e Cirurgia Odontológica do

Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e

da Faculdade de Odontologia da Universidade Potiguar no período de 1974 a

2004.

4.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA

A análise morfológica foi realizada em cortes histológicos de 5 µm de

espessura corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina examinados em

microscopia de luz. Foram investigados nesta análise os seguintes aspectos:

qualidade do infiltrado (predominantemente linfocitário ou linfoplasmocitário),

localização do infiltrado (predominantemente perivascular e justa-epitelial,

indicando um processo inflamatório mais leve e focal, ou difuso, que denota um

processo inflamatório mais grave ou avançado). As anotações foram feitas em

tabela semelhante à reproduzida no anexo 2. As lâminas foram avaliadas duas

vezes pelo mesmo observador em tempos diferentes, como sugerido por Franchi

et al. em 2002 e Godoy em 2005.

4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO

56

A análise imuno-histoquímica foi realizada em cortes histológicos medindo 3

µm de espessura, estendidos em lâminas de vidro previamente limpas,

preparadas com adesivo à base de 3-aminopropyltrietoxi-silano (Sigma Chemical

CO. , St. Louis, MO, EUA). Posteriormente, os referidos cortes foram submetidos

à técnica da imuno-histoquímica, pelo método da estreptavidina-biotina (SABC),

utilizando anticorpos primários anti-MMP-1, anti-MMP-2 e anti-MMP-9 (Quadro 1)

seguindo os seguintes passos laboratoriais:

Quadro 1 – Especificidade, recuperação antigênica, diluição e tempo de

incubação dos anticorpos utilizados.

EspecificidadeRecuperação

AntigênicaDiluição

Tempo de

IncubaçãoFabricante

MMP-1Citrato pH 6,0

Steam 30 minutos1/40 Overnight

Calbiochem(Darmstadt,Alemanha)

MMP-2

Pepsina 0,5%

(Estufa 37oC/ 30

minutos)

1/50 60 minutosNovo Castra

(Londres,Inglaterra)

MMP-9Citrato pH 6,0

Steam 30 minutos1/40 Overnight

Novo Castra(Londres,Inglaterra)

o Desparafinização em dois banhos de xilol:

o Xilol 1 (30 minutos) – 57oC

o Xilol 2 (20 minutos) – temperatura ambiente

o Rehidratação em cadeia descendente de etanóis:

o Etanol absoluto I (5 minutos) – TA

o Etanol absoluto II (5 minutos) – TA

o Etanol absoluto III (5 minutos) – TA

o Etanol 95o (5 minutos) – TA

o Etanol 80o (5 minutos) – TA

57

o Remoção do pigmento formólico com Hidróxido de amônia a 10% em

etanol a 95% (10 minutos) – TA

o Lavagem em água corrente (10 minutos)

o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)

o Recuperação antigênica

o Lavagem em água corrente (10 minutos)

o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)

o Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio (H2O2)

10 volumes – 2 trocas (5 minutos cada)

o Lavagem em água corrente (10 minutos)

o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)

o Incubação em solução tampão TRIS-HCL (Tris-hidroxi-metil-

aminometano, Sigma Chemical CO. , St. Louis, MO, EUA) –

pH 7,4 – 2 trocas (5 minutos cada)

o Incubação dos anticorpos primários diluídos em solução tampão de

TRIS-HCL (pH 7,4) acrescida de albumina sérica bovina a 1%,

conservada em azida sódica a 0,1% (BSA – Bioset S/A, São

Paulo, Brasil)

o Dupla lavagem de 5 minutos cada, em solução de Tween 20 a 1%

em TRIS-HCL.

o Incubação em TRIS-HCL – 2 trocas (5 minutos cada)

o Incubação do anticorpo secundário polivalente (anti-camundongo

anti-coelho)/ diluição de 1:100 (30 minutos) – TA

o Lavagem com TRIS-HCL

o Incubação em TRIS-HCL – 2 trocas (5 minutos cada)

o Incubação do complexo Estreptavidina-Biotina (DAKO A/S, Glostrup,

Denmark)/ diluição de 1:100 (20 minutos) – TA

o Lavagem com TRIS-HCL

o Incubação em TRIS-HCL – 2 trocas (5 minutos cada)

o Revelação da reação com solução cromógena de diaminobenzidina a

0,03% (3,3-diaminobenzidina, Sigma Chemical CO. , St. Louis,

58

MO, EUA – DAB) diluída em 100 ml de TRIS-HCL e acrescida

de 0,6 ml de peróxido de hidrogênio 20 volumes, aplicada por

um período de 3 minutos em câmara escura

o Lavagem em água corrente (10 minutos)

o Passagem em água destilada

o Contracoloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA

o Lavagem em água corrente (10 minutos)

o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)

o Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:

o Etanol 80% (2 minutos)

o Etanol 95% (2 minutos)

o Etanol absoluto I (2 minutos)

o Etanol absoluto II (2 minutos)

o Etanol absoluto III (2 minutos)

o Diafanização em dois banhos de xilol:

o Xilol 1 (2 minutos)

o Xilol 2 (2 minutos)

o Montagem em resina Permount® ( Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ,

USA) para observação em microscopia de luz

Toda reação foi efetuada utilizando como controle positivo um

adenocarcinoma de mama. Como controle negativo de todas as reações

realizadas substituiu-se o antocorpo primário por solução de BSA a 1%, diluída em

tampão TRIS-HCL pH 7,4.

4.6. MÉTODO DE ANÁLISE DAS CÉLULAS IMUNOMARCADAS

59

As lâminas foram avaliadas duas vezes pelo mesmo observador em tempos

diferentes (FRANCHI et al., 2002; GODOY, 2005), em microscópio de luz com

aumento de 400x (LEICA ATC 2000).

Foram consideradas positivas as células que exibiram coloração

acastanhada independente da intensidade de marcação.

A intensidade da marcação foi avaliada considerando-se marcação forte

(++), marcação fraca (+) ou ausência de marcação (-), considerando-se para efeito

de análise estatística escores 2, 1 e 0 respectivamente, tanto no tecido epitelial

quanto no tecido conjuntivo gengival.

A marcação no tecido conjuntivo inclui a matriz extracelular (SHIN et al.

2002) e as células presentes, sendo que quando se considera a intensidade de

marcação, nos escores 0, 1 e 2, está sendo avaliada a matriz extracelular

juntamente com as células de forma a se determinar quantodade relativa de

células marcadas e distribuição do anticorpo pelo tecido.

Posteriormente, a marcação foi avaliada em cada um dos tipos celulares

presentes.

A localização da imunomarcação foi avaliada considerando-se os seguintes

aspectos de acordo com a tabela contida nos anexos 3, 4 e 5:

o No epitélio

o Na lâmina própria

o Em células endoteliais

o Em neutrófilos

o Em linfócitos

o Em plasmócitos

o Em macrófagos

o Em fibroblastos

o Na matriz extracelular

60

4.7. TRATAMENTO ESTATÍSTICO

Os resultados obtidos da análise em microscopia de luz foram submetidos a

testes estatísticos adequados com o intuito de testar as hipóteses de diferença

e/ou correlação do padrão de marcação imuno-histoquímica de acordo com o

grupo gengivite ou periodontite. Para tanto foi utilizado o Software GraphPad

InStat versão 3.05.

A existência ou não de distribuição normal foi considerada dispensável em

virtude dos valores serem representados por escores.

Para as variáveis dependentes do tipo ordinal, representadas em escores

foram utilizadas análises não paramétricas. O teste de Mann-Whitney foi utilizado

quando comparação se deu entre dois grupos apenas (Gengivite e Periodontite) e

o de Kruskal-Wallis, seguido de pós-teste de comparação múltipla de Dunn foi

utilizado quando a comparação se deu entre três grupos (MMP-1, MMP-2 e MMP-

9).

Para as variáveis qualitativas foi utilizado o teste exato de Fisher para

determinação de associação entre duas variáveis.

Para todos os testes estatísticos utilizados, o nível de significância

estabelecido foi de 95% (α=0,05).

4.8 IMPLICAÇÕES ÉTICAS

No corpo deste trabalho só foram publicados imagens microscópicas dos

espécimes e dados referentes à idade dos pacientes não sendo possível a

61

identificação dos mesmos visto que seus nomes e números de registros são

preservados. A pesquisa obedeceu a todos os princípios éticos e legais, mantendo

as integridades física e moral dos pacientes (VALLADARES NETO, 2001).

Este projeto foi encaminhado ao Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte e registrado com o número 013-

2005, tendo sido aprovado por este comitê em 03 de Junho de 2005 (Anexo I).

62

Resultados

63

5 RESULTADOS

5.1 Resultados clínicos e morfológicos

A análise das lâminas coradas pela técnica da Hematoxilina-Eosina foi feita

em 26 casos no total sendo 13 com diagnóstico clínico de gengivite e 13 de

periodontite (Tabela 1).

Tabela 1. Total de casos analisados. Natal/ RN, 2006.

N Idade (M ± DP)

Gengivite 13 32,5 ± 8,1

Periodontite 13 46,4 ± 13,25

Total 26 40,4 ± 12,84

Ficou demonstrado que 46,2% dos casos de gengivite apresentaram

infiltrado inflamatório considerado difuso enquanto que 53,8% apresentaram

infiltrado inflamatório perivascular e justa-epitelial. Entre os casos de periodontite,

69,2% dos casos apresentaram infiltrado considerado difuso enquanto que em

30,8% o infiltrado foi considerado perivascular e justa-epitelial (Figura 1). Não

houve associação estatisticamente significante entre a localização do infiltrado

inflamatório e o tipo de doença periodontal diagnosticada clinicamente (Tabela 2).

Tabela 2. Associação entre o tipo de doença periodontaldiagnosticada e a localização da inflamação. Natal/ RN, 2006.

Difuso PVJE Total

Gengivite 6 7 13

Periodontite 9 4 13

Total 15 11 26

Não houve associação estatisticamente significante. Testeexato de Fisher (p=0,66)PVJE = perivascular e justa-epitelial

64

Figura 1. Localização do processo inflamatório em espécimes com diagnósticoclínico de periodontite. Inflamação considerada perivascular e justa-epitelial (A eB) correspondendo a um quadro histológico de menor gravidade que a inflamaçãodifusa (C e D). (H/E, 40x em A e C e H/E, 200x em B e D)

65

Com relação ao tipo celular predominante no infiltrado inflamatório

detectado nas lâminas, foi constatado que em 46,2% dos casos de gengivite o

infiltrado foi considerado predominantemente linfocitário contra 53,8% de infiltrado

considerado linfo-plasmocitário. Nos casos de periodontite, 30,8% foram

considerados predominantemente linfocitários enquanto 69,2% foram

considerados linfo-plasmocitários (Figura 2). Não houve associação significativa

entre o tipo de infiltrado predominante e o tipo de doença periodontal

diagnosticada clinicamente (Tabela 3).

Tabela 3. Associação entre o tipo de doença periodontaldiagnosticada e o tipo de infiltrado inflamatório predominante.Natal/ RN, 2006.

L LP Total

Gengivite 6 7 13

Periodontite 4 9 13

Total 10 16 26

Não houve associação estatisticamente significante. Testeexato de Fisher (p=0,68)L = LinfocitárioLP = Linfo-plasmocitário

66

Figura 2. Caracterização do tipo celular predominante no infiltrado inflamatório emlâminas com diagnóstico clínico de periodontite, evidenciando em A um infiltradopredominantemente Linfocitário e em B um considerado Linfo-plasmocitário. (H/E,200x)

67

5.2. Resultados imuno-histoquímicos

A análise da MMP-1 no epitélio de revestimento (Figura 3) demonstrou que

todos os casos de gengivite e de periodontite exibiram positividade. Dos casos de

gengivite, 30,8% tiveram marcação considerada fraca e 69,2% tiveram marcação

forte. Dos casos de periodontite, 7,7% demonstraram marcação fraca e 92,3%

exibiram forte marcação. Não houve diferença estatisticamente significante entre

a marcação imuno-histoquímica para a MMP-1 entre os epitélios nos dois tipos de

doença periodontal avaliadas (Tabela 4).

Tabela 4. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-1 no epitélio. Natal/ RN, 2006.

- + ++ Total

Gengivite 0 4 9 13

Periodontite 0 1 12 13

Total 0 5 21 26

Não houve diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney (p=0,30)- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte

No tecido conjuntivo gengival (Figura 4), a marcação imuno-histoquímica

para a MMP-1 foi considerada positiva em todos os casos tanto de gengivite como

de periodontite. Dos casos de gengivite, 53,8% tiveram marcação considerada

fraca e 46,2% forte, enquanto que a expressão nos casos de periodontite foi fraca

em 7,7% dos casos e forte em 92,3%. Esta diferença foi considerada

estatisticamente significante (p=0,03) (Tabela 5).

68

Figura 3. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 no tecidoepitelial de revestimento, onde em A é demonstrada uma marcação consideradaforte (++) em B uma marcação considerada fraca (+) e em C ausência demarcação (-). (SABC, 200x)

69

Figura 4. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 no tecidoconjuntivo, onde em A é demonstrada uma marcação considerada forte (++) em Buma marcação considerada fraca (+) e em C ausência de marcação (-). (SABC,200x)

70

Tabela 5. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-1 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006.

- + ++ Total

Gengivite * 0 7 6 13

Periodontite * 0 1 12 13

Total 0 8 18 26

* Diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney(p=0,03)- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte

Ainda com relação à MMP-1, a análise feita em cada um dos componentes

celulares do tecido conjuntivo (Figuras 5, 6 e 7) mostrou que nenhum dos tipos

celulares apresentou associação estatisticamente significante entre ele e o tipo de

doença periodontal diagnosticado clinicamente (Tabela 6).

Tabela 6. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celular encontrado no tecidoconjuntivo gengival para a MMP-1. Natal/ RN, 2006.

Fib End Linf Plasm Neutr Macrof

Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M

Gengivite 13 12 13 13 13 7 11 11 3 3 5 5

Periodontite 13 13 12 12 13 9 11 10 1 1 11 11

Total 26 25 25 25 26 16 22 21 4 4 16 16

Em nenhum caso houve associação estatisticamente significante. Teste Exato deFisher (p>0,05)Fib = Fibroblasto; End = Células Endoteliais; Linf = Linfócitos; Plasm =Plasmócitos; Neutr = Neutrófilos; Macrof = MacrófagosPr = Número de casos em que a célula foi detectadaM = Número de casos em que houve marcação da referida célula

71

Figura 5. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 evidenciandoum neutrófilo marcado (Setas). (SABC, 200x)

Figura 6. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 evidenciandocélulas endoteliais marcadas (Setas). (SABC, 400x)

Figura 7. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 evidenciandoplasmócitos (seta verde), linfócitos (seta vermelha), fibroblastos (seta preta) emacrófagos (seta azul) marcados. (SABC, 400x)

72

No epitélio, nenhum caso de gengivite apresentou marcação forte para a

MMP-2, onde 84,6% dos casos exibiram marcação fraca e em 15,4% não houve

marcação para a MMP-2. Na periodontite, 76,9% dos casos apresentaram

marcação fraca e em 23,1% da amostra houve ausência de marcação. A diferença

de marcação para a MMP-2 no epitélio não foi considerada estatisticamente

significante entre os casos diagnosticados clinicamente como gengivite e como

periodontite (Tabela 7).

Tabela 7. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-2 no epitélio. Natal/ RN, 2006.

- + ++ Total

Gengivite 2 11 0 13

Periodontite 3 10 0 13

Total 5 21 0 26

Não houve diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney (p=0,74)- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte

A análise da MMP-2 no tecido conjuntivo gengival nos casos diagnosticados

como gengivite demonstrou marcação forte em 7,7% dos casos, fraca em 53,8% e

em 38,5% dos casos ausência de marcação. Nos casos de periodontite não houve

marcação forte em nenhum dos casos, 61,5% apresentaram marcação fraca e

38,5% não apresentaram marcação. Não houve diferença estatisticamente

significante, na marcação para a MMP-2, entre os casos diagnosticados

clinicamente como gengivite e como periodontite no tecido conjuntivo gengival

(Tabela 8).

73

Tabela 8. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-2 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006.

- + ++ Total

Gengivite 5 7 1 13

Periodontite 5 8 0 13

Total 10 15 1 26

Não houve diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney (p=0,85)- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte

Na análise da marcação da MMP-2 nos tipos celulares do tecido conjuntivo

gengival, tanto na gengivite quanto na periodontite pode ser .verificada na tabela

9.

Tabela 9. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celular encontrado no tecidoconjuntivo gengival para a MMP-2. Natal/ RN, 2006.

Fib End Linf Plasm Neutr Macrof

Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M

Gengivite 13 9 13 8 13 4 12 11 2 0 11 8

Periodontite 13 6 12 5 13 4 12 9 3 0 11 7

Total 26 15 25 13 26 8 24 20 5 0 22 15

Em nenhum caso houve associação estatisticamente significante. Teste Exato deFisher (p>0,05)Fib = Fibroblasto; End = Células Endoteliais; Linf = Linfócitos; Plasm =Plasmócitos; Neutr = Neutrófilos; Macrof = MacrófagosPr = Número de casos em que a célula foi detectadaM = Número de casos em que houve marcação da referida célula

A análise imuno-histoquímica para a MMP-9 no epitélio, nos casos de

gengivite mostrou que 30,8% dos casos não exibiram marcação para a MMP-9,

46,2% marcaram fracamente e 23,1% apresentaram marcação forte. Nos

74

espécimes de periodontite 23,1% tiveram marcação fraca e 76,9% apresentaram

marcação forte. Foi encontrada diferença estatisticamente significante na

marcação imuno-histoquímica para MMP-9, no epitélio, entre os espécimes de

gengivite e os de periodontite (p=0,008).(Tabela 10).

Tabela 10. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-9 no epitélio. Natal/ RN, 2006.

- + ++ Total

Gengivite * 4 6 3 13

Periodontite * 0 3 10 13

Total 4 9 13 26

* Diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney(p=0,008)- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte

No tecido conjuntivo gengival, a MMP-9 esteve ausente em 38,5% dos

casos de gengivite, estando fraca em 46,2% e forte em 15,4%. Nos casos de

periodontite, 15,4% dos casos foram negativos, 30,8% exibiram expressão fraca e

em 53,8% a marcação foi forte. Estes dados não resultaram numa diferença

considerada estatisticamente significante entre os dois tipos de doença periodontal

(Tabela 11).

Tabela 11. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-9 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006.

- + ++ Total

Gengivite 5 6 2 13

Periodontite 2 4 7 13

Total 7 10 9 26

Não houve diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney (p=0,06)

75

- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte

Os tipos celulares específicos do tecido conjuntivo gengival, analisados

mostraram associação estatisticamente significante entre fibroblastos marcados

para a MMP-9 e o tipo de doença periodontal diagnosticada clinicamente (p=0,04),

o mesmo ocorrendo com os linfócitos (p=0,01). Nas demais células não houve

associação estatisticamente significante (Tabela 12)

Tabela 12. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celular encontrado notecido conjuntivo gengival para a MMP-9. Natal/ RN, 2006.

Fib End Linf Plasm Neutr Macrof

Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M

Gengivite 13 3* 13 13 13 3** 13 11 1 1 12 11

Periodontite 13 8* 13 13 13 9** 13 12 0 0 12 12

Total 26 11 26 26 26 12 26 23 1 1 24 23

* Associação estatisticamente significante. Teste exato de Fisher (p=0,04)** Associação estatisticamente significante. Teste exato de Fisher (p=0,01)Nos demais casos não houve associação estatisticamente significante. TesteExato de Fisher (p>0,05)Fib = Fibroblasto; End = Células Endoteliais; Linf = Linfócitos; Plasm =Plasmócitos; Neutr = Neutrófilos; Macrof = MacrófagosPr = Número de casos em que a célula foi detectadaM = Número de casos em que houve marcação da referida célula

A análise estatística foi utilizada também para determinar se houve

diferença, dentro de cada tipo de doença periodontal diagnosticada clinicamente,

entre os tipos de MMPs objetos deste estudo.

Os resultados mostraram que na gengivite, tanto o tecido epitelial quanto o

tecido conjuntivo apresentaram uma produção de MMP-1 significativamente maior

que de MMP-2 e MMP-9 (Tabela 13).

76

Tabela 13. Média dos postos e significância estatística damarcação imuno-histoquímica para a MMP-1, MMP-2 e MMP-9em gengivite. Natal/ RN, 2006.

MMP-1 MMP-2 MMP-9 p

Epitélio 28.42a 14,92b 16,65b 0,0013

Tecido Conjuntivo 27,19a 15,84b 16,96b 0,0093

Letras diferentes representam diferença estatisticamentesignificante para α=0,05 segundo pós-teste de comparaçãomúltipla de Dunn

Na periodontite, tanto o epitélio quanto o tecido conjuntivo mostraram

produções de MMP-1 e MMP-9 significantemente maiores que a de MMP-2

(Tabela 14).

Tabela 14. Média dos postos e significância estatística damarcação imuno-histoquímica para a MMP-1, MMP-2 e MMP-9em periodontite. Natal/ RN, 2006.

MMP-1 MMP-2 MMP-9 p

Epitélio 28,00a 8,15b 23,84a <0,0001

Tecido Conjuntivo 24,38a 12,00b 23,61a 0,0033

Letras diferentes representam diferença estatisticamentesignificante para α=0,05 segundo pós-teste de comparaçãomúltipla de Dunn

77

Discussão

78

6 DISCUSSÃO

A doença periodontal inflamatória crônica, é uma das doenças mais

prevalentes do nosso tempo, com tendência a se tornar cada vez mais prevalente,

já que está provado que a sua ocorrência aumenta com a idade e a expectativa de

vida da população mundial tem aumentado continuamente nos últimos anos

(ALBANDAR, 2002; GJERMO et al., 2002; SHEIHAM; NETUVELI, 2002)

É referida desde 1977 pela American Academy of Periodontology, como

duas doenças distintas, de acordo com a região do periodonto que atinge,

denominadas gengivite ou periodontite (TODESCAN, 2001).

A gengivite, denominada atualmente como gengivite induzida por placa é

definida como a inflamação crônica dos tecidos que fazem parte do periodonto de

proteção, ou seja, a inflamação restrita à gengiva (ARMITAGE, 1999).

A periodontite é definida como o processo no qual a inflamação atinge os

tecidos do periodonto de sustentação, levando à destruição progressiva do osso

alveolar e ligamento periodontal. É classificada desde 1999 em três tipos distintos:

a periodontite crônica, forma mais prevalente e caracterizada pela progressão

lenta da destruição óssea; a periodontite agressiva, forma de periodontite

caracterizada por uma progressão mais rápida da destruição periodontal devido à

existência de uma microbiota mais virulenta, combinado a alguns fatores do

hospedeiro ainda não totalmente estabelecidos e a periodontite como

manifestação de doenças sistêmicas, que abrange uma forma de doença

periodontal extremamente destrutiva, associada a quadros de doenças sistêmicas

graves (ARMITAGE, 1999).

A patogenia da doença periodontal é classicamente descrita (GONÇALVES

et al., 2005; KINANE; LINDHE, 1999) como a periodontite sendo uma

conseqüência da gengivite, sendo as duas fases distintas da mesma doença que é

a Doença Periodontal Inflamatória Crônica, ou, como chamaram Passanezi et al.

(2005) para diferenciá-la das doenças que atingem o periodonto apical, de doença

periodontal marginal infecciosa. Neste trabalho a doença será considerada desta

79

maneira, sendo sempre referida simplesmente como doença periodontal, tendo

uma fase inicial chamada Gengivite e uma mais avançada chamada de

Periodontite.

Uma breve descrição dos principais eventos da patogenia da doença

periodontal foi feita para que se possa posteriormente colocar os objetos deste

estudo, as MMPs, como personagens chave em alguns dos processos.

A doença periodontal se inicia a partir da existência do chamado fator

etiológico principal, que é o biofilme dentário (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2002;

TODESCAN, 2001; WILLIAMS et al., 1992).

Em resposta aos agentes agressores liberados pelas bactérias existentes

no biofilme, tem-se início, na gengiva marginal uma reação inflamatória aguda de

baixa intensidade, mediada basicamente por neutrófilos com o intuito de combater

os agentes patogênicos que entram em contato com a gengiva. Como as bactérias

estão constantemente na cavidade oral, e mesmo após uma limpeza profissional,

iniciando a formação de novo biofilme, este processo é comumente encontrado na

gengiva, mesmo na gengiva considerada clinicamente sadia (SEABRA; SEABRA;

BRITO, 2005).

Dessa forma, sempre há a presença do agente agressor mas sempre há o

combate por parte do hospedeiro a estes agressores e o equilíbrio é mantido

fazendo com que, diante de agentes periodontopatogênicos de baixa intensidade

o combate seja eficiente e, apesar de histologicamente existir características de

inflamação, esta não é detectável clinicamente pois é suficiente apenas para

combater esta agressão de baixíssima intensidade.

Com o aumento da patogenicidade do agressor, pelo aumento da

quantidade de biofilme ou por uma modificação na microbiota tornando-o mais

virulento (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2002), ou modificação da resposta sistêmica

ao agente agressor (ALBANDAR, 2002; BEZERRA et al., 2003), começa a ocorrer

o desequilíbrio uma vez que o hospedeiro passa a não conseguir mais combater

adequadamente a agressão.

80

O aumento na intensidade do processo inflamatório, com maior quantidade

de células inflamatórias do tipo crônica (LINS, 2003), associado à dilatação

vascular aumentando a permeabilidade dos vasos e à estase sanguínea, bem

como à angiogênese para chegada de mais células de defesa fazem com que a

gengivite passe a ser clinicamente detectável pela presença de edema e eritema

gengival.

À medida em que a agressão vai se intensificando, a resposta também se

torna mais intensa. Com isso, as células de defesa passam a abranger áreas

maiores dentro do tecido conjuntivo gengival e a angiogenêse característica dos

processos de reação de granulação se torna mais pronunciada.

Estes dois componentes citados acima, infiltrado inflamatório e

angiogênese, para ocorrerem dependem da criação de espaços dentro do tecido

conjuntivo gengival, que é um tecido com um grande componente fibroso na sua

matriz extracelular (MEC). Este espaço é criado então às custas de degradação

de matriz extracelular. Portanto, no momento em que se inicia o aparecimento de

concentrações maiores de células inflamatórias no tecido conjuntivo (LINS, 2003),

começando de forma peri-vascular e justa-epitelial, a destruição de matriz

extracelular já deve estar presente. Consequentemente, quanto maior a

inflamação, maior o componente tecidual permeado com células inflamatórias e

atingido por formação de novos vasos, portanto maior a destruição da matriz

extracelular (ALBERTS et al., 1997; SEABRA; SEABRA; BRITO, 2005).

Além da destruição tecidual, os tecidos gengivais e periodontais inflamados

apresentam também queda no nível de produção de colágeno, o que acentua o

desequilíbrio entre formação e destruição tecidual resultando em maior perda de

matriz extracelular (KARIMBUX et al., 1998)

Quando o processo inflamatório no tecido conjuntivo gengival chega a

tomar proporções suficientes para atingir o osso alveolar e ligamento periodontal

subjacentes, a matriz extracelular óssea também passa a sofrer destruição,

embora envolvendo mecanismos destrutivos adicionais em relação à matriz

81

extracelular gengival (BIRKENDAL-HANSEN, 1993; KINANE; LINDHE, 1999;

MEYER et al. 1997).

Nesse momento, a doença passa a ser chamada de periodontite, embora,

como foi descrito acima, seja a continuação da mesma doença periodontal

inflamatória crônica.

Neste estudo não foi demonstrada associação com significância estatística

entre a localização do infiltrado inflamatório, e o tipo de doença periodontal

diagnosticada clinicamente (Tabela 2). Era de se esperar o contrário já que a

localização predominantemente peri-vascular e justa-epitelial corresponde a um

processo inflamatório considerado inicial enquanto que uma localização mais

difusa, indica uma processo inflamatório mais abrangente e portanto mais

avançado (LINS, 2003).

Também a associação entre o tipo de célula predominante no infiltrado

inflamatório e o diagnóstico clínico de gengivite ou de periodontite não pôde ser

estabelecido (Tabela 3). Este achado também é contrário ao que se encontra na

literatura (GONÇALVES et al., 2005; KINANE; LINDHE, 1999) que relata que um

dos sinais histológicos observados no tecido que indicam a progressão da doença

periodontal de uma gengivite em estágio mais inicial para uma em estágio mais

avançado ou mesmo uma periodontite já instalada é o aumento da proporção de

plasmócitos no infiltrado inflamatório, chegando a atingir 50% da população celular

encontrada no infiltrado.

Estes achados podem ser decorrentes do fato do diagnóstico de gengivite

ou periodontite ser exclusivamente clínico e/ou radiográfico, ou seja, não importa

para o diagnóstico quais eventos estejam ocorrendo no interior do tecido gengival

nem os achados histológicos destes eventos, o que importa é se a perda óssea

pode ser detectada clínica ou radiograficamente.

Deve-se considerar que uma biópsia para obtenção de uma gengiva em um

paciente com periodontite pode ser executada durante uma exodontia de um

dente condenado periodontalmente, que não passou pela fase do tratamento

periodontal chamada procedimentos básicos, cuja função principal é reduzir ou

82

eliminar a inflamação gengival, ou durante um procedimento de Retalho de

Widman Modificado, onde o dente em questão sofreu todos o tratamento

periodontal básico.

Obviamente, é razoável assumir que os dois fragmentos gengivais com

diagnóstico clínico periodontite são completamente diferentes histologicamente em

relação aos estágios de lesão inicial, precoce, estabelecida ou avançada

(GONÇALVES et al. 2005; KINANE; LINDHE, 1999). Portanto embora as

amostras utilizadas neste estudo tenham sido diagnosticadas clinicamente como

gengivite ou periodontite, isso não significa que os fragmentos contenham lesões

histologicamente compatíveis com seus diagnósticos clínicos.

Os eventos destrutivos que ocorrem nos tecidos periodontais durante a

doença foram durante muito tempo considerados de responsabilidade direta dos

produtos liberados pelas bactérias do biofilme (GENCO, 1992).

No entanto, sabe-se hoje que a degradação da matriz extracelular, tanto em

eventos fisiológicos quanto patológicos é mediada por uma classe de enzimas

endógenas denominadas Metaloproteinases da Matriz ou MMPs (ALBERTS et al.,

1997; MOTT; WERB, 2004; PEREIRA et al., 2005; SORSA; TJÄDERHANE;

SALO, 2004; STERNLICHT; WERB, 2001; Van DYKE; LESTER; SHAPIRA, 1993)

As MMPs são uma classe de enzimas cuja função principal é exercer a

degradação da matriz extracelular nos processos fisiológicos de formação e

desenvolvimento tecidual, renovação da matriz extracelular e degradação para

crescimento tecidual nos processos de reparo. Ou seja, têm a função de degradar

o tecido sempre que necessário por algum processo fisiológico ou patológico

(PEREIRA et al. 2005; Van DYKE; LESTER; SHAPIRA, 1993). De Souza et al.

(2005) afirmam que as MMPs são capazes de degradar todos os componentes da

matriz extracelular.

Portanto, é razoável assumir que estas enzimas também estão envolvidas

na destruição tecidual observada na doença periodontal, degradando a matriz

extracelular gengival e o componente orgânico do osso, o que significa que

componentes do próprio hospedeiro, e não produtos bacterianos, são os principais

83

responsáveis pela degradação dos tecidos periodontais observada na doença

periodontal (De SOUZA; LINE, 2002; REYNOLDS; MEIKLE, 1997; SORSA;

TJÄDERHANE; SALO, 2004).

Para que a degradação da matriz extracelular seja perfeitamente

controlada, não havendo degradação excessiva, vários mecanismos atuam na

regulação, como hormônios, fatores de crescimento e os inibidores teciduais de

metaloproteinases (TIMPs) (BIRKENDAL-HANSEN, 1993). Por isso, algum fator

que desregule o equilíbrio entre degradação fisiológica e formação de matriz,

resultando em renovação tecidual, deve atuar aumentando a produção e/ou

ativação das MMPs ou inativando os seus inibidores (GRENIER; MAYRAND,

2001).

Vários fatores endógenos como TNF-α, IL-1 e PGE2, que são produzidos

dentro da gengiva principalmente por células inflamatórias, além de fatores

exógenos como LPS bacteriano demonstraram exercer este papel (BIRKENDAL-

HANSEN, 1993; De SOUZA et al. 2005; NISHIKAWA et al. 2002; WAHL;

CORCORAN, 1993).

A MMP-1, ou Colagenase-1, foi demonstrada ser expressa por fibroblastos,

monócitos, macrófagos e células epiteliais (HAAKE et al., 2004a) como também

por plasmócitos, linfócitos e neutrófilos (SHIN et al., 2002). No presente estudo foi

observada MMP-1 nas células do epitélio pavimentoso estratificado ceratinizado

gengival, bem como nas células endoteliais, nos fibroblastos, linfócitos,

plasmócitos, neutrófilos e macrófagos.

Assim como as outras colagenases, que são a MMP-8 (Colagenase-2) e a

MMP-13 (Colagenase-3), a MMP-1 tem a capacidade de degradar o colágeno I,

principal componente fibrilar estrutural do tecido conjuntivo gengival. (HALINEN et

al. 1996; LYNCH; MATRISIAN, 2002; STAMENKOVIC, 2000; WESTERMARCK,

KÄHÄRI, 1999).

Foi detectado por Kubota, T. et al. (1996), níveis aumentados da produção

de RNAm para MMP-1, MMP-3 e MMP-8 em gengivas acometidas por doença

84

periodontal. Assim como redução de MMP-8 em gengivas acometidas por

periodontite após tratamento periodontal básico.

A MMP-1 também mostrou ter sua produção estimulada por citocinas

inflamatórias presentes na doença periodontal como a IL-1β (ALVARES et al.,

1995) e TNFα (NISHIKAWA et al., 2002).

No presente estudo, foi demonstrado que, das três MMPs analisadas a

MMP-1 se apresentou como a mais expressa na gengivite, tanto no epitélio quanto

no tecido conjuntivo. Na periodontite a MMP-9 apresentou-se também

significativamente mais expressa que a MMP-2 e com imunomarcação semelhante

à MMP-1 (Tabelas 13 e 14).

A MMP-1, portanto, mostrou forte expressão tanto no epitélio quanto no

conjuntivo desde estágios iniciais da doença periodontal até a periodontite

permanecendo relativamente inalterada durante as várias fases da doença. Isso

significa que a MMP-1 é uma das mais importantes enzimas de degradação

tecidual em todos os processos da doença.

No tecido conjuntivo gengival, os casos de periodontite apresentaram uma

expressão significativamente maior que os de gengivite (Tabela 5). Sendo

identificadas marcações em fibroblastos, células endoteliais, linfócitos,

plasmócitos, neutrófilos e macrófagos, sem haver associação significante entre a

expressão de qualquer um destes tipos celulares e o tipo de doença periodontal

diagnosticada clinicamente. Foi demonstrado no presente estudo que o tecido

epitelial é uma importante fonte de MMP-1 na doença periodontal tanto na

gengivite quanto na periodontite, uma vez que a expressão foi encontrada em

todos os casos analisados, mostrando também que o epitélio gengival exerce o

papel de produção de MMP-1 em todas as fases da doença (Tabela 4).

Estes dados mostram que em estágios mais avançados da doença

periodontal a produção de MMP-1, uma das colagenases mais importantes da

doença periodontal (KUBOTA, T. et al., 1996; MALDONADO et al., 2004),

aumenta no tecido conjuntivo, embora permaneça relativamente inalterada no

85

tecido epitelial, uma vez que desde os estágios iniciais de gengivite esta

expressão já se encontra elevada.

Isso pode significar que o tecido conjuntivo gengival só passa a ser uma

fonte importante de MMP-1 nos estágios mais avançados da doença periodontal,

que esta enzima pode exercer um papel importante na reabsorção óssea

resultante dessa doença e que a produção de MMP-1 por este tecido pode ser

crucial para a progressão da gengivite para periodontite.

Este dado está em acordo com Garlet et al. (2004) que detectou maior

produção de MMP-1 em pacientes com periodontite crônica e agressiva que em

pacientes sem periodontite e com Soell, Elkaim e Tenenbaum (2002) que

demonstraram aumento de produção e de atividade da MMP-1 em pacientes com

periodontie em relação a pacientes saudáveis.

As análises imuno-histoquímicas feitas especificamente nas células do

tecido conjuntivo, tiveram o intuito de identificar quais tipos celulares estariam

implicados na produção das três MMPs estudadas neste trabalho.

Essa análise mostrou, de acordo com a Tabela 6, que a MMP-1 pode ser

produzida de forma considerável por fibroblastos, células endoteliais, plasmócitos,

neutrófilos e macrófagos, em qualquer estágio da doença periodontal. Expressão

positiva para MMP-1 foi observada também em linfócitos, no entanto em 6 casos

de gengivite e 4 de periodontite os linfócitos presentes não se encontravam

marcados.

Estes achados concordam com os de Shin et al. (2002), que encontraram

também em análise imuno-histoquímica, marcação para MMP-1 em matriz

extracelular, neutrófilos, macrófagos, plasmócitos e linfócitos em polpas

diagnosticadas clinicamente com pulpites agudas e crônicas.

Os dados da tabela 4 e 5 em conjunto, mostram que a MMP-1, ou

Colagenase 1 é uma das enzimas de degradação de matriz extracelular mais

importantes na doença periodontal, agindo de forma considerável tanto na

destruição tecidual observada na gengivite quanto na periodontite e tanto as

células da inflamação aguda, quanto as da inflamação crônica são capazes de

86

produzí-la, assim como outros tipos celulares como ceratinócitos, fibroblastos e

células endoteliais.

Os dados expostos na tabela 6 não mostram diferenças estatisticamente

significantes na marcação de MMP-1 para nenhum tipo celular entre gengivite e

periodontite.

Pode-se inferir a partir disso que o aumento na marcação para a MMP-1

observada no tecido conjuntivo gengival na periodontite em relação à gengivite é

resultado de maior quantidade de tipos celulares produtores de MMP-1, e não por

produção desta enzima por alguma célula apenas na periodontite.

A detecção nas células endoteliais pode confirmar o seu papel na

angiogênese encontrada nos processos inflamatórios e neoplásicos como

sugerido por Haas e Madri (1999), Lynch e Matrisian (2002), Rundhaug (2003) e

DeClerk et al. (2004).

A MMP-2 e a MMP-9 são duas gelatinases, Gelatinase A e Gelatinase B

respectivamente. Wahl e Corcoran (1993) relatam que a MMP-9, chamada na

época de colagenase de 92 kDa, é capaz de degradar a gelatina, e colágenos tipo

IV e V (LYNCH; MATRISIAN, 2002; STAMENKOVIC, 2000; WESTERMARCK,

KÄHÄRI, 1999).

Chang et al. (2002) demonstraram que a produção de MMP-2 é estimulada

em culturas de células pulpares e periodontais pelas bactérias P. endodontalis, P.

gingivalis e A. actinomycetemcomitans. A MMP-9, apesar de ter sido encontrada, o

foi em pequenas quantidades. Ambas as MMPs foram também detectadas em

maior quantidade em pacientes com periodontite crônica e agressiva que em

pacientes controle, sem periodontite, por Garlet et al. em 2004 e em maior

quantidade e atividade em pacientes com periodontite que em pacientes controle

por Soell, Elkaim e Tenenbaum (2002).

Franchi et al. (2002) demonstraram que a marcação para a MMP-2 e a

MMP-9, principalmente esta última, tem grande importância nos processos de

invasão e metástase de carcinomas de cabeça e pescoço, provavelmente pelas

funções desempenhadas por elas na degradação da matriz extracelular,

87

principalmente da membrana basal, que é formada principalmente por colágenos

tipo IV e VII (ALBERTS et al., 1997), e na angiogênese.

Kumamoto et al., em 2003, demonstraram que a MMP-2, juntamente com a

MMP-9 é importante na degradação da membrana basal em germes dentários e

em ameloblastomas, tendo sido encontradas de forma mais pronunciada em

componentes mesenquimais que epiteliais.

No presente trabalho, a tabela 13 demonstra que a MMP-2 foi

significantemente menos expressa que a MMP-1 e apresentou expressão

semelhante à MMP-9 tanto no tecido epitelial quanto no conjuntivo em casos de

gengivite. Como visto na tabela 14, nos casos de periodontite a MMP-2 foi

significativamente expressa de forma mais fraca que a MMP-1 e a MMP-9 que

apresentaram expressões semelhantes entre si. Ou seja, a expressão de MMP-2

foi considerada fraca tanto na gengivite quanto na periodontite, quer seja no

epitélio ou no tecido conjuntivo.

Estes dados podem significar que as duas gelatinases se comportam de

maneiras distintas na doença periodontal. A MMP-2 (Gelatinase A) é expressa de

forma semelhante em todas as fases da doença periodontal, iniciando uma fraca

expressão em estágios iniciais, não se elevando com a progressão para estágios

mais avançados. Já a MMP-9, inicia-se com fraca expressão na gengivite e

aumenta a sua expressão, tanto no epitélio quanto no tecido conjuntivo, à medida

que a doença progride de uma gengivite para periodontite.

Como visto nas tabelas 7 e 8, a MMP-2 é expressa na maioria das vezes de

forma fraca, tanto no epitélio quanto no tecido conjuntivo, embora Chang et al.

(2002) tenha observado aumento de sua produção em cultura de células de

ligamento periodontal com P. gingivalis e Pattamapun et al. (2003) tenha

observado aumento tanto na produção quanto na ativação de MMP-2 em células

do ligamento periodontal.

Provavelmente esta MMP seja importante na degradação da membrana

basal do epitélio juncional, favorecendo sua migração para apical, evento que tem

início no estágio de lesão estabelecida e se continua na lesão avançada, conforme

88

foi sugerido no estudo de Smith et al. (2004) e semelhante à degradação da

membrana basal que ocorre em patologias como o câncer (FRANCHI et al. 2002),

cistos odontogênicos (KUBOTA, Y. et al. 2002) e ameloblastomas (KUMAMOTO

et al. 2003).

A Tabela 9, demonstra que das células analisadas apenas os neutrófilos

não apresentaram marcação para a MMP-2.

As células que são capazes de produzir esta MMP, o fazem mediante

algum estímulo, como contato com LPS bacteriano (BIRKEDAL-HANSEN, 1993;

REYNOLDS; MEIKLE, 1997), continuamente, embora em pequenas proporções,

como foi demonstrado também por Shin et al. (2002).

Mesmo que tal proporção não seja estatisticamente comparável às outras

duas MMPs analisadas neste estudo, o fato da produção da MMP-2 ter se

mostrado constante no tecido epitelial, e no conjuntivo nas células capazes de

produzí-las mostra que a MMP-2 possui alguma função na degradação da matriz

na doença periodontal e na angiogênese, em todos os estágios da doença

periodontal. Mais estudos seriam então necessários para determinar se a MMP-2

consegue desempenhar suas funções num nível importante mesmo numa

quantidade menor que a MMP-1 e MMP-9.

Já a MMP-9, ou Gelatinase B, uma enzima muito semelhante à MMP-2 à

qual é atribuída praticamente as mesmas funções, comportou-se no presente

estudo de forma diferente da Gelatinase A, exibindo o aumento da expressão

desta metaloproteinase nos casos diagnosticados como periodontite em relação

aos casos de gengivite.

Van Den Steen et al. (2002) afirmam que a MMP-9 encontra-se em níveis

aumentados em locais onde há uma ferida crônica, com ulcerações que não

cicatrizam. Esta situação descrita é facilmente encontrada em bolsas periodontais.

Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) também afirmaram que a MMP-9,

juntamente com a MMP-8 ou Colagenase 2, são as que mais frequentemente são

detectadas de forma aumentada em fragmentos de gengiva e fluido gengival de

pacientes com periodontite.

89

Grenier e Mayrand (2001), demonstraram que a P. gingivalis, através da

inativação da TIMP-1 pode fazer aumentar na gengiva inflamada os níveis de

MMP-9.

As tabelas 10 e 11 mostram que a produção de MMP-9 aumenta nos casos

de periodontite em relação aos casos de gengivite tanto no epitélio quanto no

tecido conjuntivo embora tenha apresentado diferença estatisticamente

significante apenas no epitélio.

Os dados estão em concordância com o estudo de Smith et al. (2004) que

observou níveis maiores de pró-MMP-9 mas não de pró-MMP-2 no epitélio de

bolsas periodontais, no entanto, discordam do estudo de Chang et al. (2002), que

mostrou que em células do ligamento periodontal a MMP-9, embora detectada na

análise zimográfica apresentou menor quantidade que a MMP-2.

É razoável se assumir que isso signifique que a MMP-9 pode ser uma das

enzimas mais importantes na doença periodontal, provavelmente atuando nos

processos de degradação da matriz extracelular do tecido conjuntivo gengival,

incluindo a membrana basal do epitélio juncional, do endotélio dos vasos

favorecendo a angiogênese e, possivelmente, na reabsorção do osso e ligamento

periodontal.

Seriam entretanto necessários outros estudos que avaliassem o papel das

MMPs na reabsorção óssea existente na doença periodontal, já que o estudo de

Chang et al. (2002) parece demonstrar que no ligamento periodontal a MMP-2 tem

produção maior que a MMP-9 frente a estímulos bacterianos.

Tanto a MMP-2 quanto a MMP-9, podem ter algum papel na reabsorção

óssea periodontal já que demonstraram serem estimuladas por IL-1β, um

mediador inflamatório existente na doença periodontal e exercerem algum papel

no crescimento de cistos odontogênicos (KUBOTA, Y. et al. 2000, KUBOTA, Y. et

al. 2002), além de já terem sido implicados na destruição tecidual de doenças

inflamatórias como a artrite reumatóide (Van Den STEEN et al. 2002)

A MMP-9, como visto na tabela 12, mostrou-se intensamente marcada em

células endoteliais em quase todos os casos analisados o que pode estar

90

relacionada coma sua função na angiogênese, em acordo com os achados de

Franchi et al. (2002) que encontraram densidade vascular maior em carcinomas

com superexpressão de MMP-9 que foi localizada tanto nas células tumorais

quanto nas células do estroma e nas células inflamatórias adjacentes ao tumor.

Além de atuarem na angiogênese pela degradação da membrana basal a

MMP-2 e, principalmente, a MMP-9, atuam também de forma indireta pela

liberação de epítopos pró-angiogênicos presentes nas macromoléculas da

membrana basal além de aumentarem a biodisponibilidade de fatores como VEGF

e TGF-β (BORNSTEIN; SAGE, 2002; MOTT; WERB, 2004; RUNDHAUG, 2003,).

A tabela 12 mostra também que plasmócitos e macrófagos apresentaram

considerável marcação tanto na gengivite quanto na periodontite, mostrando que

são fontes consideráveis de MMP-9 desde os estágios iniciais da doença

periodontal. Já os fibroblastos e linfócitos, mostraram significativamente maior

expressão nos casos de periodontite que nos de gengivite, o que significa que

estas células passam a produzir mais MMP-9 à medida que a doença periodontal

progride para estágios mais avançados, contribuindo com o aumento da produção

de MMP-9 no tecido conjuntivo gengival encontrado na periodontite em relação à

gengivite, fato demonstrado na tabela 11. Os neutrófilos, considerados

importantes fontes de MMP-9 por Smith et al. (2004) e De Souza et al. (2005),

tiveram baixa detecção na amostra analisada, não sendo possível qualquer

inferência embora tenha sido detectada marcação destas células para MMP-9.

Pode-se inferir que, juntamente com a MMP-1, a MMP-9 é uma enzima que

apresenta importância na destruição tecidual observada na periodontite, tanto pela

sua produção por parte do epitélio quanto do conjuntivo. O aumento na sua

produção pode ser, inclusive, considerado importante na progressão de gengivite

para periodontite e pode ser resultante tanto do aumento na quantidade das

células com capacidade de produzí-la quanto por produção por parte de

fibroblastos e linfócitos apenas na periodontite.

Este estudo demonstra de forma clara que as três MMPs analisadas

mostraram expressão imuno-histoquímica nos diferentes estágios da doença

91

periodontal evidenciadas em vários tipos celulares analisados mostrando que as

células do hospedeiro têm realmente um papel importante na produção das

substâncias responsáveis pela degradação tecidual. Este fato foi demonstrado de

forma evidente não somente em células da inflamação, classicamente

responsabilizadas pela destruição, como também em células como ceratinócitos,

fibroblastos e células endoteliais. Portanto o estudo segue a tendência atual

dentro da Periodontologia que considera que os fatores mais importantes na

degradação tecidual característica da doença periodontal são substâncias

produzidas pelo próprio hospedeiro, estimuladas pelas bactérias do biofilme

dentário, e não pelos microoganismos.

92

Conclusões

93

7. CONCLUSÕES

Podemos concluir com este estudo que:

• A combinação entre diagnóstico clínico de Gengivite ou de

Periodontite com os dados histológicos do tecido conjuntivo gengival

relativos aos estágios da patogenia da doença periodontal descritos

na literatura é difícil de ser conseguido;

• A MMP-1 é uma enzima produzida de forma intensa pelo epitélio

gengival em todas as fases da doença, desde os estágios iniciais de

gengivite até a periodontite;

• A MMP-1 tem sua produção aumentada dentro do tecido conjuntivo

gengival na periodontite em relação à gengivite, significando que a

produção desta enzima nesse tecido pode ter um papel crucial na

reabsorção óssea periodontal e na progressão do estágio de lesão

estabelecida para o de lesão avançada da doença periodontal;

• A MMP-2 mostrou-se predominantemente com fraca expressão, com

maior marcação no epitélio que no conjuntivo, portanto não pôde ser

considerada por este estudo uma das MMPs mais importantes na

patogenia da doença periodontal, no entanto, mais estudos são

necessários para determinar o seu real papel.

• A MMP-9 é expressa mais na periodontite que na gengivite, tanto no

epitélio quanto no conjuntivo significando que esta enzima pode ter

importância tanto na progressão da gengivite para a periodontite

quanto na própria patogenia da reabsorção óssea observada na

doença periodontal.

94

Referências bibliográficas

95

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALBANDAR, J.M. Global risk factors and risk indicators for periodontal disease.Periodontol. 2000, v.29, n.1, p.177-206, June 2002.

ALBANDAR, J.M. Periodontal disease in North America. Periodontol. 2000,v.29, p.31-69, 2002.

ALBERTS, B. et al. Junções celulares, adesão celular e a matriz extracelular.In: ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da célula. Porto Alegre: ArtesMédicas, 1997. Cap. 19, p.948-1009.

ALVARES, O. et al. Growth factor effects on the expression of collagenase andTIMP-1 in periodontal ligament cells. J. Periodontol., v.66, n.7, p.552-8, Jul.1995.

ARMITAGE, G.C Development of a classification system for periodontaldiseases and conditions. Ann Periodontol., v.4, n.1, p.1-6, 1999.

BEZERRA, M.G. et al. Avaliação do hábito de fumar como fator de risco para adoença periodontal. Rev. Bras. Patol. Oral, v.2, n.3, p.18-21, Jul./Set. 2003.

BIRKEDAL-HANSEN, H. Role of matrix metalloproteinases in humanperiodontal diseases. J. Periodontol.,v.64, p.474-484, 1993.

BJÖRNSSON, M.J. et al. Influence of the matrix metalloproteinase inhibitorbatimastat (BB-94) on periodontal bone destruction in Sprague-Dawley rats. J.Periodont. Res. v.39, p.269 –274, 2004.

BORNSTEIN, P.; SAGE, H. Matricellular proteins: extracellular modulators ofcell function. Curr. Opinion Cell Biol., v.14, p.608-16, Aug, 2002.

CHANG, Y-C et al. Stimulation of matrix metalloproteinases by black-pigmentedBacteroides in human pulp and periodontal ligament cell cultures. J. Endod.v.28, n.2, p.90-3, Feb. 2002.

CHANG, Y-C et al. Regulation of matrix metalloproteinase production bycytokines, pharmacological agents and periodontal pathogens in humanperiodontal ligament fibroblast cultures. J. Period. Res., v.37, n.3, p.196, 2002.

COTRIM, P. et al. Expression and activity of metalloproteinase-2 (MMP-2) inthe development of rat first molar tooth germ. Braz. Dent. J. v.13, n.2, p.97-102, 2002.

De SOUZA, A.P. et al. Analysis of MMP-9 (C-1562T) and TIMP-2 (G-418C)gene promoter polymorphisms in patients with chronic periodontitis. J. Clin.Periodontol., v.32, n.2, p.207-11, Feb. 2005.

96

De SOUZA, A.P.; LINE, S.R.P. The biology of matrix metalloproteinases. Rev.FOB, v.10, n.1, p.1-6, jan./mar. 2002.

DeCLERCK, Y. et al. Proteases, extracellular matrix, and cancer: a workshop ofthe path B section. Am. J. Pathol., v.164, n.4, p.1131-9, Apr. 2004.

FIGUEREDO, C. M. S. et al. The short-term effectiveness of non-surgicaltreatment in reducing protease activity in gingival crevicular fluid from chronicperiodontitis patients. J Clin Periodontol, v.31, p.615-619, 2004.

FRANCHI, A. et al. Expression of matrix metalloproteinase 1, matrixmetalloproteinase 2, and matrix metalloproteinase 9 in carcinoma of the headand neck: correlations with p53 status, inducible nitric oxide synthase activity,and angiogenesis. Cancer, v.95, n.9, Nov., 2002.

GARLET, G.P. et al. Matrix metalloproteinases, their physiological inhibitorsand osteoclast factors are differentially regulated by the cytokine profile inhuman periodontal disease. J. Clin. Periodontol., v.31, p.671-9, 2004.

GENCO, R.J. Host responses in periodontal diseases: current concepts. J.Periodontol., v.63, p.338-55, April Suppl., 1992.

GJERMO, P. et al. Periodontal disease in Central and South America.Periodontol 2000, v.29, p.70-8, 2002.

GODOY, G.P. Expressão imuno-histoquímica das integrinas αααα2ββββ1, αααα3ββββ1 eαααα5ββββ1 em folículos pericoronários espessados e cistos dentígerosincipientes. 2005. 116f. Tese (Doutorado em Patologia Oral) – UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte, Natal, 2005.

GOLD, S.I. Periodontics: the past: part (I): early sources. J Clin Periodontol,v.12, p.79-97, 1985.

GOLD, S.I. Periodontics: the past: part (II): the development of modernperiodontics. J Clin Periodontol, v.12, p.171-99, 1985.

GONÇALVES, P.F. et al. Patogênese da doença periodontal. In: de PAIVA,J.S.; de ALMEIDA, R.V. Periodontia: a atuação clínica baseada em evidênciascientíficas. São Paulo: Artes Médicas, 2005. Cap. 3, p.39-49.

GRENIER, D.; MAYRAND, D. Inactivation of tissue inhibitor ofmetalloproteinases-1 (TIMP-1) by Porphyromonas gingivalis. FEMS Microb.Letters. v. 203, p.161-4, 2001.

HAAKE, S.K. et al. Interações microbianas com o hospedeiro nas doençasperiodontais. In: NEWMAN, M.G.; TAKEI, H.H.; CARRANZA, F.A. Periodontiaclínica de Carranza. 9.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. Cap.8,p.118-36.

97

HAAKE, S.K. et al. Microbiologia da doença periodontal. In: NEWMAN, M.G.;TAKEI, H.H.; CARRANZA, F.A. Periodontia clínica de Carranza. 9.ed. Rio deJaneiro: Guanabara Koogan, 2004. Cap.6, p.86-100.

HAAS, T.L., MADRI, J.A. Extracellular matrix-driven matrix metalloproteinaseproduction in endothelial cells: implications for angiogenesis. TrendsCardiovasc Med. v.9, n.3-4, p. 70-7, Apr-May, 1999.

HALINEN et al. Caracterization of matrix metalloproteinase (MMP-8 and -9)activities in the saliva and in gingival crevicular fluid of children with Down'ssyndrome. J. Periodontol., v.96, n.8, p.748-54, 1996.

KARIMBUX, N.Y. et al. The expression of collagen I and XII mRNAs inPorphyromonas gingivalis-induced periodontitis in rats: the effect of doxycyclineand chemically modified tetracycline. J. Periodontol., v.69, n.1, p.34-40, Jan.1998.

KINANE, D. F.; LINDHE, J. Patogênese da periodontite. In: LINDHE, J.Tratado de periodontia clínica e implantologia oral. Rio de Janeiro:Guanabara Koogan, 1999. Cap. 5, p.127-152.

KUBOTA, T. et al. Expression of mRNA for matrix metalloproteinases andtissue inhibitors of metalloproteinases in periodontitis-affected human gingivaltissue. Archs. oral Biol., v.41, n.3, p.253-62, 1996.

KUBOTA, Y. et al. Interleukin-1α enhances type I collagen-induced activation ofmatrix metalloproteinase-2 in odontogenic keratocyst fibroblasts. J. Dent. Res.,v.81, n.1, p.23-7, 2002.

KUBOTA, Y. et al. Interleukin-1α-dependent regulation of matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) secretion and activation in the epithelial cells ofodontogenic jaw cysts. J. Dent. Res., v.79, n.6, p.1423-30, 2000.

KUMAMOTO, H. et al. Immunohistochemical detection of matrixmetalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs)in ameloblastomas. J Oral Pathol Med,v.32, p.114-120, 2003.

LINS, R. D. A. U. Análise imuno-histoquímica do perfil da respostaimunológica na doença periodontal. 2003. 156f. Tese (Doutorado emPatologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2003.

LYNCH, C.C., MATRISIAN, L.M. Matrix metalloproteinases in tumor-host cellcommunication. Differentiation, v.70, p.561-73, 2002.

MALDONADO, A. et al. Pre-exposure to high glucose augmentslipopolysaccharide-stimulated matrix metalloproteinase-1 expression by humanU937 histiocytes. J. Periodont. Res. v.39, p.415 –23, Dec. 2004.

98

MEYER, J. et al. Active and α-1 proteinase inhibitor complexed leukocyteelastase levels in crevicular fluid from patients with periodontal diseases. J.Periodontol. v. 68, n.3, p.256-61, Mar. 1997.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Projeto SB Brasil 2003: condições de saúde bucalna população brasileira 2002-2003. Brasília: Ministério da Saúde, 2004.

MOTT, J.D.; WERB, Z. Regulation of matrix biology by matrixmetalloproteinases. Curr. Opinion Cell Biol. v.16, p.558-64, 2004.

NABESHIMA, K. et al. Matrix metalloproteinases in tumor invasion: role for cellmigration. Pathology International, v.52, p.255-64, 2002.

NAKAYA, et al. Effects of interleukin-1β on matrix metalloproteinase-3 levels inhuman periodontal ligament cells. J. Periodontol. v. 68, n.6, p.517-23, Jun.1997.

NISHIKAWA, M. et al. Effects of TNFα and prostaglandin E2 on the expressionof MMPs in human periodontal ligament fibroblasts. J. Periodont. Res., v.37,p.167-76, 2002.

PATTAMAPUN, K. et al. Activation of MMP-2 by Porphyromonas gingivalis inhuman periodontal ligament cells. J. Periodontal Res., v.38, p.115-21, 2003.

PEREIRA, A.L.A., et al. O papel das proteínas da matriz extracelular e dasmetaloproteinases em carcinomas de cabeça e pescoço: uma atualizaçãobibliográfica. Rev. Bras. Otorrinolaringol. v.71, n.1, p.81-6, Jan./Fev., 2005.

REYNOLDS, J.J.; MEIKLE, M.C. Mechanisms of connective tissue matrixdestruction in periodontitis. Periodontology 2000, v.14, p.144-57, 1997.

RUNDHAUG, J.E. Matrix metalloproteinases, angiogenesis, and cancer.Clinical Cancer Res. v.9, p.551-4, Feb. 2003.

SEABRA, E.G.; SEABRA, F.R.G; BRITO, M.C.T. Processos agudos doperiodonto. In: de PAIVA, J.S.; de ALMEIDA, R.V. Periodontia: a atuaçãoclínica baseada em evidências científicas. São Paulo: Artes Médicas, 2005.Cap. 14, p.209-26.

SHEIHAM, A.; NETUVELI, G.S. Periodontal disease in Europe. Periodontol.2000, v.29, p.104-21, 2002.

SHIN, S-J. et al. Tissue levels of matrix metalloproteinases in pulps andperiapical lesions. J. Endod. v.28, n.4, p.313-5, Aug., 2002.

SMITH, P C et al. In situ detection of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) ingingival epithelium in human periodontal disease. J Periodont Res,v.39, p.87-92, 2004.

99

SOCRANSCKY, S.S; HAFFAJEE, A.D. Dental biofilms: difficult therapeutictargets. Periodontol. 2000, v.28, n.1, Jan. 2002.

SOELL, M.; ELKAIM, R.; TENENBAUM, H. Cathepsin C, matrixmetalloproteinases, and their tissue inhibitors in gingival and gingival crevicularfluid from periodontitis-affected patients. J. Dent. Res., v.81, n.3, p.174-8,2002.

SORSA, T.; TJÄDERHANE, L.; SALO, T. Matrix metalloproteinases in oraldiseases. Oral Diseases, v.10, p.311-8, 2004.

STAMENKOVIC, I. Matrix metalloproteinases in tumor invasion andmetastases. Cancer Biology, v.10, 415-33, 2000.

STERNLICHT, M.D.; WERB, Z. How matrix metalloproteinases regulate cellbehavior. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., v.17, p.463-516, 2001.

TODESCAN, J.H. Doença periodontal: conceitos e classificações. São Paulo:Santos, 2001.

TUNES, U.R., et al. Classificação das doenças periodontais. In: de PAIVA,J.S.; de ALMEIDA, R.V. Periodontia: a atuação clínica baseada em evidênciascientíficas. São Paulo: Artes Médicas, 2005. Cap. 7, p.107-20.

VALLADARES NETO, J. Ética em pesquisa. In: ESTRELA, C. Metodologiacientífica: ensino e pesquisa em Odontologia. São Paulo: Artes Médicas,2001. Cap.18, p.406-47.

Van Den STEEN, P. et al. Biochemistry and molecular biology of gelatinase Bor matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Crit. Rev. Biochem. Molec. Biology,v.37, n.6, p.375-536, 2002.

Van DYKE, T.E.; LESTER, M.A.; SHAPIRA, L. The role of the host response inperiodontal disease progression: implications for future treatment strategies. J.Periodontol., v.64, p.792-806, Aug. Suppl. 1993.

WAHL, L.M.; CORCORAN, M.L. Regulation of monocyte/macrophagemetalloproteinase production by cytokines. J. Periodontol., v.64, p.467-73,May 1993.

WESTERMARCK, J.; KÄHÄRI, V-M. Regulation of matrix metalloproteinaseexpression in tumor invasion. FASEB J., v.13, p.781-92, 1999.

WILLIAMS, D.M. et al. Tissue demage and disease progression. In: Pathologyof periodontal disease. New York: Oxford University, 1992. Cap. 6, p.98-109.

100

ANEXO 1

101

ANEXO 2

HE

Localiz. da InflamaçãoCélulas

predominantesN. da Lâmina Difusa P-vasc e J-epit Linf Linf-plasm

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Localiz = localização; P-vasc=perivascular, J-epit=justaepitelial; Linf=linfócitos,Plasm=plasmócitos.

102

ANEXO 3

MMP-1Epitélio Conjuntivo Células

N. da Lâmina (-) (+) (++) Lbas (-) (+) (++) Fib End Lf Pl Nt Mc1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Lam. Basal= lâmina basal, Fib=fibroblastos, End=células endoteliais, Lf=linfócitos,Pl=plasmócitos, Nt= neutrófilos, Mc=macrófagos

103

ANEXO 4

MMP-2Epitélio Conjuntivo Células

N. da Lâmina (-) (+) (++) Lbas (-) (+) (++) Fib End Lf Pl Nt Mc1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Lam. Basal= lâmina basal, Fib=fibroblastos, End=células endoteliais, Lf=linfócitos,Pl=plasmócitos, Nt= neutrófilos, Mc=macrófagos

104

ANEXO 5

MMP-9Epitélio Conjuntivo Células

N. da Lâmina (-) (+) (++) Lbas (-) (+) (++) Fib End Lf Pl Nt Mc1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Lam. Basal= lâmina basal, Fib=fibroblastos, End=células endoteliais, Lf=linfócitos,Pl=plasmócitos, Nt= neutrófilos, Mc=macrófagos