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Expressão imuno histoquímica da via de sinalização APC/GSK3beta-catenina no tecido do adenoma colorretal
Autores: Mariane Antonieta Menino Campos , Hélio José Fragoso,
Vivian Sati Oba Bourroul, Tiago Simão Gomes, Rogério Tadeu Palma
Celina Tizuko Fujiyama Oshima e Jaques Waisberg
CICI – CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DO IAMSPE
Adenoma ColorretalMenos de 10% dos adenomas colorretais progridam para o adenocarcinoma.Maioria dos CCR surge a partir dos pólipos adenomatosos (adenomas) do epitélio colorretal. Características do adenoma que levam à maior oportunidade de desenvolvimento do CCR são:• tamanho maior 1 cm, • histologia predominantemente vilosa ou tubulovilosa e • presença de adenomas múltiplos ou de displasia de alto grau.
Wong HL, Peters U, Hayes RB, Huang WY, Schatzkin A, Bresalier RS, Velie EM, Brody LC. Polymorphisms in the adenomatous polyposis coli (APC) gene and advanced colorectal adenoma risk. Eur J Cancer. 2010;46:2457-66.
APC
O gene APC abrange 108.352 pares de bases na posição 21q do cromossomo 5 e possui 21 éxons que codificam uma proteína com múltiplos domínios funcionais que interagem com os reguladores de proliferação e apoptose. O produto do gene APC, a proteína APC, é uma proteína de ligações multiregionais.
Buongiorno P, Pethe VV, Charames GS, Esufali S, Bapat B. Rac1 GTPase and the Rac1 exchange factor Tiam1 associate with Wnt-responsive promoters to enhance beta-catenin/TCF-dependent transcription in colorectal cancer cells. Mol Cancer. 2008;30;7:73
APC• É aceito que o gene APC é gene supressor de tumor, isto é, a
inativação de ambas cópias é necessária para conferir as alterações de fenótipo consistente com a hipótese de dois hits de Knudson, que postula que a inativação de um gene supressor de tumor ocorre somente a partir de dois eventos mutacionais independentes e, certamente, a mutação bi-alélica do APC pode ser detectada nos tumores intestinais precoces.
Knudson AG. Hereditary cancer: two hits revisited. J Cancer Res Clin Oncol.1996;122(3):135-40.
GSK3 cateninaβA proteína GSK3β (glycogen synthase kinase 3 beta) é uma serina/treonina multifuncional e foi descrita como participante de várias vias de regulação em células de mamíferos, incluindo resposta celular na via Wnt. No entanto, esta característica multifuncional acaba por despertar importante discussão com relação à seletividade, uma vez que a sua inibição é desejável em alguns contextos e acaba por ser desastrosa em outros. Portanto, em condições fisiológicas, a proteína GSK3β fosforila e degrada fatores de transcrição e oncoproteínas o que induz à conclusão de que esta enzima seria fator supressor no desenvolvimento de tumores, interferindo negativamente na sinalização oncogênica.Estudos mostraram que o aumento da atividade da GSK3β é característica frequente em neoplasias gastrintestinais.
Buongiorno P, Pethe VV, Charames GS, Esufali S, Bapat B. Rac1 GTPase and the Rac1 exchange factor Tiam1 associate with Wnt-responsive promoters to enhance beta-catenin/TCF-dependent transcription in colorectal cancer cells. Mol Cancer. 2008;30;7:73
Detectar e avaliar a imunoexpressão da proteína GSK3βcatenina e APC não mutada pelo método imuno-histoquímico no adenoma colorretal.
Materiais e Métodos
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Assistência Médica ao Servidor Público Estadual de São Paulo (IAMSPE) (parecer no 043/09) e pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola Paulista de Medicina da Universidade de São Paulo (EPM-UNIFESP) (parecer no
815/09) e obedeceu às normas da Declaração de Helsinki de 1964 e emendada em 1986.
Casuística
Analisaram-se 53 doentes com adenoma colorretal. Os doentes com adenoma colorretal foram submetidos à remoção da lesão por colonoscopia no Setor de Endoscopia da Faculdade de Medicina do ABC (Santo André, São Paulo, Brasil).
Grupo 1: Cinqueta e três doentes foram submetidos ao grupo em que foi realizada análise da expressão da proteína APC
Grupo 2: A análise da expressão da proteína GSK3β foi realizada em 46 de 53 doentes, seis (11,5%) casos foram considerados inconclusivos durante análise das lâminas e foram excluídos do estudo.
Foram obtidas as características clínicas da amostra para todos os grupos de indivíduos. Nos doentes com adenoma colorretal foram registradas as características morfológicas da lesão (localização, tamanho ao longo do maior eixo, tipo histológico e grau de atipia celular).
Estudo Histológico
• Amostras fixadas em formalina 10% e processadas em parafina
• Lâminas coradas com hematoxilina-eosina(HE), para confirmação de diagnóstico
Construção da TMA• O bloco de TMA foi elaborado usando aparelho de Beecher™
(Beecher Instruments, Silver Spring, MD, EUA)• Etapas:
1- marcação da área selecionada no respectivo bloco de parafina;2- construção da "casela" no bloco receptor;3- extração de 1 mm de tecido do bloco doador da área de interesse previamente selecionada;4- obtenção do tecido do cilindro de transferência a partir de bloco doador e sua colocação na "casela" anteriormente criada no bloco receptor;5- progressão para as novas posições dentro do bloco receptor criando assim, um conjunto de amostras de tecido em matriz e avaliação da qualidade do bloco final para o armazenamento.
Estudo Imuno-histoquímico
• Lâminas pré-tratadas, desparafinizadas com xilol e etanol
• O anticorpo primário utilizado foi o anticorpo de coelho policlonal primário anti-GSK3β (H-76), lote B1009 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) em concentração de 1:100 e a incubação foi realizada numa câmara úmida a 4°C durante, pelo menos, 16-18 horas. Também foi utilizado o anticorpo policlonal primário de coelho anti-APC C-20 (lote C1709) (Santa Cruz Biothecnology Inc., CA, EUA) que detecta a proteína APC não mutada
• O escore ou pontuação final variou entre 0 e 12 e foi obtido pela multiplicação dos escores de intensidade e positividade.
Escore: 0 a 8 foi considerado reduzido 9 a 12 foi considerado forte.
• Positividade das lâminas:Grau 0: quando menos que 5% das células epiteliais foram imunocoradas; Grau 1, com 5 a 25% das células epiteliais imunocoradas; Grau 2, com 26 a 50% das células epiteliais imunocoradas; Grau 3, com 51 a 75% das células epiteliais imunocoradas eGrau 4, quando mais que 75% das células epiteliais foram imunocoradas.
• Intensidade:Grau 0 (zero) se negativa; Grau 1 (um), intensidade fraca; Grau 2 (dois), intensidade moderada e Grau 3 (três), intensidade forte.
Análise Estatística• Resultados quantitativos foram descritos como média e desvio
padrão. Os dados qualitativos foram descritos como frequência• Correlação de Spearman: escores de imunoexpressão da proteína
GSK3β e APC• Teste t Student: significância de parâmetros clinico-patológicos• Testes do qui-quadrado e de Mann-Whitney: demais parâmetros• Testes de qui-quadrado e Exato de Fischer: associação da
positividade na marcação das proteínas• A análise de regressão logística (ANOVA) univariada e a análise
multivariada foram adotadas para identificar as variáveis dependentes e independentes.
• Adotou-se nível de significância de 5% (p ≤ 0,05). Para o cálculo estatístico foi utilizado o programa SPSS, versão 15.0 (The Predictive Analytics Company, Chicago, IL, EUA).
Os 71 adenomas removidos dos 53 doentes: Localização: 64 (90,1%) cólon descendente, sigmóide ou reto 7 (9,9%) cólon ascendente ou no transverso
Tipo histológico: 49 (69%) tubulares 22 (31%) lesões e tubulovilosos
Atipia: 39 (55%) leve 32 (45%) não mostraram atipia.
No estudo imuno-histoquímico foram excluídos 18 adenomas de doentes com mais de um adenoma analisado.
A positividade da expressão imuno-histoquímica da proteína APC e GSK3β observadas no citoplasma dos 53 adenomas colorretais estudados são descritas nas tabelas 1 e 2.
Quando se comparou a imunoexpressão da GSK3-β entre os subtipos de adenomas (tubular e túbulo-viloso) observou-se que houve diferença significante (p=0,0002).
Tabela 6 – Percentagem da intensidade de imunocoloração com cut-off de 50% de células coradas pelo anticorpo GSK3β no adenoma.
• O encontro da maior expressão da proteína APC mutada no tecido do adenoma colorretal pode indicar que o gene APC participa das alterações do processo da sequência adenoma-carcinoma da carcinogênese colorretal.
• Houve diferenças na imunoexpressão da proteína GSK3β nos adenomas e na mucosa colorretal não neoplásica adjacente ao carcinoma.
• A expressão da proteína GSK3β catenina foi mais acentuada no adenoma tubular do que no adenoma túbulo-viloso.
