Estudos citogenéticos em três espécies do gênero Astyanax ... · A citogenética compreende o estudo dos cromossomos quanto à morfologia, organização, função, variação

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Estudos citogenéticos em três espécies do gênero Astyanax,

com ênfase no DNA ribossomal

CARLOS ALEXANDRE FERNANDES

MARINGÁ

2006

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Estudos citogenéticos em três espécies do gênero Astyanax,

com ênfase no DNA ribossomal

CARLOS ALEXANDRE FERNANDES

Tese de Doutorado apresentada ao

Programa de pós-graduação em

Ciências Biológicas da

Universidade Estadual de Maringá,

como parte dos requisitos para a

obtenção do título de Doutor em

Ciências Biológicas, área de

concentração Biologia Celular.

MARINGÁ

2006

Professora Dra. Isabel Cristina Martins dos Santos

(ORIENTADORA)

Dedico ao meu pai,

minha mãe e a Day

que sempre me

apoiaram.

Agradecimentos

Agradeço a todos a pessoas que direta e indiretamente contribuíram para a

realização desta Tese de Doutorado, principalmente:

A Universidade Estadual de Maringá por ter-me dado a formação acadêmica e

propiciado a chance de fazer pós-graduação na área de Biologia Celular para que eu

possa melhorar meus conhecimentos nesta área, a fim de alcançar meus objetivos

futuros.

A Professora Doutora Isabel Cristina Martins-Santos por ter me aceitado como

orientando e de ter dado todo atendimento necessário para o desenvolvimento da

pesquisa na área de Citogenética de Peixes e a CAPES por ter financiado a pesquisa.

A graduanda Ana Paula de Santi por ter me ajudado e dado toda a atenção no

início da pesquisa, quando eu ainda estava no Mestrado, ajudando-me a aprender e

desenvolver as técnicas experimentais.

A todos os amigos do laboratório que sempre estiveram dispostos a ajudar e

participar das coletas de peixes.

Aos Professores Doutores, Horácio e Ana Luiza por sempre estarem dispostos a

tirar dúvidas, dar dicas e opiniões referentes ao trabalho.

A todos sem exceção do laboratório de Citogenenética de Peixes que sempre

estavam dispostos a ajudar de alguma forma.

A Ana Cristina Petry e Fernando Pelicice pela valorosa ajuda na revisão dos

manuscritos em inglês.

Em especial a minha namorada Dayani Bailly que sempre esteve a disposição

para ajudar no que fosse preciso, dando conselhos e opiniões, participando das

pescarias, da revisão do manuscrito e mesmo nos momentos mais difíceis dando apoio

para não desistir e continuar na pesquisa.

Ao meu pai e minha mãe por sempre me apoiarem durante os anos de pós-

graduação.

A Deus por ter me dado saúde e disposição para a realização desta Tese.

Sumário

1 Introdução geral e objetivos................................................................................ 1

2 Revisão bibliográfica ........................................................................................... 3

2.1 Considerações gerais sobre citogenética de peixes, com ênfase no gênero

Astyanax................................................................................................................... 3

2.2 DNA ribossomal: uma pequena revisão...................................................... 4

3 Material e métodos ............................................................................................ 10

3.1 Espécies estudadas e locais de coleta......................................................... 10

3.2 Preparação dos cromossomos mitóticos.................................................... 10

3.3 Identificação dos cromossomos ................................................................. 11

3.4 Banda C ..................................................................................................... 11

3.5 Regiões organizadoras de nucléolo ........................................................... 12

3.6 Cromomicina A3 (GC-específico) .............................................................. 12

3.7 Extração do DNA genômico. ..................................................................... 13

3.8 Amplificação do DNAr 18S por PCR........................................................ 14

3.9 Amplificação do DNAr 5S por PCR ......................................................... 15

3.10 Marcação das sondas 18S e 5S .................................................................. 17

3.11 Hibridação in situ por fluorescência (FISH)............................................. 17

3.12 Método para localização seqüencial das NORs em lâminas previamente

tratadas por FISH ................................................................................................. 20

3.13 Processamento das imagens ...................................................................... 20

4 Referências bibliográficas ................................................................................. 21

5 Artigos ............................................................................................................... 29

5.1 Capítulo I - Mapeamento dos genes RNA ribossomais 18S e 5S em

Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei, Characidae) da bacia do

alto rio Paraná....................................................................................................... 29

5.2 Capítulo II - Localização cromossômica dos genes RNAr 18S e 5S em três

citótipos simpátricos de Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae) da

bacia do rio Ivaí, Estado do Paraná, Brasil.......................................................... 41

5.3 Capítulo III - Caracterização citogenética em Astyanax fasciatus

(Teleostei, Characiformes) da bacia do alto rio Paraná por Giemsa, Ag-NOR,

banda-C e FISH..................................................................................................... 55

6 Conclusões ......................................................................................................... 66

Resumo

A localização cromossômica do DNAr 18S e 5S tem contribuído no

entendimento da organização do genoma em peixes. Os sítios ativos de DNAr 45S

mostram uma coincidência posicional com as regiões organizadoras de nucléolo

(NORs) nos cromossomos, enquanto os cistrons de DNAr 5S não estão presentes nas

NORs. Além disso, o DNAr 18S tem revelado variações numéricas e posicionais intra-

e inter-populacionais, enquanto o DNAr 5S tem-se mostrado extremamente conservado

mesmo entre organismos filogeneticamente distantes. Buscando melhor compreender as

NORs, assim como, o padrão de distribuição dos sítios de DNAr 18S e 5S, foram

investigadas espécies do gênero Astyanax, com ênfase em A. scabripinnis, A.

altiparanae e A. fasciatus, espécies relativamente comuns de pequenos peixes

amplamente distribuídos em rios neotropicais. Para alcançar tal objetivo, foram

empregadas técnicas de coloração por nitrato de prata, cromomicina e hibridação

fluorescente in situ. Para os espécimes de A. fasciatus também foram realizados estudos

do cariótipo e da heterocromatina constitutiva. No total, seis populações foram

analisadas, sendo quatro para A. altiparanae, uma para A. fasciatus e uma para A.

scabripinnis, sendo que esta última revelou três citótipos diferentes. O DNAr 18S

revelou variações numéricas e posicionais entre os indivíduos da mesma espécie e entre

as espécies diferentes, enquanto o DNAr 5S mostrou o mesmo padrão de distribuição

entre os indivíduos da mesma espécie e entre os espécimes de A. fasciatus e A.

scabripinnis. A localização cromossômica variável do DNAr 18S e a conservada do

DNAr 5S foram atribuídas a posição destes sítios no cromossomo. Alguns autores

descrevem que a proximidade das regiões teloméricas dentro do núcleo interfásico

facilitaria transferência de material genético. Portanto, a localização terminal dos sítios

de DNAr 18S das espécies analisadas poderia facilitar eventos de transferência,

enquanto a localização intersticial dos sítios de DNAr 5S poderia não sofrer esta

influência. As técnicas de nitrato de prata, cromomicina e hibridação fluorescente in situ

com sonda de DNAr 18S revelaram presença de NOR múltipla para as espécies de

Astyanax analisadas, indicando ser uma característica comum do grupo. A constituição

cariotípica e o padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva dos espécimes de

A. fasciatus corroboram com os dados descritos para esta espécie na bacia do alto rio

Paraná.

Abstract

Chromosomal location of the 18S and 5S rDNA have contribute toward a better

understanding of fish genome organization. 45S rDNA active sites show a positional

coincident with NORs in chromosomes, while 5S rDNA not be present in the NORs.

Moreover, 18S rDNA have shown intra and interpopulation numerical and positional

variations, while the 5S rDNA have shown to be extremely conserved even among

organism phylogenetically distants. In order to better understand the NORs, as well the

distributional pattern of 18S e 5S rDNA sites, species of the genus Astyanax were

investigated, with emphasis in A. scabripinnis, A. altiparanae and A. fasciatus, small-

size fish species widely distributed in neotropical rivers. To reach such objective,

techniques of coloration with silver nitrate, chromomycin and fluorescence

hybridization in situ were employed. For A. fasciatus specimens, studies of karyotype

and constitutive heterochromatin also were carried out. A total of six populations were

analyzed, being four of A. altiparanae, one of A. fasciatus and one of A. scabripinnis,

being the latter revealing three different cytotypes. The 18S rDNA revealed numerical

and positional variations among individuals of the same species and among species,

while the 5S rDNA showed the same distributional pattern between A. fasciatus and A.

scabripinnis specimens and among the studied species. Variable chromosomal location

of 18S rDNA and conserved of 5S rDNA were attributed to location of these sites in the

chromosome. Some authors describe that the proximity among telomeric regions within

interphase nucleus would facilitate the transference of genetic material. Therefore,

terminal location of 18S rDNA sites of the analyzed species could facilitate transference

events, while interstitial location of 5S rDNA sites could not suffer this influence. The

techniques of silver nitrate, chromomicin and fluorescence hybridization in situ with

18S rDNA probe revealed presence of multiple NOR for the analyzed species of

Astyanax, indicating a common group characteristic. The karyotypic constitution and

the distribution pattern of constitutive heterochromatin of A. fasciatus specimens

corroborated other findings for this species in the upper Paraná River basin.

Introdução geral e objetivos

1 Introdução geral e objetivos

Os peixes representam o maior grupo dos vertebrados e incluem muitas espécies

de significativo valor comercial. Estima-se que existam mais de 8.000 espécies de

peixes de água doce na América do Sul (Schaefer, 1998). Segundo Böhlke et al. (1978)

foram descritas cerca de 3.000 espécies na América do Sul e os resultados recentes

determinam aproximadamente 2.240 espécies de peixes de água doce para o Brasil

(Abilhoa e Duboc, 2004). O Brasil é um país de proporções continentais, que além de

possuir acima de 8.000 km de regiões costeiras, também apresenta um grande número

de bacias hidrográficas. Desta forma, não é surpreendente que também possua uma

enorme diversidade ictiofaunística. Um grande número de espécies ainda precisa ser

descrito, porém através da interferência antrópica no meio ambiente, muitas espécies

encontram-se ameaçadas de extinção. Uma boa parte dos trabalhos em ictiologia no

Brasil tange à sistemática, em função da enorme quantidade de espécies sendo descritas,

principalmente em água doce, uma vez que a fauna de peixes continentais da América

do Sul pode representar sozinha cerca de 24% de todas as espécies de peixes do planeta

(Vari e Malabarba, 1998). Entretanto, no sentido do conhecimento a respeito do status

das espécies, são fundamentais os estudos de sua biologia e ecologia, ainda incipientes

para a grande maioria dos peixes, principalmente daqueles sem importância econômica.

Dentro deste contexto está o gênero Astyanax, o qual consiste de pequenos peixes

conhecidos no Brasil como lambaris ou piabas, muito importantes no equilíbrio

ecológico existente nos sistemas aquáticos. Neste grupo a maioria das informações

disponíveis tem se concentrado em sistemática e análises citogenéticas e somente

poucos trabalhos têm realizado inferências acerca da organização genômica de genes e

seqüências repetitivas. Dentre estas seqüências repetitivas, destacam-se os genes

ribossomais, o DNAr 45S e o DNAr 5S. O primeiro codifica os RNAr 18S, 5,8S e 28S,

enquanto o DNAr 5S codifica o RNAr 5S. Sítios ativos de DNAr 45S correspondem as

NORs nos cromossomos. As NORs têm sido extensivamente estudadas em peixes e

constituem bons marcadores genéticos, ajudando estudos citotaxonômicos de espécies

relacionadas. Sítios de DNAr 5S não estão presentes na NOR, mas o RNAr 5S faz parte

da subunidade maior dos ribossomos. A evolução do DNA repetitivo é governada por

mecanismos particulares que induzem uma segregação não-Mendeliana destas

seqüências, desempenhando um significativo impacto na diferenciação das populações.

Diante do exposto o objetivo do presente trabalho foi:

Organização do DNAr em Astyanax

2

- Identificar o número e a posição das NORs em relação ao padrão de distribuição

dos sítios de DNAr 18S e 5S em espécies do gênero Astyanax, com ênfase em A.

scabripinnis, A. altiparanae e A. fasciatus. Para alcançar tal objetivo, foram empregadas

técnicas de coloração por nitrato de prata, cromomicina e hibridação fluorescente in

situ. Para os espécimes de A. fasciatus também foram realizados estudos do cariótipo e

da heterocromatina constitutiva.

Revisão bibliográfica

3

2 Revisão bibliográfica

2.1 Considerações gerais sobre citogenética de peixes, com ênfase no gênero

Astyanax

A citogenética compreende o estudo dos cromossomos quanto à morfologia,

organização, função, variação e evolução. Os primeiros estudos citogenéticos em peixes

foram publicados por Retzius e Kateschenko em 1890 (apud Denton, 1973). Contudo,

somente a partir de 1960 os trabalhos de citogenética puderam apresentar dados precisos

a respeito do número e forma dos cromossomos após a descoberta e aplicação dos

tratamentos hipotonizantes para o estudo das células em divisão.

Os peixes neotropicais apresentam uma grande variabilidade cariotípica, tanto

inter quanto intra-específica. Seus números cromossômicos diplóides variam de 2n=20

cromossomos em Pterolebias longipinnis à 2n=132 cromossomos em Corydoras aeneus

(Oliveira et. al., 1988). No Brasil o primeiro trabalho de citogenética de peixes

descreveu o número de cromossomos em Synbranchus marmoratus (Andrea, 1971).

Atualmente são conhecidos os números diplóides e/ou haplóides para aproximadamente

920 espécies neotropicais (Oliveira et. al., 2000).

Astyanax é um gênero relativamente comum, o qual consiste de pequenos peixes

conhecidos no Brasil como lambaris ou piabas, com ampla distribuição geográfica,

compreendendo mais do que cem espécies e subespécies em rios neotropicais (Garutti e

Britski, 1997). Este gênero revela várias formas quase similares, formando um grupo

altamente complexo e sua precisa identificação tem sido difícil (Melo, 2001). Entre as

espécies do gênero Astyanax tem sido observada extensa diversidade cariotípica com

número diplóide variando de 2n = 36 (A. schubarti) a 2n = 50 (A. altiparanae, A.

taeniatus, A. scabripinnis) cromossomos.

A diversidade cariotípica também ocorre entre indivíduos da mesma espécie,

com variações numéricas e estruturais. Estas espécies têm sido tratadas como complexo

de espécies, tais como A. scabripinnis, A. fasciatus e A. altiparanae: no complexo

scabripinnis, o número diplóide varia de 2n = 46, 2n = 48 e 2n = 50 cromossomos

(Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Fernandes e Martins-Santos, 2005); no complexo

fasciatus, o número diplóide varia de 2n = 45 a 2n = 50 cromossomos (Centofante et al.,

2003a) e no complexo altiparanae apesar do número diplóide constante (2n =50


4

cromossomos), são relatadas diferenças na constituição cariotípica, com número

fundamental (NF) variando de 76 a 100 (Fernandes e Martins-Santos, 2004).

Em A. scabripinnis os diferentes números diplóides têm sido relatados em

populações distintas, mas também foram descritos para populações simpátricas e

sintópicas (Souza et al. 1995; Maistro et al., 2000; Fernandes e Martins-Santos, 2005).

As espécies do gênero Astyanax podem sofrer outras variações de número,

devido à presença de cromossomos B. Em A. scabripinnis os cromossomos B aparecem

com maior freqüência, descritos como macrocromossomos (Salvador e Moreira-Filho

1992; Maistro et al. 1992; Mizoguchi e Martins-Santos 1997; Moreira-Filho et al. 2001;

Fernandes e Martins-Santos, 2005) e microcromossomos (Rocon-Stange e Almeida-

Toledo, 1993; Mizoguchi e Martins-Santos, 1997; Alves e Martins-Santos, 2002).

Outras espécies do gênero Astyanax, como A. fasciatus e A. schubarti (Moreira-Filho et

al. 2001) também apresentam macrocromossomo B. O tipo de cromossomo B que tem

predominado nestas espécies é o metacêntrico macrocromossomo, similar em tamanho

ao primeiro par do complemento, porém em A. scabripinnis outros tipos de

macrocromossomos B têm sido relatados (Néo et al., 2000; Ferro et al., 2003;

Fernandes e Martins-Santos, 2005).

Casos de triploidia natural também têm sido identificados em algumas espécies

de Astyanax, como em A. schubarti (Morelli et al., 1983) e A. scabripinnis (Fauaz et al.,

1994; Maistro et al., 1994).

A constatação de variações envolvendo tanto o número quanto à estrutura dos

cromossomos de peixes vem aumentando à medida que se ampliam os estudos

citogenéticos nesses animais. No entanto, já se percebe a necessidade do

desenvolvimento e da aplicação de novas tecnologias voltadas ao estudo cromossômico

de peixes, para auxiliar, juntamente com as técnicas convencionais da citogenética, na

compreensão dos mecanismos de especiação que atuaram e atuam nesse grupo.

2.2 DNA ribossomal: uma pequena revisão

Em eucariotos superiores, o DNAr apresenta genes organizados dentro de duas

famílias multigênicas distintas, compostas de segmentos repetidos em tandem que são

definidos com DNAr 45S e DNAr 5S. O DNAr 45S compreende os genes que

codificam os RNAr 18S, 5.8S e 28S, os quais estão separados por espaçadores

transcritos internos (ITS) e externos (IGS ou ETS) (Figura 1). O IGS é um dos

principais responsáveis pelas diferenças encontradas no tamanho dos cístrons entre


5

espécies distintas. Os ITSs são geralmente ricos em GC (Torres et al., 1990) compostos

de seqüências repetitivas (King, 1991), o que justifica a detecção das regiões

organizadoras de nucléolos através do emprego de fluorocromos GC-específicos e pela

técnica de banda C, respectivamente. Os sítios ativos de DNAr 45S mostram uma

coincidência posicional com as NORs nos cromossomos.

Figura 1. Representação da organização em tandem do DNAr 45S para os RNAr (18S, 5,8S e

28S) e seus espaçadores transcritos internos (ITS) e externos (IGS).

Ao contrário do DNA ribossomal 45S, o DNAr 5S transcreve o RNAr 5S que

migra para o nucléolo e se junta ao RNAr 5,8S e 28S, este DNA é composto de

unidades repetitivas em tandem de aproximadamente 120 pares de bases, intercaladas

por um espaçador não-transcrito (NTS) (Figura 2). A região codificante do DNAr 5S é

extremamente conservada mesmo entre organismos filogeneticamente distantes,

enquanto os NTSs apresentam-se muito heterogêneos, variando de tamanho entre as

espécies (Pendas et al., 1994).

Figura 2. Representação da organização em tandem do DNAr 5S com seus respectivos genes

codificantes (5S) e regiões não transcritas (NTS).

Os clusters do DNAr 45S são usualmente identificados citogeneticamente como

NORs (Long e Dawid, 1980). A análise das NORs representa uma importante

ferramenta para o estudo do cariótipo em peixes. Essas regiões cromossômicas têm

mostrado um comportamento altamente variável nos diferentes grupos de peixes, não

somente em termos de número, localização e tamanho dos cistrons ribossômicos, mas

também em relação a sua atividade gênica.

Gene 5S NTS Gene 5S NTS Gene 5S NTS Gene 5S

IGS DNAr 45S IGS DNAr 45S IGS DNAr 45S IGS

IGS 18S ITS1 5,8S ITS2 28S IGS


6

Em peixes, estudos das NORs têm sido realizados mais freqüentemente com

coloração de nitrato de prata (AgNO3) devido à simplicidade desta técnica, embora esta

metodologia está limitada a detectar apenas as regiões nucleolares que foram ativas na

intérfase precedente (Miller et al. 1976), sendo mais apropriada para estudos de

atividade gênica. Fluorocromos GC-específicos são usados para evidenciar NORs ativas

e inativas em vertebrados inferiores, principalmente em anfíbios e peixes, uma vez que,

sítios ativos de NOR têm mostrado coincidência com bandas cromomicina positivas

(fluorocromo GC-específico), por outro lado estes fluorocromos podem também revelar

outras regiões ricas em GC (Mayr et al., 1986; Schimid e Guttenbach, 1988).

Recentemente a técnica de FISH tem sido empregada para o mapeamento das NORs

através de sondas ribossomais, principalmente através da sonda de DNAr 18S e tem

provado ser a mais eficiente técnica para investigar genes ribossômicos (Long e Dawid,

1980), quase sempre permitindo detectar um maior número de NORs do que por

coloração de prata ou bandeamento por fluorocromo GC-específico.

A localização cromossômica dos genes DNAr 45S e/ou 5S foi descrita para 71

espécies de peixes representando grupos distintos, tais como Acipenseriformes,

Anguilliformes, Characiformes, Cypriniformes, Salmoniformes, Siluriformes,

Perciformes e Tetraodontiformes (Tabela 1). Estes resultados revelam que os genes

DNAr 5S estão localizados em regiões intersticiais dos cromossomos da maioria destas

espécies analisadas, enquanto que o DNAr 45S em regiões teloméricas. A localização

intersticial dos genes DNAr 5S parece representar algum significado relacionado a

distribuição destes genes nos cromossomos de peixes. Segundo Schweizer e Loidl

(1987) a disposição dos cromossomos no núcleo interfásico promove uma proximidade

das regiões teloméricas o que facilitaria transferência de material genético presente

nestas regiões. Portanto, o fato do DNAr 5S não estar localizado em regiões terminais

facilitaria sua conservação dentro do genoma. Ao contrário do DNAr 5S, o DNAr 45S

foi localizado em regiões terminais na maioria dos cromossomos, daí a variabilidade

encontrada tanto intra quanto inter-populacional (Ferro et al., 2001; Souza et al., 2001;

Fontana et al., 2003; Centofante et al., 2003; Jesus e Moreira-Filho, 2003; Hatanaka e

Galetti, 2004; Mantovani et al., 2005).


7

Tabela 1. Dados de localização cromossômica dos DNAr 5S e 45S (dados

principalmente de sondas de 18S) em cromossomos de peixes

Ordens e espécies Nº locus de DNAr 5S

Nº locus de DNAr 45S

Refêrencias

Acipenseriformes Acipenser baerii 4 10-12 Fontana et al., 2003 Acipenser naccarii 4 10-12 Fontana et al., 1999 Acipenser ruthenus 2 6 Fontana et al., 1999 Acipenser ruthenus 2 6-8 Fontana et al., 2003 Acipenser stellatus 2 6-8 Fontana et al., 2003 Acipenser sturio 2 Tagliavini et al., 1999 Acipenser sturio 2 6-8 Fontana et al., 2003 Acipenser transmontanus 4 10-12 Fontana et al., 2003 Huso huso 2 6 Fontana et al., 1998 Huso huso 2 6-8 Fontana et al., 2003

Anguilliformes Anguilla anguilla 2 2 Martinez et al., 1996 Anguilla rostrata 2 2 Nieddu et al., 1998

Salmoniformes Coregonus artedti 2 Sajdak et al., 1998 Coregonus zenithicus 2 Sajdak et al., 1998 Hucho peri 8 3 Fugiwara et al., 1998 Oncorhynchus masou 6 2 Fugiwara et al., 1998 Oncorhynchus mykis 3–4 2 Móran et al., 1996 Salmo salar 2 2 Pendás et al., 1994 Salmo trutta 2 2 Móran et al., 1996 Salvelinus fontinalis 8 42 Fugiwara et al., 1998

Cypriniformes Acheilognathus tabira 4 Inafuku et al., 2000 Carassius auratus auratus 2 Murakami e Fugitani, 1998 Carassius auratus langsdorfi 8-12 Murakami e Fugitani, 1998 Cyprinus carpio 4 Inafuku et al., 2000 Danio rerio 2 6 Phillips e Reed, 2000 Rhodeos ocellatus 2 Kikuma et al., 2000

Characiformes Astyanax altiparanae 2 4 Almeida-Toledo et al., 2002 Astyanax lacustris 2 4 Almeida-Toledo et al., 2002 Astyanax fasciatus 4 6 Almeida-Toledo et al., 2002 Astyanax giton 10 Kavalco et al., 2004 Astyanax intermedius 10 Kavalco et al., 2004 Astyanax parahybae 4 Kavalco et al., 2004 Astyanax scabripinnis 6 Kavalco et al., 2004 Astyanax scabripinnis 6–8 Souza et al., 2001 Astyanax scabripinnis 4 4 Almeida-Toledo et al., 2002 Astyanax scabripinnis 4 2–16 Mantovani et al., 2005 Astyanax scabripinnis 8 4–9 Ferro et al., 2001 Astyanax schubarti 4 4 Almeida-Toledo et al., 2002


8

Tabela 1. (continuação)

Ordens e espécies Nº locus de DNAr 5S

Nº locus de DNAr 45S

Refêrencias

Brycon brevicauda 4 Wasko et al, 2001 Brycon cephalus 4 Wasko et al, 2001 Brycon insignis 4 Wasko et al, 2001 Brycon lundii 4 Wasko et al, 2001 Brycon microlepis 4 Wasko et al, 2001 Brycon orbignyanus 4 Wasko et al, 2001 Brycon sp. 4 Wasko et al, 2001 Bryconamericus aff. exodon 8 Paintner-Marquez et al., 2002 Bryconamericus aff. iheringii 2 Paintner-Marquez et al., 2003 Hoplias malabaricus 2 10 Born e Bertollo, 2000 Hyphessobrycon anisitsi 4-5 10-13 Centofante et al., 2003b Leporinus cf. elongates 4 Martins e Galetti, 2001 Leporinus elongatus 4 Martins e Galetti, 1999 Leporinus friderici 4 Martins e Galetti, 1999 Leporinus obtusidens 4 Martins e Galetti, 1999 Leporinus reinhardti 4 Martins e Galetti, 2001 Oligosarcus hepsetus 4 4 Kavalco et al., 2005 Parodon hilarii 4 2 Vicente et al., 2001 Parodon sp. 4 2 Vicente et al., 2001 Parodon tortuosus 4 2 Vicente et al., 2001 Prochilodus argenteus 3 1–5 Hatanaka e Galetti, 2004 Prochilodus lineatus 2 2–5 Jesus e Moreira-Filho, 2003 Schizodon altoparanae 4 Martins e Galetti, 2000 Schizodon borelli 4 Martins e Galetti, 2000 Schizodon isognathum 4 Martins e Galetti, 2000 Schizodon knerii 4 Martins e Galetti, 2000 Schizodon nasutus 4 Martins e Galetti, 2000 Schizodon vittatus 4 Martins e Galetti, 2000

Siluriformes Harttia loricariformis 2 Kavalco et al., 2004 Hypostomus affinis 8 Kavalco et al., 2004 Neoplecostomus microps 2 Kavalco et al., 2004 Pinirampus pirinampu 2 Swarça et al., 2001 Rhamdia quelen 2 Fenocchio et al., 2003 Upsilodus sp. 4 Kavalco et al., 2004

Perciformes

Centropyge aurantonotus 18 2 Affonso e Galetti, 2005 Centropyge ferrugatus 4 2 Affonso e Galetti, 2005 Coris julis 4 Mandrioli et al., 2000 Chromis insolata 4 Molina e Galetti, 2002 Chromis flavicauda 4 Molina e Galetti, 2002 Ephinephelus marginatus 2 Sola et al., 2000 Micropterus salmoides 2 Deiana et al., 2000 Oreochromis niloticus 4 Martins et al., 2000

Tetraodontiformes Tetraodon fluviatilis 2 Mandrioli e Manacardi, 2001 Tetraodon nigroviridis 2 Fischer et al., 2000


9

Na maioria dos eucariotos, os genes de DNAr 45S estão organizados

separadamente dos genes de DNAr 5S. Em peixes não é diferente, porém locus 45S e

5S sintênicos foram descritos para algumas espécies (Pendas et al., 1994; Móran et al.,

1996; Fugiwara et al., 1998; Inafuku et al., 2000; Phillips e Reed, 2000; Mandrioli et

al., 2000; Almeida-Toledo et al., 2002; Mantovani et al., 2005). Os genes RNAr 45S

são transcritos pela enzima RNA polimerase I, enquanto os genes 5S são transcritos

longe do nucléolo pela enzima RNA polimerase III. Sugere-se que tais divergências

funcionais requereriam posições físicas diferentes entre o DNA 45S e o 5S

(Amarasinghe e Carlson, 1998). Além disso, a conversão gênica e o crossing-over

desigual são mecanismos comuns agindo nos processos de evolução de seqüências

múltiplas em tandem (Dover, 1986). Estes mecanismos poderiam ser mais eficientes

quando os clusters 45S e 5S permanecessem separados em vez de uma configuração

ligada, evitando a desordem, tal como translocação indesejada das seqüências 5S dentro

das seqüências 45S (Martins e Galetti, 1999). Isto poderia explicar porque a maioria de

vertebrados tem estes conjuntos em cromossomos distintos.

Material e métodos

10

3 Material e métodos

3.1 Espécies estudadas e locais de coleta

- Astyanax fasciatus:

Os espécimes foram coletados no córrego das Rosas, um tributário do rio Pirapó,

pertencente a bacia do alto rio Paraná. Localizado próximo a cidade de Maringá, Paraná.

- Astyanax scabripinnis:

Os espécimes foram coletados no córrego Tatupeba (23º29’592”S e

52º01’041”W), um tributário do rio Ivaí, pertencente a bacia do alto rio Paraná.

Localizado próximo a cidade de Maringá, Paraná.

- Astyanax altiparanae:

Os espécimes foram coletados no rio Paraná (região de Porto Rico), córrego

Tatupeba (tributário do rio Ivaí), córrego Keçaba e ribeirão Maringá (tributários do rio

Pirapó), todos pertencentes a bacia do alto rio Paraná. Estes três tributários estão

localizados próximo a cidade de Maringá, Paraná.

3.2 Preparação dos cromossomos mitóticos

Os cromossomos mitóticos foram obtidos de células extraídas do rim, segundo a

metodologia descrita por Bertollo et al (1978), descrito abaixo:

1) Injetar intraperitoniamente colchicina (0,05%) na proporção de 1ml para cada

100g do peso do animal.

2) Deixar o peixe em aquário bem aerado, por 50 minutos.

3) Sacrificar o animal com tesoura, retirando o rim, e quando necessário às

brânquias.

4) Colocar os tecidos retirados em placa de Petri contendo10ml de solução

hipotônica de cloreto de potássio (KCl) a 0,075M.

5) Fragmentar bem o material com o auxilio de pinças de dissecação,

completando-se esse processo com uma seringa hipodérmica desprovida de agulha, para

se obter uma suspensão celular homogênea.

6) Colocar a suspensão obtida a 36-37°C, em estufa, durante 25-30 minutos.

7) Retirar da estufa, ressuspender o material com o auxilio de pipeta Pasteur, e

transferir a solução para um tubo de centrifuga, adicionar 5 a 6 gotas de fixador

(Metanol-Acído Acético, 3:1).


11

8) Centrifugar durante 9 minutos a 900 rpm, descartando o sobrenadante com

pipeta Pasteur.

9) Adicionar, cuidadosamente, 6ml de fixador deixando-o escorrer através da

parede do tubo.

10) Ressuspender o material, cuidadosamente, com o auxilio de pipeta Pasteur,

centrifugar por 10 minutos a 900rpm.

11) Repetir os itens 9 e 10 por mais três vezes.

12) Após a última centrifugação, retira-se o sobrenadante e adiciona 2ml de

fixador, levando a solução para um frasco plástico do tipo Ependorff.

13) Pingar o material em lamina quente ou gelada e aquece-la a 70°C e deixar

secar ao ar.

14) Corar com Giemsa 5%, por 20-30 minutos.

15) Lavar em água corrente e deixar secar ao ar, analisar a lâmina em

microscópio.

3.3 Identificação dos cromossomos

A classificação dos cromossomos foi feita mediante medidas cromossômicas,

com o auxílio de paquímetro, determinando-se o comprimento do braço menor, do braço

maior e o comprimento total de cada cromossomo, calculando os valores médios para

cada par. As medidas cromossômicas serão realizadas apenas nas metáfases escolhidas

para montagem final dos cariótipos. Os cromossomos serão identificados de acordo com

os critérios de relação de braços (RB), propostos por Levan et al (1964), e classificados

como metacêntricos (M: RB = 1.00 a 1.70), submetacêntricos (ST: RB = 1.71 a 3.00),

subtelocêntricos (ST : RB = 3.01 a 7.00) e acrocêntricos (A : RB = maior que 7.01).

3.4 Banda C

Para o estudo da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica de Sumner

(1972) através do bandeamento C, seguindo os procedimentos abaixo:

1) Tratar a lâmina já contendo as gotas do material para análise, com HCl em

temperatura ambiente em estufa, por 15 minutos.

2) Lavar a lâmina em água corrente e secar ao ar.

3) Incubar em solução salina de 2xSSC, a 60°C em banho-maria por 15 minutos.

4) Lavar em água corrente e secar ao ar.

Material e métodos

12

5) Incubar a lâmina por 30 segundos em solução de hidróxido de bário (BaOH),

em banho-maria a 42°C, com o BaOH sendo recém preparado e filtrado.

6) Lavar a lâmina rapidamente em solução de HCl, e depois em água

deionizável, deixar secar ao ar.

7) Incubar a lâmina em solução salina de 2xSSC a 60°C, por 1 hora.


9) Corar com Giemsa 5% durante 5-10 minutos.

10) Lavar em água corrente e secar ao ar, analisar a lâmina em microscópio.

3.5 Regiões organizadoras de nucléolo

A metodologia usada para detecção das regiões organizadoras de nucléolo com

uso de nitrato de prata (AgNO3) foi a técnica de Howell e Black (1980), abaixo descrita:

1) De posse da lâmina já contendo o material para análise, hidrolisá-la por 3

minutos em HCl 1N a 60°C, em estufa.


3) Pingar uma gota de solução aquosa de gelatina em dois pontos distintos da

lâmina, sobre estas gotas adicionar uma gota de água deionizada.

4) Adicionar sobre as gotas anteriores, duas gotas de solução de nitrato de prata

(AgNO3), e cobrir a lâmina com lamínula.

5) Incubar em estufa a 60°C por um período de 3-5 minutos, ou até que a solução

adquira uma coloração caramelada.

6) Lavar em água corrente e secar ao ar, analisar em microscópio.

3.6 Cromomicina A3 (GC-específico)

Foi empregado o método descrito por Schweizer (1980) e modificado por

Schmid (1980), resumido abaixo:

1. Sobre a lâmina, preparada segundo a técnica descrita para cromossomos

mitóticos, colocar 150µl de solução de distamicina A recém preparada,

utilizando-se uma micropipeta.

2. Cobrir com uma lamínula e deixar agindo por 15 minutos em temperatura

ambiente.

3. Lavar a lâmina com tampão McIlvaine (ou água corrente) de modo que a

lamínula deslise e saia da lâmina e deixar secar por poucos minutos.


13

4. Colocar sobre a lâmina 150 µl da solução de cromomicina A3 ou mitramicina A,

com o auxílio de uma micropipeta, sobre a lâmina. Cobri-la novamente com

uma lamínula e deixar corando por 60 minutos, no escuro, a temperatura

ambiente.

5. Repetir o item 3.

6. Montá-la com uma lamínula, utilizando duas gotas de solução de glicerol

(Dabco 2%).

7. Estocar a lâmina à temperatura ambiente ou na geladeira, no escuro, por no

mínimo 15 dias antes de analisá-la (para prolongar o tempo de emissão de

fluorescência desses corantes).

8. Analisar em fotomicroscópio de fluorescência, com filtro de 450-490 nm (zona

de excitação do azul).

3.7 Extração do DNA genômico.

A extração do DNA genômico foi realizada seguindo o protocolo descrito por

Sambrook et al. (1989).

1. Colocar 400µl de tampão pK e 5µl de proteinase K (20 µg/µl) sobre cada

amostra de tecido em um tubo de ependorff.

2. Deixar em banho-maria com agitação com agitação a 42OC por 24 horas.

3. Adicionar fenol/tris (200 µl) pH=8,0 e agitar o extrato vigorosamente por 20

seg. com posterior agitação lenta por 10 min.

4. Adicionar igual volume de clorofórmio/isoamílico (24:1) seguida pela agitação

mencionada anteriormente.

5. Centrifugar a 12000 rpm por 3 min.

6. Retirar o sobrenadante e colocar em um novo tubo e acrescentar

clorofórmio/isoamílico. Agitar e centrifugar como descrito anteriormente.

7. Retirar o sobrenadante, colocar em um tubo novo e acrescentar o dobro de

volume de etanol 100% gelado.

8. Incubar a -200C por 12 horas.

9. Centrifugar a 10000 rpm por 10 min.

10. Descartar o etanol e deixar secar em temperatura ambiente.

11. Ressuspender em 20-50µl de 1/10 de TE + RNAse (2µl de RNAse (10 mg/ml) p/

1 ml de 1/10 de TE diluído 10x). Deixar em banho-maria 370C por 30 min-1h.

12. Deixar em geladeira até o uso.

Material e métodos

14

Antes da amplificação das sondas de DNAr, o DNA genômico extraído foi

quantificado utilizando um DNA lambda de peso molecular conhecido.

3.8 Amplificação do DNAr 18S por PCR

A sonda 18S foi produzida através de PCR usando DNA genômico de Astyanax

scabripinnis e primers específicos (NS1= 5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’ e NS8=

5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’) para amplificação de genes RNAr 18S. A

amplificação de DNA por PCR foi realizada em um termociclador (GeneAmp PCR

system 2400, Perkin Elmer) usando-se os procedimentos descritos por White et al.

1990).

A mistura para a amplificação segue abaixo:

COMPONENTES [ ] INICIAL VOL (µl) [ ] FINAL DNA 100 ng/µl 1 2 ng/µl BUFFER 10X – Tampão MgCl2

15 mM 3,5 1,5

1,5 mM

PRIMERS – NS1 NS8

10 ng/µl 10 ng/µl

3 3

0,6 ng/µl 0,6 ng/µl

DNTPs 1,2 mM cada 8 0,2 mM cada Taq POLIMERASE 5000 U/ml 1 0,1 U/µl AGUA 29

Volume total 50 µl

O programa do termociclador foi o seguinte:

(1) 5 min 94ºC

(2) 1 min 94ºC

(3) 1 min 50ºC

(4) 2,5 min 72ºC

(5) voltar ao passo (2) 30 vezes

(6) 10 min 72ºC

(7) 1h 4ºC

O produto da amplificação foi analisado pela eletroforese em gel de agarose 0,8

% e detectado pela coloração com brometo de etídio (Figura 3).


15

Figura 3. Gel de agarose com os RNAr 18S amplificados por PCR. M = Hind III, os fragmentos

de sonda 18S possuem cerca de 1800 pb.

3.9 Amplificação do DNAr 5S por PCR A sonda 5S foi produzida através de PCR usando DNA genômico de Astyanax

scabripinnis e primers específicos (A= 5’-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3’ e

B=5’-CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3’) descritos por Martins e Galetti (1999)

para amplificação dos genes RNAr 5S e seus espaçadores (NTS). A amplificação de

DNA por PCR foi realizada em um termociclador (GeneAmp PCR system 2400, Perkin

Elmer) usando-se os procedimentos descritos por Pendás et. al. (1994), com ligeiras

modificações.

A mistura para a amplificação segue abaixo:

Material e métodos

16

COMPONENTES [ ] INICIAL VOL (µl) [ ] FINAL DNA 5 ng/µl 4 0,4 ng/µl BUFFER 10X – Tampão MgCl2

15 mM 3,5 1,5

1,5 mM

PRIMERS – A B

10 ng/µl 10 ng/µl

2,5 2,5

0,5 ng/µl 0,5ng/µl

DNTPs 1,2 mM cada 8 0,2 mM cada Taq POLIMERASE 5000 U/ml 1 0,1 U/µl AGUA 27

Volume total 50 µl

O programa do termociclador foi o seguinte:

(1) 5 min 94ºC

(2) 1 min 95ºC

(3) 30 seg 63ºC

(4) 1 min 72ºC

(5) voltar ao passo (2) 30 vezes

(6) 7 min 72ºC

(7) 1h 4ºC

O produto da amplificação foi analisado pela eletroforese em gel de agarose

1,5% e detectado pela coloração com brometo de etídio (Figura 4).

Figura 4. Gel de agarose com os RNAr 5S amplificados por PCR. M = Hind III, os fragmentos

de sonda 5S possuem cerca de 120 pb.


17

3.10 Marcação das sondas 18S e 5S As sondas foram marcadas com Biotina-11-dATP por “nick translation”

conforme especificações do Kit Bionick, Labelling System (Gibco BRL).

1. Em um ependorff adicionar:

- 5 µl dNTP 10X

- 5 µl de mix da enzima 10X

- * µl (1µg) de DNA da sua amostra

- completar até 45 µl com água destilada.

* quantos µl que você deve pegar para dar 1 µg de DNA. Ex: sua

amostra tem 100 ng/µl você deverá pegar 10 µl de sua amostra.

2. Centrifugar por 5 seg. (14000 rpm).

3. Incube a 16ºC por 1 a 2 horas no termociclador.

4. Precipitar com acetato de sódio 3M 1:10, portanto para 45 µl de solução de

reação contendo o DNA colocar 4,5 µl de acetato.

5. Homogeneizar manualmente para não perder sonda antes de colocar o

etanol.

6. Adicionar 2 volumes de etanol 100% gelado.

7. Homogeneizar levemente e colocar no gelo.

8. Precipitar em freezer –80ºC por 15 min. ou –20ºC por 2 horas.

9. Centrifugar por 10 min. a 14000 rpm.

10. Retirar o sobrenadante e deixar o pellet secar.

11. Adicionar 50µl de TE e deixar na geladeira overnight.

12. Repetir os passos 5 a 10 e depois de algumas horas quantificar, ressuspender

em TE e estocar a –20ºC.

3.11 Hibridação in situ por fluorescência (FISH) A hibridação in situ fluorescente (FISH) foi realizada conforme Heslop-Harrison

et al. (1991) e Cuadrado e Jouve (1994), com algumas modificações.

1a ETAPA: Tratamento das lâminas e hibridação in situ

1. Colocar 50µl de RNAse (1:100) em cada lâmina, cobrir com lamínula

plástica e levar para a estufa 37ºC por 1 hora.

2. Lavar as lâminas em 2xSSC por 10 minutos a temperatura ambiente no

agitador (depois de 1-2 min. retirar as lamínulas que estarão boiando).

Material e métodos

18

3. Descartar o 2xSSC na pia e, na mesma cubeta, colocar o paraformaldeído 4%

a temperatura ambiente, por 10 min. no agitador.

4. Descartar o paraformaldeído no vidro de descarte apropriado e colocar

novamente 2xSSC, por 10 minutos, no agitador.

5. Descartar o 2xSSC e colocar álcool etílico 70% por 5 minutos, no agitador.

6. Descartar o álcool 70% e colocar 100% por 5 minutos, não precisa agitar.

7. Descartar o álcool 100% e deixar as lâminas secando por 1 a 3 horas.

8. Neste intervalo preparar a mistura de HIBRIDAÇÃO por lâmina:

Formamida 100% 15µl

Dextran 50% 0,6µl

20xSSC 0,3µl

DNA de bloqueio (timo de bezerro ou placenta) 0,1µl

SDS 10% 0,1µl

Sonda até 0,5µl

Água Até completar 30- 31µl

9. Desnaturar a mistura de hibridação (HIS) a 70° C por 10 minutos em banho-

maria.

10. Incubar no gelo ao menos 5 minutos e no máximo por 2 horas.

11. Colocar 30µl da mistura de HIS por lâmina e cobrir com lamínulas plásticas

e levar para o termociclador: 90° C por 10 minutos; 48° C por 10 min.; 38°C - 5 min. e

37°C até infinito.

12. Colocar as lâminas na câmara úmida a 37° C durante a noite.

13. Colocar as soluções de 2xSSC, 0,1xSSC e 4xSSC 0,2% tween no banho-

maria a 42ºC, durante a noite.

2aETAPA: Banhos pós-hibridização (Sonda DNAr 18S)

1. Tirar as lâminas da estufa, deixando a câmara úmida, e fazer os banhos pós-

hibridação. Preparar a formamida deionizada 20%.

2. Lavar em 2xSSC a 42º C por 5 minutos no agitador e assim que as lamínulas

boiarem, retirá-las da cubeta.

3. Descartar 2xSSC na pia e na mesma cubeta colocar formamida 20% a 42º C,

por 10 min. no agitador.

4. Descartar a formamida em vidro apropriado e colocar na mesma cubeta

0,1xSSC a 42º C por 5 min., no agitador.


19

5. Descartar o 0,1xSSC na pia e na mesma cubeta colocar o 2xSSC a 42º C por

5 min. no agitador.

6. Descartar o 2xSSC na pia e colocar o 4xSSC 0,2% tween a 42º C por 5 min.

no agitador.

7. Descartar o 4xSSC 0,2% tween na pia e colocar o 4xSSC 0,2% tween por 5

min. no agitador, à temperatura ambiente.

2aETAPA: Banhos pós-hibridização (Sonda DNAr 5S)

1. Tirar as lâminas da estufa, deixando a câmara úmida lá, e fazer os banhos

pós-hibridação.

2. Lavar em 6xSSC a temperatura ambiente por 10 (15) minutos no agitador,

assim que as lamínulas boiarem, retirá-las da cubeta.

3. Descartar 6xSSC na pia e na mesma cubeta colocar 6xSSC a temperatura

ambiente, por 10 (15) minutos no agitador.

4. Descartar a solução de 6xSSC e colocar na mesma cubeta 6xSSC a 42º C por

3 minutos, sem agitar.

5. Descartar o 6xSSC na pia e na mesma cubeta colocar o 4xSSC/Tween a

temperatura ambiente por 5 minu. no agitador (OPTATIVO)

3a ETAPA: Detecção da hibridação

1. Retirar a lâmina, e bater cuidadosamente no papel de filtro, e com elas ainda

molhadas pingar 50 µl de BSA 5% por 5 minutos, e cobrir com lamínulas de plástico.

2. Retirar a lamínula sacolejando a lâmina para baixo, se necessário pode ajudar

com a pinça.

3. Colocar a solução de detecção, Avidina-FITC cobrir com lamínula plástica e

incubar a 37º C por 1 hora em câmara úmida.

4. Lavar as lâminas em 4xSSC 0,2% tween por 10 minutos à temperatura

ambiente no agitador, no escuro. Retirar as lamínulas após alguns minutos.

5. Descartar a solução e repetir a mesma lavagem por mais uma vez.

4 a ETAPA: Coloração

1. Retirada as lâminas do 4xSSC 0,2% tween, bater cuidadosamente no papel de

filtro, enxugar em baixo e colocar 25 µl de solução de iodeto de propídio e cobrir com

lamínula de vidro. Retirar o excesso entre papel de filtro.

2. As análises serão feitas em microscópio de epifluorescência, com filtro 450-

490nm (Zona de excitação do azul).

Material e métodos

20

3.12 Método para localização seqüencial das NORs em lâminas previamente

tratadas por FISH

Lâminas previamente tratadas por FISH com sondas de DNAr 18S e 5S foram

desmontadas, lavadas com jatos de água para retirada do meio de montagem e secadas

ao ar. Em seguida foram submetidas ao tratamento para localização das Ag-NORs,

como descrito por Howell e Black (1980), metodologia descrita no item 3.5.

3.13 Processamento das imagens

Os cromossomos metafásicos foram analisados e fotografados em um

microscópio de fluorescência Zeiss Axioskop 2 Plus. As imagens foram capturadas

através de uma câmera digital acoplada ao microscópio pelo software Axiovision. Os

PCRs em gel de agarose foram visualizados e fotografados pelo capturador de imagens

Vilber Lourmat. As pranchas finais com cromossomos metafásicos foram montadas

com o auxílio do programa Adobe Photoshop CS2 e impressas no laboratório

fotográfico Fanny Cine Foto.

Referências bibliográficas

21

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Artigos 29

5 Artigos

5.1 Capítulo I

Mapeamento dos genes RNA ribossomais 18S e 5S em

Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei,

Characidae) da bacia do alto rio Paraná

Fernandes CA and Martins-Santos IC (aceito para publicação) Mapping of

the 18S and 5S ribosomal RNA genes in Astyanax altiparanae Garutti

& Britski, 2000 (Teleostei, Characidae) from the upper Paraná river

basin. Genetics and Molecular Biology.


30

Resumo

A hibridação fluorescente in situ (FISH) foi realizada a fim de determinar o

padrão de distribuição cromossômica dos DNAs ribossomais (DNAr) 18S e 5S em

quatro populações do peixe caracídeo Astyanax altiparanae da bacia do alto rio Paraná.

A FISH com sonda de DNAr 18S revelou variações numéricas e posicionais entre os

espécimes do córrego Keçaba comparados aos espécimes das outras populações. Em

contraste a variabilidade detectada em relação ao padrão de distribuição do DNAr 18S,

um posicionamento cromossômico altamente estável dos sítios de DNAr 5S foi

observado nas quatro populações de A. altiparanae. Divergências entre o padrão de

distribuição dos sítios de DNAr 18S e 5S são discutidos.

Capítulo I

31

Abstract

Fluorescence in situ hybridization (FISH) was undertaken in order to

determinate the chromosomal distribution pattern of 18S and 5S ribosomal DNAs

(rDNA) in four populations of the characid fish Astyanax altiparanae from the upper

Paraná river basin. The FISH with 18S rDNA probe revealed numerical and positional

variations among specimens from Keçaba stream compared to specimens of the other

populations. In contrast to the detected variability regarding to 18S rDNA distribution

pattern, a highly stable chromosomal positioning of the 5S rDNA sites was observed in

the four A. altiparanae populations. Divergences among distribution pattern of sites 18S

and 5S rDNA are discussed.

Key words: Astyanax altiparanae, Fluorescence in situ hybridization (FISH), 18S

rDNA, 5S rDNA, Sequential Ag-NOR

Running title: 18S and 5S rDNA in Astyanax altiparanae


32

Introdução

Em peixes, as regiões organizadoras de nucléolo (NORs) têm sido

extensivamente analisadas por coloração de nitrato de prata (Ag-NOR) devido a

simplicidade desta técnica. Segundo Miller et al. (1976) esta metodologia detecta

somente as regiões nucleolares que foram ativas na intérfase precedente, sendo mais

apropriada para estudos de expressão da NOR. As NORs têm sido melhor

caracterizadas pela hibridação fluorescente in situ (FISH) por determinar a posição do

DNA ribossomal (DNAr) independentemente de sua atividade. Esta metodologia quase

sempre permite detectar um maior número de NORs do que pelo bandeamento Ag-

NOR, demonstrando ser mais precisa para identificação da NOR. O DNAr é organizado

em eucariotos superiores dentro de duas distintas classes gênicas: a classe maior (DNAr

45S) que transcreve os RNA ribossomais (RNAr) 18S, 5.8S, e 28S e a classe menor

(DNAr 5S) que transcreve o RNAr 5S. Sítios ativos de DNAr 45S correspondem as

NORs nos cromossomos, enquanto DNAr 5S não estão presentes na NOR.

Em Astyanax altiparanae (Garutti e Britski, 2000), previamente identificados

como Astyanax bimaculatus para o alto rio Paraná, estudos citogenéticos em diferentes

populações têm mostrado número diplóide constante de 2n = 50 cromossomos, embora

com diferenças na sua fórmula cariotípica e também em relação ao número e posição

das NORs (Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Pacheco et al., 2001; Fernandes e

Martins-Santos, 2004). Múltiplas Ag-NORs têm sido uma característica comum em A.

altiparanae, chegando a alcançar até 10 cromossomos portadores da NOR para um

espécime do rio dos Índios (Fernandes e Martins-Santos, 2004).

No presente estudo, a FISH foi usada com o objetivo de determinar a posição

cromossômica dos sítios de DNAr 18S e 5S em quatro populações de A. altiparanae, a

fim de contribuir para um melhor entendimento da organização do genoma desta

espécie.

Material e métodos

Trinta e um espécimes de A. altiparanae foram coletados na bacia do alto rio

Paraná, sendo 9 no rio principal, 10 no córrego Tatupeba, 4 no córrego Keçaba e 8 no

ribeirão Maringá. Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim

seguindo a metodologia descrita por Bertollo et al. (1978). Os cistrons ribossomais

foram detectados pela técnica de FISH, usando sondas de DNAr 18S e 5S, seguindo o

procedimento descrito por Pinkel et al. (1986), com ligeiras modificações. As sondas

Capítulo I

33

18S e 5S foram obtidas por PCR de Astyanax scabripinnis usando primers NS1 (5’-

GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’) e NS8 (5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’),

segundo White (1990), e primers A (5’-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3’) e B (5’-

CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3’), segundo Martins e Galetti (1999),

respectivamente. A coloração seqüencial com nitrato de prata (Ag-) (Howell e Black,

1980) foi realizada após lavagem da lâmina de FISH na água da torneira. Ao menos 20

metáfases por indivíduo foram examinadas em um microscópio de fluorescência Zeiss

Axioskop 2 Plus. As imagens foram capturadas através de uma câmera digital acoplada

ao microscópio pelo software Axiovision e as pranchas finais com cromossomos

metafásicos foram montadas com o auxílio do programa Adobe Photoshop CS2 e

impressas no laboratório fotográfico Fanny Cine Foto.

Resultados e discussão

As quatro populações revelaram uma constituição macrocariotípica

monomórfica, com 2n = 50 cromossomos (6M, 26SM, 6ST e 12A). Assim, os

espécimes de A. altiparanae dos córregos Keçaba, Tatupeba e ribeirão Maringá

apresentaram idêntica fórmula cariotípica dos espécimes de A. altiparanae do rio

Paraná, previamente estudados por Fernandes e Martins-Santos (2004).

A 18S-FISH revelou sinais fluorescentes espalhados sobre a região telomérica

de 7 cromossomos (no braço curto de 2A e em 5 outros cromossomos) para os

espécimes do córrego Keçaba e na região telomérica de 4 cromossomos (no braço curto

de 2A e em 2 outros cromossomos) para os espécimes do rio Paraná, ribeirão Maringá e

córrego Tatupeba (Figura 1). Almeida-Toledo et al. (2002) também relataram 4

cromossomos marcados (2A e 2M) com sonda de DNAr 28S em espécimes de A.

altiparanae, sendo que nos 2 cromossomos metacêntricos as marcações foram

pericentroméricas. A mesma posição cromossômica do DNAr 45S (18S ou 28S) no

braço curto de 2 cromossomos acrocêntricos de A. altiparanae verificada no presente

estudo e no rio Mogi-Guaçu (Almeida-Toledo et al., 2002) indicam um cromossomo

marcador para esta espécie. Por outro lado, os outros sítios parecem não ter nenhum

grau de conservação entre as populações de A. altiparanae, os quais diferem na posição

(telomérica ou pericentromérica) e nos tipos de cromossomos.

As variações numéricas e posicionais dos sítios de DNAr 18S nos espécimes de

A. altiparanae do córrego Keçaba em comparação com as demais populações aqui

analisadas, também têm sido relatadas em outras espécies, incluindo A. scabripinnis


34

(Ferro et al., 2001; Souza et al., 2001; Mantovani et al., 2005; Fernandes e Martins-

Santos, em preparação) e Prochilodus lineatus (Jesus e Moreira-Filho, 2003). Segundo

Schweizer e Loidl (1987), a proximidade das regiões teloméricas dentro do núcleo

interfásico facilitaria transferência de material genético, de acordo ao modelo de Rabl’s.

Em distintas populações de A. scabripinnis este modelo é sugerido para explicar a

dispersão da heterocromatina em regiões teloméricas (Souza et al., 1996; Mantovani et

al., 2000; Fernandes e Martins-Santos, 2003). Portanto, a posição telomérica dos sítios

de DNAr 18S nas quatro populações de A. altiparanae facilitaria eventos de

transferência, os quais parecem ter ocorrido no caso dos exemplares do córrego Keçaba.

Figura 1 – Metáfases de FISH em Astyanax altiparanae, evidenciando a posição cromossômica

dos sítios de DNAr 18S nas populações do córrego Keçaba (a), rio Paraná (b), córrego Tatupeba

(c), ribeirão Maringá (d). As setas indicam os cromossomos portadores dos cistrons

ribossomais. As cabeças de seta indicam cistrons ribossomais no braço curto de 2 cromossomos

acrocêntricos para as quatro populações.

A coloração seqüencial da lâmina de 18S-FISH de um espécime do córrego

Tatupeba revelou que dentre os 4 cromossomos marcados, 3 foram Ag-NOR+ (Figura

Capítulo I

35

3a, b). Nem todos os cistrons de DNAr existentes são ativos no sistema de NOR

múltipla (Paintner-Marques et al., 2002), portanto esta variação observada no presente

estudo e descrita também em outros trabalhos, provavelmente ocorreu como resultado

da regulação da atividade gênica. Além disso, o heteromorfismo de tamanho da NOR

entre os cromossomos homólogos revelado por 18S-FISH e seqüencial Ag-NOR no

braço curto de 2 cromossomos acrocêntricos (Figura 3a, b) sugerem variação no número

de copias deste DNAr entre os cromossomos homólogos. Este heteromorfismo de

tamanho da NOR pode ter ocorrido por meio de eventos de transposição ou crossing-

over desigual e não devido a expressão diferencial da NOR.

Em contraste a variabilidade detectada em relação ao padrão de distribuição do

DNAr 18S, uma posição cromossômica altamente conservada dos sítios de DNAr 5S foi

observada nas quatro populações de A. altiparanae. A 5S-FISH revelou sinais brilhantes

fluorescentes espalhados sobre regiões intersticiais de um único par cromossômico,

provavelmente um cromossomo submetacêntrico (Figura 2). Considerando que no

presente estudo as seqüências de DNAr 5S não estão localizadas em regiões terminais

dos cromossomos, os eventos que dispersaram o DNAr 18S não poderia estar agindo

sobre os sítios de DNAr 5S. Além disso, a posição intersticial do DNAr 5S tem sido

encontrada na maioria das espécies de várias ordens. Por esta razão, a posição

cromossômica altamente conservada dos sítios de DNAr 5S nas quatro populações de A.

altiparanae pode ter derivado da localização intersticial destes sítios nos cromossomos.

Os genes DNAr 5S situados em um par cromossômico têm sido identificados em A.

altiparanae e A. lacustris (Almeida-Toledo et al., 2002) e outras espécies, incluindo o

Atlantic salmon (Pendás et al. 1994), Anguilla anguilla (Martinez et al. 1996),

Prochilodus lineatus (Jesus e Moreira-Filho, 2003), Neoplecostomus microps e Harttia

loricariformis (Kavalco et al. 2004), possivelmente correspondendo a uma condição

ancestral em peixes.


36

Figura 2 – Metáfases de FISH em Astyanax altiparanae, evidenciando a posição cromossômica

dos sítios de DNAr 5S nas populações do ribeirão Maringá (a), rio Paraná (b), córrego Keçaba

(c), córrego Tatupeba (d). As setas indicam os cromossomos portadores dos cistrons

ribossomais.

A coloração seqüencial das lâminas de 5S-FISH nos espécimes de A.

altiparanae do ribeirão Maringá (Figura 3c, d) e córrego Keçaba (Figura 3e, f)

revelaram que os DNAr 5S não estão localizados nos mesmos cromossomos Ag-NORs.

Portanto, investigações utilizando duplo FISH com duas sondas DNAr deverão ser

realizadas a fim de comprovar a posição cromossômica diferente do DNAr 18S e 5S

nestes espécimes. Diferentes sítios cromossômicos para NOR e 5S também têm sido

relatados para Anguilla anguilla (Martinez et al. 1996), Salmo trutta (Moran et al.

1996), Leporinus elongatus, Leporinus obtusidens e Leporinus friderici (Martins e

Galetti 1999), Oreochromis niloticus (Martins et. al. 2000) e A. scabripinnis (Fernandes

e Martins-Santos, em preparação). Segundo vários autores (Lucchini et al., 1993;

Suzuki et al., 1996), este é um arranjo freqüentemente observado em vertebrados.

Entretanto, Almeida-Toledo et al. (2002) detectaram sinais in situ para o DNAr maior

(DNAr 28S) co-localizado com clusters de DNAr 5S na região pericentromérica de um

Capítulo I

37

cromossomo marcador em cinco espécies do gênero Astyanax. Mantovani et al. (2005)

também revelaram que os loci de DNAr 45S e 5S foram sintênicos em um cromossomo

de A. scabripinnis através de duplo FISH.

Figura 3 – Coloração seqüencial das lâminas de 18S-FISH e AgNO3 (a, b) e 5S-FISH e AgNO3

(c-f). Espécimes do córrego Tatupeba (a, b), ribeirão Maringá (c, d) e córrego Keçaba (e, f).

Note que o loci de DNAr 5S não estão nos cromossomos AgNO3+.

Há ainda poucos estudos usando FISH no gênero Astyanax, sendo a maioria

limitada a A. scabripinnis (Souza et al., 2001; Ferro et al., 2001; Mantovani et al., 2005;

Fernandes e Martins-Santos, em preparação). Em A. altiparanae, somente uma

população do rio Mogi-Guaçu (Almeida-Toledo et al., 2002) e as populações analisadas


38

foram relatadas utilizando a técnica de FISH com sondas de DNAr. Estes resultados têm

sido importantes para melhor caracterizar a posição cromossômica do DNAr 5S e 28S

ou 18S, ajudando em estudo citotaxonômicos de espécies relacionadas.

Agradecimentos

Os autores agradecem a CAPES pelo seu suporte financeiro.

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41

5.2 Capítulo II

Localização cromossômica dos genes RNAr 18S e 5S em três

citótipos simpátricos de Astyanax scabripinnis

(Characiformes, Characidae) da bacia do rio Ivaí, Estado do

Paraná, Brasil

Fernandes CA and Martins-Santos (enviado para publicação). -

Chromosomal location of 5S and 18S rRNA genes in three sympatric

cytotypes of Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae) from the

Ivaí river basin, state of Paraná, Brazil. Caryologia.

Capítulo II

42

Resumo

Análises da distribuição dos genes DNAr (18S e 5S) usando técnicas clássicas,

tais como coloração por prata, CMA3 e FISH foram realizadas em espécimes de

Astyanax scabripinnis do córrego Tatupeba (bacia do rio Ivaí). Os três citótipos

identificados para esta população apresentaram sistema de NOR múltipla, com

variações numéricas e posicionais detectadas por Ag-NOR, CMA3 e 18S-FISH. Em

contraste, os dados obtidos do DNAr 5S revelaram um padrão de distribuição altamente

conservado em cada citótipo. Aspectos em relação ao padrão de distribuição dos sítios

de DNAr 18S e 5S são discutidos.


43

Abstract

Analyses of the distribution of rDNA genes (both 18S and 5S) using classical

techniques, such as silver and CMA3 staining and FISH were carried out in specimens

of Astyanax scabripinnis from Tatupeba stream (Ivaí river basin). The three cytotypes

identified for this population presented multiple NOR system, with intra-populational

numerical and positional variations, detected for Ag-NOR, CMA3 and 18S-FISH. In

contrast, data obtained from rDNA-5S revealed a highly conserved chromosomal

distribution pattern in each cytotype. Aspects on divergences among distribution pattern

of sites 18S and 5S rDNA are discussed.

Key words: Astyanax scabripinnis, Fluorescence in situ hybridization (FISH),

ribosomal DNAs, sympatric cytotypes, Characidae

Running title: 18S and 5S rDNA in A. scabripinnis

Capítulo II

44

Introdução

Embora estudos sobre as regiões organizadoras de nucléolo (NORs) tenham sido

realizados mais freqüentemente por coloração com nitrato de prata (Ag-NOR), esta

metodologia é mais apropriada para estudos de expressão da NOR. Verdadeiramente,

esta detecta somente as regiões nucleolares transcricionalmente ativas na intérfase

anterior (Miller et al., 1976; Howell e Black, 1980). Um relacionamento próximo entre

sítios Ag-NOR e bandas CMA3 (fluorocromo GC-específico) positivas tem sido

documentado em peixes (Amemiya e Gold, 1986; Mayr et al., 1986), embora CMA3

possa também revelar outras regiões cromossômicas com alto conteúdo GC (Mayr et

al., 1986; Schmid e Guttenbach, 1988).

Recentemente a fluorescente hibridação in situ (FISH) tem sido empregada para

o mapeamento das NORs através de sondas ribossomais. O DNA ribossomal (DNAr) é

organizado em eucariotos superiores dentro de duas distintas classes gênicas: a classe

maior (DNAr 45S) que transcreve os RNA ribossomais (RNAr) 18S, 5.8S, e 28S e a

classe menor (DNAr 5S) que transcreve o RNAr 5S. Sítios ativos de DNAr 45S têm-se

mostrado coincidentes as NORs nos cromossomos, enquanto DNAr 5S não estão

associados com a NOR.

Análises em populações de Astyanax scabripinnis de diferentes bacias

hidrográficas brasileiras mostram grande diversidade cariotípica no número e

morfologia dos cromossomos (Moreira–Filho e Bertollo, 1991; Salvador e Moreira-

Filho, 1992; Souza et al., 1995; Mizoguchi e Martins-Santos, 1998; Alves e Martins-

Santos, 2002; Fernandes e Martins-Santos, 2003). Número diplóide variando de 2n =

50, 48 e 46 cromossomos indicam um “complexo de espécies” (Moreira-Filho e

Bertollo, 1991). Além disso, A. scabripinnis com citótipos simpátricos devido a

diferenças no número diplóide tem sido descrito por Souza et al. (1995), Maistro et al.

(2000) e Fernandes e Martins-Santos (2005). Múltiplas Ag-NORs é uma característica

comum em A. scabripinnis, alcançando até 15 cromossomos portadores da NOR, como

observado para um espécime coletado no rio Jucu (Rocon-Stange e Almeida-Toledo,

1993). As NORs têm sido extensivamente estudadas em peixes e constituem marcadores

genéticos adequados, contribuindo com os estudos citotaxonômicos de espécies

relacionadas (Galetti Jr., 1998).

No presente estudo, em três diferentes citótipos a NOR foi caracterizada para

uma população de A. scabripinnis usando diferentes tratamentos: AgNO3, CMA3 e

FISH com sonda de DNAr 18S. O mapeamento do DNAr 5S também foi realizado e


45

alguns aspectos com relação a localização cromossômica conservada do DNAr 5S e

variável do DNAr 18S são também discutidos.

Material e métodos

Os espécimes de A. scabripinnis foram coletados no córrego Tatupeba, bacia do

rio Ivaí (23º29’592”S e 52º01’041”W). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a

partir de células do rim seguindo a metodologia descrita por Bertollo et al. (1978). Ag-

NORs foram detectadas por coloração de nitrato de prata (AgNO3) seguindo método

descrito por Howell e Black (1980). Os cistrons ribossomais foram detectados pela

técnica de FISH, usando sondas de DNAr 18S e 5S, seguindo o procedimento descrito

por Pinkel et al. (1986), com ligeiras modificações. As sondas 18S e 5S foram obtidas

por PCR de Astyanax scabripinnis usando primers NS1 (5’-




respectivamente. As regiões ricas em GC foram detectadas pelo fluorocromo

cromomicina A3 (CMA3) conforme descrito por Schmid (1980). Ao menos 20 metáfases

por indivíduo foram examinadas em um microscópio de fluorescência Zeiss Axioskop 2

Plus. As imagens foram capturadas através de uma câmera digital acoplada ao

microscópio pelo software Axiovision e as pranchas finais com cromossomos

metafásicos foram montadas com o auxílio do programa Adobe Photoshop CS2 e

impressas em laboratório fotográfico.

Resultados

Análises de quarenta e um espécimes (21 machos e 20 fêmeas) de A.

scabripinnis do córrego Tatupeba mostraram três diferentes citótipos, denominados

como citótipo I (2n = 50), citótipo II (2n = 48) e citótipo III (2n = 46). Ainda foi

observada a presença de cromossomos B em cada citótipo, como relatado em um estudo

precedente (Fernandes e Martins-Santos, 2005). No presente estudo, foi examinado o

padrão de distribuição dos genes DNAr (18S e 5S) para esses três citótipos, usando

técnicas clássicas, tais como coloração por prata, CMA3 e FISH nos indivíduos que

apresentaram as melhores e o maior número de metáfases:

Capítulo II

46

Citótipo I (2n = 50)

Um total de treze indivíduos apresentou este citótipo. A coloração por nitrato de

prata revelou até 13 cromossomos portadores da NOR, todos marcados em regiões

teloméricas. A figura (1a) mostra uma metáfase com 7 marcações Ag-NOR. Análises de

CMA3 detectaram regiões ricas em GC na região telomérica de 8 cromossomos (Figura

1b). FISH com sonda de DNAr 18S revelou sinais brilhantes fluorescentes espalhados

sobre as regiões teloméricas de 14 cromossomos, com 2 cromossomos apresentando

marcação bitelomérica (Figura 1c).

FISH com sonda de DNAr 5S revelou sinais brilhantes fluorescentes espalhados

sobre as regiões pericentroméricas de 4 cromossomos: 2 cromossomos metacêntricos e

2 grandes acrocêntricos (Figura 2a).

A coloração seqüencial da lâmina de18S-FISH de um espécime revelou 4 sítios

ativos dos 14 cromossomos com DNAr 18S (Figura 3c-d).

Citótipo II (2n = 48)

Um total de vinte e dois indivíduos apresentou este citótipo. A coloração por

nitrato de prata revelou até 4 cromossomos portadores da NOR, todos marcados em

regiões teloméricas (Figura 1d). Análises de CMA3 detectaram regiões ricas em GC na

região telomérica de 9 cromossomos, incluindo um único cromossomo do primeiro par

metacêntrico (Figura 1e). FISH com sonda de DNAr 18S revelou sinais brilhantes

fluorescentes espalhados sobre as regiões teloméricas de 16 cromossomos (Figura 1f).



2 grandes acrocêntricos (Figura 2b)

A coloração seqüencial da lâmina de 5S-FISH de um espécime revelou que os

sítios de DNAr 5S não estão em um dos cromossomos AgNO3 (Figura 3a-b).

Citótipo III (2n = 46)

Um total de seis indivíduos apresentou este citótipo. A coloração por nitrato de

prata revelou até 4 cromossomos portadores da NOR, todos marcados em regiões

teloméricas. A figura (1g) mostra uma metáfase com 2 marcações Ag-NOR, incluindo

um único cromossomo do primeiro par de metacêntrico. Análises de CMA3 detectaram

regiões ricas em GC na região telomérica de 5 cromossomos, incluindo um único

cromossomo do primeiro par de metacêntrico. Em adição, um cromossomo apresentou


47

marcação bitelomérica (Figura 1h). FISH com sonda de DNAr 18S revelou sinais

brilhantes fluorescentes espalhados sobre a região telomérica de 14 cromossomos,

incluindo um único cromossomo do primeiro par metacêntrico (Figura 1i).



2 grandes acrocêntricos (Figura 2c).

Figura 1. Localização das NORs por Ag-NOR (a, d, g), CMA3 (b, e, h) e FISH com sonda

DNAr 18S (c, f, i) nos três citótipos. Citótipo I (a, b, c), Citótipo II (d, e, f) e Citótipo III (g, h,

i). As setas indicam os cromossomos marcados pelas três técnicas, as pequenas cabeças de seta

indicam cromossomos biteloméricos, as grandes cabeças de seta indicam o primeiro par de

cromossomos metacêntricos.

Capítulo II

48

Figura 2. Localização cromossômica do DNAr 5S nos três citótipos. a) Citótipo I, b) Citótipo II

e c) Citótipo III. As setas indicam os sítios de DNAr 5S.

Figura 3. Coloração seqüencial das lâminas de 5S-FISH e AgNO3 (a, b) e 18S-FISH e AgNO3 (c,

d). Note que os sítios de DNAr 5S não estão em um dos cromossomos AgNO3.

Discussão

Estudos citogenéticos em A. scabripinnis realizados em diferentes regiões do

Brasil, revelaram grande diversidade cariotípica com relação ao numero diplóide e

estrutura cromossômica, envolvendo NOR, padrão de banda-C e diferentes tipos de

cromossomos B. No presente estudo, análises com Ag-NOR, CMA3 e 18S-FISH para os


49

três citótipos de A. scabripinnis do córrego Tatupeba revelaram sistema de NOR

múltipla, com diferenças que podem caracterizar cada um deles.

A hibridação fluorescente in situ com sonda 18S resultou em sinais brilhantes

fluorescentes espalhados sobre a região telomérica de 14 cromossomos do citótipo I e

III, e em 16 cromossomos para o citótipo II, correspondendo aos cromossomos

portadores da NOR. Sem levar em consideração esta variação numérica, sítios de DNAr

18S em um único cromossomo do primeiro par metacêntrico, em concordância com a

posição AgNO3+/CMA3

+, foram detectados somente no citótipo III. No citótipo II, este

cromossomo foi também CMA3+, mas não apresentou cistrons de DNAr. No citótipo I,

marcações de AgNO3+, CMA3

+ e de DNAr 18S não foram detectadas para este

cromossomo. Ferro et al. (2001) também detectaram sítios DNAr-18S/CMA3+ para um

cromossomo do primeiro par de metacêntricos em A. scabripinnis (2n=50) do córrego

Carpas. A presença de somente um cromossomo do primeiro par com DNAr pode

indicar um rearranjo do tipo translocação, como descrito entre um cromossomo do

primeiro par em um único cromossomo do par 17 para a população de A. scabripinnis

do córrego Amores (Fernandes e Martins-Santos, 2003).

O citótipo I apresentou como característica um par de cromossomos com

marcação bitelomérica com 18S-FISH, similar a outras populações de A. scabripinnis

com 2n=50 cromossomos (Malacrida et al., 2003; Mantovani et al., 2005), o qual não

ocorreu nos outros citótipos. O citótipo III apresentou como característica um único

cromossomo com marcação CMA3+ bitelomérica, mas foi AgNO3

+/18S-FISH+ para

apenas um telômero. Assim, os dois telômeros são ricos em GC, mas apenas um

apresenta genes de DNAr. A outra região telomérica CMA3+ deste cromossomo, assim

como um único cromossomo do primeiro par metacêntrico CMA3+ do citótipo II, devem

estar revelando outras regiões com alto conteúdo GC.

Uma outra diferença detectada entre os citótipos foi em relação à atividade

gênica. No citótipo I, dos 14 cromossomos com sítios de DNAr 18S até 13

cromossomos foram AgNO3+, mostrando que praticamente todos os sítios de DNAr 18S

estão ativos para este citótipo. Por outro lado, dos 16 e 14 cromossomos com sítios de

DNAr 18S descritos respectivamente para os citótipos II e III, ambos apresentaram

somente 4 cromossomos AgNO3+. Portanto, diferentemente do citótipo I, no citótipo II e

III apenas uma parte dos sítios de DNAr 18S estão ativos para estes dois citótipos.

A coloração seqüencial da lâmina de 18S-FISH do citótipo I detectou somente

quatro sítios AgNO3+ ativos dos 13 possíveis para este citótipo. Além disso, o

Capítulo II

50

cromossomo com marcação 18S-FISH bitelomérica foi AgNO3+ para apenas um

telômero, o que ocorreu em todas metáfases AgNO3 analisadas. Desta maneira, o DNAr

18S de um dos telômeros pode não estar mais se expressando.

As variações intra-populacionais, numéricas e posicionais observadas no

presente estudo em relação ao DNAr 18S são também relatadas em outras populações

de A. scabripinnis (Ferro et al., 2001; Mantovani et al., 2005 Segundo Schweizer e

Loidl (1987) a disposição dos cromossomos no núcleo interfásico promove uma

proximidade das regiões teloméricas o que facilitaria transferência de material genético

presente nestas regiões. Portanto, a localização telomérica dos sítios de DNAr 18S nos

três citótipos de A. scabripinnis poderia facilitar transferência de DNAr 18S, originando

as variações numéricas e posicionais observadas. Por outro lado, a presença de três

citótipos diferentes, com variações no número diplóide (2n = 50 para o I, 2n = 48 para o

II e 2n = 46 para o III), presença de marcação bitelomérica com sonda 18S relatada

apenas nos espécimes de A. scabripinnis com 2n = 50 cromossomos (citótipo I) e outras

populações (Malacrida et al., 2003; Mantovani et al., 2005) e diferenças no número,

posicionamento e atividade gênica das NORs, é uma grande evidência da presença de

três espécies que vivem em simpatria e sintopia. Conseqüentemente, as variações do

número diplóide e da NOR observada entre os citótipos seria uma característica de cada

espécie.

Em contraste a variabilidade detectada nos três citótipos com relação ao padrão

de distribuição do DNAr 18S, uma alta estabilidade no posicionamento e número dos

sítios de DNAr 5S foi observado. A localização pericentromérica em dois cromossomos

metacêntricos e dois grandes cromossomos acrocêntricos nos três citótipos, também são

a mesma, ou muito similar, localização relatada em outras populações do complexo

scabripinnis, coletados em diferentes bacias hidrográficas (Mantovani et al., 2005), e

também muito similar ao número e posicionamento para o DNAr 5S relatados em outras

espécies do gênero Astyanax (Almeida-Toledo et al., 2002; Fernandes e Martins-Santos,

em preparação). Este fato sugere que o DNAr 5S é conservado não apenas dentro do

complexo scabripinnis, mas também dentro do gênero Astyanax. Segundo Mantovani et

al. (2005) esta conservação pode ser devido a localização intersticial destes sítios nos

cromossomos, o qual em regiões intersticiais, o DNAr 5S poderia estar protegido dos

eventos mencionados para dispersão do DNAr 18S.

A coloração seqüencial da lâmina 5S-FISH de um espécime do citótipo II

demonstrou que o DNAr 5S não está localizado nos mesmos cromossomos AgNO3.


51

Diferentes sítios cromossômicos para NOR e DNAr 5S foram relatados para Anguilla

anguilla (Martinez et al., 1996), Salmo trutta (Moran et al., 1996), Leporinus elongatus,

L. obtusidens e L. friderici (Martins e Galetti, 1999), Oreochromis niloticus (Martins et.

al., 2000) e A. altiparanae (Fernandes e Martins-Santos, em preparação). Segundo

vários autores (Lucchini et al., 1993; Suzuki et al., 1996), este é um arranjo

freqüentemente observado em vertebrados. Entretanto, através de análises por duplo

FISH, Almeida-Toledo et al. (2002) detectaram sinais in situ para o DNAr maior (28S

rDNA) co-localizado com clusters de DNAr 5S na região pericentromérica de um

cromossomo marcador em cinco espécies do gênero Astyanax. Mantovani et al. (2005)

também revelaram que os locus de DNAr 45S e 5S foram sintênicos em um

cromossomo de A. scabripinnis. Portanto, investigações utilizando duplo FISH com as

duas sondas de DNAr devem ser realizadas a fim de provar a diferente localização do

DNAr 18S e 5S no citótipo II, assim como nos outros citótipos.

Agradecimentos

Os autores agradecem a CAPES pelo suporte financeiro.

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Capítulo II

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55

5.3 Capítulo III

Caracterização citogenética em Astyanax fasciatus (Teleostei,

Characiformes) da bacia do alto rio Paraná por Giemsa, Ag-

NOR, banda-C e FISH.

Fernandes CA and Martins-Santos IC (em preparação). Cytogenetic

characterization in Astyanax fasciatus (Teleostei, Characiformes) from

upper Paraná river basin by Giemsa, Ag-NOR, C-Band and FISH.

Capítulo III

56

Resumo

Espécimes de Astyanax fasciatus da bacia do alto rio Paraná foram analisados

citogeneticamente a fim de melhor compreender a variabilidade encontrada dentro desta

espécie. Os indivíduos apresentaram número diplóide de 2n = 46 cromossomos, com

sistema de NOR múltipla detectada por coloração de nitrato de prata e FISH com sonda

de DNAr 18S. Além disso, FISH com DNAr 18S revelou a presença de um par de

cromossomos metacêntricos com marcação bitelomérica, similar a marcação encontrada

em espécimes de Astyanax scabripinnis. O DNAr 5S foi detectado na região intersticial

de dois cromossomos metacêntricos e dois acrocêntricos, similar a marcação detectada

para outra população de Astyanax fasciatus descrita para a bacia do alto rio Paraná e

também com marcação similar a outras espécies do gênero, indicando uma conservação

destes sítios não somente dentro do complexo fasciatus mas também dentro do gênero

Astyanax. A heterocromatina constitutiva revelou blocos heterocromáticos nas regiões

teloméricas de cromossomos submetacêntricos, subtelocêntricos e acrocêntricos.

Aspectos em relação ao padrão de distribuição dos sítios de DNAr 18S e 5S são

discutidos.


57

Abstract

Astyanax fasciatus specimens from upper Paraná river basin were cytogenetically

analyzed in order better to understand variability found within this species. The

individuals presented diploid number of 2n = 46 chromosomes, with multiple NOR

system detected by silver nitrate staining and FISH with rDNA 18S probe. Moreover,

FISH with rDNA 18S revealed presence of one pair metacentric chromosomes with

bitelomeric markings, similar the markings detected for Astyanax scabripinnis

specimens. The rDNA 5S was detected in interstitial region of two metacentric and two

acrocentric chromosomes, similar the markins detected for other Astyanax fasciatus

population describe to upper Parana river basin and also with markings similar the

others species of genus, indicating a conservation of this sites not only within of

complex fasciatus, but also within of Astyanax genus. Constitutive heterochromatin

revealed heterochromatic blocks in the region telomeric of the submetacêntrico,

subtelocentric and acrocentric chromosomes. Aspects on divergences among

distribution pattern of sites 18S and 5S rDNA are discussed.

Key words: Astyanax fasciatus, FISH, 18S rDNA, 5S rDNA, C-band

Capítulo III

58

Introdução

Astyanax é um gênero relativamente comum, com ampla distribuição geográfica,

o qual consiste de pequenos peixes conhecidos no Brasil como lambaris ou piabas,

compreendendo mais de cem espécies e subespécies em rios neotropicais (Garutti e

Britski, 1997). Este gênero revela várias formas quase similares, formando um grupo

altamente complexo e sua precisa identificação tem sido difícil (Melo, 2001). Ainda,

algumas espécies indicam formar um complexo de espécies, tais como Astyanax

scabripinnis e Astyanax fasciatus. No complexo scabripinnis, o número diplóide varia

de 2n = 46, 2n = 48 e 2n = 50 cromossomos (Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Fernandes

e Martins-Santos, 2005) e no complexo fasciatus, o número diplóide varia de 2n = 45 a

2n = 50 cromossomos (Centofante et al., 2003).

A. fasciatus tem revelado sistema de NOR múltipla, assim como, outras espécies

do gênero. Regiões organizadoras de nucléolo (NORs) são extensivamente estudadas

em peixes e constituem bons marcadores genéticos, ajudando estudos citotaxonômicos

de espécies relacionadas (Galetti Jr., 1998). Estudos das NORs são realizados mais

freqüentemente com coloração de nitrato de prata devido a simplicidade desta técnica,

embora esta metodologia está limitada a detectar apenas as regiões nucleolares que

foram ativas na intérfase precedente (Miller et al. 1976). Recentemente a hibridação in

situ fluorescente (FISH) tem sido empregada para o mapeamento das NORs através de

sondas ribossomais. O DNA ribossomal (DNAr) é organizado em eucariotos superiores

dentro de duas distintas classes gênicas: a classe maior (DNAr 45S) que transcreve os

RNA ribossomais (RNAr) 18S, 5.8S, e 28S e a classe menor (DNAr 5S) que transcreve

o RNAr 5S. Sítios ativos de DNAr 45S têm-se mostrado coincidente as NORs nos

cromossomos.

Considerando a complexa variabilidade citogenética em A. fasciatus, nós

caracterizamos citogeneticamente uma população de A. fasciatus por meio de cariótipo

convencional de giemsa, banda-C, Ag-NOR, FISH com sondas DNAr 18S e 5S afim de

melhor compreender o “complexo fasciatus”.

Materiais e métodos

Cinco espécimes (3 machos e 2 fêmeas) de A. fasciatus foram coletadas no

córrego das Rosas tributário do rio Pirapó (Bacia do alto rio Paraná). Os cromossomos

mitóticos foram obtidos a partir de células do rim seguindo a metodologia descrita por

Bertollo et al. (1978). A identificação dos cromossomos foi feita de acordo ao critério


59

de relação de braços (RB), sugerida por Levan et al. (1964). A técnica de banda-C

descrita por Sumner (1972) foi empregada para análise da heterocromatina constitutiva.

Ag-NORs foram detectadas por coloração de nitrato de prata (AgNO3) seguindo o

método descrito por Howell e Black (1980). Os cistrons ribossomais foram detectados

pela técnica de FISH, usando sondas de DNAr 18S e 5S, seguindo o procedimento

descrito por Pinkel et al. (1986), com ligeiras modificações. As sondas 18S e 5S foram

obtidas por PCR de Astyanax scabripinnis usando primers NS1 (5’-




respectivamente.

Resultados e Discussão

Todos os espécimes apresentaram o mesmo número diplóide, 2n = 46

cromossomos, com a seguinte constituição cromossômica: 12 metacêntricos (M), 22

submetacêntricos (SM), 8 subtelocêntricos (ST) e 4 acrocêntricos (A), com número

fundamental (NF) igual a 88, para ambos os sexos (Figura 1a). Os resultados revelaram

o mesmo número diplóide 2n = 46 cromossomos da população de A. fasciatus do rio

Mogi-Guaçu (Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001), com a mesma, ou muito similar,

fórmula cariotípica, diferindo somente no número de cromossomos

submetacêntricos/subtelocêntricos: nos espécimes do rio Mogi-Guaçu, 20SM/10ST e

nos espécimes do presente estudo, 22SM/8ST. Segundo Daniel-Silva (1996) populações

de A. fasciatus da bacia do rio Paraná apresentaram 2n = 46 cromossomos, enquanto

populações de A. fasciatus da bacia do rio São Francisco apresentaram 2n = 48

cromossomos. Os resultados apresentados no presente trabalho corroboram aqueles

obtidos por este último autor.

A coloração por nitrato de prata revelou uma marcação terminal no braço longo

do par 12 em todas metáfases analisadas (Figura 1b). Além deste par, sítios adicionais de

NOR foram observados ocasionalmente em outros cromossomos. Múltiplas Ag-NOR

têm sido freqüentemente relatadas dentro do gênero Astyanax, incluindo A. altiparanae

(Daniel-Silva, 1996; Pacheco et al. 2002; Fernandes e Martins-Santos, 2004), A.

scabripinnis (Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Rocon-Stange e Almeida-Toledo, 1993;

Mizoguchi e Martins-Santos, 1998; Alves e Martins-Santos, 2002; Fernandes e Martins-

Santos, 2003; Fernandes e Martins-Santos, 2005), A. schubarti (Daniel-Silva, 1996), A.

Capítulo III

60

parahybae (Centofante et al., 2003) e A. fasciatus (Paganelli, 1990; Daniel-Silva, 1996),

indicando ser uma característica comum do grupo.

Figura 1. Cariótipo convencional de Giemsa (a), metáfases de Ag-NOR (b), 18S-FISH (c) e 5S-

FISH (d) dos espécimes de Astyanax fasciatus. Setas pequenas indicam os cromossomos

marcadores, setas grandes indicam o par submetacêntrico nº 12 e as cabeças de seta indicam os

cromossomos com marcação bitelomérica.

A técnica de FISH com sonda 18S revelou sinais brilhantes fluorescentes

espalhados sobre a região telomérica de 8 cromossomos, incluindo o par 12, o qual

revelou o maior sinal fluorescente. Estes dados confirmam sistema de NOR múltipla

para esta população. Além disso, dos 8 cromossomos marcados, um par de cromossomos

metacêntricos apresentou marcação bitelomérica (Figura 1c). Almeida-Toledo et al.

(2002) detectaram um total de 6 cromossomos portadores da NOR após FISH com sonda

de DNAr 28S em A. fasciatus do rio Mogi-Guaçu, com marcações intersticiais e

teloméricas.


61

Variações numéricas e posicionais dos sítios de DNAr 18S ou 28S entre os

espécimes de A. fasciatus do presente estudo e do rio Mogi-Guaçu (Almeida-Toledo et.

al., 2002) têm sido também relatadas em outras espécies, como A. scabripinnis (Ferro et.

al., 2001; Souza et al., 2001; Mantovani et al., 2005; Fernandes e Martins-Santos, em

publicação), A. altiparanae (Fernandes e Martins-Santos, em publicação) e Prochilodus

lineatus (Jesus e Moreira-Filho, 2003). Vários autores têm relatado que estas variações

podem estar relacionadas ao posicionamento telomérico destes sítios, uma vez que,

segundo Schweizer e Loidl (1987) a disposição dos cromossomos no núcleo interfásico

promove uma proximidade das regiões teloméricas o que facilitaria transferência de

material genético presente nestas regiões.

Em contraste com a variabilidade que tem sido detectada entre espécies próximas

do gênero Astyanax com relação ao padrão de distribuição do DNAr 18S, uma alta

estabilidade no posicionamento e no número de sítios DNAr 5S tem sido observado. No

presente estudo, análises de FISH indicaram que o DNAr 5S está localizado nas regiões

pericentroméricas de dois cromossomos metacêntricos e dois grandes cromossomos

acrocêntricos (Figura 1d). Este padrão de localização é o mesmo, ou muito similar,

àquele observado para o DNAr 5S na população de A. fasciatus do rio Mogi-Guaçu

(Almeida-Toledo et al., 2002) e em outras espécies de Astyanax, tais como, A.

scabripinnis (Almeida-Toledo et al., 2002; Mantovani et al. 2005; Fernandes e Martins-

Santos, em publicação) e A. parahybae (Kavalco et al. 2004). Estas constatações

sugerem que o DNAr 5S é conservado não somente dentro do complexo fasciatus, mas

também dentro do gênero Astyanax. Esta conservação pode estar relacionada ao

posicionamento intersticial destes sítios, que não sofrem os eventos de dispersão

mencionados para o DNAr 18S.

Com relação ao padrão de heterocromatina constitutiva, os espécimes de A.

fasciatus analisados apresentaram seis pares de blocos heterocromáticos na região distal

do braço longo de cromossomos submetacêntricos, subtelocêntricos e acrocêntricos. O

segmento Ag-NOR no par 12 foi também banda-C+ (Figura 2). Daniel-Silva e Almeida-

Toledo (2001) também detectaram este padrão de blocos heterocromáticos para

população de A. fasciatus do rio Mogi-Guaçu. Blocos heterocromáticos na região distal

do braço longo de cromossomos subtelocêntricos e acrocêntricos têm sido também

freqüentemente detectados em populações de A. scabripinnis (Maistro et al., 1992,

Maistro et al., 1998; Mizoguchi e Martins-Santos, 1998; Daniel-Silva e Almeida-Toledo,

2001; Fernandes e Martins-Santos, 2003; Fernandes e Martins-Santos, 2005),

Capítulo III

62

diferentemente das populações de A. altiparanae que apresentam blocos de

heterocromatina intersticiais (Paganelli, 1990; Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001;

Fernandes e Martins-Santos, 2004). Estes dados mostram que a heterocromatina

constitutiva é uma boa ferramenta citotaxonômica mesmo em espécies filogeneticamente

relacionadas.

Figura 2. Cromossomos metáfasicos de Astyanax fasciatus após banda-C.

Há ainda poucos estudos usando FISH no gênero Astyanax e a maioria é limitada

aos A. scabripinnis (Souza et al., 2001; Ferro et al., 2001; Mantovani et al., 2005;

Fernandes e Martins-Santos, em publicação). Em A. fasciatus, somente uma população

do rio Mogi-Guaçu (Almeida-Toledo et al., 2002) e a população aqui analisada foram

estudadas empregando-se a técnica de FISH com sondas de DNAr. Estes resultados têm-

se mostrado importantes para a caracterização da posição cromossômica dos DNAr 18S

e 5S, contribuindo para um melhor entendimento dos estudos citotaxônomicos de

espécies filogeneticamente relacionadas.

Agradecimentos

Os autores agradecem a CAPES pelo suporte financeiro.

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Conclusões

66

6 Conclusões

Com base nas análises realizadas, os genes RNAr 18S situaram-se em regiões

terminais dos cromossomos nas três espécies de Astyanax.

Esta posição cromossômica pode ter favorecido as variações numéricas e

posicionais observadas.

Diferentemente, os genes RNAr 5S apresentaram uma conservação do número e

posicionamento, provavelmente por terem sido detectados em regiões intersticiais dos

cromossomos.

Os resultados obtidos nas análises da NOR, por Ag-NOR, CMA3 e 18S-FISH

nos três citótipos simpátricos e sintópicos de A. scabripinnis são indicativos de co-

existência de três espécies dentro do complexo scabripinnis, confirmando os estudos de

cariótipo e banda-C já descritos para esta população anteriormente.

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Estudos citogenéticos em três espécies do gênero Astyanax ... · A citogenética compreende o estudo dos cromossomos quanto à morfologia, organização, função, variação