Avaliação histopatológica, imuno-histoquímica e ultra

58

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v. 44, suplemento, p. 58-64, 2007

Avaliação histopatológica, imuno-histoquímica e

ultra-estrutural da resposta inflamatória crônica do

robalo (Centropomus spp.) ao BCG

1 - Setor de Piscicultura da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz daUniversidade de São Paulo, Piracicaba-SP2 - Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária eZootecnia da Universidade de São Paulo, São Paulo-SP

Ricardo Yuji SADO1

Eliana Reiko MATUSHIMA2

Correspondência para:Ricardo Yuji SadoSetor de Piscicultura, Escola Superior deAgricultura “Luiz de Queiroz”-Universidade de São Paulo, Av. Pádua Dias11, Cx.P.09, CEP 13418-900, Piracicaba,Brasil. email: [email protected]/[email protected]

Recebido para publicação: 15/05/2006Aprovado para publicação: 23/08/2007

Resumo

Objetivo do estudo foi avaliar a cinética da resposta inflamatóriainduzida experimentalmente com BCG em peixes modernospertencentes ao gênero Centropomus sp. Os animais foramexperimentalmente inoculados com BCG por via intramuscular naregião do pedúnculo caudal sendo realizada a coleta do material nostempos experimentais de 1, 3, 7, 14, 21 e 33 dias pós-inoculação. Afase aguda da resposta inflamatória se mostrou na forma de infiltradocomposto predominantemente por células mononucleares, edemaintersticial e necrose de tecido muscular. À medida que o processo sedesenvolve, observa-se a organização do foco lesional na forma deum granuloma formado por células epitelióides. Essas células, aoexame imunohistoquímico apresentaram positividade a proteína S100e citoqueratina, indicando características macrofágicas e secretória, alémde apresentarem ao exame ultra-estrutural a presença de desmossomosentre as células adjacentes. Não houve participação efetiva de célulasgigantes e pigmentares, sugerindo ser uma característica relacionada àespécie.

Palavras-chave:Peixe.Histopatologia.Inflamação.Célula epitelióide.Granuloma.

Introdução

A resposta inflamatória pode serdefinida sob duas formas, aguda e crônica.A inflamação crônica caracterizada pelaformação de granulomas pode sercomposta de várias de células, comomacrófagos, linfócitos, fibroblastos egranulócitos.1 Os granulomas podem serdenominados em “granulomas por corpoestranho” e “granulomas imunes”. Oprimeiro é formado em resposta a partículasinertes, como talco e fio de sutura cirúrgico,caracterizado pela presença de camadas decélulas epitelióides e células gigantes, com oinóculo no centro da lesão. Os granulomasimunes são formados em resposta àspartículas insolúveis com capacidade deestimular a resposta imune celular, como nasmycobacterioses ou com a utilização doBCG - cepas atenuadas de Mycobacterium bovis.

Esses são compostos por células epitelióidescom conteúdo necrótico na região centraldo granuloma.1

Baseando-se na teoria evolutiva deDarwin, Metchnikoff2 desenvolveu estudossobre a resposta inflamatória com espécimesde diferentes filos, classes e ordem demetazoários propondo que a complexidadedo processo inflamatório acompanha acomplexidade da evolução natural dasespécies animais. Em peixes, talcomplexidade está presente na respostainflamatória crônica de diversas espécies, epertencentes filogeneticamente a gruposdistintos. Segundo Gosline3 os peixesteleósteos podem ser divididos em trêsgrupos distintos: primitivos, intermediáriose modernos.

Em peixes modernos da espécieChanna striatus, “snakehead”4 , Odonthestesbonariensis, peixe rei5, Oreochromis niloticus, tilápia

59


do Nilo6, Dicentrarchus labrax, “seabass”europeu7 e Sparus aurata, “gilthead sebream”8

a resposta inflamatória crônicagranulomatosa é composta por célulasepitelióides circunscrevendo o inóculo, osquais possuem amplo citoplasmavacuolizado e núcleo contendo cromatinafrouxa podendo apresentar célulaspigmentares ao redor do granuloma4, 6, 7, 8 .Em contrapartida, na maioria dos peixesteleósteos primitivos, Prosopium williamsoni9,Ictalurus puntactus, bagre do canal10, Corydoranattereri, corydora,11 há formação decélulas gigantes circunscrevendo o patógenono decorrer do processo inflamatório sema formação de um granuloma ediferenciação dos macrófagos em célulasepitelióides12, 13, 14.

Dentre os vertebrados ectotérmicos,o estudo do processo inflamatório já éconhecido; mas há extensas lacunas noconhecimento deste fenômeno que devemser preenchidas, principalmente dos pontosde vista filogenético e patológico, já que ofenômeno em peixes ainda não estáclaro devido à falta de estudos morfológicosem condições controladas. O objetivo dessetrabalho foi caracterizar a respostainflamatória crônica do robalo (Centropomusspp.) dos pontos de vista histopatológico,imuno-histoquímico, ultraestrutural efilogenético.

Material e Método

AnimaisForam utilizados 52 robalos (média

de 26,83 cm), peixe pertencente ao gêneroCentropomus, considerado moderno, ordemdos Perciformes, subordem Percoidei,superfamília Percoidae3 coletados através delinha e anzol no canal de Bertioga – SP/Brasil e mantidos nas instalações do ACQUAMUNDO – Aquário do Guarujá/Brasil, emtanques circulares com 1.000 litros decapacidade, aeração constante e troca deágua a cada dois dias.

Procedimento experimentalOs animais foram anestesiados, por

meio de imersão em solução alcoólica debenzocaína 1:10.00015, 16. Na região depedúnculo caudal, acima da linha lateral nolado direito, foram inoculados 0,05mLda vacina BCG (Bacilo Calmette – Guerin)proveniente do Instituto Butantã – SP, naconcentração de 8mg mL-1. O grupocontrole era composto por animaisque não sofreram inoculação doBCG no tecido muscular. Após oprocedimento, os animais foramdevolvidos ao tanque, para recuperaçãodo comportamento normal após5 minutos. Seguindo a metodologia deMatushima6, foi realizada a coleta de materialum, três, sete, 14, 21 e 33 dias após ainoculação. Para tanto os animais foramsacrificados em solução supersaturada debenzocaína e extraído fragmento de tecidomuscular no local da inoculação utilizando-se lâmina de bisturi. O fragmento colhidofoi imediatamente fixado em solução deformol a 10% para posterior preparo paraanálises histopatológica e imuno-histoquímica.

HistopatologiaO material coletado foi fixado por

24 horas, sendo posteriormente processadopelas técnicas histológicas usuais e coradopela técnica da hematoxilina-eosina (HE);sendo montados entre lâmina e lamínula.17

As lâminas montadas foramobservadas em microscópio de luz comumem objetivas de 40, 100, 200, 400 e 1000vezes.

ImunohistoquímicaApós inclusão do material em

parafina, foram obtidos cortes de cincomicrômetros de espessura. Estes forammontados em lâminas que continham filmede silano a 4% em acetona. Essas lâminasforam processadas e submetidas a reaçõescom anticorpos primários para Mycobacteriumbovis - BCG (Dako A/S Denmark),citoqueratina AE1/AE3 (Dako A/SDenmark) e proteína S100 (Dako A/SDenmark) na diluição de 1:10.000, 1:800 e1:15.000, respectivamente.

60


Microscopia eletrônicaFragmentos de tecido muscular

coletados 14, 21 e 33 dias após inoculaçãoforam fixados em glutaraldeído a 2% emtampão Milloning para posteriorprocessamento e visualização emmicroscópio eletrônico de transmissão.

Resultados

HistopatologiaAo exame histopatológico, o grupo

controle apresentou musculatura esqueléticaestriada normal com feixes muscularesapresentando núcleos periféricos, comausência de lesão tecidual ou infiltradoinflamatório.

Inicialmente, após 24h da inoculaçãodo BCG, há processo inflamatório difusocom infiltrado moderado compostopredominantemente por célulasmononucleares ao redor do inóculo, alémda presença de edema intersticial e necrosetecidual (Figura 1A). Três dias apósinoculação, observa-se formação dealgumas células gigantes com posteriororganização do foco lesional, com aumentode camadas de células ao redor do inóculo.Essas células apresentam amplo citoplasmaacidófilo com inúmeros vacúolos,assemelhando-se à células epitelióides (Figura1B). Após o 14o dia da inoculação haviamaior organização da lesão em diversosgranulomas. Até o 33o dia de inoculação nãohouve mudanças significantes no quadroreacional, apenas maior organização da lesãona forma de granuloma compostopredominantemente por células epitelióides(Figura 1C).

ImunohistoquímicaAo exame imuno-histoquímico para

o BCG observou-se positividade nosfragmentos observados em todos ostempos, sendo difusa nos primeiros dias,tornando-se mais restrita ao interior dosgranulomas nos tempos subseqüentes (Figura1D). A reação imunohistoquímica paraproteína S100 foi positiva nos fragmentosem todos os tempos, demonstrando a

presença de células macrofágicas no focolesional (Figura 1E). Em contrapartida, areação para citoqueratina foi negativa paraAE1/AE3 até o sétimo dia após inoculação.A partir do 14o dia, apresentou-se positiva,demonstrando a diferenciação dosmacrófagos em células epitelióides excretorasde citoqueratina (Figura 1F).

Ultra-estruturaA ultra-estrutura das células epitelióides

presentes na resposta inflamatória crônicadesses animais, mostra a presença dejunções desmossômicas entre as célulasadjacentes que compõe o granuloma(Figura 2).

Discussão

Espécies de peixes primitivos,implantes hormonais na cavidade peritonealdo bagre do canal, Ictalurus punctatus10, BCGintramuscular em corydora, Corydora nattereri11

e micobacteriose em “goldfish”, Carassiusauratus13 verificou-se uma respostainflamatória crônica difusa compostabasicamente por células gigantes, semformação de granuloma e diferenciação dosmacrófagos em células epiteliódes14, 18,conseqüentemente negativas à expressão decitoqueratina.

Diferenças morfológicas e celulares sefazem presentes no decorrer do processo.Após 24 horas da inoculação do BCG, afase aguda se caracteriza com uma reaçãoinflamatória difusa composta por infiltradoinflamatório, edema intersticial e necrosetecidual, sendo essa fase inicial tambémverificada por Finn e Nielsen19, Timur,Roberts e McQueen20, Matushima6 e Rego21.

A intensa reação inflamatóriaperivascular observada por diversosautores6,19,22, também pôde ser observada nopresente estudo, sugerindo a migração decélulas macrofágicas para o foco lesional.No decorrer do experimento, ocorremmudanças na morfologia das célulasfagocíticas, como sua diferenciação emcélulas com características epiteliais, as quais

61


Figura 1 - (A) Tecido muscular de Centropomus sp., 24 horas após inoculação do BCG, infiltrado inflamatóriomoderado ao redor do inóculo, edema (E) e necrose tecidual (N), HE X 1000. (B) Tecido muscular deCentropomus sp., 7 dias pós-inoculação do BCG, formação de estrutura granulomatosa, possuindo nocentro o inóculo (I), e na periferia camadas de células (C) com cromatina frouxa, e amplo citoplasmaacidófilo e vacuolizado, HE X 4000. (C) Tecido muscular de Centropomus sp., 33 dias pós-inoculação,formação de diversos granulomas (G) compostos por células epitelióides (CE), contendo na regiãocentral, o BCG, HE X 2000. (D) Tecido muscular de Centropomus sp., 21 dias após inoculação. As setasindicam positividade para imunohistoquímica anti-BCG, ABC X 400. (E) Tecido muscular de Centropomussp., setas indicam positividade para imunohistoquímica anti-proteína S100, ABC X 400. (F) Tecidomuscular de Centropomus sp., setas indicam reação imunohistoquímica anti-AE1AE3 positiva,ABC X 2000

Figura 2 - Eletromicrografia de tecido muscular de Centropomus sp. A seta mostra a presença de desmossomosentre as células adjacentes. x168.000

62


se organizam ao redor do inóculo,formando várias camadas à medida que oprocesso se cronifica. A presença de algumascélulas gigantes multinucleadas na respostainflamatória do presente estudo, de peixesconsiderados filogeneticamente modernospode ser um fenômeno ligado não só aposição filogenética do animal, mas tambémuma característica ligada à espécie, já que emlinguados (Pleuronectes platessa) inoculadoscom carragenina20 e tilápias (Oreochromisniloticus) inoculadas com BCG6, peixesclassificados como modernos, tambémapresentam esse tipo celular durante aresposta inflamatória crônica, ao passo queem douradas, Sparus aurata, peixe tambémconsiderado filogeneticamente modernonão apresentam8, 18.

No decorrer do processo inflamatório,há organização da lesão na forma de granulomacomposto por células com cromatina frouxa, eamplo citoplasma vacuolizado sugestivas de seremepitelióides. Essas características também sãoencontradas em algumas espécies primitivas(salmonídeos) e demais espéciesmodernas.4,5,6,12,13,14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27

A positividade à reação imuno-histoquímica anti-BCG observada nosfragmentos de todos os tempos constituiu-se em padrão reacional semelhante aosencontrados por Radhakrishman et al.28,Matushima6, Carabias et al.29 e Rego21.

Da mesma forma, a reação positivapara proteína S100 se desenvolveu desde oprimeiro fragmento observado, tornando-se mais intensa no decorrer do tempo,corroborando Rego21, que observou o mesmoem peixes do gênero Poecilia, consideradosfilogeneticamente intermediários3, e emgranulomas de mamíferos, formados porcélulas epitelióides30, 31, 32. Em contrapartida,a reação imuno-histoquímica paracitoqueratina AE1/AE3 se mostrou positivasomente após o 14o dia da inoculação doBCG, tempo em que é possível observarcélulas com caracterísitcas epitelióides pormeio da histopatologia, fenômeno que vaise intensificando até o 33° dia. O resultadoverificado em muito se assemelha aoencontrado por Noga, Wright e Pasarell24 e

Matushima6 que observaram positividadepara citoqueratina em peixes consideradosfilogeneticamente modernos.

A ultra-estrutura das células epitelióidesdemonstrou a presença de desmossomos. Asmesmas características ultra-estruturaistambém foram observadas por Rego21 empeixes intermediários do gênero Poecilia(Molinésia), e Noga, Wright e Pasarell24 eMatushima6 em peixes modernos (Oreochromisniloticus).

Pelo fato de peixes consideradosprimitivos, como a truta arco-íris19,“goldfish”13,25 apresentarem a formação decélulas epitelióides14,18, essas espécies podemestar numa posição na escala filogenéticapróxima aos animais pertencentes ao grupodos intermediários, começando assim, aapresentar algumas características dessegrupo, mas não apresentando tamanhaespecialização celular a ponto de expressaremcaracterísticas morfológicas e funcionais deuma célula epitelial, como a presença dedesmossomos entre células adjacentes epositividade à reação imunohistoquímicapara citoqueratina AE1/AE3 observadosem algumas espécies intermediárias21 eespécies modernas, como a tilápia do Nilo6

e “striped bass”1, mas apenas característicasmacrofágicas.

Conclusão

Há diferenças histológicas, histoquímicase ultraestruturais na resposta inflamatória crônicaem peixes pertencentes a diferentes posiçõesfilogenéticas, ou seja, primitivos,intermediários ou modernos. Sendo que, empeixes modernos, na formação de umgranuloma imune, os macrófagos sediferenciam em células epitelióides, ao passoque em peixes primitivos, os macrófagos sediferenciam em gigantócitos, sem aformação de um granuloma.

Agradecimentos

Ao Programa de Pós-Graduação emPatologia Experimental e Comparada doDepartamento de Patologia da Faculdade

63


de Medicina Veterinária e Zootecnia - USP,ACQUA MUNDO - Aquário do Guarujá,Faculdade de Medicina - USP, Instituto

Butantã, Instituto Adolfo Lutz e Fundaçãode Amparo à Pesquisa do Estado de SãoPaulo (FAPESP).

Histopathological, immunohistochemical, and ultra-structural evaluation of

chronic inflammatory response of robalo (Centropomus spp) to BCG

Abstract

This study set out to evaluate inflammatory response kinetics afterexperimental inoculation with BCG in modern Centropomus sp. fish.BCG was applied through intramuscular injection in the caudalpeduncular region, and samples were collected for analyses at days 1,3, 7, 14, 21, and 33 post-injection. Acute phase inflammatory infiltratewas characterized by predominant mononuclear cells, intersticial edema,and muscular tissue necrosis. As the inflammatory response evolved,the lesion organized into a granuloma formed by epithelioid cells.These epithelioid cells were positive for the S100 protein and cytokeratinat histochemical analysis, which demonstrates macrophage andsecretory activity, besides ultra-structural analysis showed desmosomicjunctions within adjacent cells. It didn’t have an expressive participationof giant cells and pigment containing cells in the inflammatory reaction,suggesting that it’s a specie-specific characteristic.

Key words:Fish.Histopathology.Inflammation.Epithelioid cells.Granuloma.

Referências

1 GAUTHIER, D. T.; VOGELBEIN, W. K.; OTTINGER,C. A. Ultrastructure of Mycobacterium marinumgranuloma in striped bass Morone saxatilis. Diseasesof Aquatic Organisms, v. 62, p. 121-132, 2004.

2 METCHNIKOFF, E. Lectures on the comparativepathology of inflammation. New York: DoverPublication, 1968. 223 p.

3 GOSLINE, W.A. Functional morphology andclassification of teleostean fishes. Honolulu: TheUniversity Press of Hawai, 1971. 208 p.

4 CHINABUT,S.; LIMSUWAN, C.; CHANRATCHAKOOL,P. Mycobacteriosis in the snakehead, Channa striatus(Fowler). Journal of Fish Diseases, v. 13, n. 6, p. 531-535,1990.

5 HATAI, K. et al. Mycobacterium infection in pejerrey,Odonthestes bonariensis Cuvier & Valenciennes.Journal of Fish Diseases, v. 16, n. 4, p. 397-402, 1993.

6 MATUSHIMA, E. R. Avaliação do processoinflamatório crônico granulomatoso induzidoexperimentalmente através da inoculação de BCG empeixes da espécie Oreochromis niloticus – Tilápia doNilo. 1994. 120 f. Tese (Doutorado em Patologia) –Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,Universidade de São Paulo, São Paulo, 1994.

7 COLORNI, A. et al. Histopathology of sea bass(Dicentrarchus labrax) experimentally infected withMycobacterium marinum and treated with streptomycin

and garlic (Allium sativum) extract. Aquaculture, v. 160,n. 1-2, p. 1-17, 1998.

8 RAMOS, P. Granulomatose visceral em dourada(Sparus aurata L.) de presumível etiologiamicobacteriana. Revista Portuguesa de CiênciasVeterinárias, v. 95, n. 536, p. 185-191, 2000.

9 ABERNETH, C. S.; LUND, J. E. Mycobacteriosis inmountain whitefish (Prosopium williamsoni) from theYakima River. Journal of Wildlife Disease, v. 14, n. 3,p. 333-336, 1978.

10 GOODWIN, A. E.; GRIZZLE, J. M. Granulomatousinflammation and monstrous giant cells in response tointraperitoneal hormone implants in channel catfish(Ictalurus punctatus). Journal of Comparative Pathology,v. 104, n. 2, p. 149-160, 1991.

11 XAVIER, J. G.; MATUSHIMA, E. R. Estudocomparado do processo inflamatório em teleósteos:inflamação crônica induzida por BCG em Corydoranattereri. In: REUNIÃO ANUAL DA FEDERAÇÃO DESOCIEDADES DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL, 7.1993, Caxambu. Anais... Caxambu: [s. n.], 1993. p. 22.

12 GOMÉZ, S. Unusual morphopathological featuresin case of fish tuberculosis. Journal of Fish Diseases, v.21, n. 3, p. 137-141, 1998.

13 TALAAT, A. M. et al. Pathogenicity of Mycobacteriumsmegmatis to goldfish, Carassius auratus. VeterinaryMicrobiology, v. 66, n. 2, p. 151-164, 1999.

14 HOWARD, S. T.; BYRD, T. F. The rapidly growingmycobacteria: saprophytes and parasites. Microbes and

64


Infection, v. 2, n. 15, p. 1845-1853, 2000.

15 WEDEMEYER, G. Stress of anesthesia with MS-222and benzocaine in rainbow trout (Salmo gardineri).Journal of the Fisheries Research Board of Canadá, v.27, n. 5, p. 909-914, 1970.

16 FERREIRA, J. T. et al. Comparison of anestheticpotency of benzocaine hydrochloride and MS-222 intwo freshwater fish species. The Progressive FishCulturist, v. 41, n. 3, p. 161-163, 1979.

17 LUNA, L. G. Histopathologic methods and coloratlas of special stains and tissue artifacts. Maryland:Jhonson Printers, 1992. p. 88-312.

18 GOMÉZ, S. et al. Fish mycobacteriosis:morphopathological and immunocytochemicalaspects. Journal of Fish Diseases, v. 16, n. 2,p. 137-141, 1993.

19 FINN, J. P.; NIELSEN, N. O. The inflammatoryresponse of rainbow trout. Journal of Fish Biology, v.3, p. 463-478, 1971.

20 TIMUR, M.; ROBERTS, R. J.; MCQUEEN, A.Carrageeenin granuloma in the plaice (Pleuronectesplatessa); a histopathological study of chronicinflammation in a teleost fish. Journal of ComparativePathology, v. 87, n. 1, p. 89-96, 1977.

21 REGO, A. A. M. S. Avaliação histológica,imunohistoquímica, ultraestrutural e filogenética daresposta inflamatória induzida experimentalmente peloBCG em peixes do gênero Poecilia (Molinésia). 1999.105f. Dissertação (Mestrado em Patologia) – Faculdadede Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade deSão Paulo, São Paulo, 1999.

22 NASH, K. A.; FLETCHER, T. C.; THOMSON, A. W.Migration of fish leucocytes in vitro: the effect of factorswich may be involved in mediating inflammation.Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 12,n. 1-4, p. 83-92, 1986.

23 HEDRICK, R. P.; MCDOWELL, P.; GROFF, J.Mycobacteriosis in cultured striped bass from California.Journal of Wildlife Diseases, v. 23, n. 3, p. 391-395,1987.

24 NOGA, E. J.; WRIGHT, J. F.; PASARELL, L. Chronicinflammatory cells with epithelial cell characteristics inteleost fishes. Veterinary Pathology, v. 26, n. 5, p. 429-437, 1989.

25 HUIZINGA, H. W.; NADAKAVUKAREN, M. J.Cellular response of goldfish, Carassius auratus (L.), tometacercarie of Ribeiroia marini (Faust & Hoffman,1934). Journal of Fish Diseases, v. 20, n. 6, p. 401-408, 1997.

26 CHINABUT, S. Mycobacteriosis and Nocardiosis.In: WOO, P. T. K.; BRUNO, D. W. Fish diseases anddisorders. London: CAB Publishing, 1999. v. 3,p. 319-340.

27 KENT, M. L. et al. Ichthyophonus andMycobacterium-like bacterial infections incommercially-important rockfish, Sebastes ssp., in theeastern North Pacific Ocean. Journal of Fish Disease,v. 24, n. 7, p. 427-431, 2001.

28 RADHAKRISHMAN, V. V. et al. Immunohistochemicaldemonstration of mycobacterial antigens in intracranialtuberculoma. Indian Journal of Experimental Biology, v.29, n. 7, p. 641-644, 1991.

29. CARABIAS, E. et al. Evaluation of animmunohistochemical test with polyclonal antibodiesraised against mycobacteria used in formalin-fixed tissuecompared with mycobacterial specific culture. ActaPathologica, Microbiologica, et ImmunologicaScandinavica, v. 106, n. 3, p. 385-388, 1998.

30 FALK, S.; TAKESHITA, M.; STUTTE, H. J. Epithelioidgranulomatosis with initial and predominantmanifestation in spleen. Morphological andimmunohistoquemical analysis of six cases. VirchowsArchiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology,v. 414, n. 1, p. 69-76, 1988.

31 MULLER, H.; TAKESHITA, M. In situimmunophenotype of macrophages and lymphocytesin granuloma formation of tuberculous lynphadenitisin HIV infected and immunocompetentpatients. Research in Virology, v. 142, n. 2-3, p. 159-172, 1991.

32 MOMOTANI, E. et al. Immunohistoquemicaldistribution of S100 alpha-positive cells in bovinemycobacterial and non-mycobacterial granulomas.Journal of Comparative Pathology, v. 108, n. 3, p.291-301, 1993.

33 GODWIN, A. E.; GRIZZLE, J. M. Granulomatousinflammation and monstrous giant cells in response tointraperitoneal hormone implants in channel catfish(Ictalurus punctatus). Journal of Comparative Pathology,v. 104, n. 2, p. 149-160, 1991.

Documents

Avaliação histopatológica, imuno-histoquímica e ultra