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ANÁLISES DE CROMOSSOMOS MITÓTICOS
Histórico dos Estudos em Cromossomos
• Fim Século XIX 1º idéias cromossomos: estudos mitose (divisão celular).
• Flemming (1882) termo mitose, divisão mitótica foi mais bem estudada em animais e vegetais.
• Weismann (1887) a partir de seus trabalho, relação com a herança
• Redescobrimento das leis de Mendel (1900), “Teoria cromossômica da herança” por Sutton e Boveri em 1902.
• Conseqüência: citologia e a genética sobrepõem seus conhecimentos na área denominada CITOGENÉTICA.
CITOGENÉTICA: compreende todo e qualquer estudo relativo ao cromossomo isolado ou em conjunto, condensado ou distendido, tanto no que diz respeito a sua morfologia, organização, função e replicação, quanto a sua variação e evolução.
(Guerra, 1988)
Análise de Cromossomos
• Células em divisão → Mitose
• Metáfase → cromossomos com grau máximo de condensação
• Tecidos de crescimento rápido → sangue, medula óssea, rins, etc.
Técnica de Obtenção de Cromossomos
• Obtenção Direta → extração do tecido
• Obtenção Indireta → cultura de células
TÉCNICA IN VITRO:
Cultura de linfócitos
Coleta do sangue
- Separação do sangue em 3 fases:
Hemáceas
Papa leucocitária
Região Líquida
Sangue semeado no meio de cultura
- Aplicar a papa leucocitária - Meio de cultura contendo fitohemaglutinina- Estimula crescimento de linfócitos T
Meio + sangue naestufa
- 3 dias de crescimento em estufa a 37ºC- Estímula divisão celular
Material na estufa 37oC
Aplicação de Colchicina:- “Antimitótico”- Impede ligação do fuso mitótico- Célula não sofre divisão
Aplicação de Solução Hipotônica:
- Osmose- Aumenta tamanho da célula- Mais fácil de espalhar e visualizar o material
Preparo do material para centrifugação
Fixação:
- Solução de álcool + ácido acético = FIXADOR
- Limpa o material
- Fixa a célula na fase desejada
Montagem de Cariótipos
a
m
st
sm
Cariótipo – grego = cerne (conteúdo do núcleo)- Disposição dos cromossomos recortados
OrdemTamanhoFormato dos cromossomos
Formato dos Cromossomos
Centrômero
Braço curto (p)Francês - petite
Braço longo (q)Letra seguinte do alfabeto
Classificação dos Cromossomos
TIPO CROMOSSÔMICO RAZÃO DE BRAÇOS
Metacêntrico (m) RB = 1,00 – 1,70
Submetacêntrico (sm) RB = 1,71 – 3,00
Acrocêntrico (a) RB = 3,01 – 7,00
Telocêntrico (t) RB > 7,01
Razão de braços – q/p
Classificação dos Cromossomos
- Metacêntrico: possui braços aproximadamente do mesmo tamanho; - Submetacêntrico: possui um dos braços menor que o outro;- Acrocêntrico: possui um dos braços muito pequeno em relação ao outro;- Telocêntrico: possui apenas um braço, pois o centrômero se localiza na
extremidade do filamento do cromossomo.
Avestruz : 2n= 22
Sapo: 2n = 26
Peixe : 2n = 56
Vegetal 2n = 16
Cariótipo Humano
Grupo A: (cromossomos 1, 2 e 3), meta e submetacêntricos
Grupo B: (cromossomos 4 e 5), submetacêntricos
Grupo C: (cromossomos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e cromossomo X), submetacêntricos
Grupo D: (cromossomos 13, 14 e 15), acrocêntricos
Grupo E: (cromossomos 16, 17 e 18) submetacêntricos
Grupo F: (cromossomos 19e 20), metacêntricos
Grupo G: (cromossomos 21, 22 e cromossomo Y), acrocêntricos
BANDAMENTOS
CROMOSSÔMICOS
Qual a importância dos bandamentos cromossômicos?
• Os bandamentos cromossômicos ampliaram em muito os horizontes da citogenética, sendo primeiramente utilizados para auxiliar no pareamento.
• Em um segundo momento, as diferentes técnicas de bandamento passaram a auxiliar na detecção de rearranjos (duplicações, deleções, inversões, translocações) que dificilmente seriam detectados com a técnica convencional.
Por exemplo:- Humano: identificar alterações entre cromossomos do grupo D distinguir a trissomia do 21 da trissomia do 22
- Evolução: Cariótipo Humano X Primatas (chimpanzé, gorila e orangotango)
• Bandamento NOR
• Bandamento – C
• Bandamento – G
• Bandamento – R
• Bandamento – Q
Colocação Convencional por Giemsa
- Gustav Giemsa
- Tipo de coloração mais comum
- Não é intercalante de DNA, cora na sua totalidade
- Técnica utilizada para visualizar forma e número de cromossomos
Bandamento - G
- Corante Giemsa
- Essa técnica é a mais utilizada entre os bandamentos
Permite visualizar as regiões que se condensam mais cedo durante a prófase (regiões escuras) e possuem uma constituição AT-rica, enquanto os segmentos negativos para banda-G (regiões claras) são condensados tardiamente na prófase e são ricos em bases GC.
Genes Housekeeping X Genes Tecido-específicos
Cariótipo G – bandado
Banda G - morcego
Bandamento - Q
- Essa foi a primeira técnica de bandeamento, a qual foi descrita por Caspersson et al. (1968) para cromossomos humanos
- Essa técnica utiliza corantes fluorescentes para induzir o bandeamento
- O primeiro fluorocromo utilizado foi a quinacrina mostarda, o qual deu o nome para a técnica
- O padrão de bandas – Q está relacionado ao padrão de replicação do DNA - SEMICONSERVATIVO
Cariótipo Q – bandado
Bandamento - R
-Também conhecido por Banda Reversa
- Esse bandeamento ocorre devido ao tratamento do material em alta temperatura, o que induz a desnaturação de proteínas e do DNA de constituição AT-rica, mantendo o DNA GC-rico com a configuração original
- O padrão de bandamento é revelado devido a maior interação do corante às regiões desnaturadas (AT-rica)
- Pode ocorrer a utilização tanto de corantes fluorocromos (acridina laranja) como de convencional (Giemsa)
Bandamento - NOR
- As regiões cromossômicas associadas ao nucléolo.
- Cada organizador nucleolar corresponde a um agrupamento de genes de rRNA repetidos em tandem em um cromossomo.
- A concentração dos genes de rRNAs em tandem, juntamente com a transcrição intensiva dos mesmos, são responsáveis pela criação da morfologia característica dos nucléolos
RONs: impregnação pelo nitrato de prata, não é específico ao DNAr, mas às proteínas acídicas (pré-rRNA) Atividade gênica
Impregnação pelo nitrato de prata - Humano
RON - roedor
RON - Morcego
Bandamento - C
- Este tipo de Bandamento mexe com a estrutura dos cromossomos, devido a uma série de banhos que são feitos na lâmina.
- O padrão de bandas evidencia as regiões de heterocromatina constitutiva presente na espécie.
• Banda C de cariótipo humano
Cariótipos de Astyanax fasciatus submetido ao bandamento C
Fluorocromos
- Corantes fluorescentes.
- Corantes podem marcar regiões específicas; utilizar sondas específicas, etc.
- Visualizados em comprimentos de onda específicos.
Eyprepocnemis plorans – gafanhoto (DAPI)
CromomicinaA3
DAPI
Rineloricaria latirostris – 12 cm
• Sonda Telomérica em humanos